大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298及其鉴定方法和应用与流程

本发明涉及一种大麦黄花叶病抗性基因，具体涉及大麦黄花叶病抗性基因eif4ehor3298及其鉴定方法和应用。

背景技术：

大麦黄花叶病是一种土传病毒病害，由大麦黄花叶病毒(baymv)或大麦温和花叶病毒(bammv)或两者共存复合体引起，两种病毒均属于马铃薯y病毒科，其是欧洲和东亚等冬大麦产区的重要病害之一，根据发病程度和发病时间不同，在感病田中大麦平均减产10％-50％，严重威胁欧亚地区冬大麦粮食生产。

baymv和bammv寄生在土壤中的禾谷多黏菌的休眠孢子中，由于土壤耕种、风吹土壤颗粒、含有游动孢子的水分短距离运输，病毒随着真菌孢子的传播完成在不同植株和不同地域间传播。在自然条件下，baymv和bammv通常在秋季感染幼苗根部，来年早春最先在植株新叶中出现典型的花叶病症，随着病斑不断增多导致叶片黄化、植株矮小、分蘖少、籽粒产量下降，或早枯或不抽穗结实。由于禾谷多黏菌休眠孢子在土壤中能够存活10年以上，在外界环境适宜的情况下，携带病毒的休眠孢子萌发再次感染寄主植物，因而该病成为一种长期、持久的病害胁迫。

大麦黄花叶病是我国长江中下游大麦产区最主要的病害，严重影响该地区的大麦产量。现有的化学和生物防治措施降低土壤中的禾谷多黏菌含量的效果有限，不能杜绝病害发生，农药的大量使用也会污染农田和环境。在自然条件下，部分大麦材料对大麦黄花叶病具有遗传抗病性，将抗病性基因导入栽培大麦品种中，可以有效防止病害发生，是当前农业生产中广泛采用的防控手段。由于自然选择条件下病毒频繁发生遗传变异，新毒性株系的出现可能导致当前的抗病性基因失效，鉴定新的抗性基因(或者已知基因新的抗性变异类型)因此具有重要的育种价值。

目前，已知的大麦黄花叶病抗性位点共18个，只有2个基因pdil5-1和eif4e被图位克隆。抗性遗传位点rym4(rym，resistancetoyellowmosaicdisease，抗黄花叶病)、rym5和rym6是等位基因，由真核生物翻译起始因子(eukaryotictranslationinitiationfactor4e)eif4e序列突变导致，抗病材料中的eif4e基因编码序列与感病材料不同，从而导致编码氨基酸序列改变；抗性遗传位点rym1和rym11是等位基因(rym为隐性基因)，由蛋白质二硫键异构酶基因(proteindisulfideisomeraselike)pdil5-1功能丢失引起。rym4/rym5，rym1/11是大麦生产中主要使用的抗性资源。

目前，德国、法国、日本等国家以及我国的长江中下游部分地区均出现了针对rym4、rym5、rym6和rym1/11的致病型毒性株系(例如欧洲毒性分离株baymv-ii、bammv-sil和bammv-teil，日本毒性分离株baymv-iii，我国的毒性分离株baymv-c和bammv-c)，意味着现有的抗性资源不能够满足育种使用，必须发掘新的抗性基因以及配套的分子标记选择方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供大麦黄花叶病抗性基因eif4ehor3298及其鉴定方法和应用，解决了携带大麦黄花叶病抗性位点rym4/rym5和rym1/11出现致病型毒性株系的问题，携带抗性基因eif4ehor3298的大麦材料分别在多个病圃田(病圃携带的致病型毒性株系可以感染rym4/rym5和rym1/11)中展现出对大麦黄花叶病毒和大麦温性花叶病毒的完全抗性，可用于大麦黄花叶病抗性育种。

为了达到上述目的，本发明提供了大麦黄花叶病抗性基因eif4ehor3298，该eif4ehor3298包含如sedidno.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种携带抗大麦黄花叶病基因的大麦，该大麦含有大麦黄花叶病抗性基因eif4ehor3298，该eif4ehor3298包含如sedidno.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种大麦黄花叶病抗性基因eif4ehor3298的鉴定方法，该方法包含：

(1)将携带eif4ehor3298基因的大麦与携带pdil5-1基因抗性变异基因rym1/11的大麦作为亲本材料进行杂交，获得f1代遗传材料，将f1代遗传材料自交获得f2代分离遗传群体；

(2)将f2代及亲本材料随机播种于含有baymv/bammv病毒的病土中培育，待植株长大，进行表型调查，判断抗病或者感病；

(3)提取植株的总rna，反转录，采用pcr检测植株dna中的pdil5-1基因抗性变异基因rym1/11，对不携带rym1/11的植株进行遗传学分析和序列分析，从而获得eif4ehor3298基因，采用dcaps分子标记技术检测eif4ehor3298基因。

其中，所述eif4ehor3298包含如sedidno.1所示的核苷酸序列。

其中，所述dcaps分子标记技术的引物分子包含：如sedidno.2和sedidno.3所示的核苷酸序列。

优选地，在步骤(2)中，所述培育条件为：12℃光照和8℃黑暗交替。

优选地，在步骤(3)中，所述总rna是采用rnazolreagent提取获得的。

优选地，在步骤(3)中，所述反转录采用rtkitwithgdnaeraser。

优选地，在步骤(3)中，所述rym1/11的遗传变异采用pcr检测，其反应体系为：体积比10：10：2：2：2：1：73的cdnatemplate、10x含mg²⁺的taqbuffer、dntpmix、上游引物pdi_45_743_f、下游引物pdi_45_743_r、5u/μltaqdnapolymerase、ddh2o；其中，所述上游引物pdi_45_743_f包含：如sedidno.4所示的核苷酸序列，所述下游引物pdi_45_743_r包含：如sedidno.5所示的核苷酸序列。

优选地，在步骤(3)中，所述eif4ehor3298基因dcaps分子标记检测采用的反应分为两步：

第一步反应是对eif4e基因进行pcr扩增，采用的反应体系为：体积比10：10：2：2：2：1：73的dnatemplate、10x含mg²⁺的taqbuffer、dntpmix、上游引物dcaps_hor3298_f2、下游引物dcaps_hor3298_r、5u/μltaqdnapolymerase、ddh2o；其中，所述上游引物dcaps_hor3298_f2包含：如sedidno.2所示的核苷酸序列，所述下游引物dcaps_hor3298_r包含：如sedidno.3所示的核苷酸序列；

第二步反应是对eif4ehor3298基因酶切，采用的反应体系为：体积比1000：200：5：795的pcr产物、10x的flycutbuffer、20u/μl的限制性内切酶ecori、ddh2o。

本发明还提供了一种dcaps分子标记检测eif4ehor3298基因的试剂盒，该试剂盒包含：引物分子含有如sedidno.2所示的核苷酸序列的上游引物及含有如sedidno.3所示的核苷酸序列的下游引物。

本发明的大麦黄花叶病抗性基因eif4ehor3298及其鉴定方法和应用，具有以下优点：

本发明的抗性基因eif4ehor3298，对大麦黄花叶病毒和大麦温和花叶病毒的致病性毒性株系具有抗性作用，可用于大麦黄花叶病抗性育种。本发明提供了dcaps分子标记检测方法，该方法可以有效检测抗性基因eif4ehor3298，用于大麦育种过程中挑选抗病性植株。

附图说明

图1为本发明实施例1的大麦总rna的质量检测电泳图。

图2为本发明实施例3在f2群体中检测pdil5-1基因型的检测结果电泳图。

图3为本发明实施例3的eif4ehor3298基因的酶切结果电泳图(图中的maker为50bpdnaladder)。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1大麦黄花叶病抗性基因eif4ehor3298的遗传定位

大麦遗传材料hor3298是来自伊朗的大麦地方品种，w757/612是来自德国的大麦育种材料(携带rym1/11抗性基因，其抗性来源于pdil5-1基因的功能丢失)。

(1)利用hor3298与w757/612杂交，获得f1代遗传材料，通过套袋自交构建了f2代分离遗传群体；

(2)将f2代及亲本材料随机播种于含有baymv/bammv病毒的病土中，培育于光照培养箱中(12℃,10h白天/8℃,14h黑夜)，待种子发芽后，大约等植株长至4个月后开始调查其表型并取样待用，表型调查要分三次进行，每次间隔一周，判断抗病或者感病；

(3)剪取的待检测植株叶片，通过rnazolreagent(北京金百特生物技术有限公司，货号r011-100)提取总rna，nanodrop荧光分光光度计测定提取的rna浓度，利用1％(w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳跑胶检测提取质量，实验结果如图1所示，为本发明实施例1的大麦总rna的质量检测电泳图。利用rtkitwithgdnaeraser试剂盒(北京金百特生物技术有限公司；p514-100)反转rna，该试剂盒为一管式反转录预混mix，包括：4xgdnaerasermix、5xrtmastermix、rnaasefreeh2o，将反转成功的cdna稀释5倍后保存至-20℃待用。

(4)分子标记检测f2群体pdil5-1基因型，参考实施例3的方法，在f2群体中挑选不携带rym1/11的植株，根据表型调查结果，将16个感病样品和16个抗病样品的rna分别混合成池，每个样品按浓度2μg/μl等量混合，进行混池转录组测序(bulkedsegregantrna-seq,bsr-seq)和生物信息学分析，该结果证实，大麦品种hor3298中的只含有一个抗性位点，定位于染色体3h长臂末端。

(5)大麦品种hor3298与大麦品种franka(携带rym4抗性基因)杂交得到的f1代用于等位测验。将杂交得到f1代群体以及亲本材料播种于育苗盘中，放入光照培养箱中发苗(24℃，14h白天/18℃，10h黑夜)，长至两叶一心期机械摩擦接种大麦黄花叶病毒，发现f1代植株全部表现抗大麦黄花叶病。说明大麦品种hor3298携带的抗性基因与rym4属于等位关系，证实hor3298的抗性由eif4e基因提供。

实施例2大麦品种hor3298中eif4e基因的重测序

对大麦品种hor3298中eif4e基因全长编码区域，即648bp(sedidno.1)的核酸片段，通过pcr扩增和一代测序，鉴定eif4e基因的核苷酸序列变异，如下表1，为本发明实施例2大麦品种hor3298进行pcr扩增的反应体系表。

表1为本发明实施例2大麦品种hor3298进行pcr扩增的反应体系表

上游引物eif4e-54s包含：如sedidno.6所示的核苷酸序列(gcccgtccgtcstagaaaag)，所述下游引物eif4e-849as包含：如sedidno.7所示的核苷酸序列(gaaacagcatccacccgcta)。

表2为本发明实施例2大麦品种hor3298进行pcr反应的程序表

将测序结果利用sequencher5.4.6软件进行序列分析，比较大麦品种hor3298和eif4e基因已发表的其他变异类型之间的序列差异，发现eif4ehor3298与已发表序列均不相同，如下表3，为本发明大麦品种hor3298的eif4e基因与已发表的其他变异类型的eif4e基因之间的序列差异表，表明hor3298的抗性基因是eif4e的又一新型变异单倍型。

表3为本发明大麦品种hor3298的eif4e基因与已发表的其他变异类型的eif4e基因之间的序列差异表

注：1.参考pingyangetal.,theoretical&appliedgenetics(2017),130(2):331-344；2、3：参考nilssteinetal.,theplantjournal(2005),42(6):912-922；4、5：参考draganperovicetal.,theoretical&appliedgenetics(2014),127(5):1061-1071。

实施例3分子标记检测f2群体pdil5-1基因型

采用已发表的分子标记(yangetal.2014,theoreticalandappliedgenetics，127：1625-1634)选择不含pdil5-1基因功能丢失变异，即抗性基因rym1/11的f2植株，如下表4，为本发明实施例2检测抗性基因rym1/11的pcr反应体系表。

表4为本发明实施例2检测抗性基因rym1/11的pcr反应体系表

实验材料：easytaqdnapolymerase(货号ap111)和10xeasytaqbuffer(+mg²⁺)(货号gk101-01)，均购买于北京全式金生物技术有限公司；dntpmixture溶液(货号b500056-0500)，购买于生工生物工程(上海)股份有限公司。

上游引物pdi_45_743_f包含：如sedidno.4所示的核苷酸序列，所述下游引物pdi_45_743_r包含：如sedidno.5所示的核苷酸序列。

表5为本发明实施例2检测抗性基因rym1/11的pcr反应程序表

用1％(w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳跑胶，10μl扩增产物中加入2μlloadingdye(6x)上样，采用‘5000+dnaladder’(北京博迈德基因技术有限公司)作为片段大小指示，180v电压电泳30min，实验结果如图2所示，为本发明实施例2在f2群体中检测pdil5-1基因型的检测结果图，图2中有条带缺失的，即说明植株pdil5-1基因缺失某一片段序列导致该基因功能丢失，该植株在pdil5-1位点上是抗病的，反之则为感病的。

实施例4采用分子标记dcaps_hor3298检测eif4ehor3298基因

基于eif4ehor3298位于565bp上的特异性单核苷酸多态性开发dcaps分子标记，采用上游引物dcaps_hor3298_f2和下游引物dcaps_hor3298_r，上游引物dcaps_hor3298_f2包含：如sedidno.2所示的核苷酸序列，下游引物dcaps_hor3298_r包含：如sedidno.3所示的核苷酸序列，特异性扩增获得跨越eif4e基因的第3内含子和第4外显子的224bp片段。通过限制性内切酶酶切反应，采用flycutecori切割eif4ehor3298的33bp片段。

表6为本发明实施例4检测eif4ehor3298的pcr反应体系表

表7为本发明实施例4检测eif4ehor3298的pcr反应程序表

将上述pcr产物进行酶切，在pcr仪中37℃孵育1.5h，充分酶切，获得酶切产物。

表8为本发明实施例4对eif4ehor3298的pcr产物酶切的反应体系表

实验材料：flycutecori(货号je201-01)和10xflycutbuffer均购买于北京全式金生物技术有限公司。

采用3％(w/v)的琼脂糖凝胶(注：酶切产物的片段大小差异仅为30bp，需要高浓度的凝胶才能有效区分片段差异)，20μl酶切产物加入3μl的loadingdye上样，采用‘50bpdnaladder’(北京博迈德基因技术有限公司)作为片段大小指示，180v电压电泳30-35min，如图3所示，为本发明实施例3的eif4ehor3298基因的酶切电泳结果图，pcr获得的扩增条带，即片段大小为224bp的pcr产物，使用限制性内切酶flycutecori进行酶切反应，含eif4ehor3298基因的pcr产物被切掉34bp的片段，即为190bp，从图中可以看出，出现了小于224bp的条带(样品hor3298)；不含eif4ehor3298基因的片段不会被酶切，即为224bp(样品w757/612、样品htx来自中国地方品种)；杂合状态下同时出现224bp和190bp两个片段(样品hor3298+w757/612和样品hor3298+htx)，该结果证实，利用dcaps_hor3298分子标记可以有效鉴定纯合和杂合状态下的eif4ehor3298基因。

实施例5分子标记dcaps_hor3298检测试剂盒

分子标记dcaps_hor3298检测抗性基因eif4ehor3298试剂盒(50次)，该试剂盒成分(如表1)包括：两条dcaps引物(上游引物和下游引物)、阳性对照(eif4ehor3298的质粒dna)、taqdnapolymerase、taqbuffer、dntpmix、flycutecori、10xflycutbuffer和ddh2o。

表9本发明分子标记dcaps_hor3298检测试剂盒的成分表

检测过程参照实施例4，结果如图3所示。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110>杨平

时丽洁

蒋枞璁

阚金红

<120>大麦黄花叶病抗性基因eif4ehor3298及其鉴定方法和应用

<141>2018-10-23

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>648

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

atggcggaggacacggagacgaggcccgcgtcggcgggcgcggaggagagggaggagggg60

gagatcgcggacgacggagacgggtccgcggcggcggcggccgggcgcgtcagcgcccac120

cctctggagaacgcctggaccttctggttcgacaacccgcagggcaagttccgggcggtg180

gcctgggggagcaccatccaccccatccacaccttctccaccgtcgaggacttctggagc240

ctttacaacaatattcatcaccctagcaagttgaatgttggagccgacttccattgcttc300

aaggataagattgagccaaaatgggaagaccccatttgtgccaatggcggtatatggacc360

atcagttgtggcaaagggaaatctgacacattttggttgcatactttgctggcattgatt420

ggtgaacaattcgactttggtgatgaaatttgcggagcagtcgtcagcgtgcgtaagaac480

caggaaagagtagctatctggactaaaaatgctgccaatgaaactgctcagataagcatc540

ggtaagcagtggaaggagtttctggactacaaggactccattggattcgtcgttcatgag600

gatgctaagaggtccggcaaagccgccaagaaccgctacacggtttga648

<210>2

<211>37

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>2

ctttggtgatgaaatttgcggagcagtcgtcagcgtg37

<210>3

<211>36

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

tcacatgaacgacgaatccaatggagtccttggaat36

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>4

gtatccgccttctcctcgtc20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>5

cggtcaaaactcgcattgta20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>6

gcccgtccgtcstagaaaag20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>7

gaaacagcatccacccgcta20