一种采用阴离子型离子交换琼脂糖填料吸附槲皮素的方法与流程

本发明属于分离纯化技术领域，具体涉及一种采用阴离子型离子交换琼脂糖填料吸附槲皮素的方法。

背景技术：

槲皮素的分子式为c15h10o7，黄色针状结晶，为黄酮类化合物，槲皮素溶于冰醋酸几乎不溶于水，可以用作天然染料；槲皮素具有一定的抗氧化性能，可作为油脂，抗坏血酸的抗氧化剂；作为药品，具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用，此外还有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉，增加冠脉血流量等作用，用于治疗慢性支气管炎，对冠心病及高血压患者也有辅助治疗作用。

琼脂糖是线性的多聚物，基本结构是1,3连结的β-d-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-l-半乳糖交替连接起来的长链，它是一种来源于红藻的多糖，因为有特殊的凝胶性质。琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶，这是它具有多种用途的主要特征和基础。琼脂糖凝胶填料因其具有多孔性、亲水性及电中性等特点，且多糖链上带有多个羟基，可被修饰上不同的官能团。琼脂糖凝胶填料广泛用于凝胶过滤介质、离子交换介质、疏水层析介质、亲和层析介质及金属螯合层析介质，用于不同物质的分离和分析。它对分离介质的优势在于它的生物相容性好、柱载量高可达90％的孔容，可直接用于填充柱、选择性强、化学稳定性好交联结构可在ph值为1-14范围内保持稳定、操作简便灵活、微球交联后可耐较高流速和反压、适用于多种蛋白质的分离纯化。其中，三乙胺基胺衍生化的琼脂糖凝胶填料是一种弱阴离子交换模式的凝胶填料，与目前一般的氨基衍生化弱阴离子交换模式填料相比，其在分子结构上胺基的修饰量更大，同时由于氨基之间具有相对固定的位置关系，因此相邻的氨基可以相互协同，起到与目标纯化物具有更加稳定的结合关系的特点，因此是纯化分离领域一种重要的离子交换模式填料介质。

槲皮素存在于许多植物的花、叶、果实中，多以甙的形式存在，如芦丁(芸香甙)，槲皮甙，金丝桃甙等植物中含量较高。槲皮素的提取方法有很多种比如回流提取法、超声提取法、醇提取法等提取方法；分离方法主要有大孔树脂的吸附、活性炭层析法、硅胶柱层析法等分离方法。这其中，大孔树脂吸附方法使用最为广泛，工艺上也最为成熟。但是大孔树脂大多是由苯乙烯或丙烯酸脂类的单体聚合、交联而成，树脂本身的非特异性吸附很高，且树脂本身具有亲脂性的特征。对于天然植物提取物中的特定成分，往往有很强的吸附能力，洗脱工艺相对困难，同时高的非特异性吸附作用使得大孔树脂的使用寿命显著降低。活性炭层析法所使用的活性炭来源简单，成本低廉。但同样存在非特异性吸附高、选择吸附能力很差的问题，且活性炭沉降过程长，延长了工艺周期。硅胶柱层析法具有较高的效率，但随之而来的式设备要求高，对于天然植物提取物粗产品的组分富集过程，相对成本较高。并且硅胶材料耐碱性较差，在洗脱、清洗、再生过程中，不能采用强碱性的溶液，这就大大限制了硅胶材料的应用。

而琼脂糖填料由于其是多糖构成的基本结构，填料亲水性强，且非特异性吸附很弱，同时对于酸、碱有很强的耐受性。伴之以相应离子交换模式的辅助，可望在天然植物提取物中特定组分的吸附过程中，提供一个良好的解决方案。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种采用阴离子型离子交换琼脂糖填料吸附槲皮素的方法，该方法不仅能将槲皮素吸附到填料中，而且槲皮素也可以被很好的洗脱下来。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案。

一种采用阴离子型离子交换琼脂糖填料吸附槲皮素的方法，可分为溶液配制、上样、淋洗、洗脱、hplc分析五个步骤，具体步骤如下：

1)溶液配制：将含有槲皮素的原料配置成溶液，所选溶剂为甲醇或/和乙醇；溶液中溶剂含量不低于30％，配制溶液的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml，优选0.5mg/ml～2mg/ml；

2)上样：将样品溶液滴加在spe柱中填料的上表面即可或者利用aktapurier纯化系统所进行的吸附工作，可以通过上样环上样或上样液直接通过纯化系统管路上样；

3)淋洗：一般淋洗液为水，淋洗液的添加单位为柱体积，淋洗液的流速为0.5ml/min～15ml/min；一般加入1～5个柱体积的水，将阴离子型离子交换琼脂糖填料中所有吸附较弱或者未吸附的物质冲淋下来，保证强吸附作用下的槲皮素分子与样品中其它杂质的分离；

4)洗脱：本发明采用含有甲酸的甲醇溶液洗脱，解吸附，甲酸的浓度为0.5％～5％，洗脱液的流速为0.5ml/min～15ml/min；可用紫外吸收的检测技术对于洗脱液中的槲皮素进行检测，一旦检测不到槲皮素的吸收，洗脱即可完成；同时，由于槲皮素本身在溶液中呈现出黄色，因此也可以使用肉眼判断是否洗脱结束；收集洗脱液，供hplc分析；

5)hplc分析：采用unitaryc18色谱柱，hplc仪器为waters2695(2998pdadetector)，检测波长为360nm，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，进样体积为10μl，流动相为甲醇和0.4％的磷酸(55:45)；对流出液进行分析，收集槲皮素成分的产品溶液。

进一步的，本发明所使用的填料为阴离子型离子交换琼脂糖填料，发生阴离子型离子交换行为的为琼脂糖填料表面的功能化配基，本发明中这种功能化配基为三(2-氨基乙基)胺，即所采用阴离子型离子交换琼脂糖填料为该配基衍生化修饰的琼脂糖填料。目前市场上有这类商业化的填料销售，具体为bio-works公司的琼脂糖填料，该产品命名为tren。如果没有特殊说明，下面直接用tren来代替这一商品化填料。

进一步的，在上样过程进行之前，需要将阴离子型离子交换琼脂糖填料装填至一定体积的柱管之内，这一装填过程可以通过利用预装柱的方式省略，同时也可以通过利用spe空柱管装填的方式进行；但柱管的直径直接影响分离效果和上样量，因此做如下规定，柱管的直径为5mm～800mm，优选5mm～50mm。

进一步的，本发明中采用spe柱管所进行的吸附工作是在常压下完成的，其流速可以通过spe柱管下端连结的泵，通过改变泵的功率来实现；而利用预装柱进行的吸附工作则一般在aktapurier纯化系统中完成，其流速由软件通过纯化系统内部的泵进行控制，流速为0.5ml/min～15ml/min。

与现有技术相比，本发明的优点为：

1)利用琼脂糖填料对槲皮素进行了吸附，利用琼脂糖填料底非特异性吸附的特点，最大限度的降低了非特异性吸附对于工艺的影响。

2)琼脂糖作为一种生物制药领域常用的分离填料，其生物安全性与稳定性远远好于其它的常见填料，对于来源于植物中的天然产物的吸附与纯化过程，是十分有益的。

3)利用低浓度的甲酸甲醇洗脱液即可进行洗脱，省却了复杂的洗脱和后处理过程，整体洗脱条件较为简单，易于实施，并易于后期处理。

4)本发明方法得到槲皮素纯度大于95％，收率大于85％。

附图说明

图1为实施例1流动相的流出，流速压力与紫外吸收波长的变化图；

图2为实施例1中上样流穿、淋洗以及洗脱过程中，收集不同阶段流出液的hplc分析结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述，可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：

取浓度为1mg/ml槲皮素甲醇溶液。采用5mltren预装柱，使用aktapurier纯化系统进行分析。首先平衡预装柱，平衡完成后进样，以5ml/min的流速进样量5ml槲皮素甲醇溶液，2个柱体积后用纯化水淋洗，淋洗2个柱体积后以1.5％甲酸甲醇洗脱，洗脱至无峰结束，共计洗脱4个柱体积，将上样流穿液、淋洗液、洗脱液一次按柱体积收集液保留，具体过程如图1中所示。

实施例2：

取浓度为0.5mg/ml槲皮素甲醇溶液。取5ml阴离子型填料tren，先后采用1ml0.1m的hcl和0.1m的naoh活化，然后用水冲至中性。配制1mg/ml的槲皮素甲醇溶液，取5ml的槲皮素甲醇溶液与5ml的tren混合静置，当颜色全部吸附到tren上时，用水淋洗，直至tren的颜色不在变化，最后用15ml1％甲酸甲醇对有颜色的物质进行洗脱。

实施例3：

取浓度为1mg/ml槲皮素乙醇溶液。取2ml阴离子型填料tren，装填至5mlspe空柱管之中。先后采用1ml0.1m的hcl和0.1m的naoh活化，然后用水冲至中性。配制1mg/ml的槲皮素甲醇溶液，取2ml的槲皮素甲醇溶液上样至填料之中。上样结束后，用4ml水淋洗，最后2ml用3％甲酸甲醇对有颜色的物质进行洗脱。

实施例4：

取浓度为1mg/ml槲皮素甲醇/水50/50的溶液。使用aktapurier纯化系统进行。取50ml阴离子型填料tren，装填至中压层析空柱管之中，并连接到纯化系统之中。以10ml/min的流速先后采用30ml0.1m的hcl和0.1m的naoh活化，然后用水冲至中性。配制1mg/ml的槲皮素甲醇溶液，取50ml的槲皮素甲醇溶液，以5ml/min的流速上样至填料之中。上样结束后，以5ml/min的流速用水淋洗，最后用100ml0.8％甲酸甲醇以5ml/min的流速对有颜色的物质进行洗脱。

实施例5：

取浓度为1.5mg/ml槲皮素乙醇/水95/5的溶液。采用1mltren预装柱，使用aktapurier纯化系统进行分析。首先平衡预装柱，平衡完成后进样，以5ml/min的流速进样量1ml槲皮素甲醇溶液，2个柱体积后用纯化水淋洗，淋洗3个柱体积后以1.5％甲酸甲醇洗脱，洗脱至无峰结束，收集液保留。

实施例6：

如图2所示，将实施例1中上样流穿、淋洗以及洗脱过程中，收集不同阶段流出液的hplc进行分析。其中采用unitaryc18色谱柱，hplc仪器为waters2695(2998pdadetector)，检测波长为360nm，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，进样体积为10μl，流动相为甲醇和0.4％的磷酸(55:45)。

分析测试的样品依次为上样原液、流穿液、第一个柱体积的淋洗液、第二个柱体积的淋洗液、第一个柱体积的洗脱液、第二个柱体积的洗脱液、第三个柱体积的洗脱液、第四个柱体积的洗脱液。根据分析结果，合并第二、三、四个柱体积的洗脱液即可得到槲皮素成分的产品溶液。

通过五个实施例，可以看出，一种采用阴离子型离子交换琼脂糖填料吸附槲皮素的方法，得到槲皮素纯度大于95％，收率大于85％。

上述仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案的范围内，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。