一种高纯贝壳杉烯酸提取分离的方法与流程

本发明天然产物活性成分的提取分离技术领域，涉及一种从药食两用植物慈姑球茎中提取分离高纯贝壳杉烯酸的方法，特别是涉及一种用超临界co2萃取结合分子蒸馏技术提取分离高纯贝壳杉烯酸的方法。

背景技术：

慈姑(sagittariasagittifolial)是泽泻科慈姑属植物，又名剪刀草。原产于中国，主要分布在华北、华南等地，一般生长在浅水或沼泽中，目前已广泛种植。其地上叶部分与地下球茎均可入药，其中地下球茎部分可食用。慈姑性微寒，味苦，具有解毒利尿、防癌抗癌、散热消结、强心润肺之功效。另由于其球茎中富含丰富的碳水化合物及蛋白质以及钙、铁、硒等微量元素，成为餐桌上广受欢迎的食品。据相关文献记载，慈姑中含有丰富的萜类化合物，主要包括一些二萜类化合物和三萜类物质。其中主要有贝壳杉烷类、半日花烷类以及玫瑰烷类型二萜。参见liuxue-ting.antibacterialent-rosaneandent-kauranediterpenoidsfromsagittariatrifoliavar.sinensis.chinesejournalofnaturalmedicines2009,7(5):0341-0345.

贝壳杉烯酸(kaurenoicacid)又名异贝壳杉烯酸，是一种贝壳杉烷型二萜。相关研究表明贝壳杉烯酸可以有效抑制大肠杆菌(escherichiacoli)的生长，mic值为62.5mg/ml；贝壳杉烯酸对于人乳腺癌细胞(sk-br-3)具有良好抑制效果，ic50值可达11.0μmol/l，另外其对人结肠癌细胞(hct-8)、人神经癌细胞(sf-268)、人肝癌细胞(hepg2)、人肺癌细胞(nci-h460)等都具有中度抑制作用，且在此基础上经过简单修饰后得到的化合物细胞毒性加大增强，由此可见贝壳杉烯酸具有很好的抗肿瘤潜力。参见motohikoukiya,cytotoxicandapoptosis-inducingactivitiesofsteviolandisosteviolderivativesagainsthumancancercelllines.chemistry&biodiversity2013,10,177-188。此外，贝壳杉烯酸还具有舒缓血管平滑肌、抗炎、利尿等功能。

目前对于慈姑球茎的研究多集中于营养成分层面，只有极少数学者针对慈姑化学成分特别是二萜类成分进行研究，参见liuxue-ting.antibacterialent-rosaneandent-kauranediterpenoidsfromsagittariatrifoliavar.sinensis.chinesejournalofnaturalmedicines2009,7(5):0341-0345和yoshikawam.medicinalfoodstuffs.ii.onthebioactiveconstituentsofthetuberofsagittariatrifolial.(kuwai,alismataceae):absolutestereostructuresoftrifolionesa,b,c,andd,sagittariosidesa,andb,andaravincthalitoside.chempharmbull,1996,44(3):492-499。从植物中分离贝壳杉烷型二萜的文献较少，其中涉及的方法不仅产率低且操作复杂。如专利从狭叶凤尾蕨中提取分离贝壳杉烷型二萜用到的方法为：用甲醇冷浸提取，后续使用硅胶柱层析方法来分离纯化(cn105218320a，一种对映贝壳杉烷型二萜化合物及其制备方法和应用，申请号201510631170.4)，这个方法中甲醇属于有毒试剂会给环境造成污染，硅胶柱层析操作复杂，不宜放大生产且吸附严重，产品产率低。目前为止没有学者对从慈姑中提取贝壳杉烯酸的方法进行过研究。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种高纯贝壳杉烯酸提取分离的方法，该方法从慈姑球茎中提取分离高纯贝壳杉烯酸的方法，该方法操作简单，产率高、纯度高且易于工业化生产。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种高纯贝壳杉烯酸提取分离的方法，包括以下步骤：

(1)阴干、粉碎：将新鲜的慈姑球茎切片后自然阴干，粉碎过筛得到慈姑球茎粉末；

(2)超临界co2萃取：将慈姑球茎粉末装入超临界萃取釜中，超临界co2萃取，用乙酸乙酯溶液为夹带剂先静态萃取，后动态萃取，得到超临界萃取物；

(3)分子蒸馏：将超临界萃取物装入到分子蒸馏装置的原料缸中，收集轻相组份；

(4)重结晶：将所得的轻相组份浓缩、干燥，加入乙醇溶液后用重结晶，过滤、洗涤后得到晶体为贝壳杉烯酸。

作为优选，步骤(1)中所述粉碎至30目以上过筛得到慈姑球茎粉末。

作为优选，步骤(2)中所述超临界co2萃取的萃取温度为40～65℃，萃取压力为20～30mpa。

进一步地，步骤(2)中所述乙酸乙酯为夹带剂，，其中二氧化碳和乙酸乙酯的流速比为100:10～15，先静态萃取5～8分钟，后动态萃取2-3小时。

作为优选，步骤(2)中所述将超临界萃取物装入到分子蒸馏装置的原料缸中先设定分子蒸馏装置参数预热，打开真空泵抽真空，设定刮膜转速后打开原料缸进料阀，调整物料流速，收集轻相组份。

进一步地，步骤(3)中设定分子蒸馏温度为160～190℃，刮膜转速为250～300r/min，压力为0.2～0.5pa，打开原料缸进料阀，物料流速为1.5～2ml/min。

作为优选，步骤(4)中所述乙醇溶液为热乙醇溶液，温度为40～60℃。

机理：本发明采用超临界co2萃取，温度和压力都处于临界温度和临界压力以上的流体称为超临界流体。纯co2的临界压力为7.3mpa，临界温度为31.1℃，处于临界压力和临界温度以上的co2被称为超临界co2。超临界流体的物理化学性质和非临界状态下气体和液体的性质有很大的不同，兼具液体和气体的优点。利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，通过简单的变换co2的压力和温度在超临界状态下，将超临界co2与待分离的物质接触，使其有选择性地把成分依次萃取出来的技术叫超临界co2萃取技术。由于co2是非极性物质，对于稍微强极性的化合物萃取效率很低，加入适当的极性夹带剂可以对极性成分进行更好的萃取。贝壳杉烯酸属于二萜类中等极性物质，可以完全通过超临界二氧化碳萃取提取出来。

此外本发明采用的分子蒸馏是一种特殊的液--液分离技术，它不同于传统蒸馏依靠沸点差分离原理，而是靠不同物质分子运动平均自由程的差别实现分离。当液体混合物沿加热板流动并被加热至适当的温度，轻、重分子会逸出液面而进入气相，由于轻、重分子的自由程不同，恰当地设置一块冷凝板，则轻分子达到冷凝板被冷凝排出，而重分子达不到冷凝板沿混合液排出。分子蒸馏用在超临界流体萃取之后，可以对所需成分进行精制纯化。二萜类物质属于轻相，可以在轻相中收集到。由于纯化后的贝壳杉烯酸特别容易结晶析出，后续通过重结晶就可以得到高纯度的贝壳杉烯酸。

有益效果：与现有技术相比本发明具有如下优点：

(1)本发明采用超临界co2萃取，萃取能力强特别是针对脂溶性成分，二氧化碳无毒无污染；温度较低，活性成分不易分解；压力适中，具有抗氧化灭菌作用，保证天然产物品质，且本方法中加入了适量的乙酸乙酯溶液作为夹带剂，增加了溶质的溶解度，大大提高了萃取效果。

(2)本发明采用分子蒸馏，真空度高，操作温度低、受热时间短等优势可以极大地保护活性成分不易破坏，特别适用于天然产物的纯化和精制；作为分离的辅助纯化手段其分离能力强且分离后有效成分高度富集，特别适用于超临界萃取物之后的精制，后续可通过重结晶的方法得到高纯度产品。

(3)本发明方法以泽泻科慈姑属植物慈姑的新鲜球茎为原料，经过自然阴干、粉碎、超临界co2萃取(以乙酸乙酯为夹带剂)，继以分子蒸馏和重结晶的方法获得了高纯度的具有抗肿瘤潜力的贝壳杉烷型二萜-贝壳杉烯酸。本发明采用植物慈姑可以广泛种植，价格低廉，为从天然植物中分离贝壳杉烯酸提供了新方法途径；本发明采用方法流程简单、易操作，产率高，纯度高达99.0％，不使用有毒有害溶剂，环境污染程度低，适用于工业化应用。整个操作过程完全不使用有毒试剂，安全无污染且操作简便、产品纯度高，具有很好的工业化前景。

附图说明

图1是利用本发明分离得到的贝壳杉烯酸的¹h-nmr图谱。

图2是利用本发明分离得到的贝壳杉烯酸的¹³c-nmr图谱。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

首先将新鲜的慈姑球茎切片后自然阴干重约3.5kg，粉碎至30目后加入到超临界萃取仪中，设定萃取压力为25mpa，萃取温度为40℃，超临界co2流量为30l/h，调节超临界co2和夹带剂乙酸乙酯溶液的流速比为100:10，先静态萃取5分钟，之后动态萃取3小时得到超临界萃取物。将上述萃取物装入到分子蒸馏装置的原料缸中，设定温度参数为180℃，预热，设定刮膜转速为300r/min，打开真空泵抽真空调节压力为0.3pa时开启原料缸进料阀门，调整物料流速为1.5ml/min，使萃取物缓慢流下，之后收集轻相组份。将所得的上述轻相组份浓缩、干燥，加入热的乙醇溶液后用常规方法重结晶，过滤、洗涤后得到晶体为贝壳杉烯酸。

实施例2

首先将新鲜的慈姑球茎切片后自然阴干重约3.5kg，粉碎至40目后加入到超临界萃取仪中，设定萃取压力为30mpa，萃取温度为55℃，超临界co2流量为30l/h，调节超临界co2和夹带剂乙酸乙酯溶液的流速比为100:15，先静态萃取5分钟，之后动态萃取2小时得到超临界萃取物。将上述萃取物装入到分子蒸馏装置的原料缸中，设定温度参数为160℃，预热，设定刮膜转速为250r/min，打开真空泵抽真空调节压力为0.2pa时开启原料缸进料阀门，调整物料流速为2ml/min，使萃取物缓慢流下，之后收集轻相组份。将所得的上述轻相组份浓缩、干燥，加入热的乙醇溶液后用常规方法重结晶，过滤、洗涤后得到晶体为贝壳杉烯酸。

实施例3

首先将新鲜的慈姑球茎切片后自然阴干重约3.5kg，粉碎至40目后加入到超临界萃取仪中，设定萃取压力为20mpa，萃取温度为40℃，超临界co2流量为30l/h，调节超临界co2和夹带剂乙酸乙酯溶液的流速比为100:10，先静态萃取8分钟，之后动态萃取3小时得到超临界萃取物。将上述萃取物装入到分子蒸馏装置的原料缸中，设定温度参数为160℃，预热，设定刮膜转速为250r/min，打开真空泵抽真空调节压力为0.2pa时开启原料缸进料阀门，调整物料流速为1.5ml/min，使萃取物缓慢流下，之后收集轻相组份。将所得的上述轻相组份浓缩、干燥，加入热的乙醇溶液后用常规方法重结晶，过滤、洗涤后得到晶体为贝壳杉烯酸。

实施例4

首先将新鲜的慈姑球茎切片后自然阴干重约3.5kg，粉碎至40目后加入到超临界萃取仪中，设定萃取压力为30mpa，萃取温度65℃，超临界co2流量为30l/h，调节超临界co2和夹带剂乙酸乙酯溶液的流速比为100:15，先静态萃取5分钟，之后动态萃取2小时得到超临界萃取物。将上述萃取物装入到分子蒸馏装置的原料缸中，设定温度参数为190℃，预热，设定刮膜转速为300r/min，打开真空泵抽真空调节压力为0.5pa时开启原料缸进料阀门，调整物料流速为2ml/min，使萃取物缓慢流下，之后收集轻相组份。将所得的上述轻相组份浓缩、干燥，加入热的乙醇溶液后用常规方法重结晶，过滤、洗涤后得到晶体为贝壳杉烯酸。

将上述是实施例得到的化合物通过¹h-nmr、¹³c-nmr进行结构鉴定，核磁谱图参照附图1-2，所分离纯化得到的产品是贝壳杉烯酸，数据如下：白色针状晶体，溶于氯仿，分子式为c20h30o2，分子量为302.46。

¹³c-nmr(100mhz，cdcl3，δh(ppm)：40.7(c-1)，19.1(c-2)，37.8(c-3)，43.7(c-4),57.0(c-5)，21.8(c-6)，41.2(c-7)，44.2(c-8)，55.1(c-9)，39.7(c-10)，18.4(c-11)，33.1(c-12)，43.8(c-13)，39.7(c-14)，48.9(c-15)，155.9(c-16)，102.9(c-17)，28.9(c-18)，183.5(c-19)，15.6(c-20)。

¹h-nmr(400mhz，cdcl3，δc(ppm)：4.79(1h,s,h-17)，4.73(1h,s,h-17)，2.63(1h,brs,h-13)，2.14(1h,brd)，2.04(2h,d)，1.24(3h,s,me)，0.94(3h,s,me)。

同时结合相关文献报道确定该化合物为贝壳杉烯酸，alisongeraldopacheco.¹³c-nmrdataofditerpenesisolatedfromaristolochiaspecies.molecules2009,14,1245-1262.

对比例

目前针对植物中二萜类成分分离的方法，现有技术多集中在有机溶剂提取和柱色谱分离技术阶段，如专利(cn1508114a，二萜类有效成分的提取方法，申请号02149680.3)中公开了一种提取分离蕨类植物中二萜类成分的方法：先采用超临界二氧化碳萃取，后续使用大孔吸附树脂进行纯化。该方法与本发明的不同之处在于，用大孔吸附树脂代替了本发明中的分子蒸馏方法。大孔吸附树脂相对于分子蒸馏来说需要用到大量的溶剂进行洗脱，不仅步骤繁琐、溶剂消耗量大且会对成分有一些吸附损耗，本发明中分子蒸馏方法效率高、操作简单，不消耗过多溶剂且几乎没有损耗，明显优于该方法。再如专利(cn105837434a，一种豨莶草中提取的二萜类化合物及其制备方法和应用，申请号201610255807.9)中公开了一种在豨莶草中提取分离二萜的方法：用有机溶剂提取，后续用大孔吸附树脂、硅胶柱色谱以及葡聚糖凝胶色谱进行分离纯化。该方法使用常规有机溶剂提取，后有用到有机溶剂进行脱脂，溶剂耗量大且毒性较大；该方法通过三个柱色谱来进行分离纯化，过程繁琐且硅胶柱色谱吸附严重，样品损耗量大。本发明中使用先进的超临界二氧化碳萃取和分子蒸馏联用的方法进行提取分离，具有步骤简单、溶剂使用量极少、不消耗有毒试剂、损耗小等优点，明显优于现有技术。