本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种i型牛疱疹病毒重组蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
牛传染性鼻气管炎(ibr)又称“坏死性鼻炎”、“红鼻病”，是i型牛疱疹病毒(bhv-1)引起的一种牛呼吸道接触性传染病。此病目前在世界范围内流行，对乳牛的产奶量、公牛的繁殖力均有较大影响。1980年我国从新西兰进口奶牛中首次报道该病，并分离到一株牛传染性鼻气管炎病毒，随后经血清学调查证实，我国广东、广西等省市的黑白花乳牛、本地黄牛、水牛或牦牛均有ibr病毒存在。在一些交通极不便利的地区，ibr病毒抗体阳性率极高。
体外诊断核心原料的开发是开发相应诊断试剂的前提,只有开发出具有高活性、高性能的抗原抗体,体外诊断试剂产品才能成为现实。因此,针对i型牛疱疹病毒抗体和抗原开发出能够用以生产诊断试剂的原料迫在眉睫,从某种程度上说,原料的开发也必将成为降低i型牛疱疹病毒病蔓延的首要解决问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于，提供一种i型牛疱疹病毒重组蛋白及其制备方法和应用。
本发明的技术方案:一种i型牛疱疹病毒重组蛋白，包括i型牛疱疹病毒抗原和i型牛疱疹病毒单链抗体；
所述i型牛疱疹病毒抗原为含有主要抗原决定簇的gd抗原；
所述i型牛疱疹病毒单链抗体为scfv。
一种i型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法，包括以下步骤:
(1)查找i型牛疱疹病毒中含有主要抗原决定簇的gd抗原；
(2)优化i型牛疱疹病毒gd抗原基因的密码子，合成核酸序列并进行表达；
(3)构建针对i型牛疱疹病毒gd抗原的单链抗体，调取单链抗体scfv的基因；
(4)重组优化的i型牛疱疹病毒gd抗原基因和针对i型牛疱疹病毒gd抗原的单链抗体scfv的基因，并进行诱导表达；诱导之后,将培养液4℃5000rpm离心20min收集菌体；
(5)纯化及复性i型牛疱疹病毒重组蛋白。
前述的一种i型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法中，所述步骤(2)和步骤(4)在大肠杆菌系统中表达。
前述的一种i型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法，所述步骤(2)和步骤(4)表达时的诱导温度为20℃、25℃、28℃或37℃，诱导转速为250rpm，诱导的iptg浓度为0.5mm。
前述的一种i型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法，所述步骤(2)和步骤(4)表达时的诱导温度为25℃或37℃。
前述的一种i型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法和应用中，所述步骤(2)和步骤(4)表达时的诱导温度为25℃。
前述的一种i型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方中，所述步骤(5)的纯化方式选自离子交换层析、凝胶过滤层析或亲和层析。
前述的一种i型牛疱疹病毒重组蛋白的制备方法中，所述步骤(5)的纯化方式为亲和层析。
一种i型牛疱疹病毒重组蛋白的应用，所述重组蛋白用于制备i型牛疱疹病毒检测试剂盒。
与现有技术相比，(1)首次开发针对i型牛疱疹病毒主要抗原gd的单链抗体scfv。
本发明在开发单克隆抗体的基础上又进行重组抗体技术开发单链抗体,单链抗体具有以下优点:1)具有完整的抗原结合位点,不含抗体恒定区；2)分子量小,减少了抗体的非特异性结合,降低了诊断产品的假阳性风险；3)结构简单,易于基因工程改造；4)易于在细胞中表达,可以在真核或者原核细胞中表达,可大量生产,成本较低。
(2)国内外首次开发i型牛疱疹病毒主要抗原表位及针对gd抗原的scfv重组蛋白。
由于感染i型牛疱疹病毒初期不产生抗体,致使在此段时间我们检测不到相应的i型牛疱疹病毒抗体,从而导致漏检,为了解决此问题必须在检测i型牛疱疹病毒抗体的同时增加对抗原的检测,开发针对i型牛疱疹病毒gd抗原的抗体成为关键。
(3)制备了同时结合i型牛疱疹病毒抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的重组蛋白。
在主要抗原表位和针对i型牛疱疹病毒gd抗原的抗体开发出后,利用基因工程技术将筛选出的高效抗原表位(i型牛疱疹病毒gd抗原的38-292aa)和针对i型牛疱疹病毒gd抗原的单链抗体scfv(23-30aa)重组,制备成具有同时结合i型牛疱疹病毒抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的重组蛋白,该重组蛋白具有以下优点:1)在快诊试剂条中只需要使用一种原料即可,这样可以避免多种原料间的交叉反应；2)在原料的生产上,只需要稳定一种原料的生产工艺即可,这样可以减少生产成本的投入,缩短原料生产周期,降低生产批间差；3)节省了开发i型牛疱疹病毒诊断试剂的成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例:一种i型牛疱疹病毒重组蛋白，包括i型牛疱疹病毒抗原和i型牛疱疹病毒单链抗体；
所述i型牛疱疹病毒抗原为含有主要抗原决定簇的gd抗原；
所述i型牛疱疹病毒单链抗体为scfv。
其制备方法，包括如下步骤:
1.i型牛疱疹病毒gd抗原基因的密码子优化及表达载体构建；
从ncbi查找gd抗原基因genbank:afb76672.1,其38-292aa蛋白质序列如下:
prynyterwhttgpipspfadgreqpvevryatsaaacdmlaliadpqvgrtlweavrrharaynatviwykiesgcarplyymeyteceprkhfgycryrtppfwdsflagfayptddelglimaaparlvegqyrralyidgtvaytdfmvslpagdcwfsklgaargytfgacfpardyeqkkvlrltyltqyypqeahkaivdywfmrhggvvppyfeeskgyepppaadggspappgddearedegeted
经过密码子优化后序列如下:
cctcgttataattacaccgaacgctggcataccaccggtccgattccgagcccgtttgccgatggccgcgaacagccggtggaagttcgttatgcaaccagtgcagccgcctgcgatatgctggccctgattgccgatccgcaggtgggtcgcaccctgtgggaagcagtgcgtcgtcatgcacgcgcctataatgcaaccgttatttggtataaaatcgaaagtggctgtgcacgcccgctgtattatatggaatataccgaatgtgaaccgcgcaaacattttggttattgccgttatcgtaccccgccgttttgggatagctttctggcaggctttgcctatccgaccgatgatgaactgggtctgattatggccgcaccggcccgtctggtggaaggccaatatcgtcgcgcactgtatattgatggcaccgttgcatataccgattttatggttagtctgccggccggcgattgctggtttagtaaactgggtgccgcacgtggttatacctttggcgcatgctttccggcccgtgattatgaacagaaaaaagtgctgcgcctgacctatctgacccagtattatccgcaggaagcccataaagcaattgtggattattggtttatgcgccatggcggcgttgttccgccgtattttgaagaaagcaaaggctatgaaccgccgccggcagcagatggtggtagtccggcaccgccgggtgacgatgaagcccgtgaagatgaaggtgaaaccgaagat
设计引物如下:
p1u:gcccatatgcctcgttataattacaccgaacgctggcataccaccggtccgattccg
p1d:ataacgaacttccaccggctgttcgcggccatcggcaaacgggctcggaatcggaccggt
p2u:gtggaagttcgttatgcaaccagtgcagccgcctgcgatatgctggccctgattgccg
p2d:gacgacgcactgcttcccacagggtgcgacccacctgcggatcggcaatcagggcca
p3u:aagcagtgcgtcgtcatgcacgcgcctataatgcaaccgttatttggtataaaatc
p3d:ggtatattccatataatacagcgggcgtgcacagccactttcgattttataccaaat
p4u:tatatggaatataccgaatgtgaaccgcgcaaacattttggttattgccgttatcgtac
p4d:cggataggcaaagcctgccagaaagctatcccaaaacggcggggtacgataacggcaa
p5u:aggctttgcctatccgaccgatgatgaactgggtctgattatggccgcaccggcc
p5d:gccatcaatatacagtgcgcgacgatattggccttccaccagacgggccggtgcggccat
p6u:actgtatattgatggcaccgttgcatataccgattttatggttagtctgccggccggcg
p6d:aaaggtataaccacgtgcggcacccagtttactaaaccagcaatcgccggccggcagac
p7u:tttggcgcatgctttccggcccgtgattatgaacagaaaaaagtgctgcgcctgacctat
p7d:ccacaattgctttatgggcttcctgcggataatactgggtcagataggtcaggcgcag
p8u:ataaagcaattgtggattattggtttatgcgccatggcggcgttgttccgccgtatt
p8d:ccatctgctgccggcggcggttcatagcctttgctttcttcaaaatacggcggaacaa
p9u:gccggcagcagatggtggtagtccggcaccgccgggtgacgatgaagcccgt
p9d:gccctcgagatcttcggtttcaccttcatcttcacgggcttcatcgtc
实验方法如下:
将引物p1u,p1d,p2u,p2d,p3u,p3d混合,进行pcr反应,所得产物命名为w1；将引物p4u,p4d,p5u,p5d,p6u,p6d混合,进行pcr反应,所得产物命名为w2(以上两个pcr反应的条件均为：94℃,2分钟x1个循环)；将引物p7u,p7d,p8u,p8d,p9u,p9d混合,进行pcr反应，其条件为：(98℃,15秒,55℃,30秒,68℃,30秒)x30个循环,所得产物命名为w3；然后将上述三个产物w1,w2,w3混合做为模板,用引物p1u,p9d进行pcr反应即得到优化后i型牛疱疹病毒的gd基因，条件为：72℃,7分钟x1个循环。测序证明序列正确后,将此pcr产物用ndei和xhoi限制性内切酶(购自neb公司)进行双酶切之后,插入到用相同两个酶切处理的pet30a(novagen产品,货号69909-3)载体中。
2.构建针对i型牛疱疹病毒核心蛋白i型牛疱疹病毒gd抗原的单链抗体；
(1)单克隆抗体(只针对结合gd抗原蛋白23-30aa的抗体)细胞株的获得；
a.将构建成功的pet30a-gd载体转化至bl21表达菌种表达纯化后获得gd抗原蛋白；
b.用获得的gd抗原蛋白免疫小鼠；
c.用单克隆抗体技术筛选到只针对结合gd抗原蛋白23-30aa的抗体细胞株。
(2)细胞rna的提取
用trizolls(invitrogen产品,货号10296-010)试剂,按照说明书操作步骤提取细胞总rna。
cdna第一链的合成
取1μgrna做逆转录模板,oligo(d)t1μl做逆转录引物,
加depc水至总体积12μl,混匀；
接着，
70℃变性5min,迅速冰浴冷却；
接着，
依次加入5×缓冲液4μl,rnase抑制剂1μl,dntp(10mmeach)
2μl,混匀，
37℃孵育5min；
接着，
加入amv逆转录酶1μl,
37℃反转录60min；
接着，
70℃10min终止反应；
最后，
冰上冷却。
(3)以逆转录cdna为模板,按照以下引物,用rt-pcr扩增重链轻链基因。
mhvu1:gatgtgaagcttcaggagtc
mhvu2:caggtgcagctgaaggagtc
mhvu3:caggtgcagctgaagcagtc
mhvu4:caggttactctgaaagagtc
mhvu5:aaggtccagctgcaacaatc
mhvu6:gaggtccagctgcagcagtc
mhvu7:caggtccaactgcagcagcc
mhvu8:gaggtgaagctggtggagtc
mhvu9:gaggtgaagctggtggaatc
mhvu10:gatgtgaacttggaagtgtc
mhvd1:tgcagagacagtgaccagagt
mhvd2:tgaggagactgtgagagtggt
mhvd3:tgaggagacggtgactgaggt
mhvd4:tgaggagacggtgaccgtggt
mkvu1:gatgttttgatgacccaaact
mkvu2:gatattgtgatgacgcaggct
mkvu3:gatattgtgataacccag
mkvu4:gacattgtgctgacccaatct
mkvu5:gacattgtgatgacccagtct
mkvu6:gatattgtgctaactcagtct
mkvu7:gatatccagatgacacagact
mkvu8:gacatccagctgactcagtct
mkvu9:caaattgttctcacccagtct
mkvd1:ccgtttcagctccagcttg
mkvd2:ccgttttatttccagcttggt
mkvd3:ccgttttatttccaactttg
用引物mhvu1—mhvu10分别与mhvd1—mhvd4组合；mkvu1—mkvu9分别与mkvd1—mkvd4组合做pcr反应。
pcr反应体系25μl,其中cdna0.5μl,上游引物0.25μl下游引物0.25μl,taq酶0.2μldntp2μl10×buffer2.5μl。
pcr(toyobo公司产品,货号：02510d1),pcr条件为：94℃,2分钟x1个循环；(98℃,5秒,55℃,30秒,68℃,25秒)x30个循环；72℃,7分钟x1个循环。
经测序验证后确定重链和轻链基因,然后通过递归pcr将重链和轻链基因连接起来,此重组基因为rscfv。
3.含有i型牛疱疹病毒gd抗原基因(38-292aa)和针对i型牛疱疹病毒gd抗原的单链抗体基因(23-30aa)重组,并进行表达:
(1)通过递归pcr将有i型牛疱疹病毒gd抗原基因(38-292aa)和针对i型牛疱疹病毒gd抗原的单链抗体基因(23-30aa)连接在一起,用ndei和xhoi限制性内切酶(购自neb公司)进行双酶切之后,插入到用相同两个酶切处理的pet30a(novagen产品,货号69909-3)载体中。
(2)将上述重组蛋白基因的表达载体转化至大肠杆菌bl21中,涂布于含100ug/ml硫酸卡那霉素(上海生工生物工程服务有限公司,货号：kb0286)的lb平板上,37℃过夜培养,挑取单克隆菌落,用含有相同浓度的硫酸卡那霉素的300mllb培养基37℃培养至od600达0.6左右,用浓度为0.5mm的iptg(生工,货号：ib0168)进行诱导表达,诱导条件为：37℃,转速250rpm,5h。诱导之后,将培养液4℃5000rpm离心20min收集菌体。
4.含有i型牛疱疹病毒重组蛋白的纯化及复性:
将菌体用50ml包涵体抽提液(20mmtris-hcl,0.5mureaph7.5,0.5mnacl,2％tritonx-100)重悬,然后超声破碎,条件为每次超声3s,间隔6s,共180次,12000rpm,4℃离心收集包涵体沉淀。用上样缓冲液bindingbuffer(50mmtris,8murea,0.5mnacl,20mm咪唑ph8.0)50ml破碎包涵体,上柱纯化,用洗脱缓冲液elutionbuffer(50mmtris,8murea,0.5mnacl,300mm咪唑ph8.0)洗脱目的蛋白。将纯化后的重组蛋白用透析缓冲液(1mm氧化型谷胱甘肽gssh,2mm还原型谷胱甘肽gsh,2mmedta,20mmtris,ph8.5)透析,每隔48h换一次透析液。取出透析后的蛋白液,经据乙醇-20000进行浓缩,于-20℃保存备用。
sequencelisting
<110>杭州亿米诺生物科技有限公司
<120>一种i型牛疱疹病毒重组蛋白及其制备方法和应用
<130>2
<160>46
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>255
<212>prt
<213>gd抗原基因genbank：（afb76672.1）的38-292aa蛋白质序列
<400>1
proargtyrasntyrthrgluargtrphisthrthrglyproilepro
151015
serprophealaaspglyarggluglnprovalgluvalargtyrala
202530
thrseralaalaalacysaspmetleualaleuilealaaspprogln
354045
valglyargthrleutrpglualavalargarghisalaargalatyr
505560
asnalathrvaliletrptyrlysilegluserglycysalaargpro
65707580
leutyrtyrmetglutyrthrglucysgluproarglyshisphegly
859095
tyrcysargtyrargthrproprophetrpaspserpheleualagly
100105110
phealatyrprothraspaspgluleuglyleuilemetalaalapro
115120125
alaargleuvalgluglyglntyrargargalaleutyrileaspgly
130135140
thrvalalatyrthraspphemetvalserleuproalaglyaspcys
145150155160
trppheserlysleuglyalaalaargglytyrthrpheglyalacys
165170175
pheproalaargasptyrgluglnlyslysvalleuargleuthrtyr
180185190
leuthrglntyrtyrproglnglualahislysalailevalasptyr
195200205
trpphemetarghisglyglyvalvalproprotyrpheglugluser
210215220
lysglytyrgluproproproalaalaaspglyglyserproalapro
225230235240
proglyaspaspglualaarggluaspgluglygluthrgluasp
245250255
<210>2
<211>765
<212>prt
<213>gd抗原基因genbank：（afb76672.1）的38-292aa蛋白质经过密码子优化后序列
<400>2
cyscysthrcysglythrthralathralaalathrthralacysala
151015
cyscysglyalaalacysglycysthrglyglycysalathralacys
202530
cysalacyscysglyglythrcyscysglyalathrthrcyscysgly
354045
alaglycyscyscysglythrthrthrglycyscysglyalathrgly
505560
glycyscysglycysglyalaalacysalaglycyscysglyglythr
65707580
glyglyalaalaglythrthrcysglythrthralathrglycysala
859095
alacyscysalaglythrglycysalaglycyscysglycyscysthr
100105110
glycysglyalathralathrglycysthrglyglycyscyscysthr
115120125
glyalathrthrglycyscysglyalathrcyscysglycysalagly
130135140
glythrglyglyglythrcysglycysalacyscyscysthrglythr
145150155160
glyglyglyalaalaglycysalaglythrglycysglythrcysgly
165170175
thrcysalathrglycysalacysglycysglycyscysthralathr
180185190
alaalathrglycysalaalacyscysglythrthralathrthrthr
195200205
glyglythralathralaalaalaalathrcysglyalaalaalagly
210215220
thrglyglycysthrglythrglycysalacysglycyscyscysgly
225230235240
cysthrglythralathrthralathralathrglyglyalaalathr
245250255
alathralacyscysglyalaalathrglythrglyalaalacyscys
260265270
glycysglycysalaalaalacysalathrthrthrthrglyglythr
275280285
thralathrthrglycyscysglythrthralathrcysglythrala
290295300
cyscyscyscysglycyscysglythrthrthrthrglyglyglyala
305310315320
thralaglycysthrthrthrcysthrglyglycysalaglyglycys
325330335
thrthrthrglycyscysthralathrcyscysglyalacyscysgly
340345350
alathrglyalathrglyalaalacysthrglyglyglythrcysthr
355360365
glyalathrthralathrglyglycyscysglycysalacyscysgly
370375380
glycyscyscysglythrcysthrglyglythrglyglyalaalagly
385390395400
glycyscysalaalathralathrcysglythrcysglycysglycys
405410415
alacysthrglythralathralathrthrglyalathrglyglycys
420425430
alacyscysglythrthrglycysalathralathralacyscysgly
435440445
alathrthrthrthralathrglyglythrthralaglythrcysthr
450455460
glycyscysglyglycyscysglyglycysglyalathrthrglycys
465470475480
thrglyglythrthrthralaglythralaalaalacysthrglygly
485490495
glythrglycyscysglycysalacysglythrglyglythrthrala
500505510
thralacyscysthrthrthrglyglycysglycysalathrglycys
515520525
thrthrthrcyscysglyglycyscyscysglythrglyalathrthr
530535540
alathrglyalaalacysalaglyalaalaalaalaalaalaglythr
545550555560
glycysthrglycysglycyscysthrglyalacyscysthralathr
565570575
cysthrglyalacyscyscysalaglythralathrthralathrcys
580585590
cysglycysalaglyglyalaalaglycyscyscysalathralaala
595600605
alaglycysalaalathrthrglythrglyglyalathrthralathr
610615620
thrglyglythrthrthralathrglycysglycyscysalathrgly
625630635640
glycysglyglycysglythrthrglythrthrcyscysglycyscys
645650655
glythralathrthrthrthrglyalaalaglyalaalaalaglycys
660665670
alaalaalaglyglycysthralathrglyalaalacyscysglycys
675680685
cysglycyscysglyglycysalaglycysalaglyalathrglygly
690695700
thrglyglythralaglythrcyscysglyglycysalacyscysgly
705710715720
cyscysglyglyglythrglyalacysglyalathrglyalaalagly
725730735
cyscyscysglythrglyalaalaglyalathrglyalaalaglygly
740745750
thrglyalaalaalacyscysglyalaalaglyalathr
755760765
<210>3
<211>57
<212>dna
<213>设计引物（p1u）
<400>3
gcccatatgcctcgttataattacaccgaacgctggcataccaccggtccgattccg57
<210>4
<211>60
<212>dna
<213>设计引物（p1d）
<400>4
ataacgaacttccaccggctgttcgcggccatcggcaaacgggctcggaatcggaccggt60
<210>5
<211>58
<212>dna
<213>设计引物（p2u）
<400>5
gtggaagttcgttatgcaaccagtgcagccgcctgcgatatgctggccctgattgccg58
<210>6
<211>57
<212>dna
<213>设计引物（p2d）
<400>6
gacgacgcactgcttcccacagggtgcgacccacctgcggatcggcaatcagggcca57
<210>7
<211>56
<212>dna
<213>设计引物（p3u）
<400>7
aagcagtgcgtcgtcatgcacgcgcctataatgcaaccgttatttggtataaaatc56
<210>8
<211>57
<212>dna
<213>设计引物（p3d）
<400>8
ggtatattccatataatacagcgggcgtgcacagccactttcgattttataccaaat57
<210>9
<211>59
<212>dna
<213>设计引物（p4u）
<400>9
tatatggaatataccgaatgtgaaccgcgcaaacattttggttattgccgttatcgtac59
<210>10
<211>58
<212>dna
<213>设计引物（p4d）
<400>10
cggataggcaaagcctgccagaaagctatcccaaaacggcggggtacgataacggcaa58
<210>11
<211>55
<212>dna
<213>设计引物（p5u）
<400>11
aggctttgcctatccgaccgatgatgaactgggtctgattatggccgcaccggcc55
<210>12
<211>60
<212>dna
<213>设计引物（p5d）
<400>12
gccatcaatatacagtgcgcgacgatattggccttccaccagacgggccggtgcggccat60
<210>13
<211>59
<212>dna
<213>设计引物（p6u）
<400>13
actgtatattgatggcaccgttgcatataccgattttatggttagtctgccggccggcg59
<210>14
<211>59
<212>dna
<213>设计引物（p6d）
<400>14
aaaggtataaccacgtgcggcacccagtttactaaaccagcaatcgccggccggcagac59
<210>15
<211>60
<212>dna
<213>设计引物（p7u）
<400>15
tttggcgcatgctttccggcccgtgattatgaacagaaaaaagtgctgcgcctgacctat60
<210>16
<211>58
<212>dna
<213>设计引物（p7d）
<400>16
ccacaattgctttatgggcttcctgcggataatactgggtcagataggtcaggcgcag58
<210>17
<211>57
<212>dna
<213>设计引物（p8u）
<400>17
ataaagcaattgtggattattggtttatgcgccatggcggcgttgttccgccgtatt57
<210>18
<211>58
<212>dna
<213>设计引物（p8d）
<400>18
ccatctgctgccggcggcggttcatagcctttgctttcttcaaaatacggcggaacaa58
<210>19
<211>52
<212>dna
<213>设计引物（p9u）
<400>19
gccggcagcagatggtggtagtccggcaccgccgggtgacgatgaagcccgt52
<210>20
<211>48
<212>dna
<213>设计引物（p9d）
<400>20
gccctcgagatcttcggtttcaccttcatcttcacgggcttcatcgtc48
<210>21
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu1）
<400>21
gatgtgaagcttcaggagtc20
<210>22
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu2）
<400>22
caggtgcagctgaaggagtc20
<210>23
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu3）
<400>23
caggtgcagctgaagcagtc20
<210>24
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu4）
<400>24
caggttactctgaaagagtc20
<210>25
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu5）
<400>25
aaggtccagctgcaacaatc20
<210>26
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu6）
<400>26
gaggtccagctgcagcagtc20
<210>27
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu7）
<400>27
caggtccaactgcagcagcc20
<210>28
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu8）
<400>28
gaggtgaagctggtggagtc20
<210>29
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu9）
<400>29
gaggtgaagctggtggaatc20
<210>30
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mhvu10）
<400>30
gatgtgaacttggaagtgtc20
<210>31
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mhvd1）
<400>31
tgcagagacagtgaccagagt21
<210>32
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mhvd2）
<400>32
tgaggagactgtgagagtggt21
<210>33
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mhvd3）
<400>33
tgaggagacggtgactgaggt21
<210>34
<211>21
<212>dna
<213>设计引物(9mhvd4)
<400>34
tgaggagacggtgaccgtggt21
<210>35
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvu1）
<400>35
gatgttttgatgacccaaact21
<210>36
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvu2）
<400>36
gatattgtgatgacgcaggct21
<210>37
<211>18
<212>dna
<213>设计引物（mkvu3）
<400>37
gatattgtgataacccag18
<210>38
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvu4）
<400>38
gacattgtgctgacccaatct21
<210>39
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvu5）
<400>39
gacattgtgatgacccagtct21
<210>40
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvu6）
<400>40
gatattgtgctaactcagtct21
<210>41
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvu7）
<400>41
gatatccagatgacacagact21
<210>42
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvu8）
<400>42
gacatccagctgactcagtct21
<210>43
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvu9）
<400>43
caaattgttctcacccagtct21
<210>44
<211>19
<212>dna
<213>设计引物（mkvd1）
<400>44
ccgtttcagctccagcttg19
<210>45
<211>21
<212>dna
<213>设计引物（mkvd2）
<400>45
ccgttttatttccagcttggt21
<210>46
<211>20
<212>dna
<213>设计引物（mkvd3）
<400>46
ccgttttatttccaactttg20