长效细胞因子基因衍生物融合蛋白的制作方法
本发明涉及利用重组技术制造具长效性的人血清白蛋白和细胞因子基因衍生物的融合蛋白。生物实验证明这种新型的长效融合蛋白与人细胞因子衍生物具生物活性功能和更优的特性。长效化的融合蛋白是由酵母工程菌表达由人血清白蛋白和人细胞因子基因衍生物蛋白的基因直接融合，表达和分泌到酵母菌体外，经分离纯化获得的非自然界存在的一种蛋白，可用于作为长效重组细胞因子基因衍生物融合蛋白药物，旨在大大提高细胞因子基因衍生物蛋白药物在体内的半衰期、大大减少给药频次、获得更低的生产制造成本，并具有更为显著的临床疗效。
背景技术：
1.白蛋白
人血清白蛋白(hsa)是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半。白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。血清白蛋白是一种球状非糖基化的、分子量为65千道尔顿的血清蛋白质。人血清白蛋白基因位于4号染色体上，有16961个碱基对，分为15个间隔区。经rna加工拼接后形成的mrna可编码一个具有585个氨基酸的蛋白质。这一蛋白(白蛋白前体)再通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，而分泌到细胞外。血清白蛋白有35个半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一个有17个二硫键的单体(参见brownjr，“白蛋白的结构、功能和应用”pergamon，纽约，1977)。当没有分泌多肽时，在酵母细胞内的白蛋白产物是错配状态，将失去90％的抗原性(与血浆中自然状态白蛋白相比)，并且形成不溶性的白蛋白聚合体。现在用于临床的白蛋白均是从人血浆中提取的。利用微生物重组表达白蛋白(rhsa)的生产已在专利ep330451和ep361991中公开。
白蛋白具有多种多态体及30种不同的遗传杂分子(weikamp，cr等，人类遗传年报，37：219-226，1973)。血清白蛋白分子的三维结构已经由x-光衍射法测定(carter，科学，244，1195-1198，1989)。白蛋白是血液中的主要成分，在人体内含量为每升血液含40克，半衰期寿命为14-20天。综上所述，白蛋白具有极大的优势使之可抵御生物体内酶的作用，并可使治疗性蛋白质以较高剂量使用。
利用基因工程技术，将人血清白蛋白与人生长激素在酵母菌中表达为融合蛋白，该融合蛋白增加了人生长激素在血清中和储存时的稳定性。该项技术已在中国的专利申请cn1207131中公开。同理，人血清白蛋白与cd4蛋白受体形成融合蛋白后融合蛋白对hiv-1病毒的亲和性与cd4受体蛋白质单体相比有相同或更高的结合度(美国专利6,165,470)。
2.干扰素
干扰素是多功能细胞因子异源家族成员之一，其首先被发现的生物活性是抵抗病毒感染。多年以来，干扰素的抗病毒活性是其唯一的生物功能。如今，发现干扰素有许多其它生物功能，如作用于细胞的生长、分化和免疫调节等活性可能具有更大的生物学意义。
干扰素有两个完全不同的家族，超级家族干扰素α/β(也称i型干扰素)包括一组结构相关基因和蛋白，可进一步分为ifnαiifnαii，和ifnβ亚族。另一亚族包括单一基因和其编码的蛋白ifnγ(也称ii型干扰素或免疫干扰素)。应该清楚ifnγ在结构上与ifnα/β超级家族无相关性，由于历史的原因，才把它们放在一起讨论。isaacs和lindenmann于1957年首先发现干扰素是被病毒感染的细胞的产物，并能诱导细胞抵抗同类或不同类的病毒的侵染。功能相关的病毒抑制蛋白(现称干扰素γ)是wheelock于1965年发现并描述为“干扰素类似物”，它是有丝分裂原激活的t淋巴细胞产生的物质。多年来，区分干扰素γ和其它类型的干扰素的唯一特性是干扰素γ缺乏ph2稳定性(wheelcok1965)和不同的抗原特异性(youngnerandsalvin1973)。直到20世纪80年代初期，各主要类型干扰素的基因和蛋白序列被揭示，才弄清楚不同类型干扰素之间的关系。人们才认识到干扰素γ是一种免疫调节细胞因子，干扰素α/β的潜在作用可以是更广义的细胞和组织。
干扰素α/β超级家族代表典型的干扰素。第一个清楚被阐述的是i类干扰素，研究表明它来源于人白细胞和纤维原细胞，具有不同的抗原性(havell等，1975)。以后，源于白细胞和纤维原细胞的干扰素被分别命名为干扰素α和干扰素β(committeeoninterferonnomenclature1980)。基因克隆研究揭示了大多数干扰素的结构，已确定至少24个非等位人干扰素α基因和假基因。可将这些基因分为二个不同的亚类ifnαi和αii(weissmannandweber1986)。ifnαi亚类包含一些有潜在功能的基因和数个假基因。ifnαii亚类仅有一个功能基因和5至6个非等位假基因。干扰素αi基因编码的成熟蛋白包括165-166个氨基酸，干扰素αii基因编码的成熟蛋白有172个氨基酸。编码n末端分泌信号肽序列，通常为23个氨基酸残基，成熟干扰素在从细胞中释放出来前，其信号肽序列被酶水解。已经发现所有类型的人干扰素αi基因和蛋白序列存在高度同源性，而干扰素αii的序列则与干扰素αi有很大的不同。据此，人们将它们分成不同的亚族(capon等，1985)。实际上，干扰素αii已经被命名为干扰素ω(adolf1987)。
干扰素α由单核细胞或巨噬细胞、淋巴母细胞或成纤维细胞产生，其它类型细胞如被病毒、核酸、糖皮质激素以及其它低分子量物质诱导也能产生的干扰素α，其分子量在19道尔顿至26道尔顿之间。干扰素的作用广泛，最主要的是抗病毒和抗寄生虫。此外，干扰素α还有抗某些肿瘤细胞的增殖作用。有些天然的人干扰素α已被纯化到均一，分子量在16000～21000之间(rubinsteinetal.1981)。分子量存在明显差别的原因还未完全弄清楚。
人干扰素β的单一基因编码166个氨基酸长的蛋白质。干扰素β和干扰素α亚族成员之间氨基酸的同源性约为25％～30％，核酸序列的同源性约为45％(taniguchietal.1980)。另外，在其转录启动子和增强子序列的5’端区域有高度同源性，表明干扰素α和干扰素β的基因常常是协同诱导的(degrave等，1981)。
干扰素是一类重要的生物药物，已被用于治疗多种疾病，包括免疫性疾病、癌症以及提高机体抗感染的免疫力。至今，已有5种人干扰素即α、β、γ、ω以及一种新的人类和鼠的干扰素ε已经用于临床诊断和治疗。目前临床使用干扰素治疗乙型肝炎和丙型肝炎以及多种癌症如慢性骨髓性白血病。还可用于多种癌症、肿瘤的治疗和多种肝炎病毒、禽流感、艾滋病毒、性相关病毒，例如：hpv、尖锐湿疣等等。
干扰素用于治疗乙型肝炎和丙型肝炎以及多种癌症如慢性骨髓性白血病。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒感染引起的肝脏炎症。丙型肝炎病毒是最常见的与血液相关的慢性疾病，在中国有近八千万携带者，在美国有四百万携带者，导致全世界每年有一百万人死亡。慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的肝脏炎症，乙型肝炎病毒能发展成肝癌和肝硬化。全世界有近五亿人感染乙型肝炎病毒。
病毒感染过程中产生的干扰素α/β能够阻止病毒的扩散并促进机体恢复(gresser等，1976)。近年来，有几类干扰素制剂已被批准临床使用。在美国，大肠杆菌表达的重组人干扰素α2a和干扰素α2b已被批准用于毛细胞白血病的治疗。干扰素α2a和干扰素-α2b都是干扰素α1亚族成员，两者的区别仅在23位点的一个氨基酸差别(干扰素α2a是精氨酸，干扰素α2b是赖氨酸)。一种制剂被批准用于治疗尖锐湿疣，另一种制剂被一些国家批准用于临床，例如人淋巴细胞的namalwa系产生的几种ifnα亚型的天然的混合物或培养的成纤维细胞产生的天然的人ifn-β。在一些国家，这些被批准的干扰素制剂用于慢性活动性乙型肝炎，急性病毒性脑炎以及鼻咽癌。在德国，大肠杆菌表达的重组人干扰素γ已被批准用于治疗风湿性关节炎。批准和试验的干扰素的治疗应用广泛地涉及这一主题(finterandoldham1985)。低剂量的干扰素β正用于刺激因红细胞成熟障碍的红细胞生成(michalevicz，us5,104,653)。
利用人干扰素α基因转化的大肠杆菌产生的新的多肽经过分离和鉴定，证明这些多肽具有干扰素活性，如抗病毒、细胞生长调节以及细胞物质产生的调节。这些新干扰素被innis在美国专利5,098,703中称为干扰素α67，在美国专利4,975,276中称为干扰素α54，在美国专利4,973,479中称为干扰素α61。
纯化的干扰素γ和白介素-2的混合制剂可用于治疗肿瘤。优选地，干扰素γ和白介素-2是由重组细胞合成得到(palladinous5,082,658)。
glue等在美国专利5,908,621中公开了一种将聚乙二醇(peg12000)与干扰素α共价结合来制备干扰素α使之用于慢性丙型肝炎病人的治疗。这里提到如何制备长效和缓释形式的干扰素。shechter等报道(proc.natl.acad.sci.usa.2001january30；98(3)：1212-1217)通过共价连接fms(2-硫代-9-氟芴基甲氧羰基(fluorenylmethoxycarbonyl)在干扰素α2b的氨基酸基团上能延长人干扰素-α2b的半衰期。
leibowitz等在美国专利us4,892,743报道了一个发明，其特征是构建一个新的干扰素杂合子，它由161和/或162个氨基酸组成。这个杂合子的新颖性不仅在于其结构，还在于该杂合子是剪切缩短过的干扰素α。因此，该干扰素杂合子并不存在于自然界中。
chang等在美国专利us5,723,125中报道了融合重组蛋白，由人干扰素，优选的是干扰素α和人免疫球蛋白fc片断，优选的是γ4链，通过由一个连接肽glyglyserglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser[(g2s)2-(g4s)2]来连接而组成的融合蛋白。
有些研究论文报道多种干扰素的联合使用可对病人较有利。如trotta在美国专利us5,190,751中提到人干扰素α和干扰素γ联合使用，或是同时或是先后使用，能抑制白血病t细胞和b细胞的增殖，干扰素α优先的是干扰素α2b。
然而，这些使用方式的一般特征是存在于各种组织体液中的干扰素快速失活(o′kelly等，1985.proc.soc.exp.biol.med.178，407-411)，导致细胞因子在注射后的数小时内从血浆中消失(rostaing等，1998，j.am.soc.nephrol.9，2344-2348)。在体内，干扰素药物分子量小是通过在循环系统中的巨噬细胞吞噬消除的。因此，在临床上用于治疗病毒感染和癌症，非常需要具有长效性干扰素。
3.细胞因子基因衍生物(cellfacor-likeananlogs，缩写简称：cfa)
将多种人干扰素的基因序列混合，然后用计算机软件按人干扰素α基因dna序列进行编辑，可以获得混合人干扰素α衍生物(也称人干扰素α类似物)dna序列，其与人干扰素α基因dna序列有60-95％的同源性。通过常规的人干扰素α细胞生物活性测定方法(中国药典2005-2010版，2015版)测定这些软件重组的的干扰素衍生物dna在细菌中表达出来的重组蛋白的细胞抗病毒活性高于常规人干扰素α蛋白质的干扰素衍生物。细胞因子基因衍生物可用于多种癌症、肿瘤的治疗和多种肝炎病毒、禽流感、艾滋病毒、性相关病毒，例如：hpv、尖锐湿疣等等。一个典型的成功范例是wang，hetal.，us9,625,555展示了一个recombinanthumaninterferon-likeprotein(重组人干扰素衍生物蛋白)的制备和筛选过程。从人外周血白细胞的mrna获得12种人干扰素基因，利用dnashuffling技术构建杂交文库，经抗病毒、抗肿瘤细胞增殖活性筛选，获得高表达活性的重组菌株，再通过培养发酵和纯化，得到具有干扰素样活性的重组蛋白质。该干扰素衍生物蛋白质与人干扰素α2b氨基酸序列相似度比率约为86.75％；与人干扰素a2a氨基酸序列相似度比率约为87.35％的一种基因衍生物。其优点是生物活性比常规人干扰素α的生物活性提高50％以上，这个重组蛋白质则为药品被命名为人细胞因子基因衍生物(商品名：
本发明可意想不到地解决了现有人细胞因子基因衍生物作为药品在临床上应用的以下缺陷：
·给药频次太繁，每天一次注射给药；
·长期高频次给药，乙肝患者的接受度和药物依存度不高，临床显示不可能很好控制疾病的发展和获得更好的疗效；
·由于人细胞因子基因衍生物是人干扰素的基因突变体，基因衍生物，较之天然存在的人体蛋白质，衍生物更易于在人体中产生免疫原性和抗药抗体，导致在很短时间内药物的作用就将不再显效；
·作为人细胞因子基因衍生物，在人体中易于产生新的不同于正常人细胞因子的毒副反应；
·单次高剂量给药易于产生细胞因子风暴增加人体的免疫异常状态出现。
4.慢性病毒性乙型肝炎
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒引起的肝脏疾病，主要通过血液途径、母婴及性接触传播。受病毒因素和宿主因素影响，一部分人群感染hbv后将转为慢性感染状态。慢性乙型肝炎的临床表现多样，重者可出现食欲不振、恶心、呕吐、腹胀、全身乏力和黄疸等。alt持续或反复异常，或者肝脏组织学持续或反复存在炎性病变，将导致病情逐步进展至肝硬化、肝功能失代偿，最终导致死亡。
据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过hbv，其中3.5亿人为慢性hbv感染者，每年约有60万人死于hbv感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。hbv感染呈世界性流行，但不同地区hbv感染的流行强度差异很大。2006年全国乙型肝炎流行病学调查表明，我国1-59岁一般人群hbsag携带率为7.2％，据此推算我国现有的慢性hbv感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例，每年有约50万人死于终末期肝病。
目前已应用于临床的抗hbv治疗药物有两类。第一类为核苷(酸)类似物药物，主要有5种为拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定、恩替卡韦和替诺福韦酯，其中恩替卡韦和替诺福韦酯起效快、抗病毒作用强、耐药发生率低，国内外临床治疗指南均推荐为首选药物。第二类为干扰素，包括普通干扰素和聚乙二醇化干扰素。干扰素治疗慢性乙型肝炎在相对确定的疗程内患者的病毒抑制率和hbeag消失率或血清学转换率较高，停药后复发率较低。取得持续应答的患者可改善远期预后，减少肝硬化和肝细胞癌的发生率，提高生存率。聚乙二醇修饰的长效干扰素，一次有效剂量后可维持有效浓度48-72小时，每周只需注射一次，疗程一年。干扰素和核苷(酸)类似物都是治疗慢性乙型肝炎的有效药物，两种治疗方法具有互补性，如果其中一种方法疗效不明显、甚至无效时需要改换成另一种治疗。长效化的细胞因子基因衍生物是有其临床上需求的，特别是产品更新换代的要求。
技术实现要素：
本发明涉及体外制备重组人血清白蛋白/细胞因子衍生物融合蛋白的方法，特别是这种人细胞因子衍生物融合蛋白能增强机体对抗病毒侵染，刺激机体的免疫应答，提高疾病治疗的水平。
本发明涉及人细胞因子衍生物，即人干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白，目的是解决使用传统干扰素在治疗上的不足。总之，与干扰素比较，本发明涉及的细胞因子衍生物具有下列优点：1)能刺激机体对病毒感染的免疫应答；2)细胞因子衍生物融合蛋白在体内的存留时间长；3)起最大的治疗作用以及减小传统干扰素的潜在的副作用或毒性。
本发明还提供一种人细胞因子衍生物的治疗方法。这些方法包括由细胞因子衍生物组成的药物制剂以及治疗的有效剂量。药物制剂可以是任何药学可接受的能够使细胞因子衍生物稳定的任何赋形剂制剂形式。药物制剂可以进一步是天然的或重组的人白蛋白，和/或不同的细胞因子衍生物。
另外，本发明还涉及一种利用酵母生产细胞因子衍生物的高效低成本的方法.特别是用毕氏酵母生产人白蛋白与人细胞因子基因衍生物的融合蛋白，这种融合蛋白其在体内、体外的生物保护功能与传统的干扰素α相同，也与人细胞因子衍生物相同。但在血浆中的稳定性非常高、并且血浆半衰期长达到10被以上。
1.人血清白蛋白-人细胞因子基因衍生物融合蛋白
本发明描述了编码人血清白蛋白和一种人细胞因子基因衍生物所形成的融合基因，还应该提出的其它类型的人血清白蛋白和人血清白蛋白衍生物、突变体、白蛋白片段也都能用于制备本发明所提到的细胞因子基因衍生物融合蛋白。
细胞因子基因衍生物可以包括融合人工设计的细胞因子衍生物，也包括干扰素家族的任何成员。在一具体实例中，细胞因子基因衍生物是被病毒感染的细胞产生的天然细胞因子。这样的干扰素或细胞因子基因衍生物在“肽生长因子及其受体ii”(spornandroberts，spring-verlagheidelberg，newyorkinc.，usa.pp3-38)中被vilcek(1991，)称为“干扰素和干扰素衍生物”，这一名称一直沿用至今，现在本发明确认干扰素、干扰素衍生物也可以称为细胞因子基因衍生物。
人细胞因子基因衍生物的特别实例包括，但不限于，所有经计算机软件处理形成的自然界没有，而经试验验证，这些重新综合出来的新dna序列，经计算机程序重组后，由外源细胞表达系统表达制备，也经科学试验证明具有生物学功能、具有临床治疗功能的重组人细胞因子具有衍生物。
在本发明中重点描述一种不同的人血清白蛋白/人细胞因子衍生物融合蛋白(rhsa/cfa)的制备。白蛋白-细胞因子基因衍生物融合蛋白和其他种类的细胞因子衍生物融合蛋白成员也能用同样的方法制备新的白蛋白/细胞因子基因衍生物融合蛋白。
人细胞因子基因衍生物基因序列可直接连接在白蛋白的n末端或c末端形成细胞因子衍生物融合蛋白。也可以，通过一个连接肽来连接白蛋白和细胞因子基因衍生物以形成融合蛋白，血清白蛋白-连接肽-人细胞因子基因衍生物或人细胞因子基因衍生物-连接肽-人血清白蛋白。连接肽长度优选是2-100个氨基酸，更优选是5-50个氨基酸，最优选为12-30个氨基酸。连接肽长度可短至白蛋白大分子对细胞因子基因衍生物形成的位阻保持最小，例如(g4s)3-4，更优选地是(g4s)2-6。连接肽有利于细胞因子基因衍生物与其受体结合。但连接肽的加入可能使融合蛋白在作为药物的使用时产生额外的免疫原性，最优选的是白蛋白与细胞因子基因蛋白之间不设有连接肽。
白蛋白-细胞因子基因衍生物融合蛋白可以是分泌型蛋白，可与人的特异性血清白蛋白抗体相结合，优选地，其还与细胞因子基因衍生物融合蛋白的特异性抗体相结合。
本发明提供体外制备人细胞因子衍生物融合蛋白的方法，获得的融合蛋白可用于疾病的治疗以提高人类重大疾病治疗和提高健康水平。特别是人血清白蛋白(hsa)和人细胞因子基因衍生物的重组融合蛋白能：1)保持细胞因子基因衍生物原有的在体内、体外的生物学功能；2)在体内缓慢释放来维持最大的抗病毒效果，使得临床用药频次减少至少7-14次，由每天一次给药成为每14天给药一次的长效药物；3)大大减少潜在的细胞因子基因衍生物单独使用时伴随的显著副作用或毒性。此外，4)利用酵母菌生产重组融合蛋白成本比细菌还低、效率高，患者治疗费用可至少10倍的降低。
本发明同时提供一种独立的核苷酸编码血清白蛋白和细胞因子基因衍生物融合蛋白，本发明还包括所有在体内体外具有细胞因子基因衍生物生物功能的蛋白。特别是，包括，但不局限于，细胞因子基因衍生物可以是来自干扰素α1b、2a和/或2b)、干扰素β、干扰素γ和/或干扰素w以及来自任何其它的人细胞因子基因衍生物。
在实施例中，dna核苷酸序列可编码人血清白蛋白/细胞因子基因衍生物融合蛋白(rhsa/cfa)，其核苷酸序列至少有90％与seqidno.1同源；优选地，多核苷酸序列至少有95％与序列seqidno.1同源。由该核苷酸序列编码的人血清白蛋白/细胞因子基因衍生物融合蛋白成熟肽氨基酸序列为seqidno.2，其氨基酸序列至少有90％与序列seqidno.2同源；有些地，氨基酸序列至少有95％与序列seqidno.2同源。
与上述的氨基酸序列有一定程度的序列相似性是指：例如，一种细胞因子衍生物，并在相似的氨基酸序列之间具有至少95％的序列同源性的氨基酸。其包括氨基酸链上每百个氨基酸有5个氨基酸点的突变，并也是细胞因子衍生物融合蛋白的氨基酸序列。换句话讲，任何氨基酸链与上述细胞因子衍生物融合蛋白的氨基酸链具有95％的序列同源性，即，即便有多达5％的氨基酸个体可以被替换、删减或插入等，均与本发明所指的氨基酸序列相同。无论是在5’或3’端，或在两端之间的任何位点发生氨基酸的突变，还是以单体或多体发生的氨基酸突变均在本发明的范围内。
实践上，任何特指的氨基酸分子链，只要具有与seqidno.2有90％、95％、96％、97％、98％或99％的相似性，就在本发明的保护范围内。而且由氨基酸序列编码的细胞因子衍生物融合蛋白也可由常规已知的计算机软件，如bestfit软件(wisconsin)序列分析软件包来获得。bestfit应用区域同源性比较方法(文献：smith和waterman，应用数学进展，2：482-489(1981)来寻找两个序列之间最佳的同源序列。当应用该软件或其它任何具有类似的dna序列对比分析时，某一特定的序列如与本发明所提出的序列有95％以上的序列同源性，均视为与本发明所述的序列相同源。
在室温或低温条件下，细胞因子基因衍生物融合蛋白贮藏期比传统细胞因子基因衍生物在同样条件下，具有4倍以上，优选达6倍或更优选达10倍以上的贮存期。
本发明还涉及用人血清白蛋白作为载体，携带治疗性的细胞因子衍生物的蛋白质药物，可由用来处理和治疗各种疾病或异常，或那些病毒性感染患者。在本发明中，细胞因子衍生物可以用于脊椎动物，优选地是人类，并通过不同途径，包括但不局限于口服、非经肠胃、腹腔膜内、静脉内、动脉内、皮下、舌下、肌内、肠内、唾液腺、鼻内、脂质法，通过吸入、注射、阴道、眼内方法给药。细胞因子衍生物也可通过局部性释放(如导管或支架管)，包括皮下、脂肪下、关节下及膜内，并可以做成缓释剂。具体地，细胞因子衍生物融合蛋白主要通过注射法和喷，滴法给药。
当在动物体内使用时，细胞因子衍生物融合蛋白的血浆半衰期与传统细胞因子基因衍生物相比可延长5倍、优选的是10倍、更优选的是15倍、最优选的是20倍。
本发明所述的细胞因子基因衍生物融合蛋白可以与天然或重组的白蛋白联合使用，优选的是以治疗的有效剂量和分子摩尔比相同的融合型式。
由血清白蛋白与细胞因子基因衍生物融合后形成的细胞因子衍生物融合蛋白将有更长的贮藏期和在血浆中更长的半衰期，这便于运输，节省贮藏费用以及减少药物的使用量或使用次数。
2.用于表达细胞因子基因衍生物融合蛋白的宿主系统
本发明中的细胞因子衍生物融合蛋白基因核苷酸序列可利用重组克隆技术引入宿主细胞，以使细胞因子基因衍生物融合蛋白得以表达。
一般来说，宿主细胞经遗传工程(转导或转化或转染)方法将携带有本发明中所提到的各种可能组合的细胞因子衍生物融合蛋白基因核苷酸序列的载体质粒以侵入方式、病毒感染“噬菌体”等形式转入宿主系统中。工程宿主细胞可以在含常规营养物的培养基中培养，并经过适当修改以利于启动子。以适当的操作方式控制选择转化子或扩增编码细胞因子基因衍生物融合蛋白的核苷酸链的培养条件，如温度、ph和选择表达细胞。
按本发明所述，重组载体携带有包含编码细胞因子基因衍生物融合蛋白的核苷酸。重组载体可以是一个表达载体，可在宿主细胞内由携带的核苷酸编码来表达融合蛋白。形式可为，但不局限于，hsa/cfa、cfa/hsa、hsa/l/cfa或cfa/l/hsa(l＝连接肽)。宿主生物体及体细胞包括，但不局限于，脊椎动物(如人、猴、鼠、兔等)鱼、鸡、昆虫、植物、酵母、真菌和细菌等。
编码细胞因子基因衍生物融合蛋白的核苷酸是在适当的启动子作用下表达细胞因子衍生物融合蛋白蛋白质。可利用的适合启动子包括，但不局限于，腺病毒启动子，如腺病毒主要的后期启动子；或异源启动子，如cmv启动子和rsv启动子；诱导型启动子可有mmt启动子、热刺激启动子、白蛋白启动子、apoai启动子和人球蛋白启动子；病毒胸腺嘧啶脱氧核苷酶启动子则有疱疹病毒胸腺激酶启动子；反转录病毒ltr启动子包括经修饰后的ltr启动子；β-肌动蛋白启动子；人生长激素启动子。也可用天然启动子来控制核苷酸编码表达细胞因子衍生物融合蛋白蛋白质。
优选的宿主生物为酵母属，包括但不局限于，酿酒酵母属(saccharomyces)、毕氏酵母属(phichia)、汉逊酵母(hansenula)、克鲁维酵母属(kluyveromyces)、念珠菌属(candida)、孢园酵母属(tarulaspora)和裂殖酵母属等。更优选地，宿主系统可为毕氏酵母属巴斯德菌种。具体地讲重组载体质粒可为ppicz-a，b或c。
根据选用不同的宿主用来表达细胞因子基因衍生物融合蛋白，本发明中表达的蛋白可以是糖基化或非糖基化。优选地，当在一种宿主系统中得到表达时，hsa和细胞因子基因衍生物的融合蛋白可以是糖基化的，其糖基化程度可以和在哺乳动物细胞如中国仓鼠(cho)中表达的一致，或与在毕氏酵母菌中表达的一致。
如上所述，在本发明中提到的细胞因子基因衍生物融合蛋白，优选的使用基因工程技术构建来表达。获得细胞因子基因衍生物融合蛋白的优选方法是利用载体质粒，通过转化和转染或感染的方式来表达细胞因子基因衍生物融合蛋白。特别是利用可转化酵母的表达载体，来转化毕氏酵母，并使细胞因子基因衍生物融合蛋白分泌到培养液中。
利用酵母菌表达细胞因子基因衍生物融合蛋白的优势为，酵母菌系统允许产生高质量成熟的细胞因子衍生物融合蛋白，并分泌到培养液中便于纯化。
酵母菌遗传工程的发展使外源基因可以在酵母菌中得到表达并分泌蛋白产品到细胞外。利用酵母菌表达分泌型蛋白的优点为，但不局限于，高表达产量，蛋白质为可溶性，正确的折叠和易于大规模生产和纯化。
细胞因子基因衍生物融合蛋白，既rhsa/cfa，可经由白蛋白天然信号肽分泌到酵母菌培养液中。含有人血清白蛋白融合蛋白的多肽可由信号肽主导并通过分泌途径而得到加工。在一首选实例中，人血清白蛋白的前导肽序列使细胞因子基因衍生物融合蛋白分泌到酵母菌外的培养基中。其它分泌肽，如天然的酿酒酵母的α-因子分泌信号肽，也可用于分泌本发明中的融合蛋白。
酵母表达的白蛋白是可溶性的并且显示出与血浆中分离的白蛋白有相同的二硫健结构。当作为药物使用时，白蛋白的用量为克级，因而重组白蛋白须与天然的白蛋白结构一致。由酵母分泌到培养液中的rhsa/cfa是通过与白蛋白表达一致的途径来加工的，并避免了由酵母细胞抽提物中分离纯化蛋白的难题，因为未被分泌的融合蛋白是不能体外通过复性的方法获得二级结构正确的可溶性融合蛋白，而且酵母细胞是难于裂解的。另外，被分泌出的蛋白质纯度也易于提高，因为由酵母分泌出的蛋白仅占全部酵母蛋白的0.5-1％，而且酵母无毒性蛋白伴随，特别是没有内毒素、无热源等。
优选实例为，应用巴斯德毕赤酵母菌系统来表达本发明中提及的白蛋白-细胞因子基因衍生物融合蛋白。利用毕氏酵母菌来表达hsa、hsa融合蛋白或细胞因子衍生物优于利用其它表达系统。毕氏酵母菌具有许多高等真核细胞表达系统所具有的优点，例如蛋白质的加工和折叠，转录后的修饰以及如同培养细菌或酿酒酵母一样的易于大规模培养。其与其它系统如杆状病毒、哺乳动物细胞培养相比更具有简捷、快速表达和产量更高的优点。毕氏酵母还有另外一个优势是可以10-100倍高的异源蛋白表达。这些特性使得毕氏酵母变成十分有力的蛋白表达系统。
由于毕氏酵母与酿酒酵母的相关性，许多由酿酒酵母研究发展出的方法和技术均可用于毕氏酵母，包括转化、基因插入、基因取代。更进一步的在酿酒酵母上发展出的遗传专用术语，也可用于毕氏酵母菌。如，组氨酸脱氢酶、在酿酒酵母和毕氏酵母中均是由his4基因编码的。毕氏酵母作为甲醇利用酵母能够以甲醇为单一碳源进行代谢。其过程为：首先甲醇的代谢是用乙醇氧化酶将分子氧加到甲醇分子上使甲醇氧化，变为甲醛。这一反应形成过氧化氢。为了避免过氧化氢的毒性。甲醇代谢发生在一个特殊的细胞组织中，叫做过氧质体。其可将过氧化氢的毒性与细胞其它部分隔绝。乙醇氧化酶与氧的亲和性极差，使得毕氏酵母菌为了代谢的进行而大量生产乙醇氧化酶(aox)，调控乙醇氧化酶生产的启动子被用来驱动外源蛋白(如hsa、hsa融合蛋白或细胞因子基因衍生物)在毕氏酵母菌中的表达。
毕氏酵母菌与酿酒酵母菌相比，毕氏酵母菌在对分泌的蛋白质进行糖基化的程度上有着更大的优点。即：毕氏酵母不会有过度糖基化现象。酿酒酵母和毕氏酵母均有n-连接的糖基甘露糖修饰。然而寡糖化物链加在表达的蛋白上，在毕氏酵母菌中只有8-14个糖基，而远短于在酿酒酵母中的50-150甘露糖链。在毕氏酵母菌中连接糖基化较少发生。酿酒酵母的核心糖化带有α-1，3连接末端物。而在毕氏酵母菌则没有。研究表明由酿酒酵母产生的糖基化蛋白具有较强的抗原反应，而使得这些蛋白不适于用在特别是治疗目的上的使用。当然也表明这又减少了一个对毕氏酵母菌用来表达蛋白在糖基化修饰是否过量问题上的担忧。
watanabe等(pharmres.dec：18(12)：1775，2001)描述了一种省时的纯化方法获得的由毕氏酵母表达的人血清白蛋白在生物体内外的特性。kobayashi等(therapher，nov：2(4)：257-62.1998)讨论了重组人血清白蛋白的研究进展。
利用毕氏酵母做为表达系统有许多试剂盒可以使用。如invitrogen的易选easyselecttm毕氏酵母表达试盒。表达载体上有一个aox1启动子可以使外源基因在毕氏酵母中利用甲醇来诱导表达。同时还有一个抗生素卓霉素(zeocin)抗性基因，可做为选择重组子的标记。在毕氏酵母系统中，aox1基因启动子是十分强劲的启动子，特别是在毕氏酵母菌中。在毕氏酵母里共编码两种乙醇氧化酶，aox1和aox2。aox1负责在细胞中产生合成巨量的乙醇氧化酶(aox1)活性。aox1基因的表达受到紧密控制并由甲醇诱导而达到极高的水平。典型地当用甲醇作为唯一碳源时，在所有的可溶性蛋白中aox1基因的产物就达30％。aox1基因已分离得到。aox1基因启动子也用于本发明的载体质粒中用以驱动编码有目的基因的表达。而aox2和aox1基因有97％的同源性。在甲醇中的生长速度比aox1基因为慢。这种缓慢生长状态，可以分离到mut+(aox1)株。除了aox1基因启动子外，在酵母菌中其它启动子也可用于起动hsa融合蛋白的表达。这些启动子包括，但不局限于pgk1、gapdh、gal1、gal10、cyc1、ph05、trp1、adh1或adh2基因启动子。
表达载体含有编码细胞因子衍生物融合蛋白的核苷酸。按invitrogen试剂盒所描述的方法转化酵母菌。经过抗性选择出转化的酵母菌菌落，将这些表达目标细胞因子基因衍生物融合蛋白的细胞接种于适当的选择性培养基中，然后分析这些酵母菌表达分泌细胞因子基因衍生物融合蛋白于培养基中的能力。蛋白质的收获可在细胞连续培养中进行，或在批量培养结束后一并收获。本发明所述的细胞因子基因衍生物融合蛋白经培养的酵母菌表达后，以能维持蛋白活性，药物活性的蛋白提纯方法来加以分离纯化。
在此还需提及的是，其它表达系统也可用于本发明中所提到重组蛋白和细胞因子基因衍生物融合蛋白的表达；包括，但不局限于细菌、枯草杆菌(b.subtitis)、酿酒酵母(s.cerevisiae)、克鲁维酵母菌属(kluyveromyces)、念珠菌属(candida)，汉逊酵母属(hansenula)、孢圆酵母属(tourlaspora)、裂殖酵母属(schizosaromyces)、固囊酵母属(citeromyces)、pachysoler，德巴利酵母属(debaromyces)、梅奇酵母属(metschumikowia)、红冬孢属(rhodosporidium)、无色担子孢子属(leucosporiduum)、葡状子囊菌属(botryoascus)、锁掷酵母属(sporidiobolcus)、拟内孢霉属(endomyucopsis)、动物、植物和昆虫细胞等。
本发明创造的重组人血清白蛋白/细胞因子基因衍生物融合蛋白(rhsa/cfa)表达酵母工程菌，在1000l发酵罐中的表达量不低于5g/l，纯化后的纯度可达99％。这株表达rhsa/cfa的重组巴斯德毕赤酵母工程菌(菌种株代码：9219)，已保藏在中国科学院微生物所中国微生物菌种保藏管理委员会(cgmcc)，其cgmcc保藏号为：16761，作为本发明中的rhsa/cfa(菌种株代码：9219)制备用基因工程巴斯德毕赤酵母菌菌种的代表作。
3.细胞因子基因衍生物融合蛋白的组合治疗应用
在本发明中，白蛋白的血浆转运功能和细胞因子基因衍生物的治疗功能因蛋白发生融合而得到整合。当在血液中循环时，由于与白蛋白融合而赋予细胞因子基因衍生物一个抵抗蛋白酶降解的超级稳定性，结果大大延长了细胞因子基因衍生物在血液中的半衰期。由于大量白蛋白的存在，不同的细胞因子基因衍生物与白蛋白形成融合蛋白，经组合应用后可以减少并形成较小的生物学功能上的相互干扰现象。这种干扰现象常出现在“细胞因子基因衍生物单体”之间的组合。进一步来说，一个与白蛋白融合的细胞因子基因衍生物可以在血液系统中停留相当长的一段时间而得到缓慢释放，因而减低了在常规方法下，单独使用大剂量单一细胞因子基因衍生物时，带来的急性反应，细胞风暴、毒性及副作用。这种细胞因子衍生物融合蛋白的缓慢释放作用形式，以本发明中的使用剂量大大减少，注射次数大大减少，而更进一步降低单独使用细胞因子基因衍生物是大量产生的严重毒副反应。特别是需对乙肝病人实施大剂量，长周期治疗时，这种组合式使用，在抑制病毒的复制和刺激肝细胞恢复上是十分有用的。细胞因子基因衍生物在人体中的半衰期仅1.5-2.5小时，乙肝病人忍受高剂量的重组细胞因子基因衍生物多次反复注射，长年的注射也给病人带来极大的损害和不便。根据本发明，人血清白蛋白与细胞因子基因衍生物形成融合蛋白后，可在进入体内后因缓慢释放细胞因子基因衍生物，半衰期长达60-80小时，而减少上述临床应用的局限性。另外，这样的融合蛋白可以与相对大量的使用和与不同细胞因子基因衍生物组合应用，可进一步减轻直接注射细胞因子基因衍生物进入体内导致的中枢神经系统强烈不良反应。
已知，贮存“裸露”的细胞因子基因衍生物(例如细胞因子不与另一种蛋白如白蛋白融合)是相当不稳定的，在血液中的血浆半衰期较短(1.5-2.5小时)。十分清楚地是，治疗性蛋白质的弱稳定性是它的一大缺陷。事实上，重复注射蛋白产品或由灌注点滴法给药来达到药物的有效强度对病人来讲是十分昂贵和不便的。由于血浆半衰期和稳定性的提高，本发明的rhsa/cfa和其它药物的组合应用，例如重组细胞因子基因衍生物融合蛋白与干扰素α融合蛋白、与白介素-2(rhil-2)融合蛋白的组合也能用于刺激人血浆产生多种抗病毒多肽。
在本发明中，细胞因子衍生物融合蛋白可与细胞因子衍生物组合用于病毒感染的患者可即刻刺激抗病毒多肽的分泌。例如，癌症患者可在病毒感染前或感染后注射细胞因子基因衍生物融合蛋白和细胞因子衍生物γ融合蛋白的组合以避免细胞和器官的损害。细胞因子基因衍生物融合蛋白(ifnα衍生物)能抵抗病毒而细胞因子基因衍生物γ(ifnγ衍生物)融合蛋白能共同和增效抑制癌细胞的增殖。
另一方面，细胞因子基因衍生物融合蛋白也能与不同的细胞因子基因衍生物融合蛋白先后顺序或同时使用于患者，这种组合治疗方式有协同效应。方法是给予患者含有第一种细胞因子基因衍生物融合蛋白的药物可接受的制剂有效剂量，再给予患者含有第二种细胞因子基因衍生物的药物可接受的制剂有效剂量，这样的组合治疗方式具有协同效应，并具优于单独使用所能好的的功能和临床上的治疗效果。
例如可先给予患者细胞因子基因衍生物融合蛋白，然后给予有效治疗剂量和比例的细胞因子衍生物蛋白、来自白介素-2的细胞因子基因衍生物/或重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白(rhsa/il-2)组合应用，可抑制不同癌细胞的增生，并诱导抗病毒多肽的分泌，通过机体免疫力。
细胞因子衍生物融合蛋白和它们的组合可用于治疗各种疾病，包括但不局限于病毒感染，如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、人乳头状瘤病毒、sars以及或爱滋病毒感染、尖锐湿疣、肿瘤、癌症、肾衰竭、组织或器官移植等。
附图说明
图1.基因工程构建的毕赤酵母工程菌，在500l发酵罐中规模化生产rhsa/cfa。取发酵46.5小时和72小时时的发酵上清液30μl，直接在reducing(r)和non-reducing(n)条件下做sds-page(分离胶浓度为12.5％)的电泳胶图。结果显示发酵液中的rhsa/cfa蛋白(箭头所示)的表达水平在5g/l以上。泳道mk；蛋白质标准分子量(由上至下：97.4kd，66.2kd，43.0kd，31.0kd，20.1kd，14.4kd)；r泳道46.5h：诱导表达46.5小时发酵上清液中的还原rhsa/cfa，分子量～85.6kd；r泳道72h：诱导表达72小时的还原rhsa/cfa，分子量～85.6kd；n泳道46.5h：诱导表达46.5小时的非还原rhsa/cfa，分子量～85.6kd；n泳道72h：诱导表达72小时上清液中的非还原rhsa/cfa，分子量～85.6kd；泳道mk：自制mk(分子量由上至下：83kd，66kd))。sds-page分为no-reducing(非还原)sds-page和reducing(还原)sds-page，均是变性条件下的电泳。还原和非还原sds-page的区别是在样品处理时加或不加还原剂(如dtt或2-巯基乙醇等)。
图2.左侧是精纯的non-reducing条件下rhsa/cfa原液蛋白质、中间是mk蛋白质标准分子量(由上至下：97.4kd，66.2kd，43.0kd，31.0kd，20.1kd，14.4kd)和右侧是reducing条件下的rhsa/cfa原液蛋白质电泳图(sds-page)，蛋白质纯度达98％以上。
图3.蛋白免疫印迹检测实验。抗体为鼠-抗人血清白蛋白单克隆抗体(sigmacat#a6684)泳道1.标准分子量()；泳道2.表达三天后的rhsa/cfa酵母上清液10μl；泳道3.表达三天后的rhsa/ifnα2b酵母上清液10μl；泳道4.重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白(rhsa/gcsf，分子量：87.5kd)和重组人血清白蛋白(rhsa，分子量：66kd).
图4.高效液相法(sec-hplc)分析精纯的rhsa/cfa原液，蛋白质纯度达97.645％。
图5.rhsa/cfa质谱分子量测定质谱图；测定分子量与理论分子量之间差异小于应该氨基酸的分子量。
图6.全柱成像毛细管等电聚焦电泳法(wcid-cief)等电点法测定rhsa/cfa电荷异构体组成。
图7.细胞因子基因衍生物蛋白(a)与重组人血清白蛋白/细胞因子基因衍生物融合蛋白(b)在动物体内的血液中存留时间比较。a)0-24小时，使用试剂盒自带标准品(hifnα)，蛋白含量计算单位为pg/ml，左侧纵坐标；b)1-14天，以rhsa/ifnα2b作为内控标准品，蛋白含量计算单位为ng/ml，右侧纵坐标。
具体实施例
实施例1：人血清白蛋白(hsa)基因与人细胞因子基因衍生物融合蛋白的表达载体质粒的构建
1).以来自天津溥瀛生物技术有限公司的pyz-hsa的dna载体质粒为模板(其含有下列人血清白蛋白基因的dna序列)，作为将人细胞因子基因衍生物蛋白质基因融合到人血清白蛋白成熟肽的c末端的转染用克隆质粒载体。
hsa基因dna序列(genebank注册号：ay728024)：
人血清白蛋白(hsa)成熟肽氨基酸序列(genebank注册号：ay728024)：
2).细胞因子基因衍生物(hcfa)基因的dna序列合成
采用dna全序列合成法来人工合成人细胞因子基因衍生物成熟肽的核苷酸序列(uspto：us7,625,555)(由北京擎科新业生物技术有限公司合成)。分别在其n端加上hsa特有的bsu36i酶切位点及hsa的c末端氨基酸编码序列，在人细胞因子基因衍生物的c端外加上noti和xhoi酶切位点。
细胞因子基因衍生物成熟肽基因用于直接连接到hsa的c末端人工合成的dna序列：
其下划线为可编码us7,625,555所公开的细胞因子基因衍生物成熟肽的dna序列。
3).人血清白蛋白与人细胞因子基因衍生物基因直接连接(directly-link)过程
用bsu36i和noti两个酶分别酶切合成的目的基因人细胞因子基因衍生物基因和pyz-hsa重组质粒载体连接：具体步骤：将双酶切后的目的基因人细胞因子基因衍生物基因与pyz-hsa重组质粒按一定比例混合，并加入连接buffer和连接酶，22℃连接1小时；连接产物转化dh5α感受态细胞，具体步骤：将连接产物加入dh5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃热激90秒，再冰浴2分钟，加入培养基置于摇床中，150rpm，45分钟，12000rpm离心1分钟，涂板。测序验证，具体步骤：挑取单克隆，扩大培养，小量提取质粒，酶切鉴定，挑选出酶切得到与目的片段大小一致的质粒，并进行测序确认，将最终测序确认的质粒命名为pyz-hsa/cfa(代码：9219)。
rhsa/cfa核苷酸dna序列(seqidno.2)：
下划线为编码细胞因子基因衍生物成熟肽核苷酸序列。
rhsa/cfa成熟肽氨基酸序列(seqidno.1)：
下划线为细胞因子基因衍生物(hcfa)成熟肽氨基酸序列(与us7,625,555所公开的人细胞因子基因衍生物成熟肽的氨基酸序列同)。
实施例2：毕赤酵母表达工程菌的转化和制备
将毕氏酵母菌菌株x33菌落接种于含5mlypd培养液的50ml离心管中，以250转/分的速度于30℃下培养过夜。次日取0.2ml过夜培养物再转接入500mlypd的培养液中，置于2升的三角培养瓶中。在30℃下旋转培养2-3小时，使细胞密度达到od600＝1.3-1.5。酵母菌经离心方法收集，再重悬于500ml冰预冷的无菌水中洗涤两次。然后酵母菌悬于20ml冰预冷的1msortbitol溶液洗涤一次。
将实施例1构建的pyz-hsa/cfa质粒dna经pmei限制性内切酶处理后，形成线性质粒分子。取5μg线性化后质粒dna与80μl处理后的酵母菌相混合并置于0.2厘米厚的电极杯内，置于电转仪上。电脉冲条件为电压7500v/cm，电极间隔时间为5-10(ms)。电击处理后，立即加入1ml冰预冷的1msorbitol溶液于酵母菌中，然后转入15ml试管中。转化的酵母菌置于30℃培养箱中放置2小时，然后接种涂布在含zeocin抗生素的ypd平板培养基上。经抗性选择而生长出的克隆，再用分子生物学方法鉴定其基因的插入。蛋白质的表达与分泌则以sds-page或用特异抗体做蛋白质免疫印迹检测(见图2)。
实施例3：重组酵母工程菌的筛选
将数个含有待表达基因的酵母菌落分别在含有zeocin抗生素，具有缓冲能力及甘油的基本培养液中培养。以300转/分的速度培养至菌体密度达到od600＝2-6。培养物经1500转/分，15分钟条件下离心收集菌体，菌体再重悬于同种基本培养液但不含甘油，改含0.5％甲醇，细胞密度达到od600＝1.0，继续培养。酵母菌在甲醇的诱导下，外源蛋白在启动子的作用下开始表达。其后，每24小时加入100％甲醇至最终浓度为0.5％。在不同的时间点分别收集培养上清液。使用sds-page变性聚丙烯酰胺凝胶电泳初步测定rhsa/cfa的表达，筛选表达目的特异蛋白质的重组酵母工程菌株。筛选所获得的rhsa/cfa表达重组酵母菌(菌种主代码：9219)，已保藏在中国科学院微生物所中国微生物菌种保藏管理委员会(cgmcc)获得保藏号：16761，作为本发明中的rhsa/cfa融合蛋白的代表作。
实施例4：大规模高密度发酵表达和制备rhsa/cfa融合蛋白
本发明使用500l-1000l(吨级)生物发酵罐系统开展了rhsa/cfa融合蛋白的吨级规模化生产和发酵工艺，以及百克及和公斤级rhsa/cfa蛋白的制备工艺和技术建立。重组酵母工程菌按研发的工艺程序制备工程菌种子库。取一支工程菌种子库接种到三角瓶中，从小规模摇床培养开始，然后扩增到一级种子罐、二级种子罐，进入生产发酵罐(0.5或1吨罐体积)。经培养至罐内甘油消耗尽，溶氧随之回至底限再回升时，启动甘油流加。待流加结束，溶氧再回升时，启动甲醇流加，进入诱导和重组蛋白生产阶段，维持72小时甲醇流加。可在不同培养时间点取样测试重组蛋白的表达。对于分泌型蛋白在细胞内及培养液中的含量均用sds-page方法进行分析，表达水平和纯度在每一步中均进行监测。图1为基因工程构建的毕赤酵母工程菌，在500l发酵罐中规模化生产rhsa/cfa的结果。取发酵46.5小时和72小时时的发酵上清液30μl，直接在reducing(r)和non-reducing(n)条件下做sds-page(分离胶浓度为12.5％)的电泳胶图。结果显示发酵液中的rhsa/cfa蛋白(箭头所示)的表达水平在5g/l以上。附图1的泳道mk：蛋白质标准分子量(由上至下：97.4kd，66.2kd，43.0kd，31.0kd，20.1kd，14.4kd)；r泳道46.5h：诱导表达46.5小时发酵上清液中的还原rhsa/cfa，分子量～85.6kd；r泳道72h：诱导表达72小时的还原rhsa/cfa，分子量～85.6kd；n泳道46.5h：诱导表达46.5小时的非还原rhsa/cfa，分子量～85.6kd；n泳道72h：诱导表达72小时上清液中的非还原rhsa/cfa，分子量～85.6kd；泳道mk：自制mk(分子量由上至下：83kd，66kd))。sds-page分为no-reducing(非还原)sds-page和reducing(还原)sds-page，均是变性条件下的电泳。还原和非还原sds-page的区别是在样品处理时加或不加还原剂(如dtt或2-巯基乙醇等)。
实施例5：酵母菌分泌rhsa/cfa的分离纯化方法及定性
发酵液经离心法将菌体与上清液分离，收集上清液直接经不同的gehealthycare公司生产的分离介质capto-mmc和介质填料phenyle-sepharosetmhighperformance以及sephacryls-200highresolution的3级分离、富集和纯化后，获得纯度至97％以上的原液(宿主蛋白残留量则在0.05％以下)，符合作为原料药生产注射用rhsa/cfa(冻干粉针剂)或rhsa/cfa注射液(西林瓶水针剂或预充式水针剂)的原料药(原液)，用于制备可用于临床前动物试验和临床试验研究用途。
附图2为精纯的rhsa/cfa原液，non-reducing、mk蛋白质标准分子量(由上至下：97.4kd，66.2kd，43.0kd，31.0kd，20.1kd，14.4kd)和reducing的rhsa/cfa电泳图(sds-page)，结果显示纯度达98％以上。
鼠抗人血清白蛋白的单克隆抗体(sigma，cat#6684)用于蛋白质免疫印迹实验确定表达的蛋白质为与人血清白蛋白形成的融合蛋白。典型的蛋白质免疫印迹实验是将sds-pag凝胶电泳分离的蛋白质电泳转移到尼龙或硝酸纤维膜上，与特异抗体(第一抗体)温育，然后加抗第一抗体的抗体(第二抗体)与第一抗体结合。因为第二抗体是经荧光标记的，整个特异性结合的复合物经x光胶片曝光后会留下印记。标准蛋白分子量用于决定未知蛋白的分子量。图3表示酵母菌表达的rhsa/cfa并且与来源于人血清白蛋白的抗原相同，其分子量与理论分子量相符。
利用免疫印记技术检测，确认使用兔抗人干扰素α抗体(多抗)rhsa/cfa或rhsa/ifnα2b有显著的抗原抗体免疫反应(westernblotting)。
实施例6：高效液相色谱法(hplc)分析rhsa/cfa
使用岛津lc-10avpplus高效液相色谱仪，色谱柱：tosoh公司tsk-gelg2000swxl7.8×300mm柱。以50mmpb-0.1mnacl缓冲液，ph7.0为流动相，流速：0.8ml/min，检测波长：280nm。经上述程序建立的优化分离纯化工艺，获得了纯度为97.645％的rhsa/cfa融合蛋白(见图4)，目的蛋白相关蛋白含量(聚合体和目的蛋白降解物)则约3％左右。
实施例7：rhsa/cfa质谱分子量测定
1.实验方法
(1)样品前处理方法
完整分子量测定：供试品溶液用原液5mg/ml，进样4μl(上样量20μg)进行分析；系统适应性样品用纯化水稀释至2mg/ml，混匀，进样5μl(上样量10μg)进行分析。
(2)uplc方法参数
流动相a为0.1％fa水溶液，流动相b为0.1％fa乙腈溶液。色谱柱为nano-microunips3-300column，3μm，2.1mmx50mm，[partnr.ups03300]。设置柱温箱温度80℃，样品室温度4℃，流速设置为0.2ml/min。
(3)质谱方法参数
样品经色谱柱脱盐后用ltqorbitrapxl质谱仪(thermoscientific)进行检测扫描质谱分析。分析时长：6min，检测方式：正离子模式，扫描范围：800-3500m/z，质谱分辨率(fullms)：7500。
(4)数据分析参数
lcms结果在biopharmafinder(version3.0)软件上进行质谱去卷积分析。
2.实验结论
系统适应性样品avastin的理论分子量为：149197.20，测得值为：149197.11与理论值误差为：0.6ppm，小于10ppm，系统适应性结果符合检测要求。在此条件下测得的rhsa/cfa注射液质谱分析数据经去卷积后的平均分子量为：85729.94da与理论值误差为：8.3ppm。这与rhsa/cfa成熟肽氨基酸序列的含二硫键理论分子量85730.65da比仅有0.7da的差异；与核苷酸序列转化为蛋白质序列的理论分子量85769.63da相比，则也仅有39.69da的差异，远小于最小氨基酸的分子量(甘氨酸：75da)。结果显示二者都已非常接近理论值(见图5)。
实施例8：全柱成像毛细管等电聚焦电泳法(wcid-cief)等电点法测定rhsa/cfa电荷异构体组成
全柱成像毛细管等电聚焦电泳法(wcid-cief)是将样品与两性电解质及标准的pimarker混合，同时在毛细管中电泳聚焦，根据内标聚焦的保留时，合成线性回归曲线，将样品的聚焦保留时带入线性回归曲线计算出其等电点。取50μl样品进行脱盐处理，置换到5mmnah2po4(ph＝6.5)，12000rpm，4℃，10min，置换10000倍。配置mastermix待测样品：混合以下溶液280μl3murea-ciefgel、16μl两性电解质、40μlcathodicstabilizer、4μlanodicstabilizer和pimarker4μl每种，取89μlmastermix加入5μl样品，加水补足至100μl上样。cief方法基本参数：毛细管温度：20℃；样品温度：10℃；电流最大：20μa；peakdetectparameters：threshold：2，peakwidth：9；uv：280nm，daterate：2hz；filter：normal；peakwidth(points)：16-25。全柱成像毛细管等电聚焦电泳法(wcid-cief)等电点法测定rhsa/cfa电荷异构体组成分析结果显示，其具有多个不同具等电点的电荷异构体存在，并分布在pi5.8-6.3范围内，该图形可以作为本制品的鉴别目的或用于产品批次间差异比较(见附图6)。
实施例9：rhsa/cfa对病毒攻击细胞的体外生物活性功能测定
rhsa/cfa中，只有人细胞因子基因衍生物(实际是人干扰素衍生物)才具有抗病毒的特异生物活性功能。细胞因子基因衍生物因此和干扰素一样，可保护人胎儿羊膜wish细胞抵抗疱疹性口炎病毒(vsv)诱导引起的细胞病变程度来确定生物活性单位(rubinstein等，1981，j.virol.37，755-758)。wish细胞(2.5-3.5×105细胞/孔)预先置于96孔板中(100μl/孔)，以中检院重组干扰素α国家标准品(批号：270004-201301，规格：4.27×105/支)作为对照，与二倍梯度稀释的重组人干扰素α2b(rhifnα2b)，重组人血清白蛋白/干扰素α2b融合蛋白(rhsa/ifnα2b)或重组人血清白蛋白/细胞因子基因衍生物衍生物(rhsa/cfa)一起在37℃下温育18小时。在elisa板内测定结晶紫染色的细胞的吸收值，以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。可确定wish细胞的活性。计算方法：
式中pr为标准生物学活性，iu/ml；
ds为供试品预稀释倍数；
dr为标准品预稀释倍数；
es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
er为标准品半效稀释倍数。
样品中的细胞因子基因衍生物或干扰素α的含量与使与标准品曲线相比较，可以计算出样品中的细胞因子基因衍生物含量及生物比活性值。计算方法参照“第二版国际标准制备(who，67/343)。以中检院重组干扰素α国家标准品(批号：270004-201202，规格：3.87×105/支)作为对照，确定待测样品和或血样中的rhsa/cfa融合蛋白生物活性值。
由于人血清白蛋白/细胞因子基因衍生物融合蛋白的分子量(85.8kd)，约是细胞因子基因衍生物(19kd)的4倍，如果按分子量比例计，rhsa/cfa与人细胞因子基因衍生物的生物活性比值应该有4倍差异，但如以分子摩尔数计，则都应具有相同的生物学功能。测定结果表明，重组干扰素α2b(rhifnα2b)的生物比活性值为：1.3x108iu/mg，rhsa/cfa的生物比活性值约为：3.25x106iu/mg；rhsa/ifnα2b(重组人血清白蛋白/干扰素α2b融合蛋白)的生物活性比值为：3.1x105iu/mg。这表明在细胞水平抗病毒能力，rhsa/cfa与rhifnα2b相比，生物活性差距没有400倍，仅约40倍。rhsa/cfa与rhsa/ifnα2b相比较，生物比活性则又要显著地高10倍以上。这些结果基本对应了文献表明的细胞因子基因衍生物单体与rhifnα2b单体开展细胞水平的生物活性时，测定前者优于后者，二者间有近11-15倍差距(见中国发明专利：cn101475636b)。文献还表明rhsa/ifnα融合蛋白的体外细胞水平的生物比活性值与rhifnα单体的生物比活性差值为1/400以上(富岩等，中国医药生物技术，6(2)：84-95，2011)。这表明由细胞因子基因衍生物或干扰素与白蛋白形成融合蛋白后，作为完整的，体积更大的融合蛋白质(85.7kd)，会阻碍和降低了融合蛋白中有生物活性功能的细胞因子基因衍生物(或干扰素α)与wish细胞表面的受体相结合的机会和结合的能力。这符合细胞因子基因衍生物和干扰素α与受体相结合的生物学功能部位是处于n端，当n端与白蛋白的c末端直接连接后，白蛋白c端氨基酸链影响了细胞因子基因衍生物或干扰素的功能部位结合的机会和结合能力。新发明的rhsa/cfa比rhsa/ifnα2b具有更强的抗病毒能力，这是作为常规的对融合蛋白的理解所意想不到的。
实施例10：酶联免疫试剂盒用于分析rhsa/cfa和rhsa/ifnα蛋白的免疫特异性和血清中的血药浓度
应用酶联免疫分析(elisa)测定未知样品中细胞因子基因衍生物的活性并与已知生物活性的干扰素α标准品进行比较测定是一种常规方法。ebiosciences或chemicon公司出品的干扰素α的elisa试剂盒是双抗体夹心方法。因此当样品中细胞因子基因衍生物或干扰素α浓度增加时，被抗体捕获的偶联的量增加。用streptavidin碱性磷酸酶偶联的底物反应分析可定量分析，样品中的细胞因子基因衍生物或干扰素α的含量与使与标准品(已知含量/浓度)曲线相比较，可以计算出样品中的细胞因子基因衍生物含量和浓度。
结果表明，重组人血清白蛋白/细胞因子基因衍生物融合蛋白(rhsa/cfa)、重组人血清白蛋白/干扰素α2b融合蛋白(rhsa/ifnα2b)与重组人血清白蛋白/干扰素α2a融合蛋白(rhsa/ifnα2a)都可与市售试剂盒中包被的特异抗体相结合。当以rhsa/cfa的连续稀释样品作为标准品，按不同稀释度的检测平均值看，三个融合蛋白与抗体的结合能力相同(见表1)。elisa试剂盒测定结果还显示，融合蛋白与包被在试剂盒上的抗体结合能力，均是100倍的低于单体的重组干扰素α2b或细胞因子基因衍生物蛋白。这个现象也显示出大分子融合蛋白中的功能性蛋白质与包被的抗体相结合后，产生了显著的位阻效应(白蛋白阻止)。当样品中rhsa/cfa融合蛋白的浓度过高时，则检测灵敏度下降，这是应为细胞因子衍生物融合蛋白分子太大，阻止cfa蛋白抗体有效地与融合蛋白中的cfa结合，因此使得分析的灵敏度降低，不以蛋白含量为线性梯度。但当以rhsa/cfa为参比标准时，则具有线性梯度，可用于检测待测样品中的rhsa/cfa含量(动物或人血液中的血药浓度检测)。
实施例11：在正常人血清中rhsa/cfa的生物活性稳定性测定
以rhsa/cfa和人干扰素α2b(细胞因子基因衍生物)为例，对细胞因子衍生物蛋白在37℃和50℃条件下，在人正常人血清中，在不同时间点进行稳定性测定。取100μg细菌表达的重组人干扰素α2b加入300μg重组人血清白蛋白混合物作为对照组。取400μg重组人血清白蛋白/细胞因子基因衍生物融合蛋白(rhsa/cfa)融合蛋白，置于含有500微升正常人血清中分装在200微升薄壁pcr试管中，试管封好置于pcr仪。设置规定的温度，持续保温。在不同时间点取出样品，立即置于-80℃保存。待全部时间点的样品收集后，按标准操作规程以病毒感染wish细胞系进行生物活性测定，并设立活性标准品实验。结果表明，“裸露”细胞因子基因衍生物虽然也含有重组人血清白蛋白，但在37℃下6小时丧失全部生物活性；而细胞因子基因衍生物融合蛋白则在37℃下24小时后，细胞因子衍生物的生物活性没有任何变化，甚至其抗病毒活性在7天后仍保持原有的生物活性的80％以上。在50℃下条件下，“裸露”的细胞因子基因衍生物则在6小时就完全失去了生物活性；而重组人血清白蛋白/细胞因子基因衍生物融合蛋白的生物活性在7天后保持原有的生物活性的50％以上。结果显示重组人血清白蛋白/细胞因子基因衍生物融合蛋白的储存时间大大延长，对环境，如温度则有了意想不到的稳定性和低于环境的抗性。
实施例12：rhsa/cfa在大鼠血浆中的半衰期测定
测定了在大鼠血浆中重组人血清白蛋白/细胞因子基因衍生物和人细胞因子基因衍生物的半衰期。100μg/kg的重组人干扰素α2b(即rhcfa)，加300μg/kg来自重组酵母表达的人血清白蛋白(rhsa)混合液(总蛋白为400μg/kg剂量)作为阳性对照品，rhsa/cfa和rhsa/ifnα2b也是分别以400μg/kg剂量分别注射入大鼠体内，然后在不同时间分别采集血液样品(0.1ml)。每次给药体积为300μl。给药前1h，药后的2h、8h、24h、48h、72h、96h、120h、168h、240h取血。采用异氟烷吸入麻醉后，眼眶静脉丛取血，每只每次采血量约0.1ml。血样采集后转移入含edta的ep管一起离心，上清液置-80℃冰箱中保藏。
采用美国ebiosciences公司生产的humanifn-alphaplatinumelisa试剂盒开展血样的检测。细胞因子基因衍生物蛋白(a)与重组人血清白蛋白/细胞因子基因衍生物融合蛋白(b)在动物体内的血液中存留时间比较。a)0-24小时，使用试剂盒自带标准品(hifnα)，蛋白含量计算单位为pg/ml，左侧纵坐标；b)1-14天，以rhsa/ifnα2b作为内控标准品，蛋白含量计算单位为ng/ml，右侧纵坐标。
结果显示人细胞因子基因衍生物(人干扰素α2b)的血液半衰期为2.5-3.5h，而本发明的重组人血清白蛋白/细胞因子基因基因衍生物融合蛋白(rhsa/cfa)的血液半衰期则为60-80h(见图6)。半衰期值完全支持每2周给药一次，这个血液长半衰期的长效性结果是意想不到的结果。其与rhsa/ifnα2b的对数体内血液半衰期相近。rhsa/cfa的长半衰期结果，这正是来源于白蛋白在血液中的半衰期为20天，导致的与白蛋白融合在一起的细胞因子基因衍生物，在动物体内获得了缓慢释放(slowreleasing)。rhsa/cfa在动物体内显示出本发明获得了显著和意想不到的长代谢周期，即长血液半衰期产品。
实施例13：rhsa/cfa分别与rhsa/il-2、rhsa/ifnα2b、rhil-2或/和rhifnα2b的不同组合应用展示抗肿瘤细胞增值的协同增效功能
人肝癌细胞株hepg2作为典型肿瘤细胞培养在含10％bsa的1640培养液中，使用处于对数生长期的细胞经胰酶消化，计数和配制成4x105cells/ml浓度，取100μl细胞液接种到96孔板中，培养于37℃，5％co2培养箱过夜，然后分别接种3个不同浓度的rhsa/cfa、rhsa/il-2、rhsa/ifnα2b、rhil2、或rhifnα2b单体蛋白质，每个不同蛋白质浓度在接种时是要复孔接种。获得出一个较佳的某个特定蛋白质浓度，在抑制细胞生长为显著浓度结果后，才开展组合应用研究。不同蛋白质之间的组合，则分别选择rhsa/cfa+rhsa/ifnα2b、rhsa/cfa+rhsa/il-2、rhsa/cfa+rhil-2、rhsa/cfa+rhifnα2b、rhsa/ifnα2b+rhsa/il-2或rhil-2+rhifnα2b，也设细
结果显示，所有样品均具有一定的抗肿瘤细胞生长抑制能力，而组合应用则比单独应用要显著优于，至少可提高数倍。特别是rhsa/cfa+rhsa/il-2的组合应用，rhsa/cfa+rhsa/ifnα2b。可以确认含有rhsa/cfa的组合都优于单独使用融合蛋白或rhil-2、或rhifnα2b融合蛋白(见表2)。
本发明获得的一种蛋白质，一种融合蛋白具有意想不到的优于现有市售人细胞因子基因衍生物的功能和用途，该蛋白质展示出长效化后的细胞因子基因衍生物融合蛋白作为药物的具有更优的优势。这个结果也完全支持本发明生产工艺制备的rhsa/cfa作为药物，可以期待其能达到给药频次为每2周给药一次，大大优于每天给药一次的现有细胞因子基因衍生物的在临床治疗上的给药频次。
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