本发明涉及肺细胞的分离技术领域，尤其涉及一种肺泡ⅱ型细胞的分离方法。
背景技术：
由于空气污染和人类平均寿命的延长，呼吸系统疾病呈高发趋势，慢阻肺、肺癌等严重肺部疾病已成为国人健康的重大隐患之一。肺泡ii型细胞作为哺乳动物肺泡上皮的主要组成部分，其不但有合成和分泌肺泡表面活性物质以维持肺表面张力、调节水盐平衡维持肺环境渗透压、合成免疫效应物分子抵御有害抗原物质对肺部的侵袭作用，还作为肺部的干细胞，具有修复急/慢性肺损伤、迁移并转化形成肺泡ⅰ型细胞、维持肺部内稳态的重要功能，在受损肺上皮的修复中起着极其关键的作用。所以，肺泡ⅱ型细胞的原代培养、肺泡ⅱ型细胞向肺泡ⅰ型细胞分化的机制及相关模型的研究，成为揭示肺部疾病的发病机理及探寻防治途径的基础，具有重要的理论和实际意义。
早在1974年，就有报道啮齿类动物肺泡ⅱ型细胞的分离方法，然而，以往报道的实验方法中皆使用胰蛋白酶来消化肺组织块，低浓度的胰酶消化往往不能够让组织块充分解离，而高浓度胰酶消化对肺泡ⅱ型细胞损伤很大，以至于最终所获得的肺泡ⅱ型细胞要么是活率偏低，要么不容易贴壁。而且，由于肺部含有大量的毛细血管网，用胰酶消化所获得肺泡ⅱ型细胞悬液中往往混有大量的肺泡巨噬细胞、白细胞，不利于对肺泡ⅱ型细胞的进一步研究。
技术实现要素：
针对现有分离肺泡ⅱ型细胞过程中细胞间解离不充分、细胞损伤大以及获得的肺泡ⅱ型细胞中含有其它细胞等问题，本发明提供一种肺泡ⅱ型细胞的分离方法。
为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种肺泡ⅱ型细胞的分离方法，包括以下步骤：
a、取出肺组织，用灌注液灌洗；
b、用缓冲液清洗肺泡腔，注入含有ⅱ型胶原酶和弹性蛋白酶的消化液，消化15-20in；
c、将游离出来的肺叶剪成碎片，加入dna酶ⅰ和胎牛血清；
d、加入洗涤液，洗涤、过滤得到细胞悬液；
e、纯化肺泡ⅱ型细胞；
f、细胞培养基重悬肺泡ⅱ型细胞。
相对于现有技术，本发明提供的肺泡ⅱ型细胞的分离培养方法，在对肺细胞分离过程中，使用特异性消化细胞间胶原蛋白的三维螺旋结构而对肺上皮细胞无损害的ⅱ型胶原酶进行细胞间消化，降低对分离肺细胞的损伤，但ⅱ型胶原酶的消化效率较低，为了保证细胞的消化效率同时又不损伤细胞，本发明通过加入弹性蛋白酶来辅助ⅱ型胶原酶进行消化作用，弹性蛋白酶可以特异性消化细胞外间质中经过肽键结合、酰胺结合的和酯结合的蛋白质，弹性蛋白酶和ⅱ型胶原酶的结合使用，使肺细胞的消化更充分，分离出的肺细胞活性和存活率较高，同时弹性蛋白酶和ⅱ型胶原酶的结合使用可以大大减少分离出的肺细胞中巨噬细胞和白细胞的数量，提高肺泡ⅱ型细胞的纯度。本发明还通过红细胞裂解液和免疫磁珠反向筛选法纯化肺泡ⅱ型细胞，进一步提高肺泡ⅱ型细胞的纯度，且不会损伤肺泡ⅱ型细胞，最终得到高纯度和高活性的肺泡ⅱ型细胞。
优选地，所述步骤a中的灌注液包括：pbs溶液、edta-2na和egta，灌注液中edta-2na和egta的浓度均为0.2mm，清洗肺组织中的组织液及游离的巨噬细胞。
优选地，所述步骤a中的灌洗过程为：将灌注液的ph值调节至7.2，37℃预热，灌注液通过气管灌洗肺泡腔6-10次。
优选地，所述步骤b中的缓冲液为含有hepes和nahco3的rpmi1640培养基，缓冲液中hepes的浓度为25mm，nahco3的浓度为2g/l。hepes主要作用是防止溶液ph迅速变动，可以维持ph值在7左右，为细胞消化做准备。
优选地，所述步骤b中的消化液由ⅱ型胶原酶和弹性蛋白酶加入到步骤b中的缓冲液中得到，可对肺组织进行消化，得到游离的肺叶，而不损伤肺细胞。
优选地，所述步骤d中的洗涤液包括：pbs溶液、mgcl2·6h2o和cacl2·2h2o，洗涤液中mgcl2·6h2o和cacl2·2h2o浓度均为0.1g/l。
优选地，所述步骤d中的洗涤过程为：置于37℃摇床内，100-150r/min震荡洗涤1-3min；所述过滤是依次用150μm孔径尼龙膜、70μm孔径尼龙膜、40μm孔径尼龙膜和30μm孔径尼龙膜依次进行过滤，得到的滤液中包含大量的肺泡ⅱ型细胞。
优选地，步骤e中纯化肺泡ⅱ型细胞的具体过程为：对步骤d得到的细胞悬液进行离心沉淀细胞；用生理盐水对沉淀细胞进行重悬；加入红细胞裂解液，混匀，室温静置5min，离心去上清；免疫磁珠反向筛选纯化肺泡ⅱ型细胞。
优选地，所述红细胞裂解液为包含nh4cl、khco3和na4edta的溶液，红细胞裂解液可以裂解肺泡ⅱ型细胞重悬液中的少量红细胞。
优选地，所述步骤f中的细胞培养基以质量计包括90％dmem基础培养基、8％fbs、1％ps双抗和1％谷氨酰胺。
附图说明
图1是本发明原位树脂包埋-tem鉴定实施例1得到的大鼠肺泡ⅱ型细胞的电镜图(图1-a是将肺泡ⅱ型细胞放大5000倍的电镜图；图1-b是将肺泡ⅱ型细胞放大10000倍的电镜图；图1-c将图1-b的视野放大10倍后的电镜图)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种肺泡ⅱ型细胞的分离方法，包括以下步骤：
a、选取spf级成年雄性sd大鼠(河北省实验动物中心，许可证号scxk(冀)2017-1-003，合格证号1701172)，腹腔注射肝素400u，吸收10min；腹腔注射10％水合氯醛(0.35ml/100g)，对大鼠进行麻醉，将麻醉后的大鼠全身浸泡于75％酒精中，消毒5min后，移入无菌操作台，仰位固定于无菌白瓷盘内；切割大鼠颈部，暴露气管，并于气管底部穿引无菌缝合线，以15号luerstubadaptor做气管插管，并用缝合线结扎固定；于大鼠剑骨乳突处剪开皮肤、胸肌，暴露胸腔，横向拉开胸骨，暴露心脏和肺组织；确认肺动脉，在其下穿引无菌缝合线，于右心室插管(20号塑料导尿管)至肺动脉，结扎固定；用37℃预热的灌注液冲洗、灌注肺部，然后剪开大鼠左心耳，使灌注液流出；从大鼠胸腔内小心的剪开粘连的结缔组织，取出肺脏、气管以及心脏，放入盛有无菌生理盐水的培养皿内，修剪并抛弃心脏及多余的结缔、脂肪组织；将灌注液的ph值调节至7.2，用37℃预热的灌注液通过气管插管灌洗肺泡腔8次，每次10ml的灌注液，除去肺泡腔游离的巨噬细胞。其中灌注液包括：pbs溶液、edta-2na和egta，灌注液中edta-2na和egta的浓度均为0.2mm。
b、将缓冲液的ph值调节至7.4，用37℃预热的10ml的缓冲液，经气管插管清洗肺泡腔一次；肺泡腔内注满含有ⅱ型胶原酶和弹性蛋白酶的消化液，37℃消化15-20min。其中的缓冲液为含有hepes和nahco3的rpmi1640培养基，缓冲液中hepes的浓度为25mm，nahco3的浓度为2g/l；消化液由ⅱ型胶原酶和弹性蛋白酶加入到上述缓冲液中得到。
c、从气管远端进行解剖，将游离的肺叶剪成1cm3左右的组织块，随后将组织块移入50ml塑料离心管内，并向其中加入溶于缓冲液中的dna酶ⅰ和10ml的胎牛血清，用锋利的长柄眼科剪迅速将肺组织块剪成约2mm3的碎块儿。
d、步骤c中的液体连同肺组织碎块转移至新的50ml无菌离心管内，加入洗涤液补充管内液体体积至20ml后，全部转移至250ml无菌锥形瓶内，置于37℃空气摇床内，以130r/min的速度往复式震荡2min；依次用150μm孔径尼龙膜、70μm孔径尼龙膜、40μm孔径尼龙膜和30μm孔径尼龙膜进行过滤，得到的细胞悬液中包含大量的肺泡ⅱ型细胞。其中洗涤液包括pbs溶液、mgcl2·6h2o和cacl2·2h2o，洗涤液中mgcl2·6h2o和cacl2·2h2o浓度均为0.1g/l，使用前将洗涤液的ph值调节至7.2。
e、将上述过滤所得细胞悬液在室温条件下，300g，离心10min；得到的细胞沉淀用1ml生理盐水重悬，加入4mlph值调节至7.2的红细胞裂解液裂解红细胞，轻柔混匀，室温静置5min，400g离心去上清；用免疫磁珠(miltenyibiotec,130-048-501)反向筛选纯化肺泡ⅱ型细胞，与磁珠结合的细胞为巨噬细胞、白细胞，上清液中的细胞为肺泡ⅱ型细胞。其中的红细胞裂解液为包含nh4cl、khco3和na4edta的溶液，裂解液的ph值为7.2，红细胞裂解液可以裂解掉肺泡ⅱ型细胞重悬液中的少量红细胞。
f、用5ml细胞培养基重悬肺泡ⅱ型细胞，细胞培养基以质量计包括90％dmem基础培养基、8％fbs、1％ps双抗和1％谷氨酰胺。
实施例2
原位树脂包埋-tem鉴定大鼠肺泡ⅱ型细胞，具体步骤如下：
1)将纯化后的肺泡ⅱ型细胞，以1x106/ml的密度，接种于直径3cm的培养皿中，待细胞全部贴壁后，吸取培养液，用pbs溶液漂洗3次，每次5min；
2)加入2.5％戊二醛固定液，固定1h；
3)吸去固定液，pbs漂洗3次，每次5min；
4)加入1％四氧锇酸固定液，固定1h；
5)吸去固定液，pbs漂洗3次，每次5min；
6)分别浸入30％、50％、70％、80％、95％、100％、100％丙酮，逐级脱水；
7)环氧树脂原位包埋，超薄切片；
8)醋酸铀与柠檬酸铅染色后，电镜下观察并拍照分析，观察结果如图1所示，细胞呈圆形或立方形，细胞游离面可见到粗细不等、长短不一的微绒毛(图1-a中箭头所指部位)；细胞核明显，电子密度较高，细胞质中可见大小不一特征性嗜锇性板层小体(图1-b和图1-c中箭头所示部位)的分布以及线粒体、粗面内质网、高尔基体等细胞器，完全符合肺泡ⅱ型细胞的特性。
对比例1
步骤b中用缓冲液清洗肺泡腔后，注入含有ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶的消化液，消化15-20in，其它步骤与实施例1相同。
对比例2
步骤b中用缓冲液清洗肺泡腔后，注入含有胰蛋白酶和弹性蛋白酶的消化液，消化15-20in，其它步骤与实施例1相同。
用台盼蓝法对实施例1和对比例1-2得到的肺泡ⅱ型细胞的数量和活力分别进行鉴定，鉴定方法具体为：分别取20μl纯化后的细胞悬液及20μl2％台盼蓝染液，充分混匀后，室温静置3min；取上述混合液，滴于玻璃细胞计数板，加盖玻片，于1min内计数100个细胞，并统计活(不被染色的细胞)、死(染成蓝色的细胞)细胞数目。经检测，实施例1中鼠全肺可得肺泡ⅱ型细胞4.23×106个，台盼蓝检测结果显示纯化后的细胞活力达到94.28％；对比例1中鼠全肺可得肺泡ⅱ型细胞8.19×105个，台盼蓝检测结果显示纯化后的细胞活力为70.35％；对比例2中鼠全肺可得肺泡ⅱ型细胞1.11×106个，台盼蓝检测结果显示纯化后的细胞活力为61.47％。
用碱性磷酸酶法检测实施例1和对比例1-2得到的大鼠肺泡ⅱ型细胞纯度，鉴定方法具体为：将纯化后的肺泡ⅱ型细胞，以1×106/ml的密度，接种于直径3cm的塑料培养皿中，待细胞全部贴壁后，吸取培养基，pbs漂洗3次，每次5min；加入4％多聚甲醛固定液，固定15min；吸去固定液，pbs漂洗3次，每次5min；配制bcip/nbt染色工作液：碱性磷酸酯酶显色缓冲液10ml、bcip溶液(300x)33μl和nbt溶液(150x)66μl，最后一次洗涤完毕后，吸去pbs，加入bcip/nbt染色工作液至充分覆盖样品；室温避光孵育3h；吸去bcip/nbt染色工作液，双蒸水漂洗一次，5min，终止显色；于倒置显微镜下观察，拍照并随机统计100个细胞，计算其中的碱性磷酸酶阳性细胞数。经检测，实施例1中的肺泡ⅱ型细胞的纯度达到95.66％；对比例1中的肺泡ⅱ型细胞的纯度为79.15％；对比例2中的肺泡ⅱ型细胞的纯度为74.33％。
上述碱性磷酸酶法检测肺泡ⅱ型细胞纯度的原理为：肺泡ⅱ型细胞富含碱性磷酸酶，在ph9.2-9.8的缓冲液中，能水解磷酸萘酚钠，并释放出磷酸与萘酚。萘酚与重氮盐偶联后，会形成不溶性有色(一般为蓝色)偶氮染料沉淀于胞浆中，而其它如成纤维细胞、肺泡ⅰ型细胞等终末分化的细胞则无此特性，部分巨噬细胞以及中性粒细胞虽也含有碱性磷酸酶，可进行类似的呈色反应，但很容易从形态结构以及增殖情况上与肺泡ⅱ型细胞区分开来。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。