一种细胞支架及其制备方法与流程

本发明提供一种细胞支架，其中该细胞支架是由羟丙基纤维素所构成，该细胞支架并接枝至少一种药物，该接枝是通过化学接枝法。本发明另提供一种羟丙基纤维素细胞支架改质方法，该方法包含以下步骤：将该支架进行除气后以氧化剂对支架进行处理；将氧化剂处理后的该支架进行除气；及将该支架干燥处理。

背景技术：

体外细胞的研究大多是在二维环境下进行，由二维细胞技术所培养的细胞，在体外环境下会逐渐丧失其原有的状态并与体内自然生长相去甚远。动物实验虽然较接近人体真实的情况，但由于体内存在着许多不可控因素以及环境会因体内与体外之间互相影响而变得复杂化，不利于探究具体机制。

鉴于二维细胞培养技术及动物实验均存在一定限制，近年逐渐发展出三维细胞培养技术(three-dimensionalcellculture,tdcc)。三维细胞培养技术是指将动物细胞与具有三维结构的材料共同培养，使细胞能够在三维立体空间中生长、增殖以及迁移，以此来构成三维模式细胞-载体复合物，使实验环境能更好的模拟细胞在体内的生长情形。

由于三维细胞培养既能保留天然细胞微环境的物质结构基础，又能更好的模拟体内细胞生长微环境，三维细胞培养获得的细胞可形成三维类组织的结构，不论在形态结构、增殖分化、基因表达及细胞功能等均与二维培养有着明显差异，因此，三维细胞培养技术已在药物筛选及评估、肿瘤治疗、病毒监测、再生医学等多个领域备受关注。

三维细胞培养技术又可分为有无细胞支架两种，无支架部分主要是通过物理方法使贴附型细胞悬浮于培养基中来达到三维培养的目的；有细胞支架的三维细胞培养技术是使细胞支架在三维空间内模拟出类似海绵的多孔结构以提供细胞贴附和生长，使细胞依附于支架上并进行三维方向生长及迁移。三维支架可提供细胞适合贴附与生长的环境，甚至可以引导细胞形成组织，或支撑组织形状，支架的外形还可以依照所需求的形状来塑造，以适合将来嵌入人体组织的缺陷处。由于对于多数哺乳类动物的细胞培养系统而言，若无法提供三维立体结构给予细胞生长，细胞将无法良好的分化及增生，因此三维支架在哺乳类动物的细胞培养中扮演着至关重要的角色。

支架常为多孔性的结构，如此可以增加细胞贴附空间以加速形成组织。支架的来源大抵可区分为天然及人工两类，天然类的材料主要是直接由生物取得，例如胶原蛋白、几丁质、藻胶等等，人工类的材料则有聚乳酸(polylactate)、聚甘醇酸(polyglycolate)等等。支架本身的材料最好为生物可分解性(如聚乳酸或是几丁聚醣等)，即在身体中能被逐渐分解，并进而由身体该处组织的基质来取代。更重要的是，材料本身或分解后的产物不能对身体造成毒性伤害，植入后最好不会引起身体的免疫或发炎反应，并与接着部分的原本组织能够密切而正常的接合，具备这种性质材料即具有相当的生物兼容性。

羟丙基纤维素(hydroxypropylcellulose,hpc)为一新型纤维素，其纤维素中的羟基由醚化作用(etherification)被羟丙基取代后，即产生具有刚性的羟丙基纤维素属于非离子型的纤维素醚。羟丙基纤维素拥有良好的物理特性：1.溶解度(solubility)：羟丙基纤维素可溶于水及有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙二醇等高分子溶液；2.水溶性(water-soluble)：羟丙基纤维素为白色粉末可溶于水中，水溶液加热到约45^oc会产生相分离(phaseseparation)可观察到白色混浊状态，若对水溶液进行加热步骤时也会产生凝胶态。羟丙基纤维素除了低成本外其在药物传输方面也已被美国食品药品监督管理局(foodanddrugaministration,fda)所认可。羟丙基纤维素已被应用于各种不同的生医材料领域，不管在药物释放或者细胞骨架方面都有很大潜力。

黄酮类化合物具有抗发炎、抗癌、降脂、抗氧化、抗血栓、抗过敏及减少动脉硬化等心血管疾病的发生等性质，其中，柚皮苷(naringin)及其水解产物(naringenin，柚皮苷元)被指出具有多种不同生物和药理性质，包含增加体内抗氧化酶，如过氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)与过氧化氢酶(catalas,cat)的基因表达，降低肝脏中粒线体过氧化氢含量以达到抗氧化的作用；另一方面，柚皮苷能阻断hmg-coa还原酶（hmg-coareductase）的活性，进而影响血中胆固醇合成，以达到降低血液中胆固醇的浓度。近年研究发现，柚皮苷与他汀类药物(statins)药物相同，是一种hmg-coa的抑制剂，具有治疗骨质疏松的效果，且能有效的促进骨细胞的生长，但是柚皮苷浓度过高会产生细胞毒性(cytotoxicity)，由于骨分化的促进往往发生在一定植入时间之后，为使柚皮苷在初期骨细胞增生与中后期的骨分化都具有促进效果，目前柚皮苷的使用多是以多次连续注射方式进行，并无法达到长效型的治疗。因此，控制柚皮苷释放速率及浓度以达到对生物系统达到长效型的持续刺激，将有助于柚皮苷以及其他黄酮类化合物的更有效的应用。

技术实现要素：

本发明的目的在制备具诱导细胞增生及分化能力的细胞支架，借由测定过氧化物找出材料的最佳改质条件，进一步地借由将药物接枝于支架表面以避免药物在短时间内释放浓度过高而产生细胞毒性，或达到提升材料本身细胞亲和性、促进细胞活性或分化能力。

本发明提供一种细胞支架，其中所述细胞支架是由羟丙基纤维素所构成，所述细胞支架并接枝至少一种药物，所述接枝是通过化学接枝法。

本发明所称的“化学接枝”是指利用材料表面的反应基团与被接枝的单体或大分子链发生化学反应而实现表面接枝，包含：被接枝物上的官能基团与接枝物上的官能基团之间通过键结反应而实现；通过化学试剂与材料表面或高分子链上发生反应，产生活性中心，从而引发单体的聚合；借由将材料置于氧化剂中以在材料表面形成过氧化物，过氧化物分解产生自由基以引发单体在材料表面的接枝聚合。

本发明所称的“黄酮类化合物”(flavonoid)是指两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接的系列化合物，其包含但不限于花黄素(anthoxanthins)如黄酮(flavone)、黄酮醇(flavanole)或3-羟基黄酮(3-hydroxyflavone)；黄烷酮(flavanone)如橙皮苷(hesperidin)、柚皮苷(naringin)、3',4',5,7-四羟二氢黄酮(eriodictyol)、高圣草素(homoeriodictyol)；二氢黄酮醇(flavanonols或3-hydroxyflavanone)或2,3-二氢黄酮(2,3-dihydroflavonol)；黄烷(flavans)如黄烷-3-醇(flavan-3-ols)、黄烷-4-醇(flavan-4-ols)及黄烷-3,4-二醇(flavan-3,4-diols)；花青素(anthocyanidine)；以及异黄酮(isoflavonoids)。

在一实施例中，其中所述细胞支架为三维细胞支架。

在一实施例中，其中所述药物为黄酮类化合物；在另一实施例中，其中所述黄酮类化合物包含但不限于柚皮苷。

在一实施例中，其中所述化学接枝法包含使用氧化剂进行改质；在另一实施例中，其中所述氧化剂包含但不限于臭氧。

在一实施例中，其中所述细胞生长支架是用作骨内填充物。

在一实施例中，其中所述细胞生长支架是用于细胞的培养；在另一实施例中，其中所述细胞为骨细胞；在另一实施例中，其中所述细胞的培养是在体外；在另一实施例中，其中所述细胞的培养的细胞培养液为流动状态。

本发明另提供一种羟丙基纤维素细胞支架改质方法，所述方法包含以下步骤：将所述支架进行除气后以氧化剂对支架进行处理；将氧化剂处理后的所述支架进行除气；及将所述支架干燥处理。

在一实施例中，其中所述氧化剂为臭氧；在另一实施例中，其中所述臭氧是以每分钟2-12公升的流率对支架进行处理；在另一实施例中，其中所述臭氧是以每分钟4-10公升的流率对支架进行处理；在另一实施例中，其中所述臭氧对支架进行处理的时间为20-130分钟；在另一实施例中，其中所述臭氧对支架进行处理的时间为30-120分钟。

在一实施例中，本发明提供的羟丙基纤维素细胞支架改质方法进一步包含以下步骤：在所述干燥处理后的支架上接枝药物；在另一实施例中，其中所述药物为黄酮类化合物；在另一实施例中，其中所述黄酮类化合物包含但不限于柚皮苷。

附图说明

图1、臭氧流率对羟丙基纤维素表面过氧化物浓度的影响。固定臭氧处理时间为1小时，改变臭氧流率由0至12公升/每分钟(l/min)。

图2、臭氧处理时间对羟丙基纤维素表面过氧化物浓度的影响。固定臭氧流率在6公升/每分钟，改变臭氧处理时间由0至120分钟。

图3、多种聚合物经臭氧处理后的表面过氧化物浓度比较。

图4、柚皮苷的ftir图谱。

图5、经臭氧改质与接枝不同柚皮苷浓度羟丙基纤维素支架的ftir图谱。pristine为未经过臭氧改质以及柚皮苷接枝的支架，0.05%、0.5%与1%分别代表改质程序中使用柚皮苷溶液的重量百分浓度。

图6、经臭氧改质与接枝柚皮苷后的羟丙基纤维素支架的表面形态。pristine为未经过臭氧改质以及柚皮苷接枝的支架，0%、0.05%、0.1%与1%分别代表经过臭氧改质后在接枝程序中所使用溶液的柚皮苷重量百分浓度。

图7、不同柚皮苷浓度改质对羟丙基纤维素支架膨润率的影响。pristine为未经过臭氧改质以及柚皮苷接枝的支架，0.05%、0.1%与1%分别代表为改质程序中所使用溶液的柚皮苷重量百分浓度。

图8、羟丙基纤维素支架在pbs中的柚皮苷释放浓度。0.05%、0.1%与1%分别代表改质程序中所使用溶液的柚皮苷重量百分浓度。o代表先经臭氧改质再接枝柚皮苷，a则代表以直接吸附固定柚皮苷。(a)柚皮苷释放时间：0-120小时(b)柚皮苷释放时间：0-24小时。

图9、以过氧化物浓度为最大接枝量计算羟丙基纤维素支架在pbs中的柚皮苷释放浓度。0.05%、0.1%与1%分别代表改质程序中所使用溶液的柚皮苷重量百分浓度。(a)柚皮苷释放时间：0-120小时(b)柚皮苷释放时间：0-24小时。

图10、利用臭氧改质以及直接吸附法将柚皮苷接枝在羟丙基纤维素支架上，培养五天后并借由粒线体活性测试测定7f2活性。●(p<0.05)表示与同培养时间的其他所有浓度都具有差异性。*(p<0.05)与**(p<0.01)表示所标示两组间具有显著性差异(t-test，n=4)。pristine为未经过表面改质的支架，o代表羟丙基纤维素支架先经过臭氧改质再进行柚皮苷的固定，a则代表直接吸附柚皮苷在羟丙基纤维素支架，0.05%、0.1%与1%分别代表改质程序中所使用溶液的柚皮苷重量百分浓度。

图11、利用臭氧改质法将柚皮苷接枝在羟丙基纤维素支架上，并借由粒线体活性测试测定7f2活性。*(p<0.05)与**(p<0.01)表示所标示两组间具有显著性差异(t-test，n=4)。pristine为未经过臭氧改质以及柚皮苷接枝的支架，0.05%、0.1%与1%分别代表改质程序中所使用溶液的柚皮苷重量百分浓度。

图12、在细胞培养1、3、5天后借由sem观察7f2在臭氧改质固定柚皮苷羟丙基纤维素支架上的细胞形态。pristine为未经过臭氧改质以及柚皮苷接枝的支架，0.05%、0.1%与1%分别代表改质程序中所使用溶液的柚皮苷重量百分浓度。

图13、在细胞培养5天后借由sem观察7f2在臭氧改质固定柚皮苷羟丙基纤维素支架上的细胞形态。pristine为未经过臭氧改质以及柚皮苷接枝的支架，0.05%、0.1%与1%分别代表改质程序中所使用溶液的柚皮苷重量百分浓度。可发现经过改质的组别其片状伪足(lamellipodia)与丝状伪足(filopodia)都广泛分布于材料表面，其中又以1%的分布较广。

图14、在细胞培养5天后借由共聚焦显微镜观察7f2在臭氧改质固定柚皮苷在羟丙基纤维素支架上的肌动蛋白丝组织。pristine为未经过表面改质的支架，0.05%、0.1%与1%分别代表改质程序中所使用溶液的柚皮苷重量百分浓度。

图15、利用臭氧改质法将柚皮苷接枝在羟丙基纤维素支架上，7f2的碱性磷酸酶(alp)分泌表达。*(p<0.05)与**(p<0.01)表示所标示两组间具有显著性差异(t-test，n=5)。pristine为未经过臭氧改质以及柚皮苷接枝的支架，0.05%、0.1%与1%分别代表改质程序中所使用溶液的柚皮苷重量百分浓度。

图16、利用x-rayeds分析臭氧改质将柚皮苷接枝在羟丙基纤维素支架上7f2培养14天后的钙含量。*(p<0.05)与**(p<0.01)表示所标示两组间具有显著性差异(t-test，n=4)。pristine为未经过表面改质的支架，0.05%、0.1%与1%分别代表改质程序中所使用溶液的柚皮苷重量百分浓度。

图17、细胞在二维与三维环境活性的差异。经sem观察羟丙基纤维素与明胶二维平面的表面形态。(a)羟丙基纤维素正面(b)羟丙基纤维素背面

图18、细胞在二维与三维环境活性的差异。借由粒线体活性测试测定7f2在羟丙基纤维素二维平面和三维支架上的细胞活性。*(p<0.05)与**(p<0.01)表示所标示两组间具有显著性差异(t-test，n=5)。

图19、借由粒线体活性测试测定7f2生长于羟丙基纤维素支架上的静态及动态的细胞活性。*(p<0.05)与**(p<0.01)表示所标示两组间具有显著性差异(t-test，n=4)。

具体实施方式

实施例1、臭氧改质优化。

对生医高分子材料而言，材料表面性质是其与细胞之间的亲和程度和生物分子吸附表面的关键因素。在工业应用方面已有不少研究利用物理或化学的表面改质法对高分子表面进行改质。化学表面改质法中，借由氧化剂如臭氧的强氧化性使基材表面产生过氧化物(peroxides)，并利用氧化还原的方式在材料表面产生氧的自由基(freeradical)，进而达到将单体固定在基材表面的目的。使用臭氧作为氧化剂的臭氧改质法操作简易、适用于各种形状的样品，也大量地降低了有机溶剂的使用量，除了免除残余有机溶剂带来的生物毒性外，也使此一程序对环境友善(environmental-friendly)。臭氧改质法中影响过氧化物浓度的变量包括臭氧浓度及臭氧改质时间，因此对臭氧浓度以及改质时间做探讨。

依循以下的步骤进行臭氧改质：首先将支架置入锥形瓶中，通入氮气15分钟(min)除气。接着以2-12公升/每小时(l/hr)臭氧流率在常温下通入臭氧20-120分钟。再将经臭氧改质后的锥形瓶通入氮气15分钟除气。最后将改质过的支架保存于干燥箱中。

针对臭氧浓度的探讨，由图1的结果可发现材料表面过氧化物浓度随流率升高而上升，这代表反应环境中臭氧浓度随流率升高，材料表面的活化点数目也随之上升。但当流率持续升高，过氧化物含量到达一高峰后，含量逐渐持平甚至下降，这代表材料表面的活化点浓度可能已达一饱和状态。

针对改质时间的探讨，由图2的结果发现过氧化物含量在改质初期随着时间提高而增加，但当超过一小时后则会慢慢持平，原因推测为改质期间材料的晶格性质发生改变。

结合以上试验结果，材料条件落在流率2-12公升/每分钟(l/min)里，改质时间落在20-130分钟，此条件也应用于之后的实验之中。

实施例2、表面过氧化物浓度比较。

将本发明的优化实验结果与其他经臭氧处理的聚合物针对表面过氧化物浓度进行比较，过氧化物含量测定步骤为：将1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，dpph)避光与蒸馏水混合并配制成1毫体积摩尔浓度(mm)反应溶液。改质过后的支架放入前一步骤的溶液中，同时准备一组未通入臭氧的支架并放入相同溶液中作为空白组(blank)。在70℃下避光反应24小时后，利用紫外光光谱仪(uvspectrometer)在波长520纳米(nm)下测量吸收值并计算dpph的损耗量。

表面过氧化物浓度比较结果如图3。可以发现羟丙基纤维素所产生的过氧化物浓度(9.3×10^-7克摩尔/每平方公分(gmol/cm²))相较于大部分聚合物至少高于10倍以上，可见羟丙基纤维素支架拥有良好的改质效率，此特性有助于之后的药物接枝反应。

实施例3、臭氧改质固定黄酮类化合物。

选用柚皮苷做为黄酮类化合物药物进行接枝。臭氧改质固定柚皮苷依循以下步骤进行：柚皮苷加至圆底烧瓶中并通入氮气，10分钟后加入甲醇，配置0、0.05、0.1、1重量百分浓度(wt%)柚皮苷溶液，之后将经过臭氧改质的支架分别装入圆底烧瓶中并加入前项步骤的柚皮苷溶液，期间并持续通入氮气，接着加入0.1重量百分浓度的硫酸亚铁胺六水合物(ammoniumferroussulfatehexahydrate，fas)，期间并持续通入氮气，最后，在紧密封瓶后置入55^oc油浴中反应24小时。

将经过不同柚皮苷浓度固定的支架以傅立叶红外光谱(ftir)量测400到4000公分^-1(cm^-1)的波数，再由结果来分析官能基以此定性。

由图4及图5图中箭头处可观察到，经过臭氧改质与柚皮苷接枝的组别在波峰1665公分^-1处都有属于柚皮苷的c=o特征波峰可证明柚皮苷成功接枝在羟丙基纤维素支架。

实施例4、臭氧改质与接枝柚皮苷后羟丙基纤维素支架表面形态。

材料表面的形态也是影响细胞生长的因素之一，因此在臭氧改质与接枝柚皮苷后以sem观察羟丙基纤维素支架的表面形态，探讨材料经改质后表面形态的影响。

结果如图6所示，支架表面并无明显的破损或是腐蚀，证实本发明所使用的臭氧以及柚皮苷改质条件不足以影响材料表面的形态。

实施例5、柚皮苷改质改质前后材料亲疏水性分析。

亲疏水性为生医基材是一个重要性质，在组织工程中，骨细胞的增生及分化不仅仅受到材料表面形态影响，材料本身亲疏水性也为影响细胞贴附及活性的关键。因此，针对改质前后的材料做膨润性的分析。

由图7结果可见材料在经改质后其膨润性上并无明显差异，因而可排除材料在接枝后造成亲疏水性的差异。

实施例6、材料经臭氧改质并接枝柚皮苷的药物释放结果。

通过将材料直接泡入柚皮苷溶液中的直接吸附方式固定，以及材料经过臭氧改质再接枝柚皮苷的方式，对于两种不同方式进行测试以探讨臭氧改质对于释放浓度的影响。药物释放的步骤为：将固定柚皮苷的支架浸泡于pbs中，并放置于37^oc培养箱中，在2、4、6、8、10、24、48、72、96及120小时取点，利用紫外光光谱仪(uvspectrometer)在波长286纳米下测定吸收值，最后带入检量线换算柚皮苷的浓度。

由图8结果可发现材料所释放的浓度都处于可有效刺激细胞活性1-100ppm，与低于细胞毒性(200ppm)的范围。释放曲线则分为两阶段：第一阶段为释放较为快速的区域(1^ststage)，第二阶段为释放较缓慢的区域(2^ndstage)，此一释放行为在过去药物释放的研究中颇为普遍。第一阶段的快速释放来源于键结较不稳定的柚皮苷，在初期会大量且快速的释放进入液体中，之后在材料表面只剩稳定键结的柚皮苷，释放则会进入较为缓慢的第二阶段。不论是使用何种浓度柚皮苷固定在支架上在释放24小时后都已进入第二阶段的稳定释放区域。由上述结果可发现柚皮苷以臭氧改质接枝的方式可释放较高浓度的柚皮苷，且释放的时间也相对较长，证明在长效型的释放模式中臭氧改质的方式优于直接吸附。

实施例7、柚皮苷接枝及释放比例。

为得知柚皮苷在材料上的接枝以及释放比例，假设最适化过氧化物浓度为最大柚皮苷接枝量并以此计算释放百分比。

由图9结果可发现，到第五天时释放百分比仍然以缓慢的速度上升，且释放百分比也未到达100%。证明本发明所使用的臭氧改质接枝法为一长效型的释放模式，此一释放模式也有助于在与细胞培养时产生持续性的刺激。

实施例8、不同改质程序对细胞活性的影响。

为得知臭氧改质对于固定柚皮苷在支架表面有无影响细胞活性，本发明使用臭氧改质以及直接吸附法两种不同固定程序进行细胞活性测试(mttassay)。直接吸附法固定方式如先前所述。细胞培养是根据以下步骤进行：使用α-mem作为细胞的培养基，进行骨母细胞(7f2)的培养。α-mem培养液中含有10%血清(fbs)与1%的抗生素(penicillin-streptomycin-amphotercin)，将细胞置入37℃，含5%二氧化碳的细胞恒温培养箱中进行培养，每隔三日更换一次培养基。

由图10结果可发现，柚皮苷不论是以直接吸附或化学键结于材料的方式，都能提高材料的细胞亲和性。其中，以化学键结方式对细胞有较好的刺激活性效果，表明材料经臭氧改质后能释放较高浓度的柚皮苷，对促进骨细胞活性较为有效；或是臭氧处理过的支架表面有较多固定化的柚皮苷，可通过缓慢地释放对骨细胞造成较长时间的刺激。综合上述结果，使材料提升细胞亲和性的方法为以臭氧改质活化优于物理吸附的方式。

实施例9、不同接枝浓度对细胞活性的影响。

本实验欲探讨改质时使用不同浓度的柚皮苷在长时间培养下对细胞活性的影响。细胞活性测试(mttassay)是根据以下步骤进行：首先以pbs以1：9的浓度来稀释mtt原液（stocksolution），作为细胞活性测试的工作液（workingsolution）。接下来，将培养皿中的培养液吸干后，加入pbs冲洗数次，而后再将所稀释的工作液加入培养皿中，并将培养皿放入37°c培养箱之中，以进行反应。于反应约4~6小时后，将培养皿中的mtt工作液吸出后，再加入dmso约10~15分钟，以溶解出细胞中的甲瓒（formazan）。最后，将每盘细胞培养皿吸出4次大约200微升/每孔的量，于96孔盘中，并放入elisareader后，利用波长570纳米来读取吸光值。

结果如图11所示，可发现支架都具有良好的生物兼容性，而不论是哪一天的结果，支架经臭氧改质及接枝柚皮苷后能较好促进骨细胞的增生，经过改质的组别其细胞活性都高于未改质组。其中又以高浓度的1%拥有较佳的表现。在培养初期，较高浓度的组别拥有较好的促进细胞活性效果。综合不同天数的结果，可发现随着天数的增加，接枝柚皮苷的支架与未改质组间活性的差距随之增大，由此可证明材料在接枝柚皮苷后可增进细胞亲合度以及促进细胞的增生。

实施例10、细胞在支架上的形态观察。

图12-13显示细胞在改质后羟丙基纤维素支架上的形态观察的结果。图12可发现在培养一天后，所有组别的7f2都已成功贴附于材料的表面，且细胞主体周围可看见片状伪足(lamellipodia)与丝状伪足(filopodia)；培养至第三天，可观察到更多的细胞贴附于材料上，并且开始有细胞间连结(cell-celljunction)形成；培养至第五天，经过改质的组别其细胞贴附的面积明显优于未改质组。将第五天的结果放大分析(图13)，可发现经过改质的组别其伪足(lamellipodia)与丝状伪足(filopodia)都广泛分布在材料表面，其中又以1%的分布较广，此现象也与细胞活性结果相符。此结果可证明材料接枝柚皮苷后对于细胞的亲和度上升，使细胞较容易贴附于材料表面。

实施例11、细胞在支架上的肌动蛋白骨架与细胞核染色结果。

当细胞接触基材表面时，基材的化学、物理、结构等讯号分子会通过链接蛋白与细胞骨架传送到细胞核中，因此细胞骨架在细胞内部传递讯号中扮演重要的角色。

由图14中可发现，以dapi染细胞核，鬼笔环肽(phalloidin)染细胞骨架，所有组别的7f2皆可见到明显的肌动蛋白表达，显示细胞骨架已构成完整的网络，其中又可观察到，经过改质的组别，表现出较高延展状态的肌动蛋白，此肌动蛋白的表达应是来自于片状伪足（lamellipodia）延伸所造成，显示骨细胞与经过改质的支架间已出现交互作用，此结果也显示柚皮苷能促进细胞骨架的延伸。

共聚焦显微镜从材料的内部逐渐往材料的表面进行细胞贴附染色的分析，而由此结果可以证明骨母细胞不只生长在支架表面，同时也生长于材料内部形成三维立体成长模式。

实施例12、不同浓度柚皮苷对于7f2细胞碱性磷酸酶表达的影响。

碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，alp)在骨分化的过程中被视为诱导骨生成的重要指标之一。根据以下alp定量步骤探讨不同浓度柚皮苷固定在支架上是否会影响7f2的alp表达：先配置含有0.1摩尔浓度甘胺酸(glycine)、1毫摩尔浓度氯化锌(zincchloride)和1毫摩尔浓度氯化镁(magnesiumchloride)的溶液，并使用3当量浓度的氢氧化钠水溶液调整溶液的ph值至约为10.4，其为基底溶液。取基底溶液15毫升(ml)并加入一枚的对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate(pnpp)）药锭，在避光与室温的条件下溶解后，其则为反应溶液。使用0.4毫升细胞裂解缓冲液(celllysisreagent)，将在培养皿中的细胞悬浮与溶解约15分钟后，再与1.2毫升的反应溶液均匀混合，并于室温下避光反应30分钟。30分钟后，加入终止反应的氢氧化钠水溶液(3当量浓度)0.3毫升并于4°c下放置10分钟。使用elisareader在波长范围405纳米下测其吸收度，再由检量线，计算alp的含量。

由图15的结果可看出，培养第三天，各组别间还未有差异，此可能为培养初期骨细胞可能才刚进入分化阶段所导致。培养至第六天，经过改质组其alp分泌表达都高于未改质组，此结果显示柚皮苷开始促进骨细胞分化。培养至第十天，经过改质组其alp分泌表达依然显著高于未改质组，其中改质组中以0.05%的分泌表达较佳。当培养至第十二天，各组别的alp分泌开始下降表明此时7f2将进入下一分化阶段。此结果可发现接枝柚皮苷可促进alp的分泌，在经过臭氧改质与固定柚皮苷在支架上，对于7f2初期分化都有明显的促进效果。在过去文献中，有对于细胞增生以及分化的研究，其中有提到当细胞增生过快时，可能会抑制或者推迟分化的发生，而此现象与本发明的细胞活性与分化结果相符合。

实施例13、不同浓度柚皮苷固定在支架上对后期骨细胞矿化的影响。

分化末期的骨母细胞特化成骨前驱细胞时，细胞会分泌骨钙素，此时钙离子与磷酸根离子逐渐沉积，使得造骨细胞进行骨质矿化，本实验接着利用eds元素分析后期骨细胞的钙含量，借此观察不同浓度柚皮苷固定在支架上对后期骨细胞矿化的影响。

由图16可知，经过改质的组别其钙含量分泌都高于未改质的组别，显示经过臭氧改质步骤，羟丙基纤维素支架上固定的柚皮苷更能够有效的促进骨细胞矿化，达到骨再生的目的。此结果也可推测当提高柚皮苷改质浓度时，可能会抑制骨矿化的发生。此情况也与前面alp分泌结果相符合。

实施例14、细胞在二维与三维环境活性的差异。

为了探讨三维支架材料对细胞的影响，使用了与支架相同的材料制作二维平面环境并与骨母细胞进行培养。由图17-18不同环境的细胞活性结果可以发现，两种材料在培养第一天时二维与三维间还未有差异，这可能是由于在培养初期细胞才刚贴附于材料上，还未进入下一阶段增生行为所以才无明显差异。培养至第三天，三维培养开始优于二维环境，此原因推测为细胞在支架上开始往三维方向生长，拥有较多细胞生长空间所导致，培养至第五天，三维培养远高于二维环境，此结果可证明支架其提供细胞于三维空间生长能力已充分显现，并再一次证明本研究支架为三维立体生长模式。综合结果，三维支架培养较优于二维平面环境。

实施例15、细胞在静态及动态培养的差异。

使用蠕动泵当作动力来输送培养液并将三维支架与7f2在生物反应器中进行培养以探讨细胞在不同培养系统的活性表现。

由图19结果可以发现，当使用动态系统来培养细胞于支架上时，随着天数的增加，静态与动态两者间的活性差距也随之增大，这可能是由于增加了类似流动等物理刺激以及通过不断的输送培养液增加了养分质传效果，此结果也显示羟丙基纤维素支架本身的机械性质足以承受动态系统的仿真，表明在更加类似体内环境中可拥有更佳的细胞活性表现，由不同系统的培养可得知动态系统优于静态培养。