一种去细胞主动脉瓣支架及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学材料技术领域，具体涉及一种组织工程心脏瓣膜去细胞支架材料及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]目前组织工程心脏瓣膜的研宄主要是集中在以下几方面:瓣膜支架制备及改性，种子细胞的选择及培养，种子细胞与瓣膜支架材料的相互作用。而瓣膜支架的制备是整个组织工程心脏瓣膜研宄的前提，因此制备性能良好的瓣膜支架至关重要。
[0003]去细胞基质由于其良好的生物相容性，并可为种子细胞黏附、增殖、分化等提供类似于体内的基质微环境，在组织工程学中得以广泛应用。目前，去细胞的组织工程心脏瓣膜支架大多为动物的去细胞心脏瓣膜和去细胞心包，因其具有良好的生物学和力学性能，且来源广泛，价格低廉，被越来越多的应用于组织工程心脏瓣膜研宄。理想的去细胞瓣膜支架应保持瓣膜细胞外基质的完整性、良好的生物相容性、三维立体超微多孔结构，进而为种子细胞和组织生长提供足够的空间条件，这些特点都是合成材料很难模仿的。
[0004]应用去细胞瓣膜支架材料构建组织工程心脏瓣膜，瓣膜的去细胞是至关重要的一步。根据去细胞方法性质的不同，可以大体上将其分为物理、化学和酶学方法，在实际的工作过程中，根据需要也可以将不同的去细胞方法或者不同的试剂联合应用，以得到接近理想去细胞瓣膜的效果。目前去细胞常用的物理方法包括快速冻融，声波降解等，化学方法常用试剂有曲拉通、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、吐温20等，酶学方法常用酶为低浓度的胰蛋白酶。但目前应用最多的是化学方法中的表面活性剂，阳离子表面活性剂的毒性最大，其次是阴离子表面活性剂，非离子表面活性剂最小，但去污能力以非离子表面活性剂最强，其次是阴离子表面活性剂。
[0005]目前去细胞技术还不成熟，所有的去细胞方法都会导致瓣膜结构的破坏和表面成分的潜在丢失，在一定程度上加速瓣膜的变性和钙化，并且常用的去细胞试剂都具有一定的毒性，且去细胞时间较长大多需48小时甚至更长，单纯的表面活性剂用于瓣膜及其类似组织去细胞效果往往不理想，很难保证细胞去除完全和同时保证瓣膜及类似组织的细胞外基质的完整性及机械性能不会变化。因此寻求一种试剂用于心脏瓣膜去细胞，对于构建去细胞组织工程心脏瓣膜支架尤为必要。
【发明内容】
[0006]本发明所解决的技术问题是:现有技术的去细胞方法都会导致瓣膜结构的破坏和表面成分的丢失，一定程度上加速瓣膜的变性和钙化，而且会产生一定的毒性。
[0007]为了解决上述问题，需要一种去细胞主动脉瓣支架，使其具备天然心脏瓣膜的相关性能，同时安全无毒。本发明的目的在于提供一种去细胞主动脉瓣支架，使其具备天然心脏瓣膜的相关性能，同时安全无毒，DNA含量大幅降低，极大的减少瓣膜植入体内后的免疫排斥反应。
[0008]具体来说，本发明提供了如下技术方案:
[0009]一种去细胞主动脉瓣支架，其经聚乙二醇-聚己内酯处理动物的主动脉瓣得到。
[0010]优选的，所述的主动脉瓣支架，其通过包含如下步骤的方法制备得到:
[0011](I)将动物的主动脉瓣置于含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中处理；
[0012]以及
[0013](2)将所述的主动脉瓣置于含核酸酶的缓冲液中处理。
[0014]优选的，所述的动物为哺乳动物。
[0015]一种去细胞主动脉瓣支架的制备方法，其包含如下步骤:
[0016](I)将动物的主动脉瓣置于含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中处理；
[0017]以及
[0018](2)将所述的主动脉瓣置于含核酸酶的缓冲液中处理。
[0019]优选的，步骤(I)前，首先将所述的动物主动脉瓣置于4°C含抗生素的培养基中培养12?24小时。
[0020]优选的，所述的培养基为高糖DMEM培养基，其中抗生素含量为青霉素80U/ml?120U/ml 和链霉素 80 μ g/ml ?120 μ g/ml。
[0021]优选的，步骤⑴中所述的含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。
[0022]优选的，步骤(I)中所述的含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液为三羟甲基氨基甲烧-盐酸缓冲液。
[0023]优选的，所述的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的浓度为0.01mol/L?0.02mol/L0
[0024]优选的，步骤(I)中所述的含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中聚乙二醇-聚己内酯的浓度为0.5?2% (w/v) ο
[0025]优选的，步骤(I)中所述的含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中聚乙二醇-聚己内酯的浓度为I % (w/v) ο
[0026]优选的，步骤⑴中，所述的主动脉瓣在所述的含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中，于常温?37°C、50?10rpm振荡处理12?36小时。
[0027]优选的，步骤⑴中，所述的主动脉瓣在所述的含聚乙二醇-聚己内酯的缓冲液中振荡处理的温度为37°C。
[0028]优选的，步骤⑵中，所述的缓冲液包含0.lmg/ml?0.3mg/ml的脱氧核糖核酸酶I和10 μ g/ml?30 μ g/ml核糖核酸酶A0
[0029]优选的，步骤(2)中，所述的主动脉瓣在所述的核酸酶缓冲液中，于常温?37°C、50?10rpm振荡处理2?4小时。
[0030]优选的，步骤(2)中，所述的主动脉瓣在所述的核酸酶缓冲液中振荡处理的温度为 37。。。
[0031]优选的，所述的制备方法还包括如下步骤:将步骤(I)得到的主动脉瓣置于缓冲液中，于常温?37°C、50?10rpm振荡清洗12?36小时。
[0032]优选的，步骤(I)得到的主动脉瓣置于缓冲液中振荡清洗的温度为37°C。
[0033]优选的，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。
[0034]优选的，所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，所述的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的浓度为0.03?0.08mol/Lo
[0035]一种去细胞主动脉瓣支架，其由上述所述的制备方法制备得到。
[0036]优选的，所述的主动脉瓣支架在制备组织工程心脏瓣膜材料中的应用。
[0037]优选的，所述的聚乙二醇-聚己内酯的分子量为4000?6000，其中聚乙二醇链段的分子量为2000?3000。
[0038]优选的，所述的聚乙二醇-聚己内酯通过包括如下步骤的方法制备得到:
[0039]在氮气环境下，以聚乙二醇和ε -己内酯为原料，以辛酸亚锡为催化剂，90?100°C加热得到聚乙二醇-聚己内酯。
[0040]优选的，所述的聚乙二醇和ε -己内酯加热反应24?36小时。
[0041]本发明所用到的聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)可以自合成，也可以从市面上购买得到。
[0042]聚乙二醇-聚己内酯属于非离子型表面活性剂，可降解、无毒，去污能力强，价格低廉，且其构成部分PEG和PCL均已被美国FDA组织批准在人体内使用。
[0043]本发明应用PEG-PCL低渗液对猪主动脉瓣进行去细胞处理，再经高渗、核酸酶处理，从而制备出去细胞完全的瓣膜支架材料。
[0044]本发明中的PEG-PCL为非离子表面活性剂，去污能力强，无毒可降解，且降解产物无毒，不污染环境。PEG-PCL聚合物中PEG链段以重复的乙二醇为基础结构，具有一定的表面活性，并且具有高度亲水性、无毒、无抗原性和免疫原性及良好组织相容性等优点。组织应用PEG-PCL浸泡，在去细胞的同时又能有效保护细胞外基质蛋白成分，减轻植入体内后的免疫排斥反应。PEG与疏水性PCL链段结合后的共聚物PEG-PCL作为非离子表面活性剂，在医药、食品等领域得到广泛应用。PCL和PEG均已被美国FDA组织批准在人体内使用，且PEG-PCL是经国际认证无毒害，具有良好的生物降解性和相容性。
[0045]本发明所制备的去细胞主动脉瓣支架材料，经生物学性能和力学性能评价，其中生物学性能检测包括苏木素-伊红(HE)染色、MASSON染色，扫描电子显微镜观察瓣膜去细胞情况，测定瓣膜DNA含量、含水量、胶原蛋白含量、弹性蛋白含量，细胞毒性以及瓣膜溶血实验；力学性能测试包括最大拉伸强度、断裂强度、断裂伸长率和弹性模量的测定。实验证实，本发明制备的去细胞主动脉瓣支架具备良好的生物学性能和力学性能，达到本发明的目的。
[0046]本发明所取得的有益效果:
[0047](I)本发明首次应用可降解无毒的表面活性剂PEG-PCL作为去细胞试剂，并成功地对猪主动脉瓣进行去细胞处理，细胞去除完全，去细胞细胞外基质超微结构保留完全且具备良好的生物相容性和力学性能，此为构建组织工程心脏瓣膜支架材料提供了一种新的去细胞方法。
[0048](2)本发明中的非离子表面活性剂PEG-PCL作为一种去细胞试剂，与目前常用的去细胞试剂(曲拉通、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、胰酶等)相比，该试剂无毒无刺激性，可降解且降解产物无毒，去细胞方法简单易行，便于去细胞支架材料的批量生产，并且该去细胞溶液便于消毒。PEG-PCL可自行合成，合成方法简单，市场上亦有成品出售，价格低廉。
[0049](3)本发明所制备去细胞瓣的DNA含量与新鲜正常瓣膜相比大幅降低(P
<0.05)，说明本发明的去细胞方法能将瓣膜的免疫原性大幅降低，可减少瓣膜植入体内后的免疫排斥反应。
[0050](4)应用本发明中的非离子表面活性剂PEG-PCL作为去细胞试剂，可解决目前常用去细胞试剂毒性残留问题，应用PEG-PCL作为去细胞试剂在生物支架材料的构建中具有重要的意义。
【附图说明】
[0051]图1为实施例一的共聚物PEG-PCL的红外光谱图。
[0052]图2为实施例一的共聚物PEG-PCL的核磁共振氢谱图。
[0053]图3A为实施例一所述对照组新鲜正常主动脉瓣HE染色图，图3B为实验组去细胞主动脉瓣HE染色图。
[0054]图4A为实施例一所述对照组新鲜正常主动脉瓣MASSON染色图，图4B为实验组去细胞主动脉瓣MASSON染色图。
[0055]图5A为实施例一所述对照组新鲜正常主动脉瓣扫描电子显微镜图，图5B为实验组去细胞主动脉辧扫描电子显微镜图。
[0056]图6A为实施例一拉