细胞支架构建体的制作方法

细胞支架构建体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及使用接种有获自自体来源的细胞的支架而进行的层状结构的体腔器官或组织结构的再生、重建、修复、扩张或替换。
【专利说明】细胞支架构建体
[0001] 本申请是基于申请日为2009年11月4日， 优先权日:为2008年11月4日，申请号 为200980153634. 8 (PCT/US2009/063306)，发明名称为："细胞支架构建体"的专利申请的 分案申请。

【技术领域】
[0002] 本发明涉及使用接种有获自自体来源的细胞的支架而进行的层状结构的体腔器 官或组织结构的再生、重建、修复、扩张或替换。

【背景技术】
[0003] -些畸形可导致膀胱发育异常并需要进行手术扩张。例如后尿道瓣膜、双侧输尿 管异位、膀胱外翻、生殖腔外翻和脊柱裂（即脊髓脊膜突出）的病症会使膀胱变得顺应性 差，从而导致膀胱容量变小并产生较高的压力。在临床上，这会使患者发生失禁，并增加由 于泌尿系统压力过高而导致的肾衰竭的风险。目前对这些儿童患者的标准治疗是通过肠膀 胱成形术进行的膀胱扩张（Lewis et al. Br. J. Urol. (1990) ;65:488-491)。膀胱扩张包括 从患者的大肠上取一部分，并将该组织连接到已经存在的膀胱上，以增加顺应性、降低压力 和增加容量。这一手术相当复杂和昂贵。即使手术在技术上很成功，在手术过程中也会伴随 各种中间风险，患者还可能发生慢性并发症。这些手术的侵入性、花费和并发症使得该手术 只能被限制用于最严重的膀胱缺陷患者。对成人进行的类似手术过程是针对通常由于膀胱 癌而需要进行膀胱替换的患者进行。对成人而言，需要切除整个膀胱并用大肠来替换。尽 管具有不利影响的风险，每年在美国仍完成10, 〇〇〇例这样的手术，其中约10%为患有先天 性畸形的儿童，90%为患有后天失调例如膀胱癌的成年人。在医学上，显然迫切地需要改进 的方法来消除或至少大大减少由现行标准的护理引起的不利影响。
[0004] 在人类尿膀胱是一个肌性膜性的囊，位于盆腔前部并作为尿液的储存装置，它通 过输尿管接收尿液并通过尿道排出尿液。在人类中，膀胱位于盆腔中的髋骨（耻骨联合）的 后方，由膀胱向下和向后连接到被称为尿道的引流管，尿道开口到体外。膀胱会发生多种疾 病和损伤，这引起了患者的膀胱恶化。例如，膀胱恶化可能由传染性疾病、肿瘤和发育异常 导致。此外，膀胱恶化也可能由创伤（例如车祸和运动损伤）所导致。常常有必要对膀胱癌 患者实行尿流改道。在美国每年新增超过54, 000例的膀胱癌病例。大多数膀胱癌为上皮 细胞起源，全世界每年新增约336, 000例尿路上皮癌（移行细胞癌（TCC) MKakizoe (2006) Cancer Sci. 97(9)821)。
[0005] 当个体由于泌尿系统损伤或功能丧失而不能排尿时，尿流改道是一种引导尿液从 体内排出的方法。通常，任何阻碍尿液流动并增加输尿管和/或肾内的压力的病症都可能 需要尿流改道。一些需要尿流改道的适应症包括需要进行膀胱切除术的膀胱癌、损害肾 功能的神经性膀胱功能障碍、膀胱的辐射损伤、女性的不可控性失禁以及慢性骨盆疼痛综 合征。通常对于尿流改道有两种主要的策略：尿道再造术（urostomy)和可控性尿流改道 (continent diversion)。尿道再造术包括在腹部制造一个与体内管道相通的开孔，所述体 内管道例如小肠粘膜下层（SI)的一小段，例如回肠、结肠或空肠。在这种方法中，所述短 SI的另一端与输尿管相连接，输尿管正常情况下是将尿液从肾运输至膀胱。尿液通过输尿 管流入所述短SI，然后通过所述开孔流至体外的收集袋中。这种方法的另一种替代方案是 将输尿管直接与所述开孔相连接，这也称为输尿管造瘘术（ureterostomy)。可控性尿流改 道包括在胃或小肠或大肠部位在体内制造一个袋或储存装置，这样可能需要或不需要再使 用开孔。例如，可以取一段肠子并将其改造为更接近球形的形状，从而制造可控性皮肤储存 装置。所述经过改形的区段的一端与输尿管连接，另一端与开孔连接并通向体外的收集袋。 最后，将所述经过改形的区段放置在原来膀胱的位置，将其一端与输尿管连接，另一端与尿 道连接，这样就完成了原位尿流改道，使得个体可以通过尿道排尿，而不必再通过所述开孔 排尿。
[0006] 虽然小肠粘膜下层（SI)可用于尿流改道，但据报道除去粘膜和粘膜下层会使肠 区段发生收缩（参见例如Atala，A.，J. Urol. 156:338 (1996))。其他已有报道的由于使用胃 肠区段进行膀胱手术的问题包括：形成结石、粘液产生增多、肿瘤形成、感染、代谢紊乱、长 时间挛缩和吸收。已经表明，使用天然材料进行尿流改道时，由于膀胱组织具有其特殊的肌 肉弹性以及尿道上皮的不透性功能，使其并不容易被替换。此外，使用患者自身的肠区段进 行尿流改道需要进行至少两个不同的手术过程，第一个手术是取出肠区段，第二个手术是 安装尿流改道。由于需要多个手术，从而增加了手术的总成本、患者的风险以及患者的总体 不适程度。
[0007] 因此，鉴于与使用胃肠区段进行尿道改道相关的多种并发症以及需要多次手术过 程，仍然需要方法和装置来为需要尿道改道系统的患者提供这类系统。
[0008] 尿失禁是一个普遍的问题，会发生于所有年龄和身体健康水平的人群，无论在 社区还是在医疗机构中都会发生。医学上，尿失禁容易使患者发生尿路感染，褥疮，会阴 部红疹和尿脓毒症。在社会学和心理学层面，尿失禁会引起尴尬、社会歧视、抑郁症，以 及尤其是对老年人而言会引起寄居机构的风险增加（^^20 6丨31.，4]111.1^￥.661'0111：〇1· Geriatrics, 9:74 (1989))。在经济上，关于尿失禁的花费也是惊人的，仅美国每年花在关于 失禁方面的费用就超过百亿美元。
[0009] 尿失禁可以归因于真性的尿压力（膀胱及尿道过度活动）或固有的括约肌功能障 碍（"ISD"）或两种原因均有。尿失禁在妇女中尤其常见，并在较少程度上存在于儿童（特 别是ISD)和接受了前列腺根除术的男性。
[0010] 应激性尿失禁是不自主的尿液流失，发生于增加腹内压的物理活动的过程中，例 如在咳嗽，打喷嚏，大笑或运动时。一个人可能患有上述两种类型的尿失禁中的一种或两种 均有，当两种均有时，就被称为混合性尿失禁。虽然对尿失禁已有了一些认识，但是在大多 数情况下的急迫性尿失禁是特发性的，这意味着具体原因无法确定。尿失禁可能发生在任 何年龄的任何人群，并且在女性和老年人群中更为常见。
[0011] 逼尿肌是膀胱壁肌肉，它的收缩使得尿液从膀胱排出。逼尿肌功能异常例如逼尿 肌反射亢进的结果包括膀胱顺应性变差、膀胱内压力升高和膀胱容量减小，所有这些结果 都可能导致上尿路恶化。
[0012]目前治疗急迫性尿失禁的一种方法是注射神经毒素，例如肉毒杆菌毒素，例如 Botox敗据认为，肉毒杆菌毒素通过麻痹膀胱壁上的逼尿肌或者可能影响膀胱传入途径 和减少膀胱上皮下神经中感觉受体，从而发挥对膀胱活动过度的效果。肉毒杆菌毒素分子 的大尺寸可以限制其扩散能力，从而防止其达到传入和传出神经纤维。因此，当前治疗膀胱 活动过度症（OAB)的方法例如需要许多次地（通常是20至50次）将肉毒杆菌毒素注射进 膀胱壁肌肉，从而增加了就医次数和相关的治疗费用。此外，慢性地和长期地抑制从膀胱释 放的感觉神经递质的安全性尚未确定。
[0013] 其他治疗尿失禁的方法涉及给予具有膀胱松弛特性的药物，抗胆碱能药物是此类 药物的主要代表。例如，抗胆碱药例如普鲁本辛（propantheline bromide),或者平滑肌松 弛剂/抗胆碱能药物的组合例如消旋奥昔布宁和dicyclomin的组合，已被用来治疗尿失禁 (参见例如，A. J. Wein，Urol. Clin. N. Am.，22:557 (1995))。然而，这种药物治疗经常不能够 对所有类型的尿失禁患者均获得完全的成功，并且经常导致患者出现明显的副作用。
[0014] 除了药物疗法之外，在本发明出现之前，本领域技术人员常用的方法包 括人造括约肌（Lima S.V.C.et al.，J. Urology, 156:622_624 (1996) ;Levesque P.E.et al.，J. Urology, 156:625-628 (1996))、膀胱；颈支撑假体（Kondo A. et al.，J.Urology，157:824-827 (1996))、注射交联的胶原?61'!11&11(：.16七&1.，工 Urology,157:122-124(1997) ；Perez L.M.et al. , J. Urology,156:633-636 (1996)； Leonard Μ· P. et al.，J. Urology, 156:637-640 (1996))以及注射聚四氟乙烯（Perez L. M. et al.，J. Urology, 156:633-636 (1996))。
[0015] 一种最近为人们所熟知的治疗由ISD引起的尿失禁的方法是对患者实行尿道周 内视镜的胶原蛋白注射。这扩张了膀胱肌肉，并致力于减少膀胱泄漏或应激性尿失禁的可 能性。
[0016] 现有的治疗尿失禁的技术方案有着众所周知的缺点。虽然在内视镜指导下在膀胱 颈周围注射胶原蛋白的方法对于括约肌缺陷获得了相当高的成功率，并且没有显著的发病 率，但是胶原蛋白的使用可能会导致平均在两年之后发生的衰竭，并且还需要考虑到其成 本效益问题（（Khullar V.et al. ,British J.Obstetrics&Gynecology, 104:96-99(1996)) 。此外，对可能由于迁移现象而导致的患者控制力的恶化（Perez L. M. et al.)可能需要重 复注射，以恢复控制力（Herschorn S.et al.，J. Urology, 156:1305-1309 (1996))。
[0017] 在前列腺根除术之后使用胶原来治疗应激性尿失禁的结果也通常令人失望 (Klutke C. G. et al.，J. Urology, 156:1703-1706(1996))。而且，一个研究提供证据表明， 注射牛皮胶原会产生IgG和IgA类的特异性抗体（McCell and，M.and Delustro，F.，J. Urologyl55, 2068-2073(1996))。因此，可以预计的是，随着时间推移可能会出现患者对胶 原的过敏。
[0018] 虽然仅获得了有限的成功，但是由于缺少其他合适的替代方法，经尿道的胶原注 射仍然是一种可接受的固有括约肌缺陷的治疗方法。
[0019] 目前，医生们对于患有活动过度性膀胱障碍或急性尿失禁的患者起初都先进行非 侵入性的药物治疗。然而，如果药物治疗无效，医生们都会推荐侵入性更强的治疗方案。
[0020] 因此，需要侵入性最小的由于扩张现有的层状结构的体腔器官或组织结构（例如 膀胱）的方法。
[0021] 已经成功地应用组织工程学原理提供了可植入的细胞接种基质，以用于层状结构 的体腔器官或组织结构的重建、修复、扩张或替换，所述体腔器官或组织结构例如膀胱、膀 胱的一部分或膀胱组件。如Atala的美国专利No. 6, 576, 019所述，所述细胞可以来源于可 以患者自身的组织，包括膀胱、尿道、输尿管和泌尿生殖组织。然而，作为使用最初的器官位 置作为发育新的和健康的工程组织的基本单元的方法而言，依赖于这样的细胞培养系统的 开发和维持是有问题的。例如，在治疗有缺陷的膀胱时，细胞来源就是具体的问题，因为用 来源于有缺陷的膀胱的膀胱细胞进行培养，结果可能培养出的细胞也是有缺陷的。使用这 样的细胞并不是用于接种新的膀胱支架或基质的明智选择。因此，需要另外的适用于接种 可植入的新的器官/组织结构支架或基质的细胞来源。
[0022] 有大量文献支持这一观念：人类脂肪组织是成人干细胞的丰富来 源（Devlin et al. (2004)，Cytotherapy6:7_14 ;Awad，et al. (2003)，Tissue Engineering9:1301-12 ；Erickson et al. (2002), Biochemical and Biophysical Research Communications290:763-769 ；Gronthos et al. (2001), Journal of Cellular Physiologyl89:54-63 ；Halvorsen et al. (2001) ；Metabolism50:407-413 ； Halvorsen et al. (2001), Tissue Eng. 6:729-41 ；Harp et al. (2001), Biochemical and Biophysical Research Communication281:907-912 ;Hicok et al. (2004), Tissue EngineeringlO:371-380 ；Safford et al. (2002),Jun7,294 (2):371-9 ；Safford et al, (2004), Experimental Neurologyl87:319-28 ；Sen et al. (2004), Journal of Cellular Biochemistry81:312-319 ；Sigal et al. (1994),Hepatologyl9:999-1006 ； Wickham et al. (2003), Clinical Orthopedics and Related Research, 412:196-212 ； Ashijian et al. (2003),Plast Reconstr Surg. 111:1922-31 ；De Ugarte et al. (2003)，Cells Tissues Organs. 174:101-9 ;Mizumo et al. (2002)，Plast Reconstr Surg. 109:199-209 ；Morizono et al. (2003), Hum Gene Ther. 14:59-66 ； Winter et al. (2003), Arthritis Rheum. 48:418-29 ；Zuk et al. (2001), Tissue Eng7:2n-228;Zuk et al.(2002)，Mol Bioll3:4279 - 4295，综述于 Gimble et al. (2003)，CytotherapyS: 362-369)。这些细胞被称为脂肪来源的成人干（ADAS)细 胞，它们具有与MSC相似的免疫基因型和分化潜能（Gixmthos et al. (2001)，Joumal of Cellular Physiologyl89:54-63 ；Safford et al. (2002), Biochem Biophys Res Commun. 294(2):371-9 ;Zuk et al. (2002)，Mol Biol Celll3:4279-4295)。
[0023] 在公众领域中已知能够从人类吸脂手术样本中分离成人干细胞的有 效的和可重复的方法（Aust et al. (2004)，Cytotherapy6:7-14 ;Halvorsen et al. (2001)，Metab〇liSm50:407-413)。所述方法包括将组织用胶原酶消化、差异离心和在培 养中扩增。在经过24小时的培养之后，一克组织能够产生50, 000至100, 000个基质细胞 (Sen et al. (2001)，J Cellular Biochemistry81:312-319)。对来源于 20 个独立供体的 样本的分析获得了一致的结果：从Iml吸脂手术废液中平均能够收获401，000个细胞，其存 活率为94% (Aust et al. (2004)，Cytotherapy6:7_14)。对这些细胞进行扩增，可以在两 周时间内从标准脂肪吸取物中获得含有大于5亿个细胞的细胞群。
[0024] 在存在地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和噻唑烷二酮的条件下，ADAS细胞会 经历脂肪形成过程（Sen et al. (2001) Journal of Cellular Biochemistry81:312-319)。 ADAS细胞的分化潜能并不限于分化为脂肪细胞谱系。已经报道了促使ADAS细胞向软骨 细胞和成骨细胞途径分化的条件（Awad，et al. (2003)，Tissue Engineering9:1301_12; Erickson e t a I. (2002), Biochemical and Biophysical Research Communications290:763-769 ；Halvorson et al. (2001),Metabolism50:407-413 ； Hicok et al. (2004), Tissue EngineeringlO:371-380 ；ffickham et al. (2003), Clinic Orthopedics and Related Research412:196-212)。在通过皮下植入被植入免疫缺 陷型小鼠体内后，人类ADAS细胞与羟基磷灰石生物材料合成骨基质相结合（Hikok et al. (2004)，Tissue Engineeringl0:371-380)。有大量数据能够证明，在存在抗氧化剂 和其他培养基物的条件下培养的来源于鼠类或人类脂肪组织的成人干细胞（分别称为 muADAS和huADAS)会发生与神经分化相一致的形态学和基因型的变化（De Ugarte(2003) Cells Tissues Organs. 174:101-9 ；Safford et al. (2002),294(2):371-9 ；Safford et al. (2004), Experimental Neurologyl87:319-28) 〇
[0025] 如 Jayo et al. Regen. Med. (2008) 3 (5)，671-682 (下文中称为 " Jayo I "）所述， 试图修复器官或组织的方法的特征在于频繁地通过胶原沉积或有时通过疤痕组织形成来 不完全地替换组织。Jayo等人还观察到一个更有益的组织工程学结果，就是组织结构或器 官的原始结构和功能的再生。还可参见Jayo et al.，J. Urol. (2008) 180 ;392-397(下文中 称为"Jayo II"）。已确信由某些分子与体内的再生过程有关。例如，趋化因子MCP-I是其 中最熟悉的，它具有募集单核细胞的能力。然而，它似乎还是血管平滑肌细胞增殖的强有丝 分裂原。MCP-I将循环系统中的单核细胞募集至血管受损的区域，所述单核细胞通常转化 为巨噬细胞并称为细胞因子和生长因子的储库。巨噬细胞还摄取胆固醇并氧化脂肪。巨噬 细胞和肌肉前体细胞均被认为是MCP-I信号传导的靶标。CCR-2受体是MCP-I (CCL2)的配 体，CCR-2缺陷型小鼠表现出再生缺陷和增强的脂肪生成/纤维化。CCR-2缺陷型小鼠的局 部受到骨骼肌再生刺激时与正常小鼠相比具有如下区别：细胞间隙增多、出现大量炎性细 胞、肌纤维肿肿大且变圆、细胞间隙中有更多的成纤维细胞积累、脂肪浸润与脂肪堆积周围 的胶原分布、伴有I丐沉积的纤维化（Warren et al.(2005), FASEB J. 19:413-415 ;Selzman et al. (2002), Am J Physiol Heart Circ Physiol.283 (4) ；H1455-H1461 ；Shannon et al. (2007), Am. J. Cell Physiol. 292:C953-C967 ；Shireman et al. (2006), J. Surg. Res. 134(I):145-57. Epub2006Feb20 ；Amann et al. (1998), Brit.J.Urol.82:118-121 ； Schecter et al. (2004),J.Leukocyte Biol.75:1079-1085 ；Deonarine et al. ,(2007) ,Transl Med. 5:11 ;Lumeng et al. (2007)，J Clin. Invest. 117(1) :175 - 184)。
[0026] 本发明涉及来源于自体来源的细胞群，所述自体来源与将如本文所述被再生、重 建、修复、扩张或替换的器官或组织结构不同；本发明还涉及分离这类细胞的方法、接种有 这类细胞的新的器官/组织结构支架或基质（构建体）和制备它们的方法，以及使用这类 新的器官/组织结构构建体治疗有需要的患者的方法。
[0027] 发明概述
[0028] 本发明涉及使用接种有来自受试者的自体细胞的支架，在受试者体内进行层状结 构的体腔器官或组织结构的再生、重建、修复、扩张或替换。
[0029] 在一个方面，本发明提供了尿流改道构建体和制备和使用所述构建体的方法。在 一个实施方案中，所述尿流改道针对受试者的有缺陷的膀胱，且包括：(a)第一可植入的、 生物相容性构建体，所述构建体包括管状支架，所述管状支架具有被构造为与腹腔壁区域 相连接的第一末端和第二封闭末端，和至少一个被构造为与第一输尿管相连接的第一侧部 开口；以及（b)并非来源于所述有缺陷的膀胱的自体细胞群，所述自体细胞群沉积在所述 支架的表面上或其中。在另一个实施方案中，所述尿流改道针对受试者的有缺陷的膀胱，且 包括：一个第一可植入的、生物相容性的管状支架，所述支架适于尿液的临时储存和通过， 所述支架包括一个被构造为与所述受试者的腹腔壁上的开口相连接的第一末端，和至少一 个适于与一个第一输尿管相连接的第一侧部开口，从而使得来自所述第一输尿管的尿液能 够通过所述开口流至所述管状支架的内部；和（b)并非来源于所述有缺陷的膀胱的自体细 胞群，所述自体细胞群沉积在所述支架的表面上或其中。
[0030] 在一个实施方案中，本发明提供了制备用于有需要的受试者体内的有缺陷的膀胱 的尿流改道构建体的方法，所述方法包括下述步骤：a)提供一个第一可植入的生物相容性 支架，所述支架包括一个管状支架，所述管状支架具有一个被构造为与腹腔壁区域相连接 的第一末端和一个第二封闭末端，和至少一个被构造为与一个第一输尿管相连接的第一侧 部开口；以及（b)将并非来源于所述有缺陷的膀胱的自体细胞群沉积在所述支架的一个第 一区域上或其中，以形成尿流改道构建体。在另一个实施方案中，所述方法包括下述步骤： a)提供一个可植入的、生物相容性的管状支架，所述支架适于尿液的临时储存和通过，所述 支架包括一个被构造为与所述受试者的腹腔壁上的开口相连接的第一末端和一个第二封 闭末端，和至少一个适于与一个第一输尿管相连接的第一侧部开口，从而使得来自所述第 一输尿管的尿液能够通过所述开口流至所述管状支架的内部；以及（b)将并非来源于所述 有缺陷的膀胱的自体细胞群沉积在所述支架的一个第一区域上或其中，以形成尿流改道构 建体。
[0031] 在另一个实施方案中，本发明提供了制备用于有需要的受试者体内的有缺陷的膀 胱的尿流改道构建体的方法，所述方法包括下述步骤：a)提供一个第一可植入的生物相容 性支架，所述支架包括一个管状支架，所述管状支架具有一个被构造为与腹腔壁区域相连 接的第一末端和一个第二封闭末端，和至少一个被构造为与一个第一输尿管相连接的第一 侧部开口；以及（b)将并非来源于所述有缺陷的膀胱的自体细胞群沉积在所述支架的一个 第一区域上或其中，以形成尿流改道构建体；以及c)将所述构建体植入所述受试者体内以 形成尿流改道。在另一个实施方案中，所述方法包括下述步骤：a)提供一个可植入的、生物 相容性的管状支架，所述支架适于尿液的临时储存和通过，所述支架包括一个被构造为与 所述受试者的腹腔壁上的开口相连接的第一末端和一个第二封闭末端，和至少一个适于与 一个第一输尿管相连接的第一侧部开口，从而使得来自所述第一输尿管的尿液能够通过所 述开口流至所述管状支架的内部；以及（b)将并非来源于所述有缺陷的膀胱的自体细胞群 沉积在所述支架的一个第一区域上或其中，以形成尿流改道构建体；以及c)将所述构建体 植入所述受试者体内以形成尿流改道。在另一个实施方案中，所述方法包括将一个尿流改 道构建体植入所述受试者体内的步骤，所述尿流改道构建体包括：(a) -个管状支架，所述 管状支架具有一个被构造为与腹腔壁区域相连接的第一末端和第二封闭末端，和至少一个 被构造为与一个第一输尿管相连接的第一侧部开口；以及（b)并非来源于所述有缺陷的膀 胱的自体细胞群，所述自体细胞群沉积在所述支架的表面上或其中，以形成所述尿流改道。
[0032] 在所有实施方案中，所述尿流改道支架还可包括一个被构造为与第二输尿管相连 接的第二侧部开口。在所有实施方案中，所述第一末端可被构造为与所述腹腔壁的位置平 齐。在所有实施方案中，所述第一末端可被构造为缝合在所述受试者的皮肤上。在所有实 施方案中，所述第一末端可被构造为形成开孔。在所有实施方案中，所述开孔还可包括开孔 扣。在所有实施方案中，所述支架还包括被构造为形成开孔的垫圈环。在所有实施方案中， 所述生物相容性支架为可生物降解的。在所有实施方案中，所述支架可包括选自下列的材 料：聚乙醇酸，聚乳酸，以及聚乙醇酸和聚乳酸的共聚物。在所有实施方案中，所述细胞群为 平滑肌细胞群。在所有实施方案中，所述改道可以替换所述有缺陷的膀胱。在所有实施方 案中，所述改道可为临时性的。在所有实施方案中，所述改道可为永久性的。在所有实施方 案中，所述管状支架可具有矩形或三角形或圆形的截面形状。在所有实施方案中，所述改道 可不含有尿道上皮细胞。在所有实施方案中，本发明的方法可提供一种新的尿路管道，其特 征在于能够再生类似尿道的组织。在所有实施方案中，所述再生的组织的特征可为具有下 列一种或多种结构：尿道上皮、固有层和平滑肌束。在所有实施方案中，在所述再生的组织 中可观察到下列一种或多种结构：输尿管-膀胱连接（UCJ)、所述导管的头区和所述导管的 围腔区。在所有实施方案中，所述再生的组织的特征可为具有下列一种或多种结构：粘膜、 粘膜下层和具有维管基质的平滑肌。在所有实施方案中，所述再生的组织为覆盖平滑肌的 连续尿道上皮。在所有实施方案中，所述尿路管道在被植入后形成上皮化的粘膜。
[0033] 在一个方面，本发明涉及分离的平滑肌细胞群。在一个实施方案中，所述细胞群来 源于外周血，并包含具有收缩功能的一种或多种细胞，并且对平滑肌细胞标记物呈阳性。在 另一个实施方案中，所述细胞群来源于脂肪组织，并包含具有收缩功能的一种或多种细胞， 并且对平滑肌细胞标记物呈阳性。
[0034] 在所有实施方案中，所述细胞群的特征可为具有选自下列的一种或多种平滑肌细 胞标记物：心肌蛋白（myocardin)、a-平滑肌肌动蛋白、I丐结合蛋白（calponin)、肌球蛋白 重链、BAALC、结蛋白（desmin)、成肌纤维细胞抗原和SM22。在所有实施方案中，所述细胞群 可表达心肌蛋白（ΜΥ0⑶）。在所有实施方案中，术语"ΜΥ0⑶"包括编码MYO⑶多肽的核酸和 MYO⑶多肽。
[0035] 在所有实施方案中，所述细胞群的收缩功能可为钙依赖性的。
[0036] 在另一方面，本发明提供了直接来源于人类脂肪组织的平滑肌细胞（SMC)群。在 一个实施方案中，至少一种生物标记物在所述SMC群中的表达相对于其在人类骨髓来源 的MSC中的表达有差异，所述至少一种生物标记物选自：0ct4B、骨桥蛋白、BMP6、⑶44,和 IL-lB、⑶F5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAMl、PECAM、vWF和Flk-l。在另一个实施方案中，至 少一种生物标记物在所述SMC群中的表达比其在人类骨髓来源的MSC中的表达水平要低， 所述至少一种生物标记物选自：⑶F5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAMl、PECAM、vWF 和 Flk-I。 在另一个实施方案中，在另一个实施方案中，至少一种生物标记物在所述SMC群中的表达 比其在人类骨髓来源的MSC中的表达水平要高，所述至少一种生物标记物选自：0ct4B、骨 桥蛋白、BMP6、CD44 和 IL-1B。
[0037] 在另一个实施方案中，本发明提供了直接来源于人类脂肪组织的平滑肌细胞群， 所述平滑肌细胞群的特征在于与人类骨髓来源的MSC中相应蛋白的表达水平相比：（a) ⑶F5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAM1、PECAM、vWF 和 Flk-I 中的至少一种的表达水平降低； 和（b)0ct4B、骨桥蛋白、BMP6、⑶44和IL-IB中的至少一种的表达水平升高。在又另一个实 施方案中，所述平滑肌细胞群的特征在于与人类骨髓来源的MSC中相应蛋白的表达水平相 t匕：（a)GDF5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAM1、PECAM、vWF 和 Flk-I 的表达水平全部降低；和 (b)0ct4B、骨桥蛋白、BMP6、⑶44和IL-IB的表达水平全部升高。
[0038] 在另一个实施方案中，本发明提供了直接来源于脂肪组织的平滑肌细胞群，所述 平滑肌细胞群包括⑶45+的一种或多种细胞和/或⑶117+的一种或多种细胞。
[0039] 在另一个实施方案中，本发明提供了直接来源于人类脂肪组织的平滑肌细胞群， 所述平滑肌细胞群的增殖周期比人类骨髓来源的MSC短。
[0040] 在另一个实施方案中，本发明提供了直接来源于脂肪组织的平滑肌细胞群，所述 平滑肌细胞群在培养物中表现出增殖的接触依赖性抑制。
[0041] 在又另一个实施方案中，本发明提供了直接来源于脂肪组织的平滑肌细胞群，所 述平滑肌细胞群的特征在于至少一种平滑肌细胞（SMC)标记物响应于凝血噁烷A2模拟物 而下调。在一个实施方案中，所述SMC标记物选自心肌蛋白和肌球蛋白重链-平滑肌同种 型（SMMHC)。在另一个实施方案中，所述心肌蛋白和SMMHC响应于凝血噁烷A2模拟物而下 调。
[0042] 在一个实施方案中，本文所述的平滑肌细胞群为纯化的细胞群。
[0043] 在一个方面，本发明提供了细胞来源于脂肪组织的细胞制品或细胞群。在另一个 实施方案中，所述细胞群来源于脂肪组织的SVF。在另一个实施方案中，所述SVF包括异源 的细胞群。在另一个实施方案中，所述细胞群包括完全分化的平滑肌细胞。在又另一个实 施方案中，本发明提供了与人类骨髓来源的间充质干细胞（MSC)群有区别的人类脂肪来源 的平滑肌细胞群。在一个实施方案中，所述区别指的是所述人类脂肪来源的SMC群与人类 骨髓来源的MSC群相比，在转录物组学、蛋白质组学和功能属性方面有所不同。在一个实施 方案中，所述来源于脂肪组织的细胞群从自体来源获得。
[0044] 在另一方面，本发明提供了从自体外周血或脂肪来源分离平滑肌细胞群的方法。
[0045] 在一个实施方案中，所述方法包括下述步骤：(a)将所述外周血样本与密度梯度 材料相接触；(b)离心所述样本以确定包括单核细胞级分的密度梯度；(c)从所述密度梯度 中提取所述单核细胞级分，其中所述级分包括含有一种或多种平滑肌细胞的细胞群，所述 一种或多种平滑肌细胞具有收缩功能并对平滑肌细胞标记物呈阳性。在另一个实施方案 中，所述方法还包括（d)培养所述细胞群的步骤。在一个实施方案中，所述被培养的细胞群 在培养物中形成平滑肌细胞集落。在又另一个实施方案中，所述集落在培养约5天至约10 天后形成。在另外一个实施方案中，所述细胞群不形成内皮集落。在其他实施方案中，所述 方法还包括扩增步骤（d)中的细胞群。在另一个实施方案中，所述被扩增的细胞群为纯化 的细胞群。
[0046] 在另一个实施方案中，所述方法包括下述步骤：(a)用胶原酶消化脂肪组织样本； (b)离心所述样本以确定基质血管级分（SVF);和（c)从所述样本中提取SVF，其中所述级 分包括含有一种或多种平滑肌细胞的细胞群，所述一种或多种平滑肌细胞具有收缩功能并 对平滑肌细胞标记物呈阳性。在另一个实施方案中，所述方法还包括（d)培养所述细胞群 的步骤。在其他实施方案中，所述方法还包括扩增步骤（d)中的细胞群。在另一个实施方 案中，所述被扩增的细胞群为纯化的细胞群。
[0047] 在另外一个实施方案中，本发明提供了提供分离的平滑肌细胞群的方法，所述方 法包括下述步骤：a)在不使用平滑肌细胞分化诱导培养基的条件下培养来源于人类脂肪 SVF的平滑肌细胞制品；和b)从所述培养的细胞制品中分离完全分化的平滑肌细胞群。在 另一个实施方案中，在所述培养步骤之前先进行酶促消化脂肪组织的步骤。在另一个实施 方案中，在所述培养步骤之前先进行离心所述被消化的脂肪组织以提供SVF的步骤。在其 他实施方案中，在所述培养步骤之前先进行洗涤和平板接种所述SVF的步骤。在另一个实 施方案中，所述培养步骤包括筛选与粘附至细胞培养载体的细胞。在又另一个实施方案中， 所述培养步骤不包括使用含有诱导平滑肌细胞分化的组分的培养基。在另一个实施方案 中，所述培养步骤包括使用含有血清的细胞培养基，所述血清例如胎牛血清（FBS)，它包括 几种内源性生长因子。在另一个实施方案中，所述培养步骤不包括选择并向所述细胞培养 基中加入特异性和外源性生长因子。通常，"外源性"生长因子为除了内源性生长因子之外 的选择并加入至细胞培养基中的生长因子，内源性生长因子通常已由培养基中的血清组分 (例如FBS)来提供。外源性生长因子可为重组生长因子。在一个实施方案中，所述培养步 骤不包括使用含有外源性生长因子的细胞培养基。在另一个实施方案中，所述培养步骤不 包括使用含有重组生长因子的细胞培养基。
[0048] 在所有实施方案中，所述平滑肌细胞群不是脂肪来源的干细胞群，和/或所述平 滑肌细胞群不是间充质干细胞群。
[0049] 在另一方面，本发明提供了用于为有需要的受试者提供新的层状结构的腔体器官 或组织结构的构建体。在一个实施方案中，所述构建体包括：(a)包括聚合物基质或支架的 可植入的构建体；和（b)沉积在所述聚合物基质的表面上或其中的自体细胞群，所述自体 细胞群不来源于与新的器官或组织结构相应的天然器官或组织。
[0050] 在另一方面，本发明提供了为有需要的受试者提供新的膀胱或其部分的构建体。 在一个实施方案中，所述构建体包括：(a)包括聚合物基质或支架的可植入的构建体；和 (b)沉积在所述聚合物基质的表面上或其中的且不来源于所述受试者的膀胱的自体细胞 群。
[0051] 在某些实施方案中，所述成形的聚合物基质构建体具有椭圆形的形状。在一些实 施方案中，所述成形的聚合物基质构建体在被植入时形成折叠构型。在一个实施方案中，所 述成形的聚合物基质构建体在被植入前经过处理，以使得所述成形的聚合物基质构建体在 被植入时更为柔软。在另一个实施方案中，所述成形的聚合物基质构建体的最大长度为约 10cm。在一个实施方案中，所述成形的聚合物基质构建体的最大长度为约4cm。在另一个实 施方案中，所述成形的聚合物基质构建体的最大长度为约3cm。在又另一个实施方案中，所 述成形的聚合物基质构建体的最大宽度为约4cm。在一个实施方案中，所述成形的聚合物基 质构建体具有的二维表面积为约30cm 2。在另一个实施方案中，所述成形的聚合物基质构建 体具有的二维表面积为约25cm2。
[0052] 在其他实施方案中，所述构建体含有包括一种或多种外周血来源或脂肪组织来源 的平滑肌细胞的细胞群，所述一种或多种外周血来源或脂肪组织来源的平滑肌细胞具有收 缩功能，并且对于平滑肌细胞标记物呈阳性。在一个实施方案中，所述构建体的所述细胞群 具有钙依赖性收缩功能。
[0053] 在所有实施方案中，所述构建体中不含有其他细胞群。在所有实施方案中，所述构 建体可不含有尿道上皮细胞。在所有实施方案中，沉积在所述基质上的所述自体细胞群为 本文所述的人类脂肪来源的平滑肌细胞群。在所有实施方案中，所述人类脂肪来源的SMC 细胞群可为直接来源于SVF和完全分化的细胞群。在所有实施方案中，被接种在所述基质 上的人类脂肪来源的SMC细胞群在所述构建体被植入至所述受试者的所需部位后，具有产 生MCP-I的能力。在一个实施方案中，所述MCP-I诱导天然间充质干细胞趋向于所植入的 位置。
[0054] 在另一方面，本发明提供了适于被植入有需要的受试者体内的新的器官或组织结 构构建体的制备方法。在一个实施方案中，所述方法包括下述步骤：a)获得人类脂肪组织 样本；b)从所述样本中分离完全分化的平滑肌细胞群；c)培养所述细胞群；和d)将所述细 胞群与成型的聚合物基质细胞构建体相接触，其中所述步骤a)、b)、c)和d)进行约45天或 更短时间。在所有实施方案中，所述人类脂肪组织样本从自体来源获得。在另一个实施方 案中，所述方法还包括检测平滑肌细胞标记物的表达的步骤。在另一个实施方案中，所述表 达为mRNA表达。在另外一个实施方案中，所述表达为多肽表达。在一个实施方案中，通过 细胞内免疫荧光方法检测所述多肽表达。
[0055] 在另一方面，本发明提供了为有需要的受试者提供层状结构的腔体器官或组织结 构的方法。在一个实施方案中，所述方法包括下述步骤：a)提供生物相容性的、合成的或天 然的聚合物基质，所述聚合物基质的形状与需要治疗的器官或组织结构的至少一部分相适 应；b)在所述聚合物基质的一个第一区域上或其中沉积自体细胞群，所述自体细胞群不来 源于与所述新的器官或组织结构相对应的天然器官或组织；和c)将所述成形的聚合物基 质细胞构建体植入至所述受试者体内，以用于形成层状结构的腔体器官或组织结构。在另 一方面，本发明提供了为有需要的受试者提供新的膀胱或其部分的方法。在一个实施方案 中，所述方法包括：a)提供生物相容性的、合成的或天然的聚合物基质，所述聚合物基质的 形状与膀胱或其部分相适应；b)在所述聚合物基质的一个第一区域上或其中沉积自体细 胞群，所述自体细胞群不来源于所述受试者的膀胱；和c)将所述成形的聚合物基质细胞构 建体植入至所述受试者体内，以用于形成新的膀胱或其部分。在另一个实施方案中，本文所 述方法的步骤b)中的所述细胞群含有一种或多种外周血来源的平滑肌细胞，所述平滑肌 细胞具有收缩功能且对平滑肌细胞标记物呈阳性；或者，步骤b)中的所述细胞群含有一种 或多种脂肪组织来源的平滑肌细胞，所述平滑肌细胞具有收缩功能且对平滑肌细胞标记物 呈阳性。在另一个实施方案中，所述细胞群的收缩功能为钙依赖性的。在所有实施方案中， 沉积在所述基质上的自体细胞群为本文所述的人类脂肪来源的平滑肌细胞群。在所有实施 方案中，被接种在所述基质上的人类脂肪来源的SMC细胞群在所述构建体被植入至所述受 试者的所需部位后，具有产生MCP-I的能力。在一个实施方案中，所述MCP-I诱导天然间充 质干细胞趋向于所植入的位置。
[0056] 在一个实施方案中，本发明的方法还包括对被植入的管道构建体用所述受试者的 网膜、肠系膜、肌肉筋膜和/或腹膜进行包裹以使其能够血管化的步骤。
[0057] 本发明还涉及使用接种有来源于有需要的受试者的自体细胞的支架来扩张所述 受试者的层状结构的体腔器官或组织结构。在一个方面，本发明提供了在需要这种治疗的 受试者体内扩张已有的层状结构的腔体器官或组织结构的方法，所述方法通过下述步骤实 现：提供聚合物基质或支架，所述聚合物基质或支架的形状与需要治疗的器官或组织结构 的至少一部分相适应，且所述聚合物基质或支架的大小足以使其通过腹腔镜方法而被植 入；将不是来源于所述器官或组织结构的自体细胞群沉积在所述聚合物基质的一个第一区 域上或其中；以及通过腹腔镜方法将所述成形的聚合物基质构建体植入至所述受试者体内 的治疗位置，以使得所述已有的层状结构的腔体器官或组织结构被扩张。在某些实施方案 中，所述腔体器官或组织结构为膀胱或膀胱的一部分。
[0058] 在另一方面，本发明提供了用于增加需要此治疗的受试者的膀胱容积的方法，所 述方法通过下述步骤实现：提供生物相容性的、合成的或天然的聚合物基质或支架，所述聚 合物基质或支架的形状与膀胱的至少一部分相适应，且所述聚合物基质或支架的大小足以 使其通过腹腔镜方法而被植入；将不是来源于所述受试者的膀胱的自体细胞群沉积在所述 聚合物基质的一个第一区域上或其中；以及通过腹腔镜方法将所述成形的聚合物基质构建 体植入至所述受试者体内的治疗位置，由此增加膀胱容积。在一个实施方案中，膀胱容积的 增加量为约50mL。在另一个实施方案中，膀胱容积的增加量为约100mL。
[0059] 在又另一方面，本发明提供了用于扩张需要此治疗的受试者的膀胱中的膀胱切口 位置的方法，所述方法通过下述步骤实现：提供生物相容性的、合成的或天然的聚合物基质 或支架，所述聚合物基质或支架的形状与膀胱的至少一部分相适应，且所述聚合物基质或 支架的大小足以使其通过腹腔镜方法而被植入；将不是来源于所述受试者的膀胱的自体细 胞群沉积在所述聚合物基质的一个第一区域上或其中；以及通过腹腔镜方法将所述成形的 聚合物基质构建体植入至所述受试者体内的治疗位置，由此扩张膀胱切口位置。
[0060] 在又另一方面，本发明提供了治疗需要此治疗的受试者的尿失禁的方法，所述方 法通过下述步骤实现：提供生物相容性的、合成的或天然的聚合物基质或支架，所述聚合物 基质或支架的形状与膀胱的至少一部分相适应，且所述聚合物基质或支架的大小足以使其 通过腹腔镜方法而被植入；将不是来源于所述受试者的膀胱的自体细胞群沉积在所述聚合 物基质的一个第一区域上或其中；以及通过腹腔镜方法将所述成形的聚合物基质构建体植 入至所述受试者体内的治疗位置，由此增加膀胱容积。
[0061] 本发明还提供了包括本发明的聚合物基质或支架的成套工具及其使用说明书。 [0062] 在另一方面，本发明提供了用于在植入后监测受试者体内的新的器官或组织结构 再生的预后方法。在一个实施方案中，所述方法包括检测获自所述受试者的测试样本和对 照样本中的MCP-I表达水平，其中所述测试样本中的MCP-I表达水平高于对照样本则表明 了受试者体内的再生。在另一个实施方案中，其中所述新的器官或组织结构来源于本文所 述的自体平滑肌细胞群。在另一个实施方案中，检测MCP-I多肽表达。在另一个实施方案 中，使用抗MCP-I试剂来检测MCP-I多肽表达。在另一个实施方案中，所述抗MCP-I试剂为 抗体。在另一个实施方案中，使用免疫组化方法检测MCP-I多肽表达。在一个实施方案中， 在所述检测步骤之前先进行从受试者获取所述测试样本的步骤。在另一个实施方案中，所 述测试样本为血液。
[0063] 附图简述
[0064] 图1显示了膀胱扩张支架的一个实例。
[0065] 图2显示了膀胱替换支架的一个实例。
[0066] 图3显示了尿流改道或管道支架的一个实例。
[0067] 图3A显示了具有不同类型截面的尿流改道构建体的一个实例，还显示了被设计 为与输尿管相连接的开口的可能位置。
[0068] 图3B显示了尿流改道构建体的几种变化方案（A-开口呈卵形；B-开口呈卵形 的容器；C -封闭的卵形容器和三个管）。
[0069] 图4显示了尿流改道或管道构建体的不同应用。
[0070] 图5A-B显示了肌肉等效物支架的实例。
[0071] 图6显示了呈片状或带状形式的各种肌肉等效物支架的图。
[0072] 图7显示了不同的肌肉等效物支架及其分别的植入方法。图7a显示了平面片状 支架的形成。图7b显示了适于通过腹腔镜方法植入的支架，所述支架可在植入时被卷起并 送入腹腔镜管中，然后在腹腔中展开。图7c显示了适于通过腹腔镜方法植入的支架片，所 述支架片形成卷曲构型以便于通过腹腔镜管被插入，然后它将在腹腔中展开。图7d显示了 适于通过腹腔镜方法植入的支架片，所述支架片形成卷曲构型或手风琴形的构型以便于通 过腹腔镜管被插入，然后它将在腹腔中展开。图7e显示了用于植入肌肉等效物支架的可能 的手术方法。图7f显示了在空膀胱和充盈的膀胱中的植入位置。图7g显示了带有手术切 口的膀胱模型，显示了在表面上切割是产生的椭圆形切口。
[0073] 图8显示了预折叠的手风琴形构型的支架片，以便于被插入通过腹腔镜管口。
[0074] 图9A显示了被预先切为带状然后缝合在一起的支架，从而使其能够堆积和被插 入腹腔镜管口中，并保证了在腹腔中的定位。
[0075] 图9B显示了一个长18. 7cm、宽2. Ocm的具有两折的支架。
[0076] 图9C显示了一个长13. 3cm、宽2. 8cm的具有三折的支架。
[0077] 图9D显示了一个长9. 7cm、宽4. Ocm的具有四折的支架。
[0078] 图9E显示了一个包括两片的支架，其中每一片长9. 7cm、宽2. Ocm并具有两折。
[0079] 图10显示了被植入的管道构建体的构型的实例。
[0080] 图11显示了临时性尿流改道构建体的植入组件的实例。
[0081] 图12显示了永久性尿流改道构建体的植入组件的实例。
[0082] 图13显示了尿流改道构建体的其他应用。
[0083] 图14显示了犬外周血单核细胞级分（血块黄层）的培养物。
[0084] 图15显示了犬外周血生长出的细胞。
[0085] 图16显示了犬平滑肌细胞在传代几次之后的形态。
[0086] 图17显示了从猪和人类的脂肪分离的平滑肌细胞。
[0087] 图18显示了对平滑肌细胞标记物的基因表达的RT-PCR分析。
[0088] 图19显示了平滑肌细胞标记物的免疫荧光蛋白表达。
[0089] 图20显示了从人类外周血分离的平滑肌细胞的免疫染色。
[0090] 图21显示了从血液（A)、脂肪组织⑶和膀胱组织（C)分离的猪平滑肌细胞的收 缩力测定结果。
[0091] 图22显示了从人类脂肪组织分离的平滑肌细胞的生长与每单位面积回收的细胞 数之间的函数关系。
[0092] 图23显示了从猪的脂肪（A)、外周血（B)和膀胱平滑肌（C)分离的平滑肌细胞生 长与每代回收的细胞数之间的函数关系。
[0093] 图24显示了从人类膀胱平滑肌、脂肪、外周血和膀胱尿道上皮分离的细胞中细胞 因子MCP-I的表达。
[0094] 图25显示了 MCP-I的产生和接种细胞的密度之间的相关性。
[0095] 图26显示了输尿管支架。
[0096] 图27显示了一种新的管道构建体。
[0097] 图28显示了一种与输尿管（实线箭头）相连接的新的管道构建体（虚线箭头）。
[0098] 图29显示了与输尿管（实线箭头）相连接的构建体的内流端和朝向手术产生的 开口（虚线箭头）的外流端。
[0099] 图30显示了所述开孔和用于尿液引流的导管。
[0100] 图31-32显示了植入有不含细胞的支架的动物的细胞检查图。
[0101] 图33显示了植入有用血液来源的SMC接种的支架的动物的细胞检查图。
[0102] 图34-36植入有用血液来源的SMC接种的支架的动物的细胞检查图。
[0103] 图37显示了植入有用血液来源的SMC接种的支架的动物的细胞检查图。
[0104] 图38-39显示了植入有用脂肪来源的SMC接种的支架的动物的细胞检查图。
[0105] 图40-42显示了植入有用脂肪来源的SMC接种的支架的动物的细胞检查图。
[0106] 图43显示了植入有用脂肪来源的SMC接种的支架的动物的细胞检查图。
[0107] 图44显示了尿路管道的修整示意图。
[0108] 图45显示了植入有新的尿路管道构建体的动物的亚肉眼照片。
[0109] 图46显示了植入有新的尿路管道构建体的动物在输尿管-管道连接处附近的新 的尿路管道的显微照片。
[0110] 图47显示了植入有新的尿路管道构建体的动物在输尿管-管道连接处附近的新 的尿路管道的显微照片。
[0111] 图48显示了植入有新的尿路管道构建体的动物的管道中壁的显微照片。
[0112] 图49显示了植入有新的尿路管道（膀胱SMC支架）的动物的肾盂造影照片。
[0113] 图50显示了植入有新的尿路管道（脂肪SMC支架）的动物的肾盂造影照片。
[0114] 图51显示了植入有新的尿路管道（脂肪SMC支架）的动物的肾盂造影照片。
[0115] 图52显示了植入有新的尿路管道（血液SMC支架）的动物的肾盂造影照片。
[0116] 图53显示了植入有新的尿路管道（血液SMC支架）的动物的肾盂造影照片。
[0117] 图54显示了植入有新的尿路管道（血液SMC支架）的动物的肾盂造影照片。
[0118] 图55显示了植入有新的尿路管道（血液SMC支架）的动物的肾盂造影照片。
[0119] 图56显示了植入有新的尿路管道（仅有支架）的动物的肾盂造影照片。
[0120] 图57显示了有新的尿路管道（仅有支架）的动物的肾盂造影照片。
[0121] 图58显示了有新的尿路管道（仅有支架）的动物的肾盂造影照片。
[0122] 图59显示了后固定的管道（A)和修整示意图（B)。图59C表明了管道的各区域。
[0123] 图60显示了植入有新的尿路管道（脂肪SMC支架）的动物的显微照片。
[0124] 图61显示了植入有新的尿路管道（膀胱SMC支架）的动物的显微照片。
[0125] 图62显示了植入有新的尿路管道（脂肪SMC支架）的动物的显微照片。
[0126] 图63显示了植入有新的尿路管道（膀胱SMC支架）的动物的显微照片。
[0127] 图64显示了由再生的泌尿组织形成的新的膀胱管道的组织学特征。
[0128] 图65显示了天然输尿管-膀胱连接处的三种肌肉组分。
[0129] 图66显示了管道构建体受体的子宫-管道（utero-conduit)连接处。
[0130] 图67显示了植入的管道构建体的组织学。
[0131] 图68显示了猪的㈧膀胱来源、（B)脂肪来源和（C)外周血来源的平滑肌细胞的 形态学特征。
[0132] 图69显示了猪的膀胱来源、脂肪来源和外周血来源的平滑肌细胞的平滑肌细胞 相关标记物的RT-PCR分析。
[0133] 图70显示了猪的膀胱来源、脂肪来源和外周血来源的平滑肌细胞的平滑肌细胞 相关标记物的免疫荧光分析。
[0134] 图71显示了猪的㈧膀胱来源、（B)脂肪来源和（C)外周血来源的平滑肌细胞的 收缩力。
[0135] 图72显示了（A)膀胱来源、（B)脂肪来源和（C)外周血来源的外周血来源的平滑 肌细胞的生长动力学。
[0136] 图73显示了从新的尿路管道构建体形成的再生的泌尿组织的组织学特征。
[0137] 图74显示了植入有尿流改道构建体的动物体内上皮化粘膜的存在。
[0138] 图75显示了植入的新的膀胱构建体在4个月时的膀胱造影照片。A-膀胱来源的 SMC ;B -血液来源的SMC ;C -脂肪组织来源的SMC ;D -天然膀胱对照。
[0139] 图76显示了植入的新的膀胱构建体随时间变化的㈧容积和⑶顺应性。
[0140] 图77显示了 4个月以后的动物的平均体重。
[0141] 图78显示了 4个月以后的动物的平均血清肌酸酐水平。
[0142] 图79显示了 4个月以后的动物的平均BUN。
[0143] 图80显示了 4个月以后的动物的平均碱性磷酸酶（ALP)。
[0144] 图81显示了 4个月以后的动物的平均总蛋白水平。
[0145] 图82显示了 4个月以后的动物的平均白细胞（WBC)水平。
[0146] 图83显示了植入的构建体在4个月以后的膀胱造影照片（血液来源的SMC)。
[0147] 图84显示了植入的构建体在4个月以后的膀胱造影照片（脂肪来源的SMCs)。
[0148] 图85显示了人类膀胱发育的周期。
[0149] 图86显示了随着年龄的膀胱容积增加和尿液输出量。
[0150] 图87A-C显示了循环影响再生的结果。
[0151] 图88显示循环对临床结果的再生-增强效果的转换。
[0152] 图89显示了肌肉等效物支架的植入。
[0153] 图90显示了动物在植入肌肉等效物支架后4周时的膀胱造影照片。
[0154] 图91显示了表达在脂肪来源的细胞群中各种标记物的水平：㈧脂连素 (adiponection)和 FABP-4 ; (B)SMa A、SM22、心肌蛋白、SMMHC ; (C)钙结合蛋白；（D)VECAD、 vWF、PECAM、FLTl ;和（E) FLK 和 TEK。
[0155] 图92显示了平滑肌标记物对培养基类型的依赖性：(A) SMa A、SM22、心肌蛋白、 SMMHC ;和⑶钙结合蛋白。
[0156] 图93显示了在脂肪来源的细胞和间充质干细胞中，平滑肌标记物钙结合蛋白、心 肌蛋白和SMMHC的表达的比较。
[0157] 图94显示了在释放来源的细胞中SMa A、SM22、心肌蛋白和钙结合蛋白随时间的 表达。
[0158] 图95显示了在脂肪来源的细胞和间充质干细胞中内皮标记物的表达。
[0159] 图96显示了脂肪来源的细胞中细胞表面标记物的表达。
[0160] 图97显示了间充质干细胞中细胞表面标记物的表达。
[0161] 图98显示了 MSC、膀胱来源的SMC、Ad-SMC和人类主动脉平滑肌细胞的蛋白质组 学标记的比较性分析。
[0162] 图99显示了脂肪来源的细胞在培养物中随时间的增殖能力。
[0163] 图100显示了脂肪来源的细胞和间充质干细胞对U46619的响应。
[0164] 图101显示了中胚层分化标记物的RT-PCR分析结果。
[0165] 图102显示了在MSC/AdSMC中的0ct4A/0ct4B表达的RT-PCR分析结果。
[0166] 发明详述
[0167] 本发明涉及的细胞群来源于与将进行本文所述的重建、修复、扩张或替换的器官 或组织结构不同的器官或组织结构来源，本发明还涉及分离这类细胞的方法、用这类细胞 接种的新的器官/组织结构支架或基质（构建体）及其制备方法，以及使用这类新的器官 /组织结构构建体治疗有需要的患者的方法。
[0168] 1.定义
[0169] 除非另有定义，都在本文所使用的技术术语和科学术语的含义均与本发 明所述【技术领域】的普通技术人员所通常理解的含义相同。Principles of Tissue Engineering, 3rdEd. (Edited by R Lanza, R Langer, &J Vacanti)，2007 为本领域技术人员 提供了本申请所使用的许多术语的一般性指导。
[0170] 本领域技术人员应当认识到，许多与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和 材料都可用于实施本发明。实际上，本发明并不局限于本文所述的方法和材料。为了本发 明的目的定义以下术语。
[0171] 本文所使用的术语"平滑肌细胞"或"SMC"指的是有收缩力的细胞，它们来源于与 本文所述的重建、修复、扩张或替换构建体和方法所应用的目标器官或组织不同的天然器 官或组织。所述SMC可来源于外周血或脂肪组织。对于脂肪组织而言，所述SMC可来源于 含有血管组织的SVF。因此，所述SMCs可来源于脂肪来源的血管床的毛细血管、动脉和小静 脉，或所述SMC可来源于含有周细胞的血管周围环境。本发明提供的平滑肌细胞在被接种 至本文所述的支架或基质上并在其上被培养后，能够形成常见于中空器官（例如膀胱、腹 腔、胃肠道等等）壁上的非横纹肌，并具有能够收缩和舒张的特征。本领域普通技术人员能 够知晓平滑肌细胞的其他特性。
[0172] 本文所使用的术语"细胞群"指的是直接从合适的哺乳动物组织来源分离并经过 随后的体外培养而获得的多个细胞。本领域普通技术人员能够知晓适用于本发明的分离和 培养细胞群的各种方法，以及适用于本发明的细胞群中的各种细胞数量。所述细胞群可为 脂肪来源的、但其中基本不含脂肪细胞或非粘附性脂肪细胞的平滑肌细胞群（SMC)。所述 SMC细胞群的特征可为与平滑肌细胞相关的标记物的表达。所述SMC细胞群也可为纯化的 细胞群。所述SMC细胞群可来源于自体来源。
[0173] 本文所使用的术语"自体"指的是由同一个体衍生或转移而来。自体平滑肌细胞 群来源于将作为本文所述可植入构建体的受体的受试者。
[0174] 术语"标记物"或"生物标记物"通常指的是DNA、RNA、蛋白、碳水化合物或基于糖 脂的分子标记物，它们在培养的细胞群中的表达或存在可通过标准方法（或本文所述的方 法）进行检测，并且与培养的细胞群中一种或多种细胞为特定细胞类型的事实相一致。通 常，术语细胞"标记物"或"生物标记物"指的是在本文所述的细胞群中表达并通常由天然细 胞表达的分子。所述标记物可为由细胞表达的多肽，或为在染色体上的可识别的位置，例如 由天然细胞表达的基因、限制性内切酶识别位点或编码多肽的核酸（例如mRNA)。所述标记 物可为被称为"基因表达标记物"的基因的表达区域，或为不具有已知编码功能的一些DNA 区段。
[0175] 术语"平滑肌细胞标记物"通常指的是DNA、RNA、蛋白、碳水化合物或基于糖脂的分 子标记物，它们在培养的细胞群中的表达或存在可通过标准方法（或本文所述的方法）进 行检测，并且与培养的细胞群中一种或多种细胞为平滑肌细胞的事实相一致。通常，术语平 滑肌细胞（SMC) "标记物"或"生物标记物"指的是通常由天然平滑肌细胞表达的分子。所 述标记物可为由细胞表达的多肽，或为在染色体上的可识别的位置，例如由SMC细胞表达 的基因、限制性内切酶识别位点或编码多肽的核酸。所述标记物可为被称为"基因表达标记 物"的基因的表达区域，或为不具有已知编码功能的一些DNA区段。本发明考虑到的这类标 记物包括但不限于下述标记物中的一种或多种：心肌蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、钙结合蛋 白、肌球蛋白重链、BAALC、结蛋白、成肌纤维细抗原、SM22,以及上述标记物的任何组合。
[0176] 术语"差异表达的基因"、"有差异的基因表达"以及它们的同义词在本文中可以互 换使用，指的是一种基因在第一种细胞或细胞群中被激活的表达水平高于或低于其在第二 种细胞或细胞群表达的水平。这一术语还包括这样的基因，其表达在所述第一或第二种细 胞在培养传代过程中的不同阶段被激活的表达水平有高低的区别。还应当理解的是，差异 表达的基因可在核酸水平或蛋白水平上被激活或被抑制，或可能经历改变的天然剪接而生 成不同的多肽产物。这种不同可能表现为例如多肽在mRNA水平、表面表达、多肽的分泌或 其他分区方面的改变。差异的基因表达可包括两种或多种基因或其基因产物之间的表达的 比较，或两种或多种基因或其基因产物之间的表达比例的比较，或甚至为同一基因的两种 不同的加工产物之间的比较，上述比较是在所述第一种细胞和所述第二种细胞之间进行， 并且两种细胞之间应存在差异。差异的表达包括例如所述第一种细胞和所述第二种细胞之 间的基因或其表达产物的表达时序或细胞表达类型的定量和定性的差异。出于本发明的目 的，认为"有差异的基因表达"指的是在所述第一和第二种细胞或在培养传代过程的不同阶 段中，给定基因的表达差异为至少约1倍、至少约1. 5倍、至少约2倍、至少约2. 5倍、至少 约3倍、至少约3. 5倍、至少约4倍、至少约4. 5倍、至少约5倍、至少约5. 5倍、至少约6倍、 至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约10. 5倍、至少约11倍、至少约 11. 5倍、至少约12倍、至少约12. 5倍、至少约13倍、至少约13. 5倍、至少约14倍、至少约 14. 5倍或至少约15倍。标记物的差异表达可为在脂肪来源的细胞（所述第一种细胞）中 相对于在间充质干细胞或MSC (所述第二种细胞）中的差异表达。
[0177] 术语"抑制"、"下调"、"低表达"和"降低"在本文中可以互换使用，意为基因的表 达、或编码一种或多种蛋白或蛋白亚基的RNA分子或RNA等价物分子的水平、或一种或多种 蛋白或蛋白亚基的活性相对于一种或多种对照（例如一种或多种阳性和/或阴性对照）而 言有所下降。所述低表达可为在脂肪来源的细胞中相对于MSC中的表达降低。
[0178] 本文所使用的术语"上调"或"过表达"为意为基因的表达、或编码一种或多种蛋 白或蛋白亚基的RNA分子或RNA等价物分子的水平、或一种或多种蛋白或蛋白亚基的活性 相对于一种或多种对照（例如一种或多种阳性和/或阴性对照）而言有所上升。所述过表 达可为在脂肪来源的细胞中相对于MSC中的表达上升。
[0179] 术语"收缩功能"指的是平滑肌收缩功能，包括滑动的肌动蛋白和肌球蛋白纤维之 间的相互作用，该相互作用由钙激活的肌球蛋白的磷酸化启动，并产生依赖于细胞内钙水 平的收缩。
[0180] 术语"接触依赖性抑制"指的是当两个或多个细胞彼此接触时细胞生长的停止。如 果在细胞培养物中观察到细胞彼此堆积，或类似地观察到转化细胞培养物中的集落形成， 则认为细胞生长没有被接触抑制，也就是说细胞缺乏接触依赖性抑制的属性。间充质干细 胞不具有这一属性。相反地，具有接触依赖性抑制属性的细胞不会被观察到在培养物中彼 此堆积。
[0181] 术语"外周血"通常意为在全身循环的血液。
[0182] 术语"脂肪组织"或"脂肪"通常意为基本由脂肪细胞形成的松散的结缔组织。脂 肪组织可从身体的各个部位获得，收缩部位包括但不限于皮下（皮下脂肪）和内部器官周 围（内脏脂肪）。
[0183] 术语"构建体"指的是沉积在由一种或多种合成的或天然存在的生物相容性材料 形成的支架或基质上的至少一种细胞群。所述细胞群可在体外或体内与支架或基质相结 合。
[0184] 术语"样本"或"患者样本"或"生物学样本"通常意为获自个体、体液、身体组织、细 胞系、组织培养物或其他来源的任何生物学样本。这一术语包括体液，例如，血液例如外周 血或静脉血，尿液，以及其他生物学来源的样本，例如脂肪吸取物和固体组织活检样本，例 如活检标本（例如脂肪组织活检标本），或组织培养物或来源于组织培养物的细胞以及其 后代。这一定义还包括从来源获得后经过任何方式处理之后的样本，例如通过试剂处理、溶 解或对某种组分（例如蛋白或多核苷酸）的富集。这一定义还涵盖临床样本，还包括培养物 中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物学液体和组织样本。样本的来源可为 实体组织，例如来源于新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样本或活检样本或吸取物； 血液或任何血液成分；体液例如脑脊液、羊水、腹水或细胞间液；来源于受试者任何发育阶 段的细胞。所述生物学样本可含有并不天然存在于天然组织中的化合物，例如防腐剂、抗凝 齐IJ、缓冲剂、固定剂、营养剂、抗生素等等。所述样本可用于诊断测定或监测测定。从哺乳动 物获取样本的方法是本领域公知的。如果术语"样本"单独使用，它仍旧表示所述"样本"为 "生物学样本"或"患者样本"，即所述术语可以互换使用。样本也可为测试样本。
[0185] 本文所使用的术语"测试样本"指的是来源于已被植入本文所述的构建体的受试 者的样本。所述测试样本可来源于哺乳动物受试者的各种来源，包括但不限于血液、血清、 尿液、精液、骨髓、粘膜、组织等等。
[0186] 本文所使用的术语"对照"或"对照样本"指的是阴性对照，其中预期获得阴性结 果以帮助与测试样本中的阳性结果相关联。或者，所述对照可为阳性对照，其中预期获得阳 性结果以帮助与测试样本中的阴性结果相关联。适用于本发明的对照包括但不限于：已知 具有正常的细胞因子水平的样本、从已知没有被植入本文所述的构建体的哺乳动物受试者 获得的样本，和从已知为正常的哺乳动物受试者获得的样本。对照也可为在受试者被植入 本文所述的构建体之前从所述受试者获得的样本。此外，所述对照可为含有与测试样本所 含细胞具有相同起源的正常细胞的样本。本领域技术人员能够知晓适用于本发明的其他对 照。
[0187] 本文所使用的术语"患者"指的是需要治疗的任何个体动物，更优选地为哺乳动物 (包括人类动物，例如，狗、猫、马、兔、动物园动物、牛、猪、羊以及非非人类灵长动物）。最优 选地，本文所述的患者为人类。
[0188] 本文所使用的术语"受试者"意为应接受治疗的任何个体人类受试者，包括患者， 它正具有或曾经具有一种或多种器官功能缺陷或衰竭的征兆、症状或指征，包括泌尿系统 的缺陷、受损或功能不全。这样的受试者包括但不限于新近或之前被确诊的受试者和表现 疾病复发的受试者，或者出于任何原因而具有器官功能缺陷或衰竭风险的受试者。所述受 试者可能之前已经接受过与器官功能缺陷或衰竭相关的治疗或者未经治疗。受试者可为尿 流改道治疗的候选者，包括但不限于患有膀胱癌而需要切除膀胱的受试者、患有神经性膀 胱功能障碍而影响肾功能的受试者、患有膀胱放射性损伤的受试者和患有不自主性尿失禁 的受试者。所述受试者可为新近或之前被确诊需要进行尿流改道的受试者和经历并发症的 受试者，或者出于任何原因而具有泌尿系统功能缺陷、受损或功能不全风险的受试者。所述 受试者可能之前已经接受过与泌尿系统功能缺陷、受损、或功能不全相关的治疗或者未经 这样的治疗。
[0189] 本文所使用的术语"尿流改道"或"管道"指的是所述受试者与所植入的尿流改 道构建体、愈合的输尿管和邻近的围腔经过一段时间相互作用之后所形成的器官或组织结 构。围腔与允许尿液通过腹腔壁的区室前部相连接，可由连接所述构建体的尾端（位于腹 腔内）和皮肤的腹腔包膜的最前管状部分形成。
[0190] 术语"尾"和"头"是相对于尿液产生和流动的描述性术语。术语"尾"指的是所述 尿流改道构建体在植入后最接近所述开孔处的一端，而术语"头"指的是所述尿流改道构建 体在植入后最接近肾脏和输尿管的一端。
[0191] 术语"碎屑"指的是在植入尿流改道构建体之后在愈合和再生过程中形成的碎片。 碎屑可由脱落的组织细胞、炎性渗出物和支架生物降解产物形成。如果所述管道被这类碎 片堵塞（外流不正常），那么停滞的碎片会在所述管道的腔中形成碎屑或半固体块。
[0192] 术语"清创术"指的是通过手术或非手术方法从管道中去除外来物质或被撕裂的、 无生命力的、被污染的或死亡的组织，以防止感染、防止堵塞和促进愈合过程。所述清创术 可包括去除碎屑。
[0193] 术语"开孔"指的是通过手术生成的用于使尿液从尿流改道构建体的引流管外流 端流出体外的开口。尿液通常由体外的尿袋收集。
[0194] 术语"开孔端"或"开孔扣"指的是用于保持所述开孔的开口处完整的手段例如装 置。
[0195] 本文所使用的术语"扩张"或"扩大"指的是增加已有的层状结构的腔体器官或组 织结构的大小。例如，在本发明的一个方面，已有的层状结构的腔体器官或组织结构可被扩 大 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28 或 29 个百分点。在本 发明的另一方面，已有的层状结构的腔体器官或组织结构可被扩大例如以增加已有的层状 结构的腔体器官或组织结构的已有的容积。
[0196] 本文所使用的术语"容积"指的是在确定的区域内能够含有的液体的量。
[0197] "再生预后"或"再生性预后"通常指的是对植入本文所述的构建体后的可能过程 或结果的预报或预计。如本文所述，再生预后包括对下述一种或多种情况的预报或预计：在 膀胱替换或扩张后膀胱功能的发展或改善、在管道植入后尿流改道功能的发展，改善的膀 胱容积的发展和改善的膀胱顺应性的发展。如本文所述，"对再生的预后"意为对对植入新 的器官或组织结构后的可能过程或结果提供预报或预计。在一些实施方案中，"对再生的预 后"包括对下述一种或多种情况提供预报或预计：在膀胱替换或扩张后膀胱功能的发展或 改善、在管道植入后尿流改道功能的发展，膀胱容积的发展或改善的膀胱容积，以及膀胱顺 应性的发展或改善的膀胱顺应性。
[0198] "再生的组织"指的是在植入本文所述的构建体后发展出的器官或组织结构的组 织。所述器官或组织结构可为膀胱或膀胱的一部分。所述再生的组织可包括衬有平滑肌的 连续的尿道上皮。
[0199] 2.细朐群
[0200] 本发明提供了用于层状结构的体腔器官或组织结构的重建、修复、扩张或替换的 平滑肌细胞群，其中所述细胞群包括具有收缩功能并对一种或多种平滑肌细胞标记物呈阳 性的至少一种细胞。
[0201] 如本文所述，已经应用组织工程学原理成功地提供了用于层状结构的体腔器 官和组织结构的重建、修复、扩张或替换的可植入的细胞接种基质，所述体腔器官和组 织结构例如膀胱或通常由尿道上皮和平滑肌层构成的膀胱组件。（Becker et al. Eur. Urol. 51, 1217-1228 (2007) ；Frimberger et al. Regen. Med. I, 425-435 (2006) ；Roth et al. Curr. Urol. R印· 10, 119-125(2009) ;Wood et al. Curr. Opin. Urol. 18, 564-569)。平滑 肌细胞可来源于患者自身的组织，包括膀胱、尿道、输尿管和其他泌尿生殖组织。然而，作为 使用最初的器官位置作为发育新的和健康的工程组织的基本单元的方法而言，依赖于这样 的细胞培养系统的开发和维持是有问题的（例如在膀胱癌的治疗过程中）。显然这样的癌 细胞不适于接种在可植入的新的膀胱支架或基质上。
[0202] 本发明提供了来源于与将进行重建、修复、扩张或替换的器官或组织结构不同的 器官或组织结构来源的细胞群。在一个实施方案中，所述来源为自体来源。
[0203] 在另一方面，所述细胞群表达与平滑肌细胞群一致的标记物或平滑肌细胞群典型 的标记物。
[0204] 在另一方面，本发明提供了从与将进行重建、修复、扩张或替换的腔体器官或组织 结构不同的器官或组织结构来源分离的平滑肌细胞群。在一个优选实施方案中，所述腔体 器官或组织结构为膀胱或膀胱的一部分。
[0205] 在一个方面，所述来源为外周血。在一个实施方案中，所述外周血来源的平滑肌细 胞群来源于患者样本。所述患者样本可为静脉血。
[0206] 在一个方面，所述来源为脂肪组织。在一个实施方案中，所述脂肪组织来源的平滑 肌细胞群来源于患者样本。所述患者样本可为在吸脂手术过程中取出的脂肪组织或脂肪吸 取物。在一个优选实施方案中，患者样本
[0207] 在再另一个实施方案中，本发明的分离的细胞群在被培养后可发展出多种平滑肌 细胞特征，所述特征包括但不限于："峰-谷"状形态学，一种或多种平滑肌细胞标记物的表 达，收缩功能，纤维形成和细胞因子合成。
[0208] 在一个方面，被培养的细胞群的特征在于其具有"峰-谷"状形态学。具有"峰-谷" 状形态学的细胞可具有多种特征，包括但不限于：纺锤形状、在传代时具有平坦和纤维状、 呈平行列状地延伸和排列、"漩涡"状的生长外观，以及上述任意特征的组合。在一个实施方 案中，所述细胞群在合适的培养基中培养时发展出平滑肌细胞典型的"峰-谷"状形态学。
[0209] 在另一方面，被培养的细胞群的特征在于存在一种或多种平滑肌细胞标记物。在 一个实施方案中，所述细胞群在合适的培养基中培养时表达可检测的平滑肌细胞标记物， 所述标记物包括但不限于一种或多种下列蛋白：心肌蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、钙结合蛋 白、肌球蛋白重链、BAALC、结蛋白、成肌纤维细胞抗原、SM22,以及它们的任意组合。
[0210] 在另一方面，被培养的细胞群的特征在于存在表达一种或多种细胞表面标记物的 一种或多种细胞。在一个实施方案中，所述细胞群在合适的培养基中培养时含有对细胞表 面标记物呈阳性的一种或多种细胞，所述细胞表面标记物包括但不限于下列一种或多种标 记物：⑶73、⑶90、⑶105、⑶166、⑶31、⑶54、⑶56、⑶117,以及它们的任意组合。在另一个 实施方案中，所述细胞群在合适的培养基中培养时含有⑶45+、⑶31+、⑶54+、⑶56+、⑶90+ 和⑶105+的一种或多种细胞。
[0211] 在另一方面，被培养的细胞群的特征在于存在具有收缩功能的一种或多种细胞。 在一个实施方案中，所述细胞群在合适的培养基中培养时发展出收缩功能。在另一个实施 方案中，所述收缩功能为钙依赖性的。在另一个实施方案中，所述钙依赖性的收缩功能可通 过与钙螯合剂相接触的抑制而得到证实。在另一个实施方案中，所述钙螯合剂为EDTA。本 领域普通技术人员能够知晓其他本领域已知的合适的螯合剂。
[0212] 在又另一方面，被培养的细胞群的特征在于纤维形成。在一个实施方案中，所述细 胞群在合适的培养基中培养时经历纤维形成。
[0213] 在一个方面，所述细胞群包括表达一种或多种细胞因子的至少一种细胞。在一个 实施方案中，所述细胞因子选自=MCP-U制瘤素 M、IL-8和GR0。
[0214] 在一个方面，本发明的细胞群在分离后的培养过程中具有有限的增殖寿命。在其 他实施方案中，所述细胞群的增殖寿命为约1代、约2代、约3代、约4代、约5代、约6代、 约7代、约8代、约9代、约10代、约11代、约12代、约13代、约14代、约15代、约16代、 约17代或约18代。在一个优选实施方案中，所述细胞群在培养中的增殖寿命不超过5代。 脂肪来源的SMC通常在培养中3-5天传一代，血液来源的SMC通常在培养中14天开始产生 第一代，然后每3-5天传一代（详见实施例1)。
[0215] 在一个方面，本发明提供了含有至少一种再生性细胞的再生性细胞群，所述再生 性细胞当沉积在本文所述的支架或基质上并被植入至有需要的受试者体内时，能够使得按 本文所述进行重建、修复、扩张或替换的器官或组织结构发生再生。再生性细胞群在被植入 有需要的患者体内后能够刺激或起动层状结构的体腔器官或组织结构的再生。通常，器官 或组织结构的再生的特征为细胞组件、组织结构和架构、功能以及调节性发育的重建。此 夕卜，再生性细胞群最大程度上消除了在细胞接种腔体器官或组织结构构建体植入位置上可 能发生的不完整性或障碍。在植入职位处的组织破坏的表现为胶原沉积增加和/或疤痕组 织形成，这两者中的每一个都可以通过使用再生性细胞群而被最大程度地消除。此外，某些 细胞事件是再生性过程的指征。对于通过本文所述的细胞群和支架再生的膀胱或膀胱的一 部分而言，再生的器官或组织结构包括从朝向腔体表面延伸的多个微脉管放射性发散的具 有维管组织的平滑肌薄壁组织，以及具有对齐粘膜表面的完全发育血管的基质元件（见上 文Jayo II)。再生的膀胱或膀胱的一部分的特征还有存在纺锤样/间充质细胞和ciSMAW 性的肌肉前体细胞。在一个实施方案中，所述a SM阳性的纺锤样细胞可在新生基质组织 中和多个新生血管（小动脉）周围观察到。
[0216] 在一个实施方案中，本发明提供的细胞群当沉积在本文所述的支架或基质上并被 植入至有需要的受试者体内时，能够使得按本文所述进行重建、修复、扩张或替换的器官或 组织结构发生修复。在其他实施方案中，修复效果的特征为疤痕组织形成和/或胶原沉积。 本领域技术人员能够知晓本领域已知的修复的其他特征。
[0217] 在另一方面，所述再生性细胞群提供了再生性效果，其特征在于对重建的层状结 构的腔体器官或组织结构的大小的适应性调节。在一个实施方案中，所述再生性细胞群的 再生性效果通过特异性针对接受了接种有所述再生性细胞群的支架或基质的受试者的适 应性调节而得到确认。在一个实施方案中，所述适应性调节为使用本文所述的构建体的受 试者的膀胱的替换或扩张，从而使得新的膀胱生长并发育为与所述受试者身体成比例的大 小。
[0218] 在一个实施方案中，所述能够刺激再生的细胞群为产生MCP-I的细胞群，所述细 胞群含有至少一种表达趋化因子产物MCP-I的细胞。MCP-I再生性刺激的特征为某种细胞 类型向植入位置的募集。在一个实施方案中，MCP-I将肌肉祖细胞募集至植入位置以在新的 膀胱中增殖。在另一个实施方案中，MCP-I将单核细胞募集至植入位置，所述单核细胞又可 以产生各种细胞因子和/或趋化因子以促进再生性过程。在另一个实施方案中，MCP-I诱 导网膜细胞发育为肌细胞。
[0219] 在一个方面，本发明提供了特异性细胞因子例如MCP-I作为组织再生的替代性标 记物的用途。这类标记物可以与基于功能是否重建的再生评估组合使用。随着再生过程的 时程对替代性标记物的监测可以作为再生的预后指征。
[0220] 在另一个实施方案中，所述细胞群为纯化的细胞群。本文所述的纯化的细胞群的 特征在于基于形态学、标记物表达和功能中的一种或多种的表型。所述表型包括但不限于 下列的一种或多种：峰-谷形态学、一种或多种平滑肌细胞标记物的表达、细胞因子的表 达、在培养中有限的增殖寿命、收缩功能以及诱导纤维形成的能力。所述表型可包括本文所 述的或本领域技术人员已知的其他特征。在另一个实施方案中，所述纯化的细胞群基本上 与本文所述的平滑肌细胞群相同。基本相同的纯化的细胞群通常具有至少约90%的均一 性，这可通过形态学、标记物表达和功能中的一种或多种来判断。在其他实施方案中，所述 纯化的细胞群具有至少约95%的均一性、至少约98%的均一性或至少约99. 5%的均一性。
[0221] 在另一个实施方案中，所述平滑肌细胞群直接来源于人类脂肪组织，并且其特征 在于下列一种或多种蛋白的表达水平与其在人类骨髓来源的间充质干细胞（MSC)中的表 达水平有差异：骨桥蛋白、0ct4B、生长分化因子5(⑶F5)、肝细胞生长因子（HGF)、白血病 抑制因子（LIF)、黑素瘤细胞粘附分子（MCAM)、脉管细胞粘附分子I (VCAMl)、PECAM、vWF、 Flk-1、发育不良相关转录因子2(RUNX2)、骨形态发生蛋白6(BMP6)、CD44和IL-1B。在另 一个实施方案中，所述SMC细胞群与人类骨髓来源的MSC相比：(a)⑶F5、HGF、LIF、MCAM、 RUNX2、VCAM1、PECAM、vWF和Flk-I中的一种或多种的表达水平下降；和/或（b)0ct4B、骨 桥蛋白、BMP6、⑶44和IL-IB中的一种或多种的表达水平上升。在另一个实施方案中，所述 SMC 细胞群与人类骨髓来源的 MSC 相比：（a) GDF5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAMl、PECAM、vWF 和Flk-I的表达水平全部下降；和/或（b)0ct4B、骨桥蛋白、BMP6、CD44和IL-IB的表达水 平全部上升。
[0222] 在另一个实施方案中，所述平滑肌细胞群直接来源于脂肪组织，所述脂肪组织包 括一种或多种⑶45+细胞和/或一种或多种⑶117+细胞。
[0223] 在其他实施方案中，本发明提供了直接来源于人类脂肪组织的平滑肌细胞群，所 述平滑肌细胞群与人类骨髓来源的MSC相比具有较短的增殖寿命。在另一个实施方案中， 所述SMC细胞群在培养物中表现出增殖的接触依赖性抑制。在另一个实施方案中，所述直 接来源于脂肪组织的SMC细胞群的特征在于至少一种平滑肌细胞（SMC)标记物响应于凝血 噁烷A2模拟物而下调。在其他实施方案中，所述SMC标记物选自心肌蛋白和肌球蛋白重 链-平滑肌同种型（SMMHC)。在另一个实施方案中，所述心肌蛋白和SMMHC响应于凝血噁 烷A2模拟物而下调。
[0224] 在所有实施方案中，所述SMC细胞群来源于自体来源。
[0225] 在一个方面，本发明考虑了本文所述的平滑肌细胞群用于呼吸疾病的应用。气道 平滑肌存在于大多数脊椎动物的气管系统中。呼吸系统眼部疾病指的是所述受试者由于肺 部肌肉的功能不正常而具有有缺陷的呼吸系统。据报道，某些细胞群在被给予至肺部时可 提供有益的效果（例如Ohnishi et al. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2008December; 3(4) :509 - 514)。这些SMC细胞群可对患有呼吸系统疾病（例如哮喘、肺气肿或慢性阻塞 性肺病（COPD))的个体有益处。对于患有肺癌的个体也可能有益处。在一个实施方案中， 自体SMC细胞群可从有需要的受试者的脂肪组织或外周血分离。可将所述细胞群接种于适 于植入至所述受试者肺部位置的支架上。本发明的细胞群的一个优势为：如果受试者的呼 吸系统有缺陷（例如患有肺癌）时，可能不能从所述受试者的肺部获得合适的SMC。所述细 胞群可用于受试者的肺的全部或部分被切除的情况（例如肺癌的情况）。在受试者的肺的 全部或部分被切除后，可以从活检样本中分离自体SMC细胞群，经过培养后接种于合适的 支架上并植入所述受试者体内，以提供新的肺或新的肺部组织结构。
[0226] 在另一方面，本发明考虑了本文所述的SMC细胞群用于眼部疾病的应用。眼部疾 病指的是所述受试者由于眼部肌肉的功能不正常而具有眼部缺陷。平滑肌存在于眼内的睫 状肌并控制眼的容积，以用于观察不同距离的物体并调节房水通过Schlemm氏管的外流。 平滑肌还存在于眼部的虹膜。这些SMC细胞群可对患有眼部疾病（例如老花眼和远视眼） 的患者有一处。对于患有肺癌的个体也可能有益处。在一个实施方案中，自体SMC细胞群 可从有需要的受试者的脂肪组织或外周血分离。可将所述细胞群接种于适于植入至所述受 试者眼部位置的支架上。本发明的细胞群的一个优势为：如果受试者的眼部有缺陷或由于 眼部组织的可用性受到限制时，可能不能从所述受试者的眼部获得合适的SMC。可以从活检 样本中分离自体SMC细胞群，经过培养后接种于合适的支架上并植入所述受试者体内，以 提供新的眼部组织。
[0227] 在另一个实施方案中，可以不使用支架（例如通过植入）而将本发明的平滑肌细 胞群给予患有呼吸系统疾病或眼部疾病的受试者。本领域普通技术人员能够知晓合适的植 入方法。
[0228] 在一个实施方案中，自体SMC细胞群可从有需要的受试者的脂肪组织或外周血分 离。可将所述细胞群接种于适于植入至所述受试者肺部位置的支架上。本发明的细胞群的 一个优势为：如果受试者的呼吸系统有缺陷（例如患有肺癌）时，可能不能从所述受试者的 肺部获得合适的SMC。所述细胞群可用于受试者的肺的全部或部分被切除的情况（例如肺 癌的情况）。在受试者的肺的全部或部分被切除后，可以从活检样本中分离自体SMC细胞 群，经过培养后接种于合适的支架上并植入所述受试者体内，以提供新的肺或新的肺部组 织结构。在另一个实施方案中，可以不使用支架（例如通过植入）而将本发明的平滑肌细 胞群给予患有呼吸系统疾病的受试者。本领域普通技术人员能够知晓合适的植入方法。
[0229] 3.分离细朐群的方法
[0230] 自体细胞群直接来源于需要治疗的受试者。所述受试者提供来源的组织通常与需 要治疗的器官或组织结构不同。自体细胞群可以来源于患者的自身组织，例如来源于脂肪 组织或外周血。所述自体细胞可以从活检样本中分离。此外，所述细胞在使用前可被冷冻 或扩增。
[0231] 为了准备构建细胞接种的支架，获自受试者的含有平滑肌细胞的样本被解离形成 合适的细胞悬液。分离和培养细胞的方法在已授权的美国专利No. 5, 567, 612中有述，该专 利文献通过援引的方式明确地纳入本文。将细胞解离为单细胞状态的过程并不是开始原代 培养所必需的，因为在体外培养一段时间（例如一周）后就可以形成单细胞悬液。可以通 过机械方法和酶学方法破坏连结细胞的细胞外基质和胞间连接，从而进行组织解离。如果 需要，可以在体外培养自体细胞，以增加可用于接种支架的细胞的数量。
[0232] 在接种前，可以使用遗传物质转染细胞。在聚合物接种之前，可以用特异性基因转 染平滑肌细胞。细胞-聚合物构建体可以携带能使宿主长期存活或使组织形成新的器官所 需要的遗传信息。
[0233] 可以使用或不使用本领域技术人员已知的细胞分级步骤来制备细胞培养物。可以 基于细胞大小、DNA含量、细胞表面抗原和存活力来进行细胞分级。例如，可以从脂肪组织 中富集平滑肌细胞，并同时减少内皮细胞和脂肪细胞以收集平滑肌细胞。虽然可以使用细 胞分级，但是它并不是实施本发明所必需的。
[0234] 在本文所述的方法中，另一种任选的过程为冷冻保存。可以使用冷冻保存来例如 降低对多次侵入性手术过程的需要。可以扩增取自活检样本或取自受试者的细胞，可以使 用一部分扩增的细胞并将另一部分细胞冷冻保存。能够扩增和保存细胞就减少了必需的手 术过程的次数。冷冻保存用途的另一实例是在组织库中的应用。自体细胞可在例如供体组 织库中储存。当新的器官或组织结构需要细胞时，可以按照需要由冷冻保存的细胞提供。患 病的或正接受可能危害其已有的器官或组织结构的治疗的患者可以冷冻保存一种或多种 活检样本。然后，如果患者自身的器官或组织结构发生衰竭，就可以融化冷冻保存的自体细 胞并用于治疗。例如，如果在经过治疗后的新的器官或组织结构中复发癌症，可以使用冷冻 保存的细胞来重建器官或组织结构，就不再需要另外的活检样本。
[0235] 可以按照下述总体方法来从脂肪或外周血中分离平滑肌细胞。可以获得合适重量 (例如以克为单位）和/或面积（例如以cm 2为单位）的脂肪活检标本。可以在在计划植 入新的器官或组织结构构建体之前获得合适体积（例如以ml为单位）的外周血。
[0236] 下面描述一种适用于从脂肪的基质血管级分（SVF)中分离平滑肌细胞的代 表性实例方法，所述脂肪的基质血管级分（SVF)代表了由多种细胞类型组成的不均 一的细胞群，包括内皮细胞和平滑肌细胞，以及由国际细胞治疗协会（International Society for Cellular Therapy(ISCT))标准定义的 MSC 样细胞（Domini et al.2006Cytotherapy8:4, 315-317)。可以从活检样本中获得合适重量的（以克为单位）的 脂肪组织（例如7-25g)，用PBS洗涤（例如3次），用手术刀和剪将组织剪碎，转移至50mL 锥形瓶中并在含胶原酶（例如〇· 1至〇· 3% ) (Worthington)和1 % BSA的DMEM-HG溶液中 在37°C培养60分钟。可以持续振荡或间歇性振荡所述锥形瓶以促进消化。可以以600g离 心10分钟以沉淀SVF并在添加10% FBS的DMEM-HG中重悬。然后使用基质-脉管级分来 进行第〇代细胞的接种。
[0237] 下面描述一种适用于从外周血中分离平滑肌细胞的代表性实例方法。可将合适的 体积（例如25ml)的外周血以1:1稀释于PBS中，加入25ml Histopaque_1077(Sigma)并 置于50mL锥形瓶中以分层。在离心（例如800g，30min)后，可以收集单核细胞级分，用PBS 洗涤一次并重悬于α-ΜΕΜ/10% FBS(Invitrogen)中以进行第0代细胞的接种。
[0238] 本领域普通技术人员能够知晓其他用于分离平滑肌细胞的方法。
[0239] 在一个方面，本发明提供了无需使用诱导分化为平滑肌细胞的条件而从SVF中分 离出分离的平滑肌细胞群的方法。在一个实施方案中，所述方法包括a)获得脂肪组织，b) 消化所述脂肪组织，c)离心所述被消化的脂肪组织以提供基质血管级分（SVF)，d)无需使 用诱导分化为平滑肌细胞的条件而培养所述SVF，和e)从脂肪组织来源的SVF中分离平滑 肌细胞群。在一个实施方案中，所述培养步骤包括洗涤所述SVF，在细胞培养基重悬所述 SVF，以及将所述重悬的SVF铺板。在另一个实施方案中，所述培养步骤包括提供贴靠细胞 培养载体（例如培养板或容器）的细胞群。在另一个实施方案中，所述方法还包括扩增所 述培养的细胞群。在其他实施方案中，所述方法还包括分析所述平滑肌细胞群是否具有平 滑肌细胞的特征。在一个实施方案中，所述脂肪组织来源于自体来源。
[0240] 在一个实施方案中，所述培养条件不需要使用能够诱导脂肪组 织SVF来源的细胞群分化为平滑肌细胞的细胞培养组分。据Jack et al.，J Biomaterials30 (2009) 3529-3270报道，在含有肝素的诱导培养基上培养来源于SVF的未 分化的脂肪干细胞6周，以使得干细胞分化为平滑肌细胞（还可参见Rodriguez的美国专 利No. 7, 531，355)。Jack et al.报道的干细胞不需要在培养期间内被分份。在另一个实 施方案中，所述培养条件不需要使用诱导培养基，包括含有肝素的诱导培养基。在另一个实 施方案中，本发明的方法包括使用不含有能够使细胞群分化为平滑肌细胞或培养和扩张细 胞群所需的外源性生长因子的培养条件。
[0241] 本发明的方法与其他报道过的方法相比的优势包括省略了使脂肪来源的干细胞 分化为平滑肌细胞的步骤，这就减少了获得脂肪活检样本和从中分离平滑肌细胞群之间的 时间。此外，由于不再需要诱导分化的其他细胞培养基组分（例如外源性生长因子），也就 具有了降低成本的优势。
[0242] 在另一方面，本发明提供了分离和培养平滑肌细胞群的方法，所述平滑肌细胞群 含有至少一种具有收缩功能和对一种或多种平滑肌细胞标记物呈阳性的细胞。在一个实施 方案中，所述方法包括从需要重建、修复、扩张或替换层状结构的腔体器官或组织结构的患 者获得样本的步骤，其中所述样本不是从需要被重建、修复、扩张或替换的腔体器官或组织 结构获得的。在另一个实施方案中，所述平滑肌细胞来源于患者样本。在另一个实施方案 中，所述腔体器官或组织结构为膀胱或膀胱的一部分。在一个实施方案中，所述样本为自体 样本。在另一个实施方案中，所述样本为外周血样本。在又另一个实施方案中，所述样本为 脂肪组织样本。所述脂肪组织可为通过腹部吸脂手术而取出的所述受试者的组织。
[0243] 在另一个实施方案中，在所述获得步骤之后还进行分离步骤。
[0244] 对外周血样本而言，所述分离步骤包括使样本与密度梯度材料相接触，离心所述 样本以确定含有单核细胞级分的密度梯度，以及从所述密度梯度中提取所述单核细胞级 分。在所述分离步骤之后还可以进行培养步骤，即培养来自所提取的级分的细胞。
[0245] 对于脂肪组织样本而言，所述纯化步骤包括用胶原酶消化所述样本，离心经过消 化的样本，将离心的样本混合以从原代脂肪细胞中分离基质细，离心混合的样本以获得基 质-脉管级分，该级分可被重悬以进行随后的培养。
[0246] 在一个方面，本发明提供了不使用诱导分化的细胞培养基而提供分离的平滑肌细 胞（SMC)群的方法。在一个实施方案中，所述方法包括下述步骤：a)获得脂肪组织活检样 本，b)酶促消化所述脂肪组织，c)离心经消化的脂肪组织以提供含有不均一细胞群的基质 血管级分（SVF)，d)洗涤和铺板所述不均一的细胞群；e)在不使用平滑肌细胞分化诱导培 养基的条件下培养所述细胞群，f)从培养的细胞中分离完全分化的SMC细胞群。在另一个 实施方案中，所述培养步骤e)包括筛选贴靠细胞培养载体的细胞。在另一个实施方案中， 所述培养步骤e)不包括使用含有外源性生长因子的细胞培养基。在一个实施方案中，所 述培养方法包括使用含有最少必须培养基（例如DMEM或α-MEM)和胎牛血清（例如10% FBS)的细胞培养基，并通过本领域普通技术人员已知的标准条件进行培养。在另一个实施 方案中，所述平滑肌细胞群不是脂肪来源的干细胞群。在另一个实施方案中，所述平滑肌细 胞群不是间充质干细胞群。
[0247] 4.支架（Scaffolds)
[0248] 如Atala的美国专利No. 6576019(其全部内容通过援引的方式纳入本文）所述， 支架或聚合物基质可由各种不同的材料构成。通常，生物相容性材料特别是可生物降解材 料是用于构建本文所述的支架的优选材料。所述支架为具有至少两个分离表面的可植入 的、生物相容性的、合成的或天然的聚合物基质。所述支架的形状与需要治疗的所述腔体器 官或组织结构的至少一部分相适应。所述生物相容性材料是可生物降解的。生物相容性指 的是所述材料没有毒性或对于生物学功能没有损害性效果。可生物降解指的是所述材料可 以在患者体内被吸收或降解。可生物降解材料的实例包括例如可吸收的缝线。用于形成 支架的代表性材料包括天然的或合成的聚合物，例如胶原，聚（α酯）例如聚（乳酸）、聚 (乙醇酸）、聚原酸酯和聚酸酐以及它们的共聚物，它们可以通过水解以受控的速度降解并 被吸收。这些材料可以实现对降解性、可操作性、大小和构型的最大程度的控制。优选的可 生物降解聚合物材料包括以可吸收的合成缝线材料的形式开发的聚乙醇酸和聚羟基乳酸 (polyglactin)。聚乙醇酸和聚轻基乳酸纤维可以以厂商提供的形式使用。其他支架材料包 括纤维素醚、纤维素、纤维素酯、氟化聚乙烯、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰 亚胺、聚丙烯酸酯、聚苯并恶唑、聚碳酸酯，聚醚腈（polycyanoarylether)、聚酯、聚酯碳酸 酯、聚醚、聚醚醚酮，聚醚酰亚胺、聚醚酮、聚醚砜、聚乙烯、聚氟烯烃、聚酰亚胺、聚烯烃、聚 恶二唑、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、聚硫、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚三唑、聚 氨酯、聚乙烯，聚偏氟乙烯、再生的纤维素、硅酮、脲醛，或这些材料的共聚物或物理混合物。 可用合适的抗微生物剂浸渍所述材料或者用有色添加剂对所述材料着色，以改善其视觉效 果和有助于手术过程。
[0249] 其他可生物降解的支架材料包括由Ethicon公司（Ethicon Co.，Somerville, N. J.)生产的合成缝线材料，例如M0N0CRYL?(乙醇酸和ε-己内酯的共聚物）、VICRYL? 或Polyglactin910(乳酸和乙醇酸的共聚物，涂覆有Polyglactin370和硬脂酸 钙）和PANACRYL? (乳酸和乙醇酸的共聚物，涂覆有己内酯和乙醇酸的共聚物）。 (Craig P.H. , WiIliams J.A. , Davis K.ff. , et al. :A Biological Comparison of Polyglactin910and Polyglycolic Acid Synthetic Absorbable Sutures. Surg. 141 ； 1010,（1975))和聚乙醇酸。这些材料可以以厂商提供的形式使用。
[0250] 在又另一个实施方案中，所述基质或支架可以使用天然的去细胞化器官的一部分 来产生。可以通过从器官中去除全部细胞和组织内容而对生物结构或器官部分去细胞化。 去细胞化过程包括一系列的连续提取。这种提取过程的一个关键特征是避免了可能打乱或 破坏生物结构的复杂内部结构的剧烈提取过程。第一步包括除去细胞碎片和细胞膜的溶 解。然后再溶解核胞质组分和核组分。
[0251] 优选地，通过使用温和的机械破坏方法除去包围器官部分的细胞膜和细胞碎片， 从而使所述生物结构例如器官部分被去细胞化。所述温和的机械破坏方法必须足以破坏细 胞膜。然而，所述去细胞化过程应避免损伤或打乱所述生物结构的复杂内部结构。温和的 机械破坏方法包括刮去器官部分的表面、在合适体积的液体（例如蒸馏水）中搅拌器官部 分或搅拌器官。在一个优选实施方案中，所述温和的机械破坏方法包括在合适体积的蒸馈 水中搅拌器官部分，直至细胞膜被破坏且细胞碎片被从所述器官移除。
[0252] 在除去细胞膜后，再除去所述生物结构的核和胞质组分。这可以通过溶解细胞和 核组分但不破坏其内部结构的方式来进行。为了溶解核组分，可以使用非离子型去污剂或 表面活性剂。非离子型去污剂或表面活性剂包括但不限于：可以获自Rohm and Haas of Philadelphia、Pa.的 Triton 系列产品，包括 Triton X-100、Triton N-101、Triton X-114、 Triton X-405、Triton X-705和Triton DF-16,它们可从多个供货商处购得；Tween系列 产品，例如单月桂酸酯（Tween20)、单棕榈酸酯（Tween40)、单油酸酯（Tween80)和聚氧乙 烯-23-月桂醚（Brij. 35)、聚氧乙烯醚W-I (Polyox)等等，胆酸钠、去氧胆酸盐、CHAPS、阜 角苷、正癸基-D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-D-吡喃葡萄糖苷和 Nonidet P-40。
[0253] 本领域技术人员能够知晓属于上述类别的化合物的描述和可商购的供货 商，这些也可见于〃Chemical Classification, Emulsifiers and Detergents"，McCut cheon's, Emulsifiers and Detergents, 1986, North American and International Editions, McCutcheon Division, MC Publishing Co. , Glen Rock, N. J. , U. S. A. and Judith Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry, Calbiochem. R. , Hoechst Celanese Corp. , 1987。在一个优选实施方案中， 上述非离子型表面活性剂为Triton序列产品，优选地为Triton X-100。
[0254] 可以根据被去细胞化的生物结构的类型来改变上述非离子型去污剂的浓度。例 如，对于精细组织例如血管，应降低去污剂的浓度。非离子型去污剂的优选浓度可为约 0. 001至约2. 0% (w/v)。更优选地为约0. 05至约I. 0% (w/v)。再更优选地为约0. 1% (w/ v)至约0. 8% (w/v)。优选的浓度范围为约0. 001至约0. 2% (w/v)，特别优选的范围为约 0· 05 至约 0· 1% (w/v)。
[0255] 对于包括致密的胞质纤维网络、细胞间复合物和顶端微细胞结构的细胞骨架组 分，可以使用碱性溶液例如氨水进行溶解。包括铵盐及其衍生物的其他碱性溶液也可用于 溶解细胞骨架组分。合适的铵盐溶液的实例包括硫酸铵、乙酸铵和氨水。在一个优选实施 方案中，使用了氨水。
[0256] 可以根据被去细胞化的生物结构的类型来改变所述碱性溶液例如氨水的浓度。 例如，对于精细组织例如血管，应降低去污剂的浓度。优选的浓度范围可为约0.001至约 2. 0% (w/v)。更优选地为约0. 005至约0. 1% (w/v)。再更优选地为约0. 01% (w/v)至约 0. 08% (w/v) 〇
[0257] 去细胞化的冻干的结构可储存于合适的温度下直至需要使用时。在使用前，可以 将所述去细胞化的结构在合适的等渗缓冲液或细胞培养基中进行平衡。合适的缓冲剂包 括但不限于磷酸盐缓冲溶液（PBS)、盐水、MOPS，HEPES，Hank's平衡盐溶液等等。合适的细 胞培养基包括但不限于RPMI1640、Fisher's培养基、Iscove' s培养基、McCoy's培养基、 Dulbecco' s培养基等等。
[0258] 其他可用的生物相容性材料包括不锈钢、钛、硅酮、金和硅橡胶。
[0259] 可以加固所述聚合物基质或支架。例如，可以在合成基质或支架形成的过程中加 入加固材料，或者在植入之前将加固材料贴附在天然或合成的基质上。用于形成加固的代 表性材料包括天然或合成的聚合物，例如胶原，聚（α酯），例如聚（乳酸），聚（乙醇酸）， 聚原酸酯和聚酸酐，以及它们的共聚物，它们都可以以受控的速度通过水解降解并被吸收。 这些材料可以实现对可降解性、可操作性、大小和构型的最大程度的控制。
[0260] 可以根据机械性质来表征所述可生物降解聚合物，例如使用Instron测试仪来测 量拉伸强度，通过凝胶渗透色谱（GPC)来测量聚合物的分子量，通过差示扫描量热法（DSC) 来测量转变温度，以及通过红外（IR)光谱来测量键结构；或者可以通过毒理学来表征所述 可生物降解聚合物，初始的筛选测试包括Ames测定和体外致畸性测定和动物体内植入研 究，以研究其免疫原性、炎性、释放和降解性质等。可以使用扫描电镜来测定体外细胞贴附 和存活力，使用放射性同位素来进行组织学和定量测定。还可以根据被植入患者体内后材 料降解所需的时间来表征可生物降解材料。通过变化所述构建方式，例如厚度和网筛大小， 所述可生物降解材料基本上能够在约2年至约2个月之间、优选地在约18个月和约4个月 之间、最优选地在约15个月和约8个月之间、最优选地在约12个月和约10个月之间发生 生物降解。如果必要的话，可以构建所述可生物降解材料以使其在约3年或约4年或约5 年更长时间内不发生降解。
[0261] 可以如上所述地使用可控的有孔结构编织所述聚合物基质或支架。可以使用孔的 大小来确定细胞分布。例如，聚合物基质或支架上的孔的大小可以大到使得细胞能够从一 个表面迁移至相对的表面。或者，所述孔可以小到仅能允许聚合物基质或支架的两侧进行 液体流通但不允许细胞通过。为实现这一目的，合适的孔直径可为约0. 04微米至约10微 米、优选地为约0. 4微米至约4微米。在一些实施方案中，聚合物基质或支架的表面可具有 足够大的孔，以使得细胞群可以贴附和迁移至孔中。孔在聚合物基质或支架的底部可以变 得比较小，以防止细胞从所述聚合物基质或支架的一侧迁移至相对侧。具有较小孔直径的 聚合物基质或支架的一个实施方案为层状结构，其中在两层大孔材料之间夹有小孔材料。 聚碳酸酯膜是特别合适的，因为它们在编织时可以精细控制孔的大小，例如孔的大小可为 约0. Ol微米、约0. 05微米、约0. 1微米、约0. 2微米、约0. 45微米、约0. 6微米、约I. O微 米、约2. 0微米和约4. 0微米。在亚微米水平上，所述聚合物基质或支架使得细菌、病毒和 其他微生物可以透过。
[0262] 在设计每一种具体基质或其部分的时候要考虑以下特征或标准：（i)形状、 (ii)强度、（iii)硬度和刚性，和（iv)可缝合性（所述基质或其部分易于被缝合或以其 他方式贴附至邻近组织的程度）。如本文所述，给定基质或支架的硬度透过弹性模量来 定义，弹性模量是表示使支架变形的每单位面积上的压力与导致的变形程度之间比例的 系数。（参见例如 Handbook of Biomaterials evaluation, Scientific, Technical, an d Clinical Testing of Implant Materials, 2nd edition, edited by Andreas F.von Recum, (1999) ；Ratner, et al., Biomaterials Science:An Introduction to Materials in Medicine,Academic Press (1996))。支架的刚性指的是给定支架具有的弹性（或缺乏 弹性）的程度。
[0263] 上述标准的每一个都是变量，例如可以通过材料和制造工艺的选择而被改变，以 使得所述基质或其部分能够最好地被放置和修饰，以治疗医学指征和实现其目的功能。例 如，包括用于膀胱替换、重建和/或扩张的基质或支架的材料必须足够结实，以支持缝合不 会破裂，同时还要有足够的顺应性以容纳变化的尿液体积。
[0264] 最佳地，所述基质或支架的形状应使得：在其生物降解后，所得的重建的膀胱与天 然膀胱一样在空的时候可以收缩，且在从新的器官或组织结构中取出尿路导管后输尿管不 会被堵塞也不会留下漏孔。生物工程膀胱构建体可以以整体方式生产，也可以各个部分独 立生产，或者以特殊部分的方式生产再进行组合。生产的每一个特殊基质或支架部分可具 有特殊功能。或者是为了便于制备而生产特殊部分。特殊部分可由特殊材料构建，并可被 设计为具有特殊性质。特殊部分的性质可包括与天然组织（例如输尿管）相似的拉伸强度 (0. 5至I. 5MPa2)和30至100%的最终延展性，或者收缩拉伸强度为0. 5至28MPa2,最终延 展性为10_200*%，压缩强度可为〈12。
[0265] 优选的是由纤维形成的网筛状结构，所述纤维可为圆形、扇形、扁平型、星型，可以 孤立或与其他纤维交织在一起。分支纤维的使用所基于的原理，与通常用于解决表面面积 对体积的比例增加的问题的原理相同。所有的多细胞生物体均利用这种重复分支结构。分 支系统形成器官之间以及各器官的功能单位之间的通讯网络。使用细胞接种和植入这种构 型使得可以植入大量细胞，每个细胞均与宿主的环境相接触，使得养分和废物能够自由交 换，同时实现血管新生化。所述聚合物基质或支架可根据所需的最终形式、结构和功能制成 弹性或刚性。
[0266] 在一个优选实施方案中，所述聚合物基质或支架由具有15 μ m的平均纤维直径的 聚乙醇酸纤维形成，并使用4-0Polyglactin910缝线形成膀胱形状的模型。将所得的结构 用液化共聚物涂覆，所述液化共聚物例如聚-DL-丙交酯-共-乙交酯50:50,80mg/ml亚甲 基氯，以获得合适的机械形式并固定其形状。
[0267] 在另外一个实施方案中，用生物相容性和可生物降解形凝材料涂覆本发明的支 架。在一个实施方案中，所述形凝材料包括聚丙交酯-共-乙交酯共聚物。在另一个实施 方案中，所述形凝材料为液化的。
[0268] 在另一方面，可以在植入前（在用细胞接种聚合物基质或支架之前或之后）用 添加剂或药物处理本发明的支架，从而例如在植入后促进新组织的再生。因此，例如可以 在所述聚合物基质或支架中加入生长因子、细胞因子、细胞外基质或支架组分以及其他生 物活性材料，从而促进植入物愈合和新组织的再生。通常应根据待被重建、替换或扩张 的组织或器官来选择这样的添加剂，以保证在植入的器官或组织中能够形成合适的新组 织（对于用于促进骨愈合的这类添加剂的实例而言，可参见例如Kirker-Head，C. A. Vet. Surg. 24(5) :408-19(1995))。例如，当使用聚合物基质（任选地接种有内皮细胞）来扩张血 管组织时，可以使用血管内皮生长因子（VEGF)(参见例如美国专利No. 5, 654, 273)来促进 新的血管组织的再生。如果使用加入的细胞，那么可以加入的生长因子和其他添加剂（例 如表皮生长因子（EGF)、肝素结合表皮样生长因子（HBGF)、成纤维细胞生长因子（FGF)、细 胞因子、基因、蛋白等等）的量可超过在聚合物基质上接种的细胞所产生的任何这类生长 因子的量（如果确实产生的话）。优选地，提供的这类添加剂的量足以促进新组织类型的再 生，所述组织类型适合于将要被修复、替换或扩张的组织或器官（例如通过引起或加速宿 主细胞向植入物中的渗透）。其他可用的添加剂包括抗细菌药剂抗生素。
[0269] 一种优选的支撑基质或支架含有交叉的细丝，在所述细胞支撑物被植入后，它们 可以使得营养物通过很短的距离扩散至细胞而使得细胞能够存活。在植入后，随着细胞团 的扩增，所述细胞支撑基质或支架能够同步地被血管化。
[0270] 在植入前在体外进行三维结构构建体的构建，可以促进细胞在植入后在体内的最 终分化，并且尽可能地降低对所述基质的炎性反应的风险，由此避免了植入物的挛缩和收 缩。
[0271] 在使用前，可以使用任何已知的方法对所述聚合物基质或支架进行灭菌。所使用 的方法取决于在聚合物基质中所使用的材料。灭菌方法的实例包括蒸汽灭菌、干热灭菌、放 射灭菌、用例如环氧乙烷的气体灭菌，以及气体和煮沸灭菌。
[0272] 组成支架的合成材料可使用例如溶剂浇铸、模压、拉细丝、结网、浸析、编织和涂覆 等方法来成型。在溶剂浇铸方法中，将一种或多种聚合物溶于适当的溶剂例如二氯甲烷中 形成溶液，将所述溶液浇铸在分枝形状的浮雕结构上。在溶剂蒸发后获得薄膜。在模压方 法中，将聚合物在最高达30, 000磅/平方英寸的压力下压成适当的形状。拉细丝包括从熔 融聚合物中拉丝，结网包括通过将纤维压制成毛毡状的材料而形成网筛。在浸析方法中，将 含有两种物质的溶液喷洒为接近所述构建体的最终形式的形状。然后用溶剂溶解掉其中一 种组分，导致孔隙的形成（参见Mikos,美国专利No. 5, 514, 378,通过援引的方式纳入本 文）。在成核方法中，将支架形状的薄膜暴露于放射性裂变产物以产生放射性损坏材料的 痕迹。然后用酸或碱蚀刻聚碳酸酯层，将放射性损坏材料的痕迹翻印成孔。最后可以使用 激光成型和在许多材料中烧穿成孔，以形成具有均匀孔径的结构。涂覆指的是用例如液化 共聚物（聚-DL-丙交酯-共-乙交酯50:5080mg/ml亚甲基氯）的材料涂覆或浸透聚合物 结构，从而改变其机械性质。可以进行一层涂覆，也可以进行多层涂覆，直至获得所需的机 械性质。上述成型技术可以组合使用，例如，聚合物基质或支架可被编织、模压和胶粘在一 起。而且，通过不同工艺成型的不同聚合物材料可以连接在一起形成组合形状。所述组合 形状可为层状结构。例如，可以将一种聚合物基质或支架贴附在一种或多种聚合物基质上 以形成多层聚合物基质或支架结构。这种贴附可以通过使用液体聚合物胶粘或通过缝合来 进行。此外，所述聚合物基质或支架可以以固体块的形式形成，并通过激光或其他标准技术 来成型至其所需的最终形式。激光成型指的是使用激光去除材料的过程。
[0273] 在一个优选实施方案中，所述支架由无纺聚乙醇酸（PGA)毛毡和聚（乳酸-共-乙 醇酸）聚合物（PLGA)形成。在另一个优选实施方案中，所述支架为尿流改道支架。
[0274] 如Bertram等人的美国专利公布20070276507(其全部内容通过援引的方式纳入 本文），本发明的聚合物基质或支架可成型为任意数量的所需构型，以满足其任意数量的总 体系统、几何学或空间的限制。所述基质可为三维基质，并且经过成型以符合层状结构的腔 体器官或组织结构的尺寸和形状.例如，当使用聚合物基质进行膀胱重建时，可以使用经 过成型而符合整个膀胱或其一部分的三维基质。天然地，所述聚合物基质可成型为不同的 大小和形状，以符合不同体型的患者的膀胱。任选地，所述聚合物基质在成型后应使得在其 生物降解后，所得的重建的膀胱在排空时能够像天然的膀胱一样地可收缩。所述聚合物基 质也可成型为其他形式，以适应患者的特殊需要。例如，先前具有损伤或功能障碍的患者可 能具有改变的腹腔，因此可能需要特殊的膀胱替换支架、膀胱扩张支架、膀胱管道支架和逼 尿肌肌肉等效物支架来配合。
[0275] 在一个方面，本发明考虑了适于与本文所述的平滑肌细胞群一起使用的其他支 架。例如，可以提供适于植入至肺部的支架。
[0276] A.扩张或替换令·架
[0277] 在另一方面，所述聚合物基质或支架的形状符合膀胱的一部分。在一个实施方 案中，所述成型的基质为适于替换所述受体已有膀胱的至少约50%、至少约60%、至少约 70 %、至少约80 %、至少约90 %或至少约95 %。在另一方面，所述成型的聚合物基质或支架 与膀胱的100%或全部膀胱相符合。
[0278] 在一个实施方案中，所述聚合物基质包括一个第一可植入的、生物相容性的、合成 的或天然的、具有两个分离表面的聚合物基质或支架；和一个第二可植入的、生物相容性 的、合成的或天然的、具有两个分离表面的聚合物基质或支架，它们适合于彼此接合，并且 其在接合时的形状符合需要治疗的腔体器官或组织结构至少一部分。所述第一和第二聚合 物基质可由一个整体单元形成并被分为两个或多个不同部分，或者由两个或多个不同部分 形成并适于接合。在一些实施方案中，所述第一和第二聚合物基质在接合后可用于腔体器 官或组织结构的重建、修复、扩张或替换。
[0279] 在一些实施方案中，所述第一和第二聚合物基质是对称的，而在其他实施方案中， 所述第一和第二聚合物基质是不对称的。在一个实施方案中，所述第一聚合物基质或支架 具有半球形或准半球形的形状，有一个封闭的圆顶末端和一个开放的赤道状边缘；所述第 二聚合物基质或支架具有适于与所述第一聚合物基质的赤道状边缘结合的卡圈。在另一个 实施方案中，所述第一和第二聚合物基质均为半球或准半球状，有一个封闭的圆顶末端和 一个开放的赤道状边缘。在又另一个实施方案中，所述第一和第二聚合物基质各具有一个 圆形或半圆形的底座和至少2个从所述底座呈放射状延伸的花瓣形部分。在这一实施方案 中，所述第一和所述第二聚合物基质的底座和花瓣形部分彼此接合产生一个空心球状或准 球状的基质或支架，从而使得在所述接合的聚合物基质的一侧形成一个纵向凸出的椭圆形 开口，而在所述纵向开口的对侧形成一个圆形开口。在另一个实施方案中，所述第一和第二 聚合物基质由三部分组成，包括适于接合的顶片、前片和侧片。在这一实施方案中，所述三 个不同的部分通过至少三个、优选为四个垂直接缝而接合，从而形成冠状的新的膀胱构建 体。优选地，冠状构建体单独用作用于腔体器官的重建、修复、扩张或替换的装置。在一个 实施方案中，所述构建体为膀胱扩张支架。膀胱扩张支架的一个实例示于图1。在另一个实 施方案中，所述构建体为膀胱替换支架。膀胱替换支架的一个实例示于图2。
[0280] 此外，当所述构建体必须与天然脉管或管道相连接时，所述第一聚合物基质和/ 或所述第二聚合物基质可包括至少一个适于接受管状脉管或插入物的容器或端口。所述脉 管或插入物本身为例如圆柱状或管状的成型聚合物基质，各自具有至少一个位于所述圆柱 状聚合物的第一末端的凸缘。优选地，所述所述脉管或插入物由与上述第一或第二聚合物 基质相同的生物相容性材料构成。在一些实施方案中，所述脉管或插入物还包括适于包围 所述圆柱状或管状脉管或插入物聚合物基质的垫片。例如，所述垫片为水凝胶。任选地，所 述所述圆柱状或管状脉管或插入物包括垫片。所述垫片可为水凝胶。此外，所述圆柱状或 管状插入物可为自我稳定的。
[0281] 在另一个实施方案中，当所述支架或基质（在用细胞接种后）必需与天然脉管或 管道相连接时，所述适于接受管状脉管或插入物的容器或端口也应用于下文所述的其他基 质。
[0282] B.尿流改道
[0283] 本发明提供了可被细胞接种并用作在受试者的尿流改道的构建中替换胃肠道组 织的新的尿流改道或管道支架。例如，本文所述的新的尿流改道可用于接受了膀胱根除术 治疗的患者，否则所述患者可能需要使用回肠回路改道。
[0284] 在一个方面，本发明考虑了适于用作有需要的受试者的尿流改道的管道支架或基 质，所述管道支架或基质由本文所述的方法形成。所述管道支架的一端可以与一条或多条 输尿管相连接，另一端可以与受试者体外的尿液储库相连接。在一个实施方案中，所述管道 可以通过开孔而通向受试者的体外。在另一个实施方案中，所述聚合物基质包括一个以管 状形式提供的第一可植入的、生物相容性的、合成聚合物基质或支架。在一些实施方案中， 所述管状支架包括一个被设计为与受试者的输尿管相连接的第一末端。在另一个实施方案 中，所述第一支架还包括一个被设计为在受试者体内形成开孔或括约肌的第二末端。在另 一个实施方案中，所述第一支架还包括至少一个被设计为与至少一条输尿管相连接的侧部 开孔。在一些实施方案中，所述第一支架包括被设计为与第一输尿管相连接的第一侧部开 孔和被设计为与第二输尿管相连接的第二侧部开孔。
[0285] 在另一个实施方案中，所述管状结构包括一个具有平滑边缘的第一末端和具有不 均一或不不平滑边缘的第二末端。所述不均一边缘可包括一个圆形的底座和从该底座呈放 射状延伸的几个花瓣形部分。所述花瓣形部分的数目可为1个、2个、3个、4个、5个或6个。 所述不平滑边缘可包括例如图3所示的一系列花瓣形部分。在一个实施方案中，所述管状 结构具有适于用作有需要的患者的尿流改道系统或管道的形式。在另一个实施方案中，例 如在输尿管切除术的情况下，所述系统使尿液从一条或多条输尿管改道至腹腔壁区域。在 其他实施方案中，例如在膀胱切除术的情况下，所述系统使尿液从膀胱改道至腹腔壁区域。 在另一个实施方案中，所述系统使膀胱和尿道相连接。在又另一个实施方案中，可以用一个 第一系统使尿液从一条或多条输尿管改道至腹腔壁区域，并使用一个第二系统使尿液从膀 胱改道至腹腔壁区域。在所有实施方案中，所述系统可使尿液从一条或多条输尿管改道至 腹腔壁区域，例如形成开孔。
[0286] 在另一个实施方案中，所述管状基质或支架为尿流改道或管道支架。
[0287] 在一个实施方案中，所述尿流改道系统的管状结构的截面形状为矩形、圆形或三 角形。图3A显示了本文所考虑的一些不同的截面形状。
[0288] 在另一个实施方案中，管状结构保留足够的刚性，以在植入后保持畅通。在另一个 实施方案中，通过或不通过在上述管状结构的腔中使用导管来保持其刚性。当使用导管时， 可将其置于所述管状结构的腔空间内以提供额外的通透性。
[0289] 在另一个实施方案中，所述管道支架还可包括一个圆形或卵形的第二支架，其被 设计为将所述第一支架的第一末端与输尿管相连接。在又另一个实施方案中，所述管道支 架还可包括一个垫圈形的第三支架，其被设计为开孔或括约肌的形式并与所述第一管状支 架的第二末端一起形成受试者身体的开孔。图3B显示了尿流改道构建体的变化方案（A-开口呈卵形；B-开口呈卵形的容器；C-封闭的卵形容器和三个管）。
[0290] 在一些实施方案中，所述管状结构可包括垫片结构，以用于连接至组织、器官或身 体部分，以实现吻合从而形成可控的开孔或括约肌。在另一个实施方案中，所提供的垫片的 厚度小于约lmm、小于约I. 5mm、小于约2mm、小于约2. 5mm、小于约3mm、小于约3. 5mm、小于 约4mm、小于约4. 5mm或小于约5mm。
[0291] 在一个实施方案中，所述尿流改道或管道支架被成型为图3所示的构型。
[0292] 在另一个实施方案中，所述管状结构包括一个具有平滑边缘的第一末端和一个具 有不均一或不平滑边缘的第二末端。所示不均一边缘可包括一个或多个紧固件，被设计为 与受试者的外部区域相连接，例如以开孔至受试者体外的形式。在一个实施方案中，所述管 状结构的第一和第二末端可为图3所示的形式。所示紧固件的数量可为1个、2个、3个、4 个、5个或6个。
[0293] 在另一个实施方案中，所述管状支架具有如图27所示的形式。
[0294] 图4A显示了正常人类泌尿系统的一部分解剖结构。
[0295] 在一个实施方案中，所述管状结构的形式适于用作有需要的患者体内的尿流改道 或管道。在另一个实施方案中，在另一个实施方案中，例如在输尿管切除术的情况下，所述 管道使尿液从一条或多条输尿管改道至腹腔壁区域（图4D)。在其他实施方案中，例如在膀 胱切除术的情况下，所述管道使尿液从膀胱改道至腹腔壁区域（图4B)。在另一个实施方案 中，所述管道使膀胱和尿道相连接（图4D)。在又另一个实施方案中，可以用一个第一管道 使尿液从一条或多条输尿管改道至腹腔壁区域，并使用一个第二管道使尿液从膀胱改道至 腹腔壁区域。在所有实施方案中，所述管道可使尿液从一条或多条输尿管改道至腹腔壁区 域（图4B)。在所有实施方案中，所述管道均可被设计为形成开孔。
[0296] 在一个实施方案中，所述尿流改道或管道支架的管状结构的截面形状为矩形、圆 形或三角形。在另一个实施方案中，所述管状结构保留足够的刚性，以在植入后保持畅通。 在另一个实施方案中，通过或不通过在上述管状结构的腔中使用导管来保持其刚性。在一 些实施方案中，尿流改道支架还包括被设计为在植入后置于所述管状结构的腔空间内的导 管。在一个实施方案中，所述导管为类似Foley氏管的球囊导管。当使用导管时，可将其置 于所述管状结构的腔空间内以提供额外的通透性。本领域普通技术人员能够知晓可适用于 本发明的本领域中已知的其他导管。
[0297] 在另一个实施方案中，所述支架的管状壁厚度应为小于约2mm、小于约2. 5mm、小 于约3. 5mm、小于约4mm、小于约4. 5mm、小于约5mm、小于约5. 5mm或小于约6mm。
[0298] 在一些实施方案中，所述支架可具有可变的外径和内径。在一个实施方案中，所述 支架的末端可为喇叭口形、非喇叭口形、封口形或圆形。
[0299] 在其他实施方案中，所述支架可允许尿液透过。在一个实施方案中，所述支架的孔 径大于约〇微米至约500微米。在另一个实施方案中，所述孔径为约100微米至约200微 米。在另一个实施方案中，所述孔径为约150微米至约200微米。在其他实施方案中，所述 孔径为约100微米、约110微米、约120微米、约130微米、约140微米、约150微米、约160 微米、约170微米、约180微米、约190微米或约200微米。在一些实施方案中，所述孔径为 约100微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米或约600微米。在其他实施 方案中，所述支架的孔径构型包括单孔径分布、多孔径分布或梯度孔径分布。
[0300] 在另一个实施方案中，所述支架材料可缝合的，并且可以与组织形成不渗漏的连 接。
[0301] 在其他实施方案中，选择所述管状支架的材料，以保证在为在植入应用的过程中 保持通畅、支持细胞贴附和与宿主组织一起生长并保持柔性。在另一个实施方案中，所述材 料的爆裂强度应超过其在与体内的正常体液循环接触时所承受的压力。在其他实施方案 中，所述材料应具有与宿主组织生长相适应的降解时间。
[0302] C.肌肉等效物
[0303] 在一个方面，本发明的聚合物基质或支架为肌肉等效物支架。在一个实施方案中， 肌肉等效物支架为逼尿肌肌肉等效物支架。在另一个实施方案中，所述支架适用于通过腹 腔镜手术植入。
[0304] 在一个方面，聚合物基质包括其形状适合于至少一部分需要所述治疗的器官或组 织结构和其大小是足够通过腹腔镜方法植入的聚合物基质或支架。在某些实施方案中，本 发明的聚合物基质或支架长度约为3至20cm之间。在一个实施方案中，聚合物基质或支架 的最大长度约20cm。在另一个实施方案中，聚合物基质或支架的最大长度约15cm。在另一 个实施方案中，聚合物基质或支架的最大长度约l〇cm。在另一个实施方案中，聚合物基质或 支架的最大长度约8cm。在另一个实施方案中，聚合物基质或支架的最大长度约4cm。在又 另一个实施方案中，聚合物基质或支架的最大长度约3cm。在某些实施方案中，本发明的聚 合物基质或支架的宽度约为1至8cm之间。在一些实施方案中，聚合物基质或支架的最大 宽度约4cm。在其他实施方案中，聚合物基质或支架的最大宽度约3cm。在另外的实施方式 中，聚合物基质或支架的最大宽度约5cm。
[0305] 在一个实施方案中，聚合物基质或支架具有三维（3-D)形状。在另一个实施方案 中，聚合物基质或支架具有扁平形状。在一个实施方案中，所述扁平形状的聚合物基质或 支架包括预处理区域以允许更大的灵活性。在某些实施方案中，该预处理区域在将要褶皱 的区域中具有涂层。在一个实施方案中，聚合物基质或支架具有足够的延展性以便进行卷 曲、折叠或成型以用于通过腹腔镜管和/或端口进行植入。在这种实施方式中，聚合物基质 或支架具有足够的延展性以便展开、铺开或恢复到穿过腹腔镜管和/或端口插入之后的形 状。在一个实施方案中，聚合物基质或支架在通过腹腔镜管和/或端口植入之前被切割成 2、3、4、5、6、7、8、9或10个条带。在某些实施方案中，该2、3、4、5、6、7、8、9或10个条带在通 过腹腔镜管和/或端口植入之前彼此接合。该2、3、4、5、6、7、8、9或10个条带可通过胶水、 订书钉、缝线或本领域普通技术人员熟知的其他技术方式接合在一起。在这种实施方式中， 该2、3、4、5、6、7、8、9或10个条带为折叠的和/或堆叠的以穿过腹腔镜管和/或端口。在 这种实施方式中，该2、3、4、5、6、7、8、9或10个条带在穿过腹腔镜管和/或端口插入之后为 展开的和/或铺开的。在一些实施方案中，在正确地穿过腹腔镜管和/或端口插入之后，先 前放置的接合装置被收紧。
[0306] 在一个实施方案中，聚合物基质包括一个第一可植入的、生物相容性、合成的或天 然的聚合物基质或支架，其具有补片或条带样式。在一个实施方案中，该补片具有适合于用 作患者所需的膀胱中逼尿肌肌肉等效物的样式。在另一个实施方案中，该补片具有适合于 用作患者所需的增大已有膀胱容积的样式。在某些实施方案中，该补片将膀胱的大小增大 了约50mL至约500mL。在一些实施方案中，该补片增大了膀胱大小50mL。在一些实施方案 中，该补片增大了膀胱大小约450mL。在一个实施方案中，表面面积增大了 30cm2使得200mL 的膀胱容积增大到250mL。在另一个实施方案中，表面面积增大了 25cm2使得350mL的膀胱 容积增大到400mL。在一个实施方案中，所述支架具有约30cm 2的二维表面积。在另一个实 施方案中，所述支架具有约25cm2的二维表面积。在一个实施方案中，所述补片为条带、圆 盘、方形、椭圆或其他任意合适的样式。在其他实施方案中，所述补片具有预折叠的样式，例 如风琴状。
[0307] 图5A-B示出了肌肉等效物支架或聚合物基质的示例。在一个实施方案中，聚合物 基质或支架为双楔形状，例如图5A所示的形状。在另一个实施方案中，聚合物基质成型为 图6-9所示出的其中一种结构。
[0308] 在所有实施方案中，聚合物基质或支架成型为以使得膀胱和基质或支架上的应变 最小化。
[0309] 在另一个实施方案中，聚合物基质包括一个第一可植入的、生物相容性、合成的或 天然的聚合物基质或支架，其具有补片或条带样式。在一个实施方案中，该补片具有适合于 用作患者所需的膀胱中逼尿肌肌肉等效物的样式。在另一个实施方案中，该补片具有适合 于用作患者所需的增大已有膀胱容积的样式。在一些实施方案中，该补片增大了膀胱大小 50mL。在一个实施方案中，所述补片为条带、圆盘、方形、椭圆或其他任意合适的样式。在其 他实施方案中，所述补片具有预折叠的样式，例如风琴状。
[0310] 在一个实施方案中，聚合物基质成型为图1-9或27所示出的其中一种结构。
[0311] 在所有实施方案中，所述用于这些基质或支架生物相容性材料例如是可生物降解 的。在全部这些实施方案中，所述生物相容性材料可为聚乙醇酸。
[0312] 在所有实施方案中，聚合物基质或支架涂覆有生物相容性和可生物降解的形凝材 料。在一个实施方案中，所述形凝材料可以包括液化共聚物。在另一个实施方案中，所述液 化共聚物可以包括液化乳酸/乙醇酸共聚物。在一个实施方案中，所述液化共聚物可包括 聚-DL-丙交酯-共-乙交酯。
[0313] 5.构律体
[0314] 在一个方面，本发明提供一种或多种至少接种了一种细胞群的聚合物支架或基 质。这些支架已经接种了一种细胞群，在本文中可被称为"构建体"。在一个实施方案中， 该细胞接种的聚合物基质或基质形成新的膀胱构建体，该新膀胱构建体选自膀胱替代构建 体、膀胱扩张构建体、膀胱管道构建体和逼尿肌肌肉等效物构建体。
[0315] 本领域技术人员能够知晓本文描述的一种或多种细胞群的接种或沉积可以通过 现有技术中各种已知的方法来实现。例如，生物反应器孵化和培养（美国公布的Bertram 等人的专利申请20070276507 ;McAllister等人的美国专利7, 112, 218 ;Auger等人的 美国专利5, 618, 71 ;Niklason等人的美国专利6, 537, 567)、压力引诱接种（Torigoe et al. (2007)Cell Transplant. , 16(7):729-39 ；ffang et al. (2006)Biomaterials. May ； 27(13) :2738-46)和静电接种（Bowlin等人的美国专利5, 723, 324)可以使用。此外，最新的 同时在电纺纤维外上细胞气溶胶衣的技术对接种或者沉积来说也可以是合适的（Stankus et al. (2007)Biomaterials, 28:2738-2746)〇
[0316] 在一个实施方案中，细胞的沉积包括将支架和增强细胞附着的蛋白质接触的步 骤。在另一个实施方案中，该增强蛋白为纤维连接蛋白、胶原质和MATRIGEL?的一种或多 种。在另一个实施方案中，该支架不包含增强细胞附着的蛋白质。在另一个实施方案中，细 胞的沉积包括在将支架与细胞群接触后的培养步骤。在又另一个实施方案中，该培养可能 包括一个生物反应器中脉动的和/或稳定的流动。
[0317] 从本文描述的脂肪或外周血分离的平滑肌细胞群可以在本文所述的支架上接种。
[0318] 以下为在支架上接种细胞的方法的代表性实例。脂肪的或外周血来源的平滑肌细 胞可以扩增最长达7周，以产生在支架上接种所需的细胞数量。适于在支架上接种的细胞 的密度如下所述。脂肪来源的平滑肌细胞可在细胞收获前扩增2代，以在支架上接种产生 构建体。外周血来源的平滑肌细胞为在支架上接种的培养可在收获之前扩增3-4代。为提 供细胞接种的支架，合适的材料（例如PGA毛毡）可以切成一定大小，缝合成合适的形状， 并涂覆材料（例如PLGA)。该支架然后可以用合适的方法灭菌（例如环氧乙烷）。在细胞 接种的前一天，该灭菌的支架可以通过60 %乙醇/40 % D-PBS、100 % D-PBS、D-MEM/10 % FBS 或α -MEM/10% FBS预湿而饱和，接着室温下在D-MEM/10% FBS或α -MEM/10% FBS里培养 过夜。支架可以接种脂肪来源的或外周血来源的平滑肌细胞，在湿润的、37°C含5%的CO2 的培养器中使构建体成熟，直至植入受试者体内（例如7天）。本领域普通技术人员能够知 晓为制备用于细胞接种的支架和在支架上接种细胞的其他方法。
[0319] 在一个方面，本发明提供了在减少的时间框架下制备构建体的方法，这对等待植 入构建体的所述受试者有益。据报道，来源于SVF的未分化的脂肪干细胞在分化成平滑肌 细胞之前必须在诱导培养基中培养6星期（Jack et al. 2009,见上文）。在一个实施方案 中，所述方法包括下述步骤：a)获得人类脂肪组织样本；b)从样本中分离完全分化的平滑 肌细胞群；c)培养所述细胞群；和d)将所述细胞群与聚合物基质细胞构建体接触，其中步 骤a)、b)、c)和d)需要实施约45天或少于45天的时间。在另一个实施方案中，该分离步 骤是在没有细胞筛选的情况下实施的。在另一个实施方案中，该分离步骤b)是在完成步骤 a)后实施约72小时或少于72小时的时间。在又另一个实施方案中，所述培养步骤c)实施 约4周或少于4周的时间。在其他实施方案中，该接触步骤d)实施约10天或少于10天的 时间。在另一个实施方案中，步骤a)、b)、c)和d)实施28天或少于28天的时间。在另一 个实施方案中，该分离步骤b)在完成a)步骤后实施约48小时或少于48小时的时间。在 一个实施方案中，所述培养步骤c)实施约2周或少于2周的时间。在另一个实施方案中， 该接触步骤d)实施约5天或少于5天的时间。在所有实施方案中，该人类脂肪组织样本均 从自体来源获得。在另一个实施方案中，所述方法还包括检测平滑肌细胞标记物的表达的 步骤。在另一个实施方案中，所述表达为mRNA表达。在另外一个实施方案中，所述表达为 多肽表达。在一个实施方案中，该多肽表达由细胞内免疫荧光检测。
[0320] 在一个实施方案中，该支架包括本文所述的细胞群。在另一个实施方案中，该支架 基本上由本文所述的细胞群构成。在另一个实施方案中，该支架由本文所述的细胞群组成。
[0321] 所述第一聚合物基质或第二聚合物基质，如果有的话，或两者都有，包含至少一种 细胞群，该细胞群沉积在所述第一聚合物基质的一个第一表面、所述第二聚合物基质的一 个第一表面的表面上或表面中，或两者都有，以形成基质或支架加细胞的构建体，其中至少 一种细胞群基本上包括一个肌细胞群。该肌细胞群例如为平滑肌细胞群。在一个优选实施 方案中，所述第一表面和所述第二表面为所述第一和第二聚合物基质的每个外部表面。
[0322] 在另一个实施方案中，所述包含基质和细胞的构建体不含任何其他细胞群。在一 个优选实施方案中，所述构建体不含有尿道上皮细胞。
[0323] 这些构建体是用于向有需要的受试者提供腔体器官或组织结构，如泌尿生殖器器 官，包括例如膀胱、输尿管和尿道。所述受试者可能需要重建、修复、扩张或替换这些器官或 组织。在一个实施方案中，该腔体器官或组织结构为膀胱或其部分，该聚合物基质或支架在 该基质表面沉积有平滑肌细胞。该构建体也可能用于提供尿流改道或管道、或逼尿肌肌肉 等效物。
[0324] 在一个方面，本发明提供尿流改道或管道支架或接种本文所述的细胞群的基质。 该支架已接种细胞群，在本文中可被称为"构建体"。在一个实施方案中，该尿流改道或膀胱 管道构建体由本文所述的一种或多种支架和沉积于本文所述的一种或多种支架的一个或 多个表面上的细胞群组成。
[0325] 在一个方面，本发明提供了肌肉等效物构建体，其可用于为有需要的受试者增强 已有的腔体器官或组织结构如泌尿生殖器器官，包括例如膀胱。所述受试者可能会需要这 些器官或组织的扩张或治疗。在一个实施方案中，该腔体器官或组织结构为膀胱或其部分， 该聚合物基质或支架在基质表面沉积有平滑肌细胞。在一个实施方案中，该构建体用于提 供逼尿肌肌肉等效物.。
[0326] 本领域普通技术人员能够知晓在基质或支架上沉积细胞群有数种合适的方法。
[0327] 在一个方面，构建体适合于植入需要新器官或组织结构的受试者体内。在一个实 施方案中，所述构建体包括产生细胞因子MCP-I的细胞群。在另一个实施方案中，该MCP-I 引起受试者或受体的天然间充质干细胞向植入位置迁移。在一个实施方案中，所述受体的 迁移的天然间充质干细胞帮助新器官或组织结构的再生。
[0328] 在另一方面，本发明提供特定密度的细胞接种的支架。在一个实施方案中，一个 支架由细胞密度约20 X IO6至约30 X IO6个细胞的平滑肌细胞群接种。在另一个实施方案 中，该细胞密度为约IX IO6至约40 X 106、约IX IO6至约30 X 106、约IX IO6至约20 X 106、 约IX IO6至约IOX 106,或约IX IO6至约5X IO6个细胞。
[0329] 在另外一个实施方案中，该密度为约20X IO6至约98X IO6个细胞。在再另一个 实施方案中，该密度为约21 X IO6至约97X 106、约22X IO6至约95X 106、约23X IO6至约 93 X 106、约 24 X IO6 至约 91 X 106、约 25 X IO6 至约 89 X 106、约 26 X IO6 至约 87 X 106、约 28 X IO6 至约 85 X 106、约 29 X IO6 至约 83 X 106、约 30 X IO6 至约 80 X 106、约 35 X IO6 至约 75 X 106、约 40 X IO6 至约 70 X 106、约 45 X IO6 至约 65 X 106,或约 50 X IO6 至约 60 X IO6 个细 胞。在一个优选实施方案中，该密度为约24X IO6至约91 X IO6个细胞。
[0330] 在另一个实施方案中，该密度为约2. 5 X IO6至约40 X 106、约5 X IO6至约40 X 106、 约 7. 5 X IO6 至约 35 X 106、约 10 X IO6 至约 30 X 106、约 15 X IO6 至约 25 X IO6 和约 17. 5 X IO6 至约22. 5X IO6个细胞。在另一个实施方案中，该细胞密度为约IX 106、约2X106、约 3 X 106、约 4 X 106、约 5 X 106、约 6 X 106、约 7 X 106、约 8 X 106、约 9 X 106、约 10 X 106、约 11\106、约12\106、约13\10 6、约14\106、约15\106、约16\106、约17\10 6、约18父106、 约 19X106、约 20X 106、约 21X106、约 22X 106、约 23X 106、约 24X 106、约 25X 106、约 26X 106、约 27X 106、约 28X 106、约 29X 106、约 30X 106、约 31X 106、约 32X 106、约 33X 106、 约 34X 106、约 35X 106、约 36X 106、约 37X 106、约 38X 106、约 39X 106、约 40X 106、约 41X 106、约 42X 106、约 43X 106、约 44X 106、约 45X 106、约 46X 106、约 47X 106、约 48X 106、 约 49X 106、约 50X 106、约 51X106、约 52X 106、约 53X 106、约 54X 106、约 55X 106、约 56X 106、约 57X 106、约 58X 106、约 59X 106、约 60X 106、约 61X 106、约 62X 106、约 63X 106、 约 64X 106、约 65X 106、约 66X 106、约 67X 106、约 68X 106、约 69X 106、约 70X 106、约 71X 106、约 72X 106、约 73X 106、约 74X 106、约 75X 106、约 76X 106、约 77X 106、约 78X 106、 约 79X 106、约 80X 106、约 81X106、约 82X 106、约 83X 106、约 84X 106、约 85X 106、约 86X 106、约 87X 106、约 88X 106、约 89X 106、约 90X 106、约 91X 106、约 92X 106,约 93X 106、 约 94X 106、约 95X 106、约 96X 106、约 97X 106、约 98X IO6 或约 99X IO6 个细胞。
[0331] 在又另一方面，本发明提供接种细胞的支架，该细胞在一支架的每cm2有特定的细 胞密度。在一个实施方案中，该密度为约3, 000细胞/cm2至约15, 000细胞/cm2、约3, 500 细胞/cm2至约14, 500细胞/cm2、约4, 000细胞/cm2至约14, 000细胞/cm2、约4, 500细胞 /cm2 至约 13, 500 细胞 /cm2、约 5, 000 细胞 /cm2 至约 13, 000 细胞 /cm2、约 4, 500 细胞 /cm2 至约13, 500细胞/cm2、约5, 000细胞/cm2至约13, 000细胞/cm2、约5, 500细胞/cm2至约 12, 500 细胞/cm2、约 6, 000 细胞/cm2 至约 12, 000 细胞/cm2、约 6, 500 细胞/cm2 至约 11，500 细胞/cm2、约7, 000细胞/cm2至约11，000细胞/cm2、约7, 500细胞/cm2至约10, 500细胞 /cm2、约 8, 000 细胞 /cm2 至约 10, 000 细胞 /cm2、约 7, 500 细胞 /cm2 至约 9, 500 细胞 /cm2， 或约8, 000细胞/cm2至约9, 000细胞/cm2。在一个优选实施方案中，该密度为约3, 000细 胞/cm2至约7, 000细胞/cm2,或约9, 000细胞/cm2至约15, 000细胞/cm2。
[0332] 在一个方面，本发明的构建体适于在植入后为所述受试者提供特定的特征。在一 个实施方案中，该构建体适于在植入后为所述受试者提供再生。在另一个实施方案中，该构 建体适于促进受试者在植入位置的再生。例如，在植入之后，再生的组织可以在植入位置从 所述构建体自身中形成。在另一个实施方案中，所述构建体可以在植入之后赋予所述受试 者功能性的特征。例如，尿流改道构建体可适于赋予受试者的尿液从一个第一输尿管（例 如第一侧部开孔）到管状支架的内部的通路，和/或适于在受试者外部提供临时性尿液储 存和通路（例如管状支架）。在一个实施方案中，尿流改道构建体可适于在植入后提供上皮 化的粘膜。在另一个实施方案中，构建体可适于提供受试者体内的新器官或组织结构的稳 态调节的发育。
[0333] 6.俥用方法
[0334] 在一个方面，本发明考虑了为需要这类治疗的受试者提供层状结构的腔体器官或 组织结构的方法。在一个实施方案中，该受试者可能需要重建、修复、扩张、或替换器官或组 织。在一个实施方案中，所述方法包括提供生物相容性的合成的或天然的聚合物基质的步 骤，这些基质成形，以根据器官或组织结构的需要符合至少器官或组织结构的部分。该提供 步骤之后，可以沉积本文所述的至少一种非来源于需重建、修复、扩张或替换的所述受试者 的该器官的组织结构的细胞群。该沉积步骤可以包括在聚合物基质上培养所述细胞群。在 基质上沉积所述细胞群以提供构建体之后，可以将其植入患者体内的治疗位置以形成所需 的层状结构的腔体器官或组织结构。在一个实施方案中，该层状结构的腔体器官或组织结 构为膀胱或膀胱的一部分。
[0335] 在另一方面，本发明提供了为有需要的受试者提供层状结构的腔体器官或组织结 构的方法。在一个实施方案中，所述方法包括下述步骤：a)提供生物相容性的合成的或天 然的聚合物基质，该基质的形状符合需要所述治疗的该器官或组织结构的至少一部分；b) 在聚合物基质的第一区域上或其中沉积并非来源于与新器官或组织结构相应的天然器官 或组织的自体细胞群；和c)将所述成型的聚合物基质细胞构建体植入所述受试者，以形成 层状结构的腔体器官或组织结构。在另一方面，本发明提供了向有需要的受试者提供新的 膀胱或其部分的方法。在一个实施方案中，所述方法包括a)提供生物相容性的合成的或天 然的聚合物基质，该基质的形状符合膀胱或其部分；b)在聚合物基质的第一区域上或其中 沉积并非来源于受试者膀胱的自体细胞群；和c)将所述成形的聚合物基质细胞构建体植 入所述受试者以形成新的膀胱或其部分。在另一个实施方案中，本文所述方法的所述步骤 b)的细胞群中包含一种或多种外周血来源的平滑肌细胞，它们对平滑肌细胞标记物呈阳性 并具有收缩功能，或步骤b)所述细胞群包含一种或多种脂肪组织来源的平滑肌细胞，它们 对平滑肌细胞标记物呈阳性并具有收缩功能。在另一个实施方案中，所述细胞群的收缩功 能是钙依赖性的。
[0336] 在一个实施方案中，本发明的方法还包括用受试者的网膜、肠系膜、肌肉筋膜、和/ 或腹膜包裹管道构建体以使其血管化的步骤。
[0337] 在另一方面，本发明提供了为有需要的受试者的有缺陷的膀胱提供尿流改道或管 道的方法。在一个实施方案中，所述给有需要的受试者提供尿流改道的方法包括下述步骤： (a)提供生物相容性管道支架；(b)在所述支架的第一区域上或其中沉积第一细胞群，所述 第一细胞群实质上为肌肉细胞群；和（C)将步骤（b)的支架植入所述受试者以形成允许尿 液流出所述受试者体外的管道。在另一个实施方案中，该生物相容性材料为可生物降解的。 在其他实施方案中，该生物相容性材料为聚乙醇酸。在又另一个实施方案中，所述第一细胞 群实质上为平滑肌细胞群。
[0338] 在一个实施方案中，所述方法包括提供本文所述的尿流改道或管道支架的方法。 在其它另一个实施方案中，该尿流改道或管道支架以多部分的形式提供，如第一个支架、第 二个支架和第三个本文所述的支架。在另一个实施方案中，所述方法还包括沉积并非来源 于该有缺陷的膀胱的细胞群以形成尿流改道或管道构建体的步骤。在另一个实施方案中， 该沉积步骤可以包括在所述支架上培养所述细胞群。在一些实施方案中，所述方法还包括 将尿流改道构建体植入有需要的患者的步骤。在另一个实施方案中，该植入是在有缺陷的 膀胱的位置。
[0339] 在一个实施方案中，所述构建体的开口末端（例如，一个被设计为与腹腔壁相连 接的第一末端）汇聚于贯穿腹部或耻骨弓壁的皮肤（造瘘术），以形成开孔或括约肌。在另 一个实施方案中，将导管穿过开放的开孔插入所述构建体的空腔，以提供尿液外流。
[0340] 图10显示了植入管道构建体的结构。
[0341] 在另一个实施方案中，本发明的方法还包括监测在尿流改道构建体植入后的堵塞 的步骤。所述堵塞可以是碎屑堆积引起的。如果检测到堵塞，所述方法还可以包括从管道 腔内清除碎屑的步骤。
[0342] 在一个方面，本发明临时性地为有需要的受试者提供尿流改道。在一个实施方案 中，临时性尿流改道或管道构建体被植入受试者以形成一个开放的开孔，导管或其它设备 被临时性地穿过开孔插入至管道构建体内的内腔。在想要寻求有缺陷的膀胱的永久性解决 方案时，临时性管道提供了允许尿液从所述受试者排出的优势。例如，所述管道构建体的植 入可以在接种细胞群的新膀胱植入之前、之后或同时实施（参见例如Bertram et al，见上 文）。图11显示了一个临时性尿流改道构建体的植入组件的实例。
[0343] 在一个实施方案中，本发明的方法还包括用受试者的网膜、肠系膜、肌肉筋膜和/ 或腹膜包裹尿流改道或管道构建体以使其血管化的步骤。
[0344] 在一个方面，本发明永久性地为有需要的受试者提供尿流改道。图12显示了永久 性尿流改道构建体的植入组件的实例。
[0345] 在一个实施方案中，本文所述的构建体可以用于前列腺尿道替换和尿流改道。这 些步骤对于需要前列腺根除术来切除前列腺尿道的受试者来说是必须的。其他实施方案 中，该构建体可以用于经皮肤的改道管道，以形成带有类阀门扭结的可控管道。在另一个实 施方案中，该构建体可用作膀胱颈手术中的膀胱颈吊索和包覆材料以及带有可控通道的尿 液排出口或可导尿开口。这些实施方案的实例如图13所示。
[0346] 在一个方面，本发明的尿流改道构建体提供上皮化的粘膜。在一个实施方案中，所 述构建体适于在植入上形成上皮化粘膜。在一个实施方案中，上皮化粘膜包括前庭部分和 粘膜皮肤部分。在另一个实施方案中，前庭部分邻近于粘膜皮肤部分。在另一个实施方案 中，粘膜皮肤部分位于所述连接到受试者的腹腔壁和皮肤的构建体的开孔末端。通常，天然 存在的粘膜皮肤部分以存在粘膜和皮肤外皮为特征，并且典型地存在于邻近于身体的外部 皮肤末端和覆盖身体内部的粘膜开始的开口。所述由本发明的方法和构建体提供的上皮化 粘膜在植入受试者体内后在该尿流改道构建体的所述第一末端发育。在另外一个实施方案 中，所述上皮化粘膜的特征是存在上皮细胞，其首先出现在前庭部分并逐渐扩张或从粘膜 皮肤部分向所述构建体的开口部繁殖。在另一个实施方案中，上皮细胞的特征为上皮细胞 标记物的表达。在另外一个实施方案中，上皮细胞标记物为细胞角蛋白。所述细胞角蛋白 可以是现有技术已知的角蛋白的一种或多种，包括但不限于细胞角蛋白1至19。在另一个 实施方案中，该角蛋白可以用AE-1/AE3抗体检测出。
[0347] 向待被扩张的器官或组织中植入支架可以根据实施例中所描述的方法或根据现 有技术已知的方法来实施。通过把植入材料缝合于目标器官，可以将该基质或支架植入到 所述受试者的器官或组织。
[0348] 所述技术可以用于在需要此类治疗的患者体内，以使已有的层状结构的腔体器官 或组织结构扩张。例如，已有的层状结构的腔体器官或组织结构可以通过下述步骤被扩张： 提供聚合物基质或支架，该基质或支架的形状符合需要所述治疗的器官或组织的至少一部 分，并且其大小足以通过腹腔镜方法被植入；在所述聚合物基质的一个第一区域上或其中 沉积非来源于该器官或组织结构的自体细胞群；以及，通过腹腔镜方法将所述成形的聚合 物基质构建体植入所述患者体内的所述治疗位置，从而使得已有的层状结构的腔体器官或 组织结构被扩张。
[0349] 图7e显示了用于植入本文所述的肌肉等效物支架的可能的手术方法。图7f显示 了在空的和充盈的膀胱上的植入位置。图7g显示了带有手术切口的膀胱模型，显示了在表 面切片上产生的椭圆体。塑料管可用作有限可用空间的模型，以穿过本发明折叠的或卷曲 的聚合物基质或支架。
[0350] 所述技术也可以用于增加需要该治疗的患者的膀胱容积。例如，膀胱容积可以通 过下述步骤而得到增加：提供生物相容性的合成的或天然的聚合物基质，该基质或支架的 形状符合需要所述治疗的器官或组织的至少一部分，并且其大小足以通过腹腔镜方法被植 入；在所述聚合物基质的一个第一区域上或其中沉积非来源于该器官或组织结构的自体细 胞群；以及，通过腹腔镜方法将所述成形的聚合物基质构建体植入所述患者体内的所述治 疗位置，从而使得膀胱容积增加。在一个实施方案中，本发明的所述基质或支架适合于增 加膀胱容积约50mL。在其他实施方案中，本发明的所述基质或支架适合于增加膀胱容积约 100mL。在其他实施方案中，本发明的基质或支架适合于增加膀胱容积约60、约70、约80或 约 9OmL。
[0351] 所述技术可以更进一步用于扩张需要该治疗的患者的膀胱切口位置。例如，膀胱 切口位置可以通过下述步骤而被扩张：提供生物相容性的合成的或天然的聚合物基质，该 基质或支架的形状符合需要所述治疗的器官或组织的至少一部分，并且其大小足以通过腹 腔镜方法被植入；在所述聚合物基质的一个第一区域上或其中沉积非来源于该器官或组织 结构的自体细胞群；以及，通过腹腔镜方法将所述成形的聚合物基质构建体植入所述患者 体内的所述治疗位置，从而使得膀胱切口位置被扩张。
[0352] 本发明的另一个非限制性应用包括对相应治疗有需求的患者的尿失禁的治疗方 法。例如，尿失禁可以通过下述步骤得到治疗：提供生物相容性的合成的或天然的聚合物基 质，该基质或支架的形状符合需要所述治疗的器官或组织的至少一部分，并且其大小足以 通过腹腔镜方法被植入；在所述聚合物基质的一个第一区域上或其中沉积非来源于该器官 或组织结构的自体细胞群；以及，通过腹腔镜方法将所述成形的聚合物基质构建体植入所 述患者体内的所述治疗位置，从而使得膀胱容积增加。
[0353] 在一个实施方案中，本文所述的支架、细胞群和方法还可被用于制备治疗本文所 述的障碍的药物。所述障碍包括需要再生、重建、修复、扩张或替换层状结构的体腔器官或 组织结构的受试者的任何病症。在另一个实施方案中，所述器官或组织结构为膀胱或膀胱 的部分。
[0354] 在另一个实施方案中，沉积在植入的构建体上的细胞产生MCP-I并在植入位置释 放，它会刺激天然间充质干细胞（MSC)向植入位置迁移。在另一个实施方案中，所述天然 MSC促进和/或加强植入构建体在植入位置的再生。
[0355] 在一个实施方案中，如本文所述，沉积的细胞群来源于外周血或脂肪组织平滑肌 细胞（SMC)群。在另一个实施方案中，所述SMC细胞群包括至少一种有收缩功能并对平滑肌 细胞标记物呈阳性的细胞，所述平滑肌细胞标记物例如心肌蛋白、α -平滑肌肌动蛋白、钙 结合蛋白、肌球蛋白重链、BAALC、结蛋白、成肌纤维细胞抗原、SM22,以及它们的任意组合。 在其他实施方案中，所述SMC细胞群包括至少一种表现心肌蛋白（MYO⑶）表达的细胞。该 MYO⑶表达可以为MYCOD多肽或编码MYO⑶多肽的核酸的表达。在另一个实施方案中，所 述SMC的收缩功能是钙依赖性的。在一个实施方案中，需要重建、修复、扩张或替换的受试 者所需的所述该层状结构的腔体器官或组织结构是膀胱或膀胱的一部分。在另一个实施方 案中，所述聚合物基质不含有尿道上皮细胞。
[0356] 在所有实施方案中，本发明的方法利用植入一种支架，该支架以接种有本文所述 的细胞群的膀胱替换支架、膀胱扩张支架、膀胱管道支架或逼尿肌肌肉等效物支架为基础。
[0357] 在另一个实施方案中，本文所述的层状结构的体腔器官或组织结构的再生、重建、 修复、扩张或替换的方法包括以下步骤：a)提供生物相容性的合成的或天然的聚合物基 质，该基质的形状符合需要所述治疗的腔体器官或组织结构的至少一部分；b)在所述聚合 物基质的第一区域上或其中以本文所述的细胞密度沉积一个第一细胞群，所述细胞群实质 上为肌肉细胞群；和c)将所述成形的聚合物基质细胞构建体植入所述患者的所述治疗位 置，以形成层状结构的腔体器官或组织结构。在另一个实施方案中，在体内形成的所述层状 结构的腔体器官或组织结构具有天然膀胱组织的顺应性。
[0358] 在另一方面，本发明提供了在植入有此需要的受试者后、基于生物力学刺激或循 环而再生新的膀胱的方法。在一个方面，所述方法适用于促进已经为膀胱或其一部分的扩 张或替换而植入的新的膀胱构建体的再生。在一个实施方案中，所述新的膀胱构建体由接 种在新的膀胱基质或支架上的细胞形成。在另一个实施方案中，所述新的膀胱支架是膀胱 替换支架、膀胱扩张支架、膀胱管道支架或逼尿肌肌肉等效物支架。
[0359] 在一个方面，本发明的所述方法可用于由接种在新的膀胱支架上的至少一种细胞 群形成的植入的新的膀胱构建体。在一个实施方案中，所述细胞接种聚合物基质（或基质） 为膀胱替换支架、膀胱扩张支架、膀胱管道支架或逼尿肌肌肉等效物支架。在一个实施方案 中，所述至少一种细胞群实质上包括肌肉细胞群。在另一个实施方案中，所述肌肉细胞群可 为平滑肌细胞群。如本文所述，可用使用不同的细胞接种密度。
[0360] 在一个方面，在新的膀胱植入后以不同的次数和不同的持续时间来实施本发明的 方法。在一个实施方案中，该循环在一段时间内以日为基准，在一段时间以周为基准或者每 隔一周实施。在另一个实施方案中，每日循环方案的持续时间为约2周、约3周、约4周、约 5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周或多于 14周。
[0361] 在一个实施方案中，受试者的每日循环方法可以包括下述步骤：用约1小时填充 该新的膀胱，用约1小时将该充满的新的膀胱排水，和通常允许新的膀胱自由排水过夜。该 方法可以在受试者的每日循环方案的第一天实施。这种每日循环的操作可用在第一天之后 连续实施几天。在一个实施方案中，该循环方案可以在第一天之后的某天实施，在这段时间 内，该填充的步骤可以增加到约2小时、约3小时、约4小时或比4小时更多。在另一个实 施方案中，在允许新的膀胱自由排水之前，所述填充和排水的时间可以在一天之内重复多 于一次。
[0362] 在另一个实施方案中，所述受试者在植入后再植入导管，该循环时间由夹住或者 松开受试者的导管来进行控制。
[0363] 本领域普通技术人员能够理解，本文也考虑了其他的循环方案。
[0364] 一个循环方案的实例如下所述。在如本文所述地将由接种在新的膀胱基质或支 架上的细胞而形成的新的膀胱构建体植入后，循环将会在每2周（14±2天的间隔）实施， 从植入后的1个月后开始持续到约第90日。循环将在某些类型的评估（例如植入的新膀 胱顺应性测量）之后但是在其它类型评估（例如荧光成像）之前完成。在顺应性测量完成 后，可通过用消毒盐水以10_25mL/min的速率再充盈膀胱（通过保温箱预热）的方式实施 循环。该循环将至少重复5-10次。刚开始将会达到0-10毫米贡柱的压力，并且从开始时 就进行记录。针对每个循环在每个在导管周围观察到的时间逝去点（leakage)(又名逝去 点），或者在输入的量与刚实施的顺应性测量相等的时候（以两者最先发生的时间为准）， 记录时间、输入的等渗溶液的体积和产生的压力。
[0365] 在一个实施方案中，本发明提供了促进植入受试者体内的新的膀胱再生的方法， 所述方法包括下述步骤：(a)用液体填充植入的新的膀胱；(b)排空步骤（a)中填充的新的 膀胱。在另一个实施方案中，所述方法包括步骤（c)重复步骤（a)和（b)。在另一个实施方 案中，所述方法在植入后两周内开始。在一个实施方案中，所述步骤（a)和（b)每天进行一 次、每周进行一次或每两周进行一次。在其他一些实施方案中，所述填充步骤（a)进行约1 小时，所述排空步骤（b)进行约一小时。在又另一个实施方案中，步骤（a)和（b) -直持续 进行至植入后至少六周。在另一个实施方案中，步骤（a)和（b) -直持续进行至植入后不 超过十周。在另一个实施方案中，步骤（a)和（b) -直持续进行至植入后超过十周。在其 他实施方案中，所述填充步骤包括扩张所述新的膀胱。在另一个实施方案中，所述再生包括 使受试者体内的新的膀胱的容量相对于未经过循环的新的膀胱而言有所增加。在另一个实 施方案中，所述再生包括使受试者体内的新的膀胱的顺应性相对于未经过循环的新的膀胱 而言有所增加。在其他实施方案中，所述再生包括使受试者体内的新的膀胱的细胞外基质 发育相对于未经过循环的新的膀胱而言有所增加。在一个实施方案中，细胞外基质发育的 增加包括弹性蛋白纤维的发育。
[0366] 在另一方面，本发明涉及为哺乳动物提供新的膀胱的稳态调节发育、从而使得植 入的新的膀胱能够适应受体的需要的方法。在一个实施方案中，植入的新的膀胱生长至与 所述受体成比例的大小。在另一个实施方案中，所述为受试者提供新的膀胱的稳态调节发 育的方法包括下述步骤：(a)提供生物相容性聚合物支架；(b)在所述支架的一个第一区域 上或其中沉积一个第一细胞群，所述第一细胞群实质上为肌肉细胞群；和（c)将步骤（b)的 支架植入所述受试者体内，以建立稳态调节发育。在另一个实施方案中，所述稳态调节发育 包括器官大小和结构的重建。在另一个实施方案中，所述稳态调节发育包括与体重成比例 的新的膀胱容量。在一个实施方案中，在植入后约四个月获得成比例的新的膀胱容量。在 另一个实施方案中，所述为受试者提供新的膀胱的稳态调节发育的方法包括监测稳态调节 发育的阶段或植入的新的膀胱的进展。所述监测可包括膀胱造影过程以显示植入的新的膀 胱的位置和形状，和/或测量尿动力顺应性和容量。
[0367] 在另一方面，本发明提供了在患者体内植入新的器官或组织结构后对患者的预后 进行评估的方法。在一个实施方案中，所述方法包括下述步骤：检测获自所述受试者的测试 样本中的MCP-I表达水平；(b)确定测试样本中的MCP-I表达水平相对于对照样本（或对 照参照值）的水平；和（c)基于MCP-I表达水平的测定来预测所述患者的再生性预后，其中 如果测试样本中的MCP-I表达水平高于对照样本（或对照参照值）即为对所述受试者再生 的预后。
[0368] 在另一方面，本发明提供了在患者体内植入新的器官或组织结构后对患者的预后 进行评估的方法，所述方法包括：(a)获得患者的生物学样本；和（b)监测所述生物学样本 中的MCP-I表达，其中MCP-I的表达即为对患者的再生预后。在一些实施方案中，患者生物 学样中的MCP-I表达比对照样本（或对照参照值）高即为受试者的再生预后。在一些实施 方案中，患者生物学样中的MCP-I表达比对照样本（或对照参照值）低即为受试者的未再 生预后。所述患者样本可为测试样本，包括体液例如血液或尿液。
[0369] 在一些实施方案中，所述测定步骤包括使用有合适的处理器执行的软件程序，并 实现下述目的（i)测量测试样本和对照样本中的差异的MCP-I表达水平；和/或（ii)对测 量测试样本和对照样本中的差异的MCP-I表达水平所得的数据进行分析。合适的软件和处 理器都是本领域公知的，并且可以商购获得。所述程序可被固化在软件中并存储与可读介 质上，所述介质例如CD-ROM、软盘、硬盘、DVD或与处理器相关的内存，但是本领域技术人员 容易理解的是，整个程序或其部分都可以以公知的方式在处理器以外的装置中运行和/或 固化在固件中和/或专用硬件模块中。
[0370] 例如，在测定步骤之后，测量结果、发现、诊断、预测和/或治疗建议通常被记录并 传送至技术员、医生和/或患者。在某些实施方案中，将使用计算机来将这类信息传送给相 关人员，例如患者和/或主治医生。在一些实施方案中，可以进行测定或将所述结果或诊断 传送至另一个国家或地区来进行分析。
[0371] 在一个优选实施方案中，以对具有差异水平的MCP-I表达的受试者测得的MCP-I 表达水平为基础，在测定完成和预后/预测产生以后将得到的预后、预测和/或治疗建议尽 快与受试者沟通。可以通过受试者的主治医生与所述受试者进行所述结果和/或相关信息 的沟通。或者，可以通过任何沟通手段直接与测试受试者进行结果的沟通，所述手段包括书 写和电子沟通形式，例如电话或电子邮件的沟通。在使用电子邮件沟通的情况下，使用计算 机可以促进沟通。在某些实施方案中，可以使用本领域技术人员熟知的计算机硬件和软件 的组合，自动地产生和传送基于测试的含有预后测试结果和/或所得结论和/或治疗建议 的沟通信息。美国专利No. 6, 283, 761记载了健康护理定位沟通系统的一个实例；但是本发 明并不限于使用这种特定沟通系统的方法。在本发明方法的某些实施方案中，所述方法的 全部或部分步骤，包括样本的测定、预后和/或再生的预测、以及测定结果或预后的沟通， 都可以在另外的环境（例如外部环境）中进行。
[0372] 在另一方面，本文所述的预后方法为评估植入的成功程度以及再生的康复/治疗 方法提供了有用的信息。在一个实施方案中，所述方法包括下述步骤：检测获自所述受试者 的测试样本中的MCP-I表达水平；(b)确定测试样本中的MCP-I表达水平相对于对照样本 (或对照参照值）的水平；和（c)基于MCP-I表达水平的测定来预测所述患者的再生性预 后，其中如果测试样本中的MCP-I表达水平高于对照样本（或对照参照值）则表明新的器 官或组织结构出于再生阶段。
[0373] 总体而言，本文所使用的术语"再生预后"包括对下述任意一种或多种情况的预报 和预测：通过植入本文所述的构建体进行膀胱替换或扩张后功能性膀胱的发展和改善；在 植入本文所述的构建体后功能性尿流改道的发展；在植入本文所述的构建体后膀胱容量的 发展或改进的膀胱容量；或者在植入本文所述的构建体后膀胱顺应性的发展或改进的膀胱 顺应性。
[0374] 在所有实施方案中，为需要本文所述的治疗的患者提供层状结构的腔体器官或组 织结构的方法可包括在植入后如本文所述地评估再生的步骤。
[0375] 在所有实施方案中，本发明涉及为有需要的受试者提供新的器官或组织结构的方 法，所述方法包括某些植入后的监测步骤。在一个实施方案中，监测植入的构建体的效果和 表现，例如在植入后的不同时间点通过超声成像、肾盂造影照片以及尿液和血液分析进行。 这些监测步骤在实施例3-6中有更详细的描述。
[0376] 7.试剂盒
[0377] 本发明还包括试剂盒，所述试剂盒含有本发明的聚合物基质和支架以及相关材料 和/或细胞培养基和使用说明书。使用说明书可包括例如培养细胞或给予所述细胞和/或 细胞产物的说明。所述使用说明书还可包括为了通过腹腔镜植入而对本发明的聚合物基质 和支架进行预处理、折叠或制备的说明。
[0378] 在一个实施方案中，本发明提供了含有本文所述的支架和使用说明书的试剂盒。 在另一个实施方案中，所述试剂盒中的支架为下述一种或多种支架：膀胱扩张支架、膀胱替 换支架、尿路管道支架或肌肉等效物支架。
[0379] 8.报告
[0380] 当为了商业目的实施本发明的方法时，通常会产生报告或再生性预后的总结。本 发明的方法所产生的报告应包括在提供本文所述构建体的手术之前和之后对再生的可能 过程和结果的预测。所述报告可包括对于预后任何指征的信息。本发明的方法和报告还可 包括在数据库中存储所述报告。或者，所述方法还可针对受试者从数据库中产生报告并在 报告中记载数据。在一个实施方案中，所述报告为纸质报告，在另一个实施方案中，所述报 告为声音报告，在另一个实施方案中，所述报告为电子报告。已经考虑了将所述报告提供给 医生和/或患者。所述报告的接收还可包括与含有数据和报告的服务器计算机建立网络连 接，并从所述服务器计算机请求数据和报告。本发明提供的方法的全部或部分都可以自动 进行。
[0381] 提供下述实施例仅是出于说明的目的，并不意欲以任何方式限制本发明的范围。
[0382] 本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献的全部内容均通过援引的方式纳 入本文。 实施例
[0383] 实施例1作为SMCs源的外周血和脂肪组织
[0384] 血液源细胞
[0385] 成功分离犬，猪，和人类外周血平滑肌细胞。概括地说，制备50毫升含有1:1外 周血与磷酸盐缓冲液的稀释液且在中性粒细胞分离液中、一种密度梯度材料上分层，并且 在室温下在1，354xg离心20分钟。离心作用后，密度梯度（从上到下）清楚地显示为4层： 血清，血沉棕黄层，中性粒细胞分离液，红细胞。单核细胞位于血沉棕黄层，其以乳白/灰色 的带形式存在。血沉棕黄层被收回并且转移进一根单独的50ml圆锥试管。用PBS稀释到 50ml。将样品在室温下711xg离心10分钟至球团细胞。混悬球团且培养细胞。通过细胞 传代、当达到适当的细胞数量时，部分被固定进行终点分析，包括免疫检测平滑肌细胞蛋白 质表达，平滑肌细胞mRNA转录物的核酸检测，细胞收缩，细胞因子和酶合成。
[0386] 结果
[0387] 培养基选择。单独的40_40ml单核部分犬外周血样混悬在6种不同介质配方内， 接种于6孔Primaria细胞培养板或胶原层板中。
[0388] 如图14A-E中所示，在一周的培养后，在全部条件下观察到小的粘性的菌落和小 细胞团块（DMEM介质离析没被显示）但是细胞的种类难以识别。在α-ΜΕΜ+10% FBS中生 长时，在Primaria培养皿上观察到小串葡萄状和细胞团块，EGM-2培养基和伴随添加物，和 EGM-2培养基和伴随添加物（减去VEGF和FGF2) (A，C，Ε)和胶原蛋白I型，在组织培养上 涂上在相同的介质（B，D，F)里生长的塑料板。看到与生长在DMEM配方中（数据未显示） 外周血培养相似的结果。
[0389] 如图15中所示，在两周的培养后，在Primaria(左平板）和胶原层板（中间平板） 上、a-MEM中观察到生长晕菌落和小单层。形态学上，这些菌落似乎是平滑肌（图15,顶 板）或者内皮（图15,中间平板）。平滑肌（图15,顶板）或者内皮（图15,中间平板）形 态的生长晕菌落也在其他介质/底材状态（合适的平板）下形成。一些巨噬细胞最初被保 存在a -MEM中（图15,底部左和中间平板），但是没带进随后的传代。隔离在10% FBS的 a MEM中的Primaria盘上的细胞具有平滑肌（左上平板）或者巨噬细胞（底部左平板）形 态。没有内皮细胞在这些条件（中间左平板）下被隔离。隔离在10% FBS的a -MEM中、胶 原层板上的细胞具有平滑肌（最高的中间平板），内皮（中间中间平板）和巨噬细胞（底 部中间平板）形态。其他介质/基质配方例如EGM-2 (最高位置平板）和20% FBS的DMEM 补充剂（中间正确平板）也允许间充质和类内皮细胞的生长。
[0390] 12种培养基/底材状态，α -ΜΕΜ/10% FBS的Primaria中包含大部分没有内皮细 胞的均匀隔离的平滑肌细胞（图15,左上平板）菌落。细胞在Primaria板上隔离，平铺在 Nunclon表面（在α -ΜΕΜ/10% FBS中）显示典型的"峰谷"形态的是平滑肌细胞（SMC)， 与在其他研究中的描述一致（Kassis et al. (2006) ;Koerner et al. (2006) ;Simper et al. (2002)，上文）。
[0391] 如图16中所示，这些细胞经过数次传代后仍然保持其形态（图16A-G)。猪颈动脉 SMC(图16H)和狗膀胱SMC(图161)的图像比较显示。在更晚传代（图16F，G)的平滑肌 细胞变得更大，更多展开。早期的传代（A-E)像平滑肌细胞（SMC)隔离自猪颈动脉（H)和 狗膀胱（I)。过后平滑肌细胞（F，G)的传代更大，更多展开，产生一个平滑肌表现型。
[0392] 脂肪衍生细胞
[0393] 平滑肌细胞与猪脂肪组织隔离依照下列程序。全部程序在生物安全罩里进行。
[0394] 获取脂肪样品。在用于生物安全容器之前，在室温或者4°C下储存不超过24小时。
[0395] 每IOOmlPBS中加入1克BSA和0. 1到0. 3克的胶原酶制备胶原酶溶液。通过 0. 2μπι过滤装置过滤溶液。加热至37°C。
[0396] 每脂肪体积加入等效体积的胶原酶溶液到每个离心瓶。需要组织体积的胶原酶溶 液（例如，每IOml脂肪组织胶原酶溶液IOml)。
[0397] 用消毒剂擦拭，盖上盖子，用石蜡膜包裹，并且放在37°C培养箱里振荡60分钟。或 者，试试管放在37°C水浴器中，以每20分钟手动振荡一次。
[0398] 室温下300xg离心5分钟。
[0399] 从离心机中取出试管，积极地振动10秒，使细胞完全混合。这是完成基质细胞与 主要脂肪细胞的分离。
[0400] 300xg离心5分钟。小心吸出顶层的油，主要脂肪细胞（黄的层浮动的细胞），以 及胶原酶溶液。在球团上留下大约IOml的棕色的胶原酶溶液，以便基质血试管的馏分（在 底部的深色的红细胞）不被扰乱。
[0401] 混悬细胞团块于1% BSA的PBS中，用Steri-Flip过滤。
[0402] 300xg离心细胞5分钟、吸出剩余的胶原酶溶液。吸出时，吸管的端从顶那里吸出， 以便油被尽可能完全清除。细胞团应该密封在底部。
[0403] 每个离管中加入组织培养液10ml，混悬细胞。把细胞集合到一根离心管中，离心。
[0404] 吸出上清液。用10毫升培养基悬浮细胞。
[0405] 平分细胞至对等数目的烧瓶的中。平板接种24-72个小时后，从烧瓶吸出培养基。 以PBS洗涤并且吸出。
[0406] 每瓶加原始体积的新鲜培养基。
[0407] 细胞长到80-90%合流，然后传代或者保存。
[0408] 通过细胞传代、当达到适当的细胞数量时，部分被固定进行免疫检测平滑肌细胞 蛋白质表达。
[0409] 图17是关于培养的形态学评价。在培养3到5天后，评价形态学。从人和猪细胞 脂肪组织分离得到的细胞显示平滑肌细胞形态特征（图17)。那些细胞呈现峰-谷形态，并 且显示另外特性例如细长形，在传代上变平和成纤维细胞样，拉长并且在平行排列，和一个 "旋涡"形状，所有这些均是培养的平滑肌细胞的特点。
[0410] 平滑肌标志。增加收缩基因的表达（以及他们编码的蛋白质） 与 SMC 成熟一致（Jeon et al. J Cell Scill9, 4994-5005 (2006) ;Ross et al.J Clin Inves. 116,3139-3149 (2006) ；Sinha et al.Am J Physiol Cell Physiol287, 1560-1568(2004))。心肌是对平滑肌收缩蛋白进行编码的基因转录调节器，其 中包括SM22, α平滑肌肌动蛋白，平滑肌肌浆球蛋白重链和钙调理蛋白（Qiu et al. (2005) Circ Res983-991 ；ffang et al. (2003)Proc Natl Acad Scil00:7129-7134；Yoshida et al. (2003)Circ Res92:856-864)。心肌是平滑肌分化所必需的，并且足以驱动某些细胞平 滑肌基因表达（Milyavsky et al. (2007)Cancer Cellll:133_146;van Tuyn et al. (2005) 上文；Wang et al. (2003)，上文；Yoshida et al. (2003)，上文）。我们确定是否从血或者 脂肪组织中隔离的平滑肌细胞通过隔离总RNA并且进行半定量的RT-PCR表达平滑肌细胞 标记心肌，平滑肌α肌动蛋白，SM22,肌浆球蛋白重链，和钙调理蛋白。
[0411] 如图18中所示，结果表明，在基因水平这些细胞表达所有这些平滑肌细胞标记， 和在膀胱平滑肌细胞里发现的平滑肌细胞标记一致。这些数据支持外周血或者脂肪组织隔 离的这些平滑肌细胞具有平滑肌细胞性质的观点。
[0412] 表型特征。我们已经表明这些外周血隔离平滑肌细胞与平滑肌收缩蛋白（图18) 一样表达为平滑肌基因表达的转录调节器。图18显示SMC标志心肌，平滑肌α肌动蛋白， SM22,平滑肌肌浆球蛋白重链和钙调理蛋白的RT-PCR分析。样品来自于猪脂肪，外周血和 膀胱（传代4)隔离的平滑肌细胞。从脂肪组织隔离的SMCs可以在每次传代之间培养3-5 天，从血隔离的SMCs可以头次传代之前培养14天，3-5天后进行再次传代培养。β肌动蛋 白的基因表达当作凝胶用于内部的加载控制。从动物脂肪和外周血细胞隔离的细胞表达型 与膀胱SMC的相符合。
[0413] 图19显示免疫荧光法染色，将多种抗体直接用于平滑肌细胞表达蛋白染色。标记 α肌动蛋白，SM22,钙调理蛋白和平滑肌肌浆球蛋白重链在从猪脂肪，外周血和膀胱隔离的 平滑肌细胞里检测。这些蛋白质全部涉及平滑肌细胞的收缩的功能。平滑肌α肌动蛋白， SM22,钙调理蛋白和平滑肌肌浆球蛋白重链在多次传代的平滑肌细胞中染色。这些蛋白质 的亚细胞定位与膀胱SMC相比在平滑肌细胞里实际上相同。在细胞的应力纤维里的这些蛋 白质的详细的染色被注意到。这是期望的典型的平滑肌细胞染色模型。
[0414] 图20显示的是从人外周血（传代5)隔离的平滑肌细胞的免疫染色。使用平滑肌 α肌动蛋白，SM22,钙调理蛋白的探针。同种细胞中两种蛋白质平滑肌的α肌动蛋白和钙 调理蛋白（右平板顶部）双重染色法共同显示。在单个细胞中不止1个的平滑肌细胞标记 同时表达更进一步支持这些是平滑肌细胞的观点。
[0415] 收缩性。由于外周血得到平滑肌细胞表达平滑肌收缩蛋白，我们进行一次三维的 凝胶收缩测定评价他们的收缩性能。当被嵌入在三维的凝胶（Travis et al. (2001)Circ Res88:77-83)内时，SMC已经显示自发引起胶原基质的收缩。脂肪组织得到的平滑肌细胞 也被进行收缩性测试。
[0416] 图21显示与膀胱平滑肌细胞（C)的相比较猪血得到的（A)细胞和猪脂肪组织得 到的（B)细胞收缩性更强。把EDTA加到混合物中抑制收缩，支持了收缩是依赖钙的想法， 也是平滑肌细胞的另一种特性。数据表明直径较小依赖细胞的收缩，并且是在细胞容量内 的功能。细胞种子为500, 000细胞/毫升，通过在两天后减少胶原质凝胶直径证明其能进 行收缩。猪膀胱平滑肌细胞作为阳性对照。证明收缩的钙依赖性，钙螯合剂EDTA加入到分 开的样品中抑制收缩。结果确认细胞的收缩能力以钙依赖的的方式类似于膀胱得到的平滑 肌细胞。
[0417] 发展动力学。为了在细胞治疗应用里利用平滑肌细胞，确定是否在一个可接受的 时间段内达到需要的细胞量是重要的。结果从对犬和猪研究表明，平滑肌菌落（从40ml外 周血样品中）被观察到在早于7天后接种，并且能在不到14天（图14和15)内通过。在 研究中，在培养（传代2的端）的18天后获得120万细胞，在它们冷冻保藏期间。50天后 这些特别的细胞被融化，通常在约80%融合时通过确定发展动力学。在融化后6天，细胞群 体扩大到1670万个细胞（传代3的末期）。再培养7天后，细胞群体达到3170万个细胞 (传代4的末期）。这项初始研究表明30天的培养可取得约3000万细胞。
[0418] 图22涉及到细胞有限的增殖潜能。图22显示每单位面积从人体脂组织隔离的平 滑肌细胞作为功能性细胞恢复的数量变化的函数。这些数据表明在4和5传代之间，恢复 的细胞数量开始下降，支持这些细胞是有限和有限增生的能力的论点，为祖细胞所独有的 特征，但不是真实的干细胞。
[0419] 图23显示从猪脂肪，外周血和膀胱平滑肌隔离的平滑肌细胞的发展，作为每条传 代恢复的细胞数量的函数。如图所示，在2和3传代之间，在超过2-4周的时间段，细胞数 量方面取得巨大的扩大，使数十个数百万个细胞的恢复成为可能。这证明脂肪衍生细胞的 有限或者有限的增殖潜能。
[0420] 增殖的接触抑制。从外周血和脂肪组织隔离的平滑肌细胞显示增殖的接触抑制。 例如，在图14-17提供的这些细胞的形态学上的评价证明超过几条传代的增殖的接触抑制 的存在。当细胞彼此接触时增殖停止。相反，MSCs不显示增殖的接触抑制，在转换细胞培 养过程中，观察到他们可以相互堆积，类似于焦点形成。例如，Zhou et al.报道有关离析 的情况，以及来自老鼠骨髓的单核细胞馏分的MSCs培养，并且观察到，以在3词传代之后， 培养 MSCs 存在接触抑制（见 10850 页和图 1A) (Cancer Res. 2006 ;66 (22) : 10849-10854)。
[0421] 细胞因子MCP-I的制备。MCP-I是一种膀胱迫肌细胞产品。在主动脉平滑肌细胞 里，MCP-I在再生中起作用。MCP-I以具有吸收单核细胞的能力而众所周知。类似于趋化因 子；这也是血管损伤区域血管平滑肌细胞增生和循环吸收单核细胞的一种有效的促细胞分 裂剂。单核细胞转换的巨噬细胞通常被用作细胞因子类和增长系数的存储器。巨噬细胞和 肌前体细胞两个都是MCP-I信号目标。这和细胞因子在体内吸收干细胞和祖细胞相关，潜 在的有助于再生过程。
[0422] 为测定人周血平滑肌细胞产生的MCP-I数量，来自R&D系统的一个基于酶联免疫 吸附测定的测定系统被使用。培养基样品被一式两份、与标准曲线相比，分析得到的MCP-I 水平，结果为ug/24hr/百万个细胞。确定了从人膀胱平滑肌隔离的细胞，脂肪，外周血以及 膀胱尿道上皮（阴性对照）细胞因子MCP-I的表达。
[0423] 图24显示，来自上述分析的结果表明人周血得到和人体脂组织得到的平滑肌细 胞与人膀胱平滑肌细胞相比产生相当水平的MCP-I。这些数据支持这一结论，正如膀胱SMC 一样，从脂肪和外周血隔离的平滑肌细胞表达MCP-1。另外，这些数据使我们假设MCP-I在 再生中起关键作用，通过直接或者间接的引起肌祖细胞吸收/迁移，或者在构建体内扩散。
[0424] 讨论。从动物脂肪隔离的平滑肌细胞证明了平滑肌细胞的几种特征。我们的研究 已经表明，使用标准酶消化和低速的离心作用可以轻易使细胞容从动物脂肪中隔离。细胞 可以迅速扩大，在不到一个月时间内或许达到3000万细胞。我们的研究进一步证明这些细 胞可以，实际上，描述一个平滑肌细胞群体而不是一个真实的干细胞数量，如同平滑肌标记 早在传代3时存在。SMC标记mRNA的表达在早于PO时就可被观察到，像被RTPCR证明的那 样。而且，隔离的平滑肌细胞具有收缩功能如同按标准胶原质凝胶收缩测定证明的那样。
[0425] 平滑肌细胞的特性。我们已经显示在随后的传代期间，平滑肌细胞细胞形态被保 留。在基因和蛋白质水平平滑肌标记具有良好的相关性。
[0426] 细胞因子诱导。脂肪的平滑肌细胞对MCP-I的表达引导我们假设，MCP-I在新器 官或者组织结构再生中起关键作用，通过直接或者间接的引起肌祖细胞吸收/迁移，或者 在构建体内扩散。
[0427] 实施例2 MCP-I的制备和细胞密度
[0428] 使用商业上可用的工具检测和测定来自膀胱平滑肌细胞培养条件的培养基的 MCP-1。测试来自9个构建体（3种，每种分别3种接种水平）的条件培养基样品和用于接 种构建体的配对的SMC细胞的MCP-I水平。结果如表2. 1所示。
[0429] 表 2. 1
[0430]

【权利要求】
1. 一种用于受试者中的有缺陷的膀胱的尿流改道，包括： a) 第一可植入的、生物相容性构建体，所述构建体包括管状支架，所述管状支架具有被 构造为与腹腔壁截面相连接的第一末端和第二封闭末端，和至少一个被构造为与第一输尿 管相连接的第一侧部开口；以及 b) 并非来源于所述有缺陷的膀胱的自体细胞群，所述自体细胞群沉积在所述支架的表 面上或其中。
2. 根据权利要求1所述的尿流改道，其中所述支架还包括被构造为与第二输尿管相连 接的第二侧部开口。
3. 根据权利要求1所述的尿流改道，其中所述第一末端被构造为与所述腹腔壁的位置 平齐。
4. 根据权利要求3所述的尿流改道，其中所述第一末端被构造为缝合在所述受试者的 皮肤上。
5. 根据权利要求4所述的尿流改道，其中所述第一末端被构造为形成开孔。
6. 根据权利要求5所述的尿流改道，其中所述开孔还包括开孔扣。
7. 根据权利要求5或6所述的尿流改道，其中所述支架还包括被构造为形成开孔的垫 圈环。
8. 根据权利要求1所述的尿流改道，其中所述生物相容性支架为可生物降解的。
9. 根据权利要求1所述的尿流改道，其中所述支架包括选自下列的材料：聚乙醇酸、聚 乳酸、以及聚乙醇酸和聚乳酸的共聚物。
10. 根据权利要求1所述的尿流改道，其中所述细胞群为平滑肌细胞群。
11. 根据权利要求1所述的尿流改道，其中所述改道替换所述有缺陷的膀胱。
12. 根据权利要求1所述的尿流改道，其中所述改道为临时性的。
13. 根据权利要求1所述的尿流改道，其中所述改道为永久性的。
14. 根据权利要求1所述的尿流改道，其中所述管状支架具有矩形截面构造。
15. 根据权利要求1所述的尿流改道，其中所述管状支架具有三角形截面构造。
16. 根据权利要求1所述的尿流改道，其中所述管状支架具有圆形截面构造。
17. 根据权利要求1所述的尿流改道，其中所述改道不含有尿道上皮细胞。
18. -种用于需要的受试者中的有缺陷的膀胱的尿流改道构建体的制造方法，包括： a) 提供第一可植入的生物相容性支架，所述支架包括管状支架，所述管状支架具有被 构造为与腹腔壁区域相连接的第一末端和第二封闭末端，和至少一个被构造为与第一输尿 管相连接的第一侧部开口；以及 b) 将并非来源于所述有缺陷的膀胱的自体细胞群沉积在所述支架的第一区域上或其 中，以形成尿流改道构建体。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述支架还包括被构造为与第二输尿管相连接 的第二侧部开口。
20. 根据权利要求18所述的方法，其中所述第一末端被构造为与所述腹腔壁的位置平 齐。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述第一末端被构造为缝合在所述受试者的皮 肤上。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述第一末端被构造为形成开孔。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述开孔还包括开孔扣。
24. 根据权利要求22或23所述的方法，其中所述支架还包括被构造为形成开孔的垫圈 环。
25. 根据权利要求18所述的方法，其中所述生物相容性支架为可生物降解的。
26. 根据权利要求18所述的方法，其中所述支架包括选自下列的材料：聚乙醇酸、聚乳 酸、以及聚乙醇酸和聚乳酸的共聚物。
27. 根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞群为平滑肌细胞群。
28. 根据权利要求18所述的方法，其中所述改道替换所述有缺陷的膀胱。
29. 根据权利要求18所述的方法，其中所述改道为临时性的。
30. 根据权利要求18所述的方法，其中所述改道为永久性的。
31. 根据权利要求18所述的方法，其中所述管状支架具有矩形截面构造。
32. 根据权利要求18所述的方法，其中所述管状支架具有三角形截面构造。
33. 根据权利要求18所述的方法，其中所述管状支架具有圆形截面构造。
34. 根据权利要求18所述的方法，其中所述改道不含有尿道上皮细胞。
35. -种提供用于需要的受试者中的有缺陷的膀胱的尿流改道的方法，包括： a) 提供第一可植入的生物相容性支架，所述支架包括管状支架，所述管状支架具有被 构造为与腹腔壁截面相连接的第一末端和第二封闭末端，和至少一个被构造为与第一输尿 管相连接的第一侧部开口；以及 b) 将并非来源于所述有缺陷的膀胱的自体细胞群沉积在所述支架的一个第一区域上 或其中，以形成尿流改道构建体；以及 c) 将所述构建体植入所述受试者中以形成所述尿流改道。
36. -种提供用于需要的受试者中的有缺陷的膀胱的尿流改道的方法，包括向所述受 试者中植入尿流改道构建体，所述尿流改道构建体包括：(a)管状支架，所述管状支架具有 被构造为与腹腔壁截面相连接的第一末端和第二封闭末端，和至少一个被构造为与第一输 尿管相连接的第一侧部开口；以及（b)并非来源于所述有缺陷的膀胱的自体细胞群，所述 自体细胞群沉积在所述支架的表面上或其中，以形成所述尿流改道。
37. 根据权利要求35或36所述的方法，其中所述支架还包括被构造为与第二输尿管相 连接的第二侧部开口。
38. 根据权利要求35或36所述的方法，其中所述第一末端被构造为与所述腹腔壁的位 置平齐。
39. 根据权利要求35或36所述的方法，其中所述第一末端被构造为缝合在所述受试者 的皮肤上。
40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述第一末端被构造为形成开孔。
41. 根据权利要求40所述的方法，其中所述开孔还包括开孔扣。
42. 根据权利要求40或41所述的方法，其中所述支架还包括被构造为形成开孔的垫圈 环。
43. 根据权利要求35或36所述的方法，其中所述生物相容性支架为可生物降解的。
44. 根据权利要求35或36所述的方法，其中所述支架包括选自下列的材料：聚乙醇 酸、聚乳酸、以及聚乙醇酸和聚乳酸的共聚物。
45. 根据权利要求35或36所述的方法，其中所述细胞群为平滑肌细胞群。
46. 根据权利要求35或36所述的方法，其中其中所述改道替换所述有缺陷的膀胱。
47. 根据权利要求35或36所述的方法，其中所述改道为临时性的。
48. 根据权利要求35或36所述的方法，其中所述改道为永久性的。
49. 根根据权利要求35或36所述的方法，其中所述管状支架具有矩形截面构造。
50. 根据权利要求35或36所述的方法，其中所述管状支架具有三角形截面构造。
51. 根据权利要求35或36所述的方法，其中所述管状支架具有圆形截面构造。
52. 根据权利要求35或36所述的方法，其中所述改道不含有尿道上皮细胞。
53. 根据权利要求35或36所述的方法，其中所述尿路管道构建体在植入后形成再生的 组织。
54. 根据权利要求53所述的方法，其中所述再生的组织包括覆盖平滑肌的连续尿道上 皮。
55. 根据权利要求35或36所述的方法，其中所述尿路管道构建体在植入后形成上皮化 的粘膜。
【文档编号】A61F2/04GK104274256SQ201410270167
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2009年11月4日 优先权日:2008年11月4日
【发明者】约翰.W.卢德洛, 曼纽尔.J.杰约, 乔迪普.巴苏, 蒂莫西.A.伯特拉姆, 克里斯托弗.金海默, 凯利.I.格思里, 罗杰.拉甘, 迪帕克.贾因, 奥卢瓦托因.奈特, 理查德.佩因, 萨拉.F.昆兰, H.S.拉波波特, 纳姆拉塔.桑加 申请人:坦吉恩股份有限公司