精子特异tsRNAs在辅助生殖体外受精诊断中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种精子特异tsrnas在辅助生殖体外受精诊断中的应用。

背景技术：

精子tsrnas(trna-derivedsmallrnas)主要来源于trnas的5’端，长度为29-34nt，在精子中的含量远大于micrornas(mirnas)及其他类型的非编码小rnas(smallnoncodingrnas,sncrnas)。对于tsrnas而言，其功能及机制研究才刚刚起步。最近的一项研究表明，精子中5’-halvestsrnas可以影响胚胎及子代的代谢相关基因表达。与此同时，另一项研究发现精子tsrnas可以在胚胎干细胞及胚胎中抑制代谢相关基因的表达，并影响子代的新陈代谢。有研究发现dnmt2介导的trf(trna-derivedrnafragment)修饰可以将精子所携带父系信息传递给子代。这些研究表明，父系tsrnas或许可以作为表观遗传因子影响胚胎的发育。

现有对辅助生殖体外受精(invitrofertilization，ivf)过程中精子生育力预测的技术手段和方法，主要集中在检测精液参数、精液ros值、精子dna碎片率等。但是，现有的方法仅检测精子相关参数，没有和胚胎质量相关联，无法全面、真实、准确地评估精子生育力。因此现有的方法仅对精子质量做出判断，但对精子的生育力评价不足，临床上ivf的成功率仅为30％左右，成本高(在生殖中心进行一次ivf花费约在3万人民币左右)等。

技术实现要素：

本发明选取ivf病人中正常男性精液样本87例，通过对精液样本进行优化以及精液质量检测，选取符合标准的正常精子样本，根据其对应优质胚胎率(goodqualityembryo，gqe)情况，分为h-gqe(gqe≥75％，high，h-gqe，n＝23；gqe≤25％，low，l-gqe，n＝64)，然后进行精子rna提取，最后对通过小rna高通量测序方法检测精子中sncrna表达量最高的tsrnas表达水平。再通过小rna高通量测序后，共检测到920个tsrnas，并分析两组表达差异后，共筛选得到11个差异表达tsrnas。最后通过数据分发现，这11个tsrnas对87例样本的区分效率可以达到90.47％。

因此，本发明的首要目的是提供精子特异tsrnas在制备辅助生殖体外受精的诊断试剂中的应用。本发明的第二个目的是提供精子特异tsrnas在制备辅助生殖体外受精的诊断试剂盒中的应用。本发明的第三个目的是提供精子特异tsrnas在制备用于预测或评估辅助生殖体外受精过程中精子生育力的分子标志物的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

作为本发明的第一个方面，精子特异tsrnas在制备辅助生殖体外受精的诊断试剂中的应用，所述精子特异tsrnas为glygcc-30-1、glygcc-18、glygcc-30-2、thrtgt-39、thrtgt-38、glygcc-32-1、glygcc-32-2、valcac-33-1、valcac-33-2、proagg-32或valaac-33中的一种或几种。

根据本发明，所述诊断试剂为检测生物样品中glygcc-30-1、glygcc-18、glygcc-30-2、thrtgt-39、thrtgt-38、glygcc-32-1、glygcc-32-2、valcac-33-1、valcac-33-2、proagg-32和/或valaac-33在低优质胚胎率中的特异性低表达或特异性高表达情况。

作为本发明的第二个方面，精子特异tsrnas在制备辅助生殖体外受精的诊断试剂盒中的应用，所述精子特异tsrnas为glygcc-30-1、glygcc-18、glygcc-30-2、thrtgt-39、thrtgt-38、glygcc-32-1、glygcc-32-2、valcac-33-1、valcac-33-2、proagg-32或valaac-33中的一种或几种。

根据本发明，所述诊断试剂盒包含了检测生物样品中glygcc-30-1、glygcc-18、glygcc-30-2、thrtgt-39、thrtgt-38、glygcc-32-1、glygcc-32-2、valcac-33-1、valcac-33-2、proagg-32和/或valaac-33在低优质胚胎率中的特异性低表达或特异性高表达的试剂。

作为本发明的第三个方面，精子特异tsrnas在制备用于预测或评估辅助生殖体外受精过程中精子生育力的分子标志物的应用，所述精子特异tsrnas为glygcc-30-1、glygcc-18、glygcc-30-2、thrtgt-39、thrtgt-38、glygcc-32-1、glygcc-32-2、valcac-33-1、valcac-33-2、proagg-32或valaac-33中的一种或几种。

本发明的有益效果是：glygcc-30-1、glygcc-18、glygcc-30-2、thrtgt-39、thrtgt-38、glygcc-32-1、glygcc-32-2、valcac-33-1、valcac-33-2、proagg-32和valaac-33可以作为精子特异性的分子标志物用于预测精子生育力，从而为ivf中的男性不育治疗以及临床诊断提供可靠的科学依据与个性化治疗的思路，具体体现在：

1、由于精子特异tsrnas可以在l-gqe中特异性低表达或特异性高表达，因此可以通过制备辅助生殖体外受精的监测试剂、诊断试剂或者制备用于预测或评估辅助生殖体外受精过程中精子生育力的分子标志物，结合高通量测序的方法进行检测，其检测结果更为真实、全面、可靠；

2、精子特异tsrnas作为制备辅助生殖体外受精的监测试剂、诊断试剂或者制备用于预测或评估辅助生殖体外受精过程中精子生育力的分子标志物，可以检测精子中的tsrna表达水平，从胚胎质量的角度对精子的生育力进行预测，而不仅仅是精子质量，患者获得高优质胚胎率的可能性可以达到90.47％，因此采用上述的监测试剂、诊断试剂或者分子标志物可以及早地发现潜在的男性不育靶点，并进行个性化的干预和治疗，并最终提高ivf的生育结局；

3、精子特异tsrnas作为制备辅助生殖体外受精的监测试剂、诊断试剂或者制备用于预测或评估辅助生殖体外受精过程中精子生育力的分子标志物，可以在ivf治疗开始时，就对精子样本进行检测，通过检测这些tsrnas在正常精子中表达水平的高低，判断在ivf过程中，精子生育力情况，及其对胚胎质量的影响，从而对ivf进行相应的个性化的治疗与干预，可降低患者诊疗成本。

附图说明

图1为实施例1的操作流程图。

图2为实施例1的tsrnas高通量测序结果图。

图3为实施例1的特异性表达tsrnas高通量测序的结果图。

图4为11个tsrnas对87例样本的区分效率的示意图，其中横坐标tpr为truepositiverate，真正确率；纵坐标fpr为falsepositiverate，假正确率。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

为了便于研究精子tsrnas作为精子特异性分子标志物，本实施例选取接受ivf治疗的正常精子样本，根据其对应的优质胚胎率(gqe率)将其分为高gqe(≥75％；highrateofgqe,h-gqe)组与低gqe组(≤25％；lowrateofgqe,l-gqe)，分析tsrnas变化与优质胚胎率之间的关系，寻找可以作为男性不育检测指标的tsrnas。

本发明的tsrnas应用于小rna高通量测序方法检测男性正常精子中的表达变化情况。在进行tsrnas检测之前，还要对精液进行优化、进行casa检测，并对其中的精子细胞rna提取。

实施例1

本实施例的操作流程图如图1所示。

1、样本入组情况

本实施例纳入首次接受ivf治疗的病人，并女方年龄在23-40岁之间，没有多囊卵巢综合症、异位妊娠症、卵巢早衰等疾病；男方年龄在24-50岁之间，没有生殖系统疾病。双方均汉族，且没有其他疾病。其中，女性患者在年龄、获卵数、及其mⅱ期(metaphaseⅱstage)的卵细胞数上均无显著性差异。对应男性患者的年龄、精子密度、精子存活率、以及精子(前向)活动率(a+b级精子)均无显著性差异，但精子形态略有差异(p<0.05)。

2、精液样本的分组

选取ivf病人中正常男性精液样本87例，根据其对应的gqe情况，将精液样本分为h-gqe组(≥75％)，l-gqe组(≤25％)，其中，高优质胚胎率组(h-gqe)，共23例，低优质胚胎率组(l-gqe)，共64例。

其中，h-gqe组与l-gqe组比，其对应2pn(合子发育至2细胞阶段，twopronucleistage)的数目(p<0.05)、可移植胚胎数(p<0.001)、受精率(p<0.05)、有效胚胎率(p<0.001)、优质胚胎率(p<0.001)均存在显著性差异。

因此，h-gqe组内胚胎发育较好，其对应的精子生育力较好，l-gqe组内胚胎发育质量较差，对应精子生育力较差。

3、精液样本的采集

研究对象禁欲3-7天，通过手淫法获得全份精液，置于37℃水浴孵育30min，液化后待用。

4、精液样本的优化

按照who人类精液实验室检验手册(第5版)，通过精子上游法对精液样本进行优化。

5、精液常规检测

按照who人类精液实验室检验手册(第5版)，通过casa系统进行精液常规参数检测，选取符合标准的正常精子样本入组。

6、精液样本的rna提取

选取优化过的精子(约2×10⁶)重悬于1mltrizol(invitrogen公司购买)中，并进行rna抽提(方法参照trizol产品使用说明)。

7、小rna高通量检测精子tsrnas

每个样品选取100ng总rna进行小rna高通量测序(方法参考文献yangq,linj,lium,etal.highlysensitivesequencingrevealsdynamicmodificationsandactivitiesofsmallrnasinmouseoocytesandearlyembryos.sciadv.2016,10；2(6):e1501482.)。共检测到920个tsrnas，分为h-gqe与l-gqe组，然后利用软件进行实验与分析。其中，表达量较高的前100个tsrnas的表达情况可见图2，如gluttc-33、lysctt-33、lysttt-33、gluctc-33、glygcc-31等表达量均较高，但是两组表达差异并不显著。

差异表达分析结果如图3所示，glygcc-30-1、glygcc-18、glygcc-30-2、thrtgt-39、thrtgt-38在l-gqe组中特异性低表达；glygcc-32-1、glygcc-32-2、valcac-33-1、valcac-33-2、proagg-32和valaac-33在l-gqe组中特异性高表达。

其中，

(1)glygcc-30-1、glygcc-18和glygcc-30-2，来源于trna的5’端，其在精子中的低表达，表明ivf中有优质胚胎率较低的风险；

(2)thrtgt-39和thrtgt-38：来源于trna的3’端，其在精子中的低表达，表明ivf中有hqe较低的风险；

(3)glygcc-32-1、glygcc-32-2、valcac-33-1、valcac-33-2、proagg-32和valaac-33：来源于trna的5’端，其在精子中的高表达，表明ivf中有hqe较低的风险；

结论：glygcc-30-1、glygcc-18、glygcc-30-2、thrtgt-39、thrtgt-38、glygcc-32-1、glygcc-32-2、valcac-33-1、valcac-33-2、proagg-32和valaac-33可以用于预测精子生育力。因此，这些样本对应的男性患者有必要进行个性化的男性不育诊疗，以期改善ivf的生育结局。

实施例2

通过支持向量机(supportvectormachines，svms)的方法进一步进行数据分析，这11个tsrnas(glygcc-30-1、glygcc-18、glygcc-30-2、thrtgt-39、thrtgt-38、glygcc-32-1、glygcc-32-2、valcac-33-1、valcac-33-2、proagg-32和valaac-33)对实施例1的87例样本的区分效率可以达到90.47％。结果如图4所示。

结论：采用本发明的方法，患者获得高优质胚胎率的可能性为90.47％，可以有效提高患者ivf成功率。

综上所述，本发明的11个tsrnas(glygcc-30-1、glygcc-18、glygcc-30-2、thrtgt-39、thrtgt-38、glygcc-32-1、glygcc-32-2、valcac-33-1、valcac-33-2、proagg-32和valaac-33)可以作为精子特异性的分子标志物用于预测精子生育力，从而为ivf中的男性不育治疗以及临床诊断提供可靠的科学依据与个性化治疗的思路。而且。glygcc-30-1、glygcc-18、glygcc-30-2、thrtgt-39、thrtgt-38、glygcc-32-1、glygcc-32-2、valcac-33-1、valcac-33-2、proagg-32和valaac-33可采用本领域中已知的方法，进一步制成诊断试剂或诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括检测生物样品中glygcc-30-1、glygcc-18、glygcc-30-2、thrtgt-39、thrtgt-38、glygcc-32-1、glygcc-32-2、valcac-33-1、valcac-33-2、proagg-32和/或valaac-33在低优质胚胎率中的特异性低表达或特异性高表达的试剂，还可以包括精子优化相关试剂(bww，htf等)，rna提取试剂trizol等，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。