ITS1基因在检测白粉病病原Erysiphealphitoides中的应用的制作方法

本发明涉及植物病原检测技术领域，更具体地，涉及一种its1基因在检测白粉病病原erysiphealphitoides中的应用。

背景技术：

核糖体rna，即rrna，真菌的核糖体rna基因由18s基因，its1基因，5.8s基因，its1基因和28s基因组成，核糖体rna基因的核苷酸序列包含有物种直接、准确的遗传信息，可以会被由于菌种鉴定。

柞树是对壳斗科栎属植物的一种通称，我国柞林资源丰富，具有很好的经济价值。柞树其叶可以用于饲养柞蚕；木材坚固抗腐性强，在建筑上有广泛用处，还可加工制作家具，烧制木炭；橡实含淀粉较多，可用来制作橡酒、酒精、淀粉、橡油等，也可做饲料；从柞树树皮、叶片、壳斗、橡实中提取的单宁，是制革工业、印染工业和渔业上所必须的材料；栓皮的皮层较厚可作工业上的软木材料；柞木还可培养木耳、香菇和密环菌等多种食用菌。

柞树白粉病是柞树上的一个重要病害，欧洲、亚洲、美洲均有发生，我国北起吉林，南到四川有柞林的省份亦有此病发生。柞树白粉病发生时，白粉病菌侵染柞叶后，吸收叶内营养物质并使叶绿素含量下降，光合作用减弱，生理机能失常；进而使叶片外形变态，局部或全部萎缩、硬化，逐渐变为黄褐色或赤褐色半枯萎状态，早期脱落；被害柞树发育不良，易受冻害，可使幼树叶片卷曲枯焦，枝条扭曲变形、枯死，给柞树天然林的后备林分资源造成毁灭性损失。7月上旬至9月中旬是柞树白粉病的发病期，发病初期，多数在幼龄柞树的嫩叶两面散生点状白粉斑，有时在新生嫩枝上有类似症状发生白粉层逐渐增多并扩大连片，以至布满整个叶面，即病原菌的菌丝体和分生孢子；发病后期(8月下旬至9月中旬)，在白粉层中出现乳白色、黄白色、黄褐色至黑色小颗粒，是病菌的闭囊壳，多密聚群生。柞树白粉病严重的影响柞树的生长发育。

多年来对于白粉病的病原菌一直尚未有定论，直到最近发现erysiphealphitoides是引起柞树白粉病的病原。

因此，亟需建立一种针对erysiphealphitoides引起的柞树白粉病病原检测和鉴定的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种rrna的its1基因在检测白粉病病原erysiphealphitoides中的应用。

本发明的第一个目的是提供一种柞树白粉病病原erysiphealphitoides的rrna的its1基因。

本发明的第二个目的是提供一对检测柞树白粉病病原erysiphealphitoides的引物。

本发明的第三个目的是提供所述its1基因或任一所述引物在检测柞树白粉病病原erysiphealphitoides或制备检测柞树白粉病病原erysiphealphitoides的试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种检测柞树白粉病病原erysiphealphitoides的试剂盒

本发明的第五个目的是提供任一所述的试剂盒在检测柞树白粉病病原erysiphealphitoides中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种检测检测柞树白粉病病原erysiphealphitoides的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明要求保护一种柞树白粉病病原erysiphealphitoides的rrna的its1基因，其核苷酸序列如seqidno:1所示。

一对检测柞树白粉病病原erysiphealphitoides的引物，为所述its1基因的引物。

优选地，所述引物其核苷酸序列如seqidno:2～3所示。

seqidno:2：ctcagtcgtggcatctgct；

seqidno:3：tgagttttgatggggtctttg。

所述its1基因或任一所述引物在检测柞树白粉病病原erysiphealphitoides或制备检测柞树白粉病病原erysiphealphitoides的试剂盒中的应用，也属于本法名的保护范围。

进一步本发明要求保护一种检测柞树白粉病病原erysiphealphitoides的试剂盒，含有所述its1基因的检测引物。

优选地，所述检测引物为所述引物。

优选地，还含有pcr试剂。

最优选地，一种白粉病病原erysiphealphitoides检测试剂盒，

组成：核苷酸序列如seqidno:2～3所示引物，2×taqmastermix，ddh2o；

使用方法如下：

(1)提取使用鼎国真菌dna提取试剂盒提取待测样本dna；

(2)以上一步提取的dna作为模板使用核苷酸序列如seqidno:2～3所示引物，进行pcr扩增，

pcr扩增反应体系为：2×taqmastermix10μl，引物(10μm)各0.5μl，模板dna1μl，ddh2o补足至20μl。

pcr扩增反应的条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，32个循环；72℃5min。

(3)pcr扩增反应产物的检测

pcr反应结束后，取5μlpcr扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶(eb染色)进行电泳检测，通过琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段的大小，

有168bp左右的扩增片段则说明待测样本含有柞树白粉病病原菌erysiphealphitoides，否则没有柞树白粉病病原菌erysiphealphitoides。

以上任一所述的试剂盒在检测柞树白粉病病原erysiphealphitoides中的应用。

一种检测检测柞树白粉病病原erysiphealphitoides的方法，根据所述基因设计引物，进行pcr检测。

优选地，所述引物为核苷酸序列如seqidno:2～3所示引物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明将erysiphealphitoides的核糖体rna的its1基因应用于erysiphealphitoides菌的检测中，并根据其序列提供了一组检测柞树白粉病病原菌erysiphealphitoides的特异性检测引物，该引物的特异性强，灵敏度高；并基于该引物，建立了特异性检测柞树白粉病病原菌erysiphealphitoides的检测方法和检测试剂盒，在检测柞树白粉病病原菌erysiphealphitoides中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为检测特异性电泳图；m：takaradl1000marker；1：candidamucifera(假丝酵母)；2：cladosporiumcladosporioides(支孢样支孢霉)；3：cladosporiumperangustum(细孢枝孢)；4：cladosporiumoxysporum(尖孢枝孢菌)；5：nigrosporaspharic(黑孢子菌)；6：铰altemaria(链菌)，7：aspergillus(曲霉)；8：phanerochaetechrysosporium(黄孢原毛平革菌)；9：cladosporiumcladosporioides(芽枝状枝孢霉)；10：beauveriabassiana(球孢白僵菌)；11：schizophyllumcommune(裂褶菌)；12：trichoderma(木霉菌)；13：阴性对照(健康柞树dna)；14：空白对照(水)；15：柞树白粉病病斑dna。

图2为检测灵敏度电泳图；m：500bp的mark，泳道1：2.5ng/μl；泳道2：2.5×10^-1ng/μl；泳道3：2.5×10^-2ng/μl；泳道4：2.5×10^-3ng/μl；泳道5：2.5×10^-4ng/μl；泳道6：2.5×10^-5ng/μl；泳道7：.5×10^-6ng/μl；泳道8：2.5×10^-7ng/μl；泳道9：空白对照(水)。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1白粉病病原erysiphealphitoidesrrna的its1基因的获得

1、实验方法

(1)高通量测序

在发病的柞树园随机寻找到的具有典型白粉病病斑的叶片，收集，剪取柞树叶中的病斑区域，剪下病斑材料并使用液氮充分研磨，总dna的提取使用鼎国真菌dna提取试剂盒，具体按照其操作说明进行，提取后的总dna保存于-20℃；依照illumina文库构建流程，将总dna构建为片段大小500bp的双末端高通量测序文库；使用illuminahiseq2500测序仪对构建好的dna文库进行高通量测序，共测得11.17m对测序片段，测序读长为双末端125bp，总测序数据量1.67gb。

(2)组装微生物基因组序列

微生物序列的组装使用metavelvet(v1.2.01)组装软件进行；metavelvet(v1.2.01)初始组装的序列标签为断裂的核糖体标签，为得到完整的核糖体dna序列，分析采用序列捕获和从头组装策略，以组装完整的核糖体dna。选择包含目标病原菌its序列的核糖体dna序列为参考序列，采用bwa(0.7.12-r1039)软件进行无错配0mismatch和无断裂0gap比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，进一步采用metavelvet(v1.2.01)组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，获取完整的核糖体dna序列。

序列标签注释使用blastn(2.2.31+)序列比对分析软件，组装的序列标签序列与ncbi的nt数据库进行比对，blastn比对设定期望值<1e-20，根据比对结果对序列标签进行注释。核糖体dna序列是细菌和真菌鉴定的重要的最常用的分子标记，因此物种分类鉴定和定量以核糖体dna为主要分子标记。根据序列标签注释结果，选择核糖体dna序列作为微生物鉴定与定量分析依据。使用bwa(0.7.12-r1039)+samtools(v1.2)分析软件，计算测序数据中核糖体dna片段的平均测序深度，并以此作为该物种的相对丰度值。

(3)组装完整核糖体dna序列

metavelvet(v1.2.01)初始组装的序列标签为断裂的核糖体标签，为得到完整的核糖体dna序列，分析采用序列捕获和从头组装策略，以组装完整的核糖体dna。

(4)对比分析核糖体dna序列

选择包含目标病原菌its序列的核糖体dna序列为参考序列，采用bwa(0.7.12-r1039)软件进行无错配0mismatch和无断裂0gap比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，进一步采用metavelvet(v1.2.01)组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，获取完整的核糖体dna序列。

2、实验结果

本发明得到的柞树白粉病病原菌erysiphealphitoides完整的核糖体rna基因的，其中，its1基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

实施例2一种白粉病病原erysiphealphitoides检测方法

一、实验方法

(1)样品采集

收集待测样本(选取在发病的柞树园随机寻找到的具有典型白粉病病斑的叶片作为阳性样品)，剪取柞树叶中的病斑区域。

(2)dna的提取

剪下病斑材料并使用液氮充分研磨，总dna的提取使用鼎国真菌dna提取试剂盒，具体按照其操作说明进行，提取后的总dna保存于-20℃。

(3)引物设计

根据是实施例中获得的柞树白粉病病原菌erysiphealphitoides完整的核糖体rna的its1基因的序列(其核苷酸序列如seqidno:1所示)，设计引物。

(4)pcr检测

通过根据扩增效率，扩增特异性，检测的灵敏度等方面的综合分析筛选出检测效果最好的引物用于白粉病病原erysiphealphitoides的检测，其核苷酸序列如seqidno:2～3所示。

上游引物：ctcagtcgtggcatctgct(seqidno:2)；

下游引物：tgagttttgatggggtctttg(seqidno:3)。

其中，pcr扩增反应体系如表1所示

表1pcr扩增反应体系(20μl)：

pcr扩增反应的条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，32个循环；72℃5min。

pcr反应结束后，取5μlpcr扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶(eb染色)进行电泳检测，通过琼脂糖凝胶电泳，回收大小对应的pcr产物片段。

将回收的片段进行sanger测序，然后将测序结果与柞树白粉病病原菌erysiphealphitoides的核糖体rna的its1基因的核苷酸序列如seqidno.1进行比对，由此确定叶片上是否有柞树白粉病病原菌erysiphealphitoides，并可由此推测柞树白粉病病原菌erysiphealphitoides是否是致病菌。

二、实验结果

使用核苷酸序列如seqidno:2～3所示对阳性样品进行pcr扩增检测，可以获得168bp的扩增产物。经过sanger测序，其序列与seqidno.1所述序列完全比对，可以用于检测柞树白粉病病原菌erysiphealphitoides。

实施例3一种白粉病病原erysiphealphitoides检测试剂盒

一、组成

核苷酸序列如seqidno:2～3所示引物，2×taqmastermix，ddh2o。

二、使用方法

(1)提取使用鼎国真菌dna提取试剂盒提取待测样本dna；

(2)以上一步提取的dna作为模板使用核苷酸序列如seqidno:2～3所示引物，进行pcr扩增，

pcr扩增反应体系为：2×taqmastermix10μl，引物(10μm)各0.5μl，模板dna1μl，ddh2o补足至20μl。

pcr扩增反应的条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，32个循环；72℃5min。

(3)pcr扩增反应产物的检测

pcr反应结束后，取5μlpcr扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶(eb染色)进行电泳检测，通过琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段的大小，

有168bp左右的扩增片段则说明待测样本含有柞树白粉病病原菌erysiphealphitoides，否则没有柞树白粉病病原菌erysiphealphitoides。

实施例4特异性检测

利用此方法检测其他病原菌，以检测本检测方法的特异性。

一、实验方法

使用实施例3的试剂盒对candidamucifera(假丝酵母)、cladosporiumcladosporioides(支孢样支孢霉)、cladosporiumperangustum(细孢枝孢)、cladosporiumoxysporum(尖孢枝孢菌)、nigrosporaspharic(黑孢子菌)、铰altemaria(链菌)、aspergillus(曲霉)、phanerochaetechrysosporium(黄孢原毛平革菌)、cladosporiumcladosporioides(芽枝状枝孢霉)、beauveriabassiana(球孢白僵菌)、schizophyllumcommune(裂褶菌)、trichoderma(木霉菌)、柞树白粉病子实体dna进行检测。以上所有样本均为本发明实验室分离培养的真菌，且按照国际物种条形码进行了物种鉴定。

二、实验结果

结果如图1所示，只有柞树白粉病病原菌的病斑和病原子实体模板dna扩增出目标片段，大小约为168bp，从图中看，其它菌没有相似大小的片段，且柞树白粉病病原菌所扩增的目标片段较亮，说明本检测方法特异性好。

实施例5灵敏度检测

利用此方法检测不同浓度的样本，以检测本检测方法的灵敏度。

一、实验方法

将柞树白粉病子实体dna稀释至2.5ng/μl、2.5×10^-1ng/μl、2.5×10^-2ng/μl、2.5×10^-3ng/μl、2.5×10^-4ng/μl、2.5×10^-5ng/μl、2.5×10^-6ng/μl和2.5×10^-7ng/μl，使用实施例3的试剂盒对其进行检测，并以谁作为空白对照。

二、实验结果

结果如图2所示，本检测方法的灵敏度可达2.5×10^-5ng/μl，检测灵敏度高。seqidno:1

cagagcgtgaggctcagtcgtggcatctgctgcgtgctgggccgaccctcccacccgtgtcgatttgtatcttgttgctttggcgggccgggccgcgtcgtcgctgccccgcaaggacaagcgtcggccgcccaccggtttcggctggagcgcgcccgccaaagaccccatcaaaactcatgttgtttatgtcgtcttagctttattattgaaattgata

seqidno:2：

ctcagtcgtggcatctgct

seqidno:3：

tgagttttgatggggtctttg

序列表

<110>华南农业大学

<120>its1基因在检测白粉病病原erysiphealphitoides中的应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>220

<212>dna

<213>erysiphealphitoides

<400>1

cagagcgtgaggctcagtcgtggcatctgctgcgtgctgggccgaccctcccacccgtgt60

cgatttgtatcttgttgctttggcgggccgggccgcgtcgtcgctgccccgcaaggacaa120

gcgtcggccgcccaccggtttcggctggagcgcgcccgccaaagaccccatcaaaactca180

tgttgtttatgtcgtcttagctttattattgaaattgata220

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctcagtcgtggcatctgct19

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tgagttttgatggggtctttg21