一种固定化酶载体及固定化酶的制作方法

本发明涉及固定化酶领域，具体涉及一种固定化载体及其应用。

背景技术：

脂肪酶作为一种生物催化剂，可以催化油脂水解，在非水相条件下还可以催化酯化、酯交换、酸解和醇解等反应。脂肪酶具有催化条件温和、催化多样性和底物专一性强等优点，在食品、油化、造纸、皮革、洗涤、制药等行业有着广泛的应用。

疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyceslanuginosus)是一种分布广泛、生长上限温度较高的真菌，它能够产生热稳定的具有重要工业价值的脂肪酶，即疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(简称tl脂肪酶)。tl脂肪酶分子量约为31.7kda，分子大小为等电点为4.4。相对于其它脂肪酶种类而言，tl脂肪酶发酵技术成熟，商品化生产，价格低廉，固定化稳定性好，在酶法制备生物柴油工艺中有着很好的应用前景。专利cn107012136a使用交联剂和大孔吸附树脂振荡交联固定化lipozymetl100l酶液，所得固定化tl脂肪酶催化豆油脱臭馏出物甲酯化，重复使用20批次，反应转化率均在90％以上。专利cn100552003c使用商品化酶lipozymetlim在无溶剂或有机溶剂中催化含酸油脂生产生物柴油，酯化率约为70％左右。专利cn102839166b提供了一种制备固定化tl脂肪酶的方法，该专利使用聚苯乙烯的非极性大孔吸附树脂作为载体固载ti脂肪酶，所得固定化tl脂肪酶在催化酯交换反应中具有高活性和稳定性。

一般而言，tl脂肪酶经固定化操作后，更多地展现的是催化转酯化能力,而催化酯化能力较弱，特别是固定于一些廉价的载体上，如二氧化硅、白炭黑、沸石、纤维素、膨润土等；而使用一些有机聚合物如大孔树脂和离子交换树脂等作载体时，通过调变载体官能团和固定化方法等方式，可以使固定化tl脂肪酶获得较好的酯化活力，但树脂载体的成本价格较为昂贵，固定化成本增加。显然，以上的技术方法，对于将tl脂肪酶应用到催化高酸价油脂原料制备生物柴油的反应中，都是不太适用的。现有技术方法仍缺乏一种成本低廉且具有较高催化酯化活力的固定化tl脂肪酶产品。

米糠指的是稻谷加工过程的糙米碾白步骤中产生的副产物，主要成分为果皮、谷皮、胚芽、糊粉层等。专利cn104651341b提供了一种米糠为载体固定化生物酶的方法，但是仅将其作为水处理过程中使用的助剂，并未涉及在固定化脂肪酶过程中提高酶对短链醇耐受性的改善。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种固定化酶载体，所述固定化酶载体含有米糠或由米糠组成。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体含有米糠。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体由米糠组成。

在一个具体的实施方式中所述米糠中天然脂肪酶水解活力为50～600u/kg。

在一个具体的实施方式中所述米糠中天然脂肪酶水解活力为55～580u/kg。

在一个具体的实施方式中所述米糠中天然脂肪酶水解活力为55～420u/kg。

在一个具体的实施方式中所述米糠中天然脂肪酶水解活力为130～280u/kg。

在一个具体的实施方式中，以米糠质量计，所述米糠中油脂含量5～15wt％。

在一个具体的实施方式中，以米糠质量计，所述米糠中油脂含量6～15wt％。

在一个具体的实施方式中，以米糠质量计，所述米糠中油脂含量6～14wt％。

在一个具体的实施方式中，以米糠质量计，所述米糠中油脂含量9～11wt％。

在一个具体的实施方式中，以米糠质量计，所述米糠中淀粉含量8～25wt％。

在一个具体的实施方式中，以米糠质量计，所述米糠中淀粉含量8～24wt％。

在一个具体的实施方式中，以米糠质量计，所述米糠中淀粉含量8～17wt％。

在一个具体的实施方式中，以米糠质量计，所述米糠中淀粉含量10～13wt％。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持水能力220-320ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持水能力240～317ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持水能力260～290ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持油能力90-150ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持油能力91-150ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持油能力91-130ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持油能力100-115ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体中天然脂肪酶水解活力为50～600u/kg。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体中天然脂肪酶水解活力为55～580u/kg。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体中天然脂肪酶水解活力为55～420u/kg。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体中天然脂肪酶水解活力为130～280u/kg。

在一个具体的实施方式中，以固定化酶载体质量计，所述固定化酶载体中油脂含量5～15wt％。

在一个具体的实施方式中，以固定化酶载体质量计，所述固定化酶载体中油脂含量6～15wt％。

在一个具体的实施方式中，以固定化酶载体质量计，所述固定化酶载体中油脂含量6～14wt％。

在一个具体的实施方式中，以固定化酶载体质量计，所述固定化酶载体中油脂含量9～11wt％。

在一个具体的实施方式中，以固定化酶载体质量计，所述固定化酶载体中淀粉含量8～25wt％。

在一个具体的实施方式中，以固定化酶载体质量计，所述固定化酶载体中淀粉含量8～24wt％。

在一个具体的实施方式中，以固定化酶载体质量计，所述固定化酶载体中淀粉含量8～17wt％。

在一个具体的实施方式中，以固定化酶载体质量计，所述固定化酶载体中淀粉含量10～13wt％。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体的持水能力220-320ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体的持水能力240～317ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体的持水能力260～290ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体的持油能力90-150ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体的持油能力91-150ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体的持油能力91-130ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体的持油能力100-115ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体还含有白炭黑、硅胶、活性炭、硅藻土、硅酸镁、纤维素、树脂中的至少一种。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体还含有白炭黑、硅胶、活性炭、硅藻土、硅酸镁中的至少一种。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体中除米糠之外的载体以质量计占固定化载体总质量的10％以下，优选6％以下。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体由米糠组成。

本发明的第二方面目的在于提供一种固定化酶，所述固定化酶含有米糠。

在一个具体的实施方式中，以固定化酶质量计，所述固定化酶中油脂含量5～15wt％。

在一个具体的实施方式中，以固定化酶质量计，所述固定化酶中油脂含量6～15wt％。

在一个具体的实施方式中，以固定化酶质量计，所述固定化酶中油脂含量6～14wt％。

在一个具体的实施方式中，以固定化酶质量计，所述固定化酶中油脂含量9～11wt％。

在一个具体的实施方式中，以固定化酶质量计，所述固定化酶中淀粉含量8～25wt％。

在一个具体的实施方式中，以固定化酶质量计，所述固定化酶中淀粉含量8～24wt％。

在一个具体的实施方式中，以固定化酶质量计，所述固定化酶中淀粉含量8～17wt％。

在一个具体的实施方式中，以固定化酶质量计，所述固定化酶中淀粉含量10～13wt％。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶的持水能力220-320ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶的持水能力240～317ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶的持水能力260～290ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶的持油能力90-150ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶的持油能力91-150ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶的持油能力91-130ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶的持油能力100-115ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠中天然脂肪酶水解活力为50～600u/kg。

在一个具体的实施方式中所述米糠中天然脂肪酶水解活力为55～580u/kg。

在一个具体的实施方式中所述米糠中天然脂肪酶水解活力为55～420u/kg。

在一个具体的实施方式中所述米糠中天然脂肪酶水解活力为130～280u/kg。

在一个具体的实施方式中，以米糠质量计，所述米糠中油脂含量5～15wt％。

在一个具体的实施方式中，以米糠质量计，所述米糠中油脂含量6～15wt％。

在一个具体的实施方式中，以米糠质量计，所述米糠中油脂含量6～14wt％。

在一个具体的实施方式中，以米糠质量计，所述米糠中油脂含量9～11wt％。

在一个具体的实施方式中，以米糠质量计，所述米糠中淀粉含量8～25wt％。

在一个具体的实施方式中，以米糠质量计，所述米糠中淀粉含量8～24wt％。

在一个具体的实施方式中，以米糠质量计，所述米糠中淀粉含量8～17wt％。

在一个具体的实施方式中，以米糠质量计，所述米糠中淀粉含量10～13wt％。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持水能力220-320ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持水能力240～317ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持水能力260～290ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持油能力90-150ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持油能力91-150ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持油能力91-130ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持油能力100-115ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体还含有白炭黑、硅胶、活性炭、硅藻土、硅酸镁、纤维素、树脂中的至少一种。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶载体还含有白炭黑、硅胶、活性炭、硅藻土、硅酸镁中的至少一种。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶中除米糠之外的载体以质量计占固定化载体总质量的10％以下，优选6％以下。

在一个具体的实施方式中所述固定化脂肪酶的载体选自前述第一方面目的所述的载体。

在一个具体的实施方式中所述酶选自脂肪酶、磷脂酶、蛋白酶和/或淀粉酶。

在一个具体的实施方式中所述酶选自脂肪酶。

在一个具体的实施方式中所述脂肪酶选自tl脂肪酶、tl脂肪酶、calb脂肪酶、rm脂肪酶或rol脂肪酶中的至少一种。

在一个具体的实施方式中所述tl脂肪酶选自：嗜热丝孢菌(thermomyceslanuginosus)的发酵产物和/或通过基因工程或者蛋白质工程改造得到的tl脂肪酶和/或市售的tl脂肪酶。

在一个具体的实施方式中所述市售的tl脂肪酶选自lipozymetl100l。

本发明第三方面的目的在于提供一种米糠或前述第一或第二方面目的中所述米糠的制备方法：

a)淀粉酶处理脱脂米糠a，获得脱脂米糠b；

b)将脱脂米糠b与新鲜全脂米糠混合，获得混合米糠c；和

c)将混合米糠c与可溶性钙盐溶液接触后，分离获得所述米糠；

在一个具体的实施方式中所述步骤a)中淀粉酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶。

在一个具体的实施方式中淀粉酶选自α-淀粉酶。

在一个具体的实施方式中α-淀粉酶选自高温淀粉酶。

在一个具体的实施方式中所述步骤a)中淀粉酶与脱脂米糠a的接触温度为80-90℃。

在一个具体的实施方式中接触时间30min。

在一个具体的实施方式中接触ph为5.0-6.6。

在一个具体的实施方式中所述步骤b)中将获得的混合米糠c的粒径调整为140-700目。

在一个具体的实施方式中在步骤b)混合步骤前将脱脂米糠b和/或新鲜全脂米糠的粒径调整为140-700目。

在一个具体的实施方式中，所述粒径调整方法采用干法粉碎、湿法粉碎、超微粉碎和低温粉碎中的至少一种。

在一个具体的实施方式中，所述脱脂米糠b与新鲜全脂米糠的质量比为1:4～4:1

在一个具体的实施方式中所述步骤c)中可溶性钙盐选自氯化钙、硝酸钙、硫酸氢钙、碳酸氢钙中的至少一种。

在一个具体的实施方式中所述可溶性钙盐选自氯化钙。

在一个具体的实施方式中所述可溶性钙盐溶液浓度为10％-80％(w/v)。

在一个具体的实施方式中所述可溶性钙盐溶液的体积用量以混合米糠c质量计至少为1ml/g。

在一个具体的实施方式中浸渍时间1-2hr。

在一个具体的实施方式中浸渍温度为25-35℃。

在一个具体的实施方式中浸渍后干燥至水分为5-10％。

在一个具体的实施方式中所述干燥方法采用冷冻干燥、低温真空干燥、自然晾干、低温流化干燥中的至少一种。

在一个具体的实施方式中在所述步骤a)中，还包括：a1)将脱脂米糠a与水在ph为5.0-6.6条件下接触的步骤。

在一个具体的实施方式中所述在使用淀粉酶处理脱脂米糠a前，将脱脂米糠a与水的接触。

在一个具体的实施方式中所述脱脂米糠a与缓冲溶液接触温度为80-120℃。

在一个具体的实施方式中所述缓冲溶液选自柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、tris-盐酸缓冲液、pbs缓冲液中的至少一种。

在一个具体的实施方式中所述缓冲溶液选自柠檬酸缓冲液。

在一个具体的实施方式中接触时间为20-40min。

在一个具体的实施方式中所述柠檬酸缓冲溶液浓度为0.01-0.1mol/l。

本发明第四方面的目的在于提供一种本发明第三方面的目的所述方法制备得到的米糠，所述米糠具有以下至少一个特征；

1)所述米糠中天然脂肪酶水解活力为50～600u/kg；

2)所述米糠中油脂含量5～15wt％；

3)所述米糠中淀粉含量8～25％；

4)所述米糠的持水能力220-320ml/100g；

5)所述米糠的持油能力90-150ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠中天然脂肪酶水解活力为50～600u/kg。

在一个具体的实施方式中所述米糠中天然脂肪酶水解活力为55～580u/kg。

在一个具体的实施方式中所述米糠中天然脂肪酶水解活力为55～420u/kg。

在一个具体的实施方式中所述米糠中天然脂肪酶水解活力为130～280u/kg。

在一个具体的实施方式中所述米糠中油脂含量5～15wt％。

在一个具体的实施方式中所述米糠中油脂含量6～15wt％。

在一个具体的实施方式中所述米糠中油脂含量6～14wt％。

在一个具体的实施方式中所述米糠中油脂含量9～11wt％。

在一个具体的实施方式中所述米糠中淀粉含量8～25wt％。

在一个具体的实施方式中所述米糠中淀粉含量8～24wt％。

在一个具体的实施方式中所述米糠中淀粉含量8～17wt％。

在一个具体的实施方式中所述米糠中淀粉含量10～13wt％。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持水能力220-320ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持水能力240～317ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持水能力260～290ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持油能力90-150ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持油能力91-150ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持油能力91-130ml/100g。

在一个具体的实施方式中所述米糠的持油能力100-115ml/100g。

本发明第五方面的目的在于提供一种含有本发明第一方面的目的所述的固定化酶载体的固定化酶，

在一个具体的实施方式中所述酶选自脂肪酶、磷脂酶、蛋白酶和/或淀粉酶。

在一个具体的实施方式中所述酶选自脂肪酶。

在一个具体的实施方式中所述脂肪酶选自tl脂肪酶、tl脂肪酶、calb脂肪酶、rm脂肪酶或rol脂肪酶中的至少一种。

在一个具体的实施方式中所述tl脂肪酶选自：嗜热丝孢菌(thermomyceslanuginosus)的发酵产物和/或通过基因工程或者蛋白质工程改造得到的tl脂肪酶和/或市售的tl脂肪酶。

在一个具体的实施方式中所述市售的tl脂肪酶选自lipozymetl100l。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶还含有白炭黑、硅胶、活性炭、硅藻土、硅酸镁、纤维素、树脂中的至少一种载体。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶还含有白炭黑、硅胶、活性炭、硅藻土、硅酸镁中的至少一种载体。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶中除米糠之外的载体以质量计占固定化载体总质量的10％以下，优选6％以下。

本发明第六方面的目的在于提供一种制备如本发明第五方面目的所述的固定化酶的方法，其特征在于将如本发明第一方面目的所述的固定化酶载体与酶接触。

在一个具体的实施方式中所述固定化酶通过吸附法，共价结合法，包埋法，交联法中的至少一种制备得到。

本发明第七方面的目的在于提供一种如本发明第二方面目的或本发明第五方面目的所述的固定化酶在选自催化酯化、酯交换、醇解、酸解和/或水解中至少一种反应中的应用。

本发明第八方面的目的在于提供一种如本发明第二方面目的或本发明第五方面目的所述的固定化酶在制备生物柴油中的应用。

本发明第九方面的目的在于提供一种提高脂肪酶催化酯化活力和/或短链醇耐受性的方法，其特征在于，使用本发明第一方面目的所述的固定化载体与酶接触。

附图说明

图1是针对固定化tl脂肪酶催化油酸与甲醇酯化制备生物柴油过程中，固定化tl脂肪酶对于甲醇等短链醇耐受性的测试结果，其中菱形标识的曲线为使用本发明方法制备得到的固定化tl脂肪酶3；方形标识的曲线为使用其他方法制备得到的弱碱性阴离子交换树脂固定化tl脂肪酶；在油酸与甲醇摩尔比为1:2的条件下，重复操作9个批次获得的曲线。

图2是针对固定化tl脂肪酶催化油酸与甲醇酯化制备生物柴油过程中，固定化tl脂肪酶对于甲醇等短链醇耐受性的测试结果，其中菱形标识的曲线为使用本发明方法制备得到的固定化tl脂肪酶3；方形标识的曲线为使用其他方法制备得到的弱碱性阴离子交换树脂固定化tl脂肪酶；在油酸与甲醇摩尔比为1:4的条件下，重复操作9个批次获得的曲线。

具体实施方式

以下利用实施例具体地说明本发明的实施方式和技术效果，但本发明不限定于以下实施例。

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原料：

脱脂米糠来源：益海嘉里集团佳木斯工厂

全脂米糠来源：益海嘉里集团佳木斯工厂

高温淀粉酶来源：购自河北鹏宇生物科技有限公司

脂肪酶来源：lipozymetl1ool，购自诺维信公司

氯化钙：购自国药集团

柠檬酸来源：购自国药集团

破碎设备：泰斯特高速万能粉碎机fw100

冷冻干燥机：冠森生物科技上海公司

油脂来源：丰益油脂科技(上海)有限公司

甲醇来源：购自国药集团

乙醇来源：购自国药集团

生物柴油检测方法：

油酸转化率＝(油相起始酸价-反应后油相酸价)/油相起始酸价×100％，其中油相酸价测定方法参照“gb/t5530-2005动植物油脂酸值和酸度的测定”

米糠检测方法：

米糠中天然脂肪酶水解活力的测定方法参照文献“anitav.prabhu,shreehasp.tambe,etal.ricebranlipase:extraction,activityandstability.biotechnol.prog.1999,15,1083-1089.”。

米糠中油脂含量的测定方法参照“gb/t6433-2006饲料中粗脂肪的测定”。

米糠中淀粉含量的测定方法参照“gb/t20194-2018动物饲料中淀粉含量的测定旋光法”。

米糠的持水能力和持油能力的测定方法：称取100g米糠样品于1l烧杯中，倒入500ml蒸馏水(或大豆油)，将烧杯放置于20℃水浴锅中恒温吸水(或吸油)2h后，将吸水(或吸油)的米糠倒置于滤布上至无连续液滴滴下时，量取流下的液体体积v，持水能力(或持油能力)＝500–v。

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实施例1

称取50g脱脂米糠于1l烧杯中，加入250ml0.01mol/l的ph5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，沸水煮30min后，降低温度至80℃，并加入0.2wt％(以脱脂米糠重量计)的高温α-淀粉酶，搅拌30min，过滤，然后按照1:4的比例(以脱脂米糠重量计)与200g新鲜米糠混合均匀后，研磨至粒径140-700目，加入500mlcacl2饱和溶液，在25℃条件下搅拌浸渍2h，过滤，用液氮预先冷冻后，冷冻干燥至水分含量5％；再将125mltl脂肪酶酶液加入到上述预处理的米糠载体中，并加入250ml0.01mol/l的ph7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，搅拌2h，然后再加入10ml浓度0.5％的戊二醛溶液交联反应1h；过滤分离出米糠部分，在室温条件下自然晾干至水分含量10％，得到固定化tl脂肪酶1。

实施例2

称取50g脱脂米糠于1l烧杯中，加入250ml0.03mol/l的ph5.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，沸水煮30min后，降低温度至90℃，并加入0.3wt％(以脱脂米糠重量计)的高温α-淀粉酶，搅拌30min，过滤，然后按照1:2的比例(以脱脂米糠重量计)与100g新鲜米糠混合均匀后，研磨至粒径140-700目，加入300ml质量浓度10％的cacl2溶液，在30℃条件下搅拌浸渍1h，过滤用液氮预先冷冻后，冷冻干燥至水分含量7％；再将150mltl脂肪酶酶液加入到上述预处理的米糠载体中，并加入150ml0.01mol/l的ph7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，搅拌3h，然后再加入8ml浓度0.5％的戊二醛溶液交联反应0.5h；过滤分离出米糠部分，在40℃条件下真空干燥至水分含量8％，得到固定化tl脂肪酶2。

实施例3

称取50g脱脂米糠于1l烧杯中，加入250ml0.06mol/l的ph5.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，沸水煮30min后，降低温度至85℃，并加入0.4wt％(以脱脂米糠重量计)的高温α-淀粉酶，搅拌30min，过滤，然后按照1:1的比例(以脱脂米糠重量计)与50g新鲜米糠混合均匀后，研磨至粒径140-700目，加入100ml质量浓度40％的cacl2溶液，在35℃条件下搅拌浸渍1.5h，过滤，用液氮预先冷冻后，冷冻干燥至水分含量10％，；再将200mltl脂肪酶酶液加入到上述预处理的米糠载体中，并加入100ml0.01mol/l的ph7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，搅拌4h，然后再加入6ml浓度0.5％的戊二醛溶液交联反应0.5h；过滤分离出米糠部分，冷冻干燥至水分含量5％，得到固定化tl脂肪酶3。

实施例4

称取50g脱脂米糠于1l烧杯中，加入250ml0.1mol/l的ph6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，沸水煮30min后，降低温度至85℃，并加入0.3wt％(以脱脂米糠重量计)的高温α-淀粉酶，搅拌30min，过滤，然后按照2:1的比例(以脱脂米糠重量计)与25g新鲜米糠混合均匀后，研磨至粒径140-700目，加入75ml质量浓度60％的cacl2溶液，在30℃条件下搅拌浸渍1.5h，过滤，用液氮预先冷冻后，冷冻干燥至水分含量8％；再将225mltl脂肪酶酶液加入到上述预处理的米糠载体中，并加入75ml0.01mol/l的ph7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，搅拌3h，然后再加入3ml浓度0.5％的戊二醛溶液交联反应1h；过滤分离出米糠部分，35℃真空干燥至水分含量7％，得到固定化tl脂肪酶4。

实施例5

称取100g脱脂米糠于1l烧杯中，加入500ml0.01mol/l的ph6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，沸水煮30min后，降低温度至80℃，并加入0.3wt％(以脱脂米糠重量计)的高温α-淀粉酶，搅拌30min，过滤，然后按照4:1的比例(以脱脂米糠重量计)与25g新鲜米糠混合均匀后，研磨至粒径140-700目，加入125ml质量浓度80％的cacl2溶液，在35℃条件下搅拌浸渍2h，过滤，用液氮预先冷冻后，冷冻干燥至水分含量5％，；再将375mltl脂肪酶酶液加入到上述预处理的米糠载体中，并加入125ml0.01mol/l的ph7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，搅拌3h，然后再加入5ml浓度0.5％的戊二醛溶液交联反应1h；过滤分离出米糠部分，室温条件下自然晾干至水分含量9％，得到固定化tl脂肪酶5。

实施例6

称取70g脱脂米糠于1l烧杯中，加入350ml0.01mol/l的ph6.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，沸水煮30min后，降低温度至80℃，并加入0.3wt％(以脱脂米糠重量计)的高温α-淀粉酶，搅拌30min，过滤，加入30g白炭黑，然后按照1:4的比例(以脱脂米糠和白炭黑总重量计)与400g新鲜米糠混合均匀后，研磨至粒径140-700目，加入500mlcacl2饱和溶液，在25℃条件下搅拌浸渍2h，过滤，用液氮预先冷冻后，冷冻干燥至水分含量5％；再将125mltl脂肪酶酶液加入到上述预处理的载体中，并加入250ml0.01mol/l的ph7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，搅拌2h，然后再加入10ml浓度0.5％的戊二醛溶液交联反应1h；过滤分离出米糠部分，在室温条件下自然晾干至水分含量10％，得到固定化tl脂肪酶6。

对比例1

直接使用新鲜全脂米糠作为固定化载体，固定化条件下和干燥条件与实施例1完全相同。

对比例2

直接使用稳定化脱脂米糠作为固定化载体，固定化条件下和干燥条件与实施例1完全相同。

对比例3

直接使用脱脂脱淀粉米糠作为固定化载体，固定化条件下和干燥条件与实施例1完全相同。

米糠载体相关指标测定：

实验结果

1.酯化活力测定

称取20g油酸(油酸纯度为75％)于50ml圆底烧瓶中，加入3％固定化tl脂肪酶(以油相底物质量计)，6ml甲醇2h内分三次加入，40℃条件下反应4h，测定油酸转化率。

油酸转化率＝(油相起始酸价-反应后油相酸价)/油相起始酸价×100％

从实验结果可以看到，本发明的米糠固定化tl脂肪酶在催化油酸和甲醇酯化反应中，油酸转化率均为93％以上，比商品酶lipozymetlim(tl固定于二氧化硅载体)的转化率高出20％以上。对比例1固定化tl脂肪酶使用新鲜米糠，而新鲜米糠本身是缺乏孔洞且相对致密的结构，不利于tl脂肪酶的沉积和吸附，因此tl在新鲜米糠上负载量较低，酯化活力也最低；对比例2和对比例3固定化tl脂肪酶使用脱脂米糠或者脱脂脱淀粉米糠，虽然有利于tl脂肪酶的负载和吸附，但由于缺乏米糠天然脂肪酶和米糠脂质水解对tl脂肪酶的预先激活作用，所以对比例2固定化tl脂肪酶活力也没有显著提高。

2.甲醇耐受性测定

称取20g油酸(油酸纯度为75％)于50ml圆底烧瓶中，加入3％图1或图2所示固定化tl脂肪酶(以油相底物质量计)，6ml及12ml甲醇(油酸和甲醇的摩尔比分别为1:2和1:4)分别一次性加入，反应4h。反应结束后，过滤出固定化tl脂肪酶，继续用于下一批次反应，根据图1或图2所示批次数进行反应。

由于甲醇等短链醇对脂肪酶具有很强的失活作用，所以在制备生物柴油过程中，甲醇往往都是分批次加入或者流加的方式。如图2或图1所示，上述方式虽然在一定程度上可以较少酶的失活，但也大大降低了反应效率。本发明的米糠固定化tl脂肪酶与树脂固定化tl脂肪酶相比，具有较好的甲醇耐性，特别是高的甲醇浓度的反应体系中，米糠固定化tl脂肪酶的失活速度明显慢于树脂固定化的脂肪酶。