通过激活STING通路实现CIK细胞高效杀伤的培养方法与流程

本发明属于细胞生物学领域，具体为一种通过激活sting通路实现cik细胞高效杀伤的培养方法。

背景技术：

随着细胞生物学技术、临床医疗技术的研究深入和发展，免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤等方面的研究也逐渐深入，但因肿瘤细胞具备逃避免疫系统监视的能力，所以促进和激活免疫细胞的信号传导、对肿瘤细胞的识别及杀伤作用对肿瘤治疗及免疫细胞治疗的发展、临床应用具有重要的临床意义。

细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-inducedkiller，cik）是一种新型的免疫活性细胞，cik细胞增殖能力及细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。作为一种新型的、高效的、非mhc限制性的免疫活性细胞得到了广泛应用。cik细胞的实质和来源是指cd3⁺、cd56⁺的淋巴细胞，存在于正常人体中，但含量较少，约占5%以下。目前国内外用于临床的cik细胞制品，就是在体外倍增出的以这些细胞为主的细胞群。

癌症免疫疗法改变了癌症的治疗，免疫检查点抑制剂针对程序性细胞死亡1配体（pdl-1），证明了对多种肿瘤类型的临床疗效。除了那些直接针对适应性免疫应答的免疫调节剂之外，其他免疫调节剂的研究已经扩展到先天免疫激活，这有望增强肿瘤免疫原性。干扰素基因刺激因子（sting）是位于细胞内质网上的一种免疫受体，可以促进细胞溶质病原体和自身dna的增殖及先天免疫传感。sting还与cgmp相互作用及关联，可以调控atp的合成，而sting在与cgmp相结合后分为两个途径，其中1个途径激活nk-κb，nk-κb在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中发挥关键性作用。但是sting与cgmp结合后两个途径最终均会激活ifn-β，提高ifn-β的合成和分泌，ifn-β会提高t淋巴细胞对肿瘤细胞的识别、信号转导、杀伤效果，以及提高t淋巴细胞的增殖速度，提高机体免疫力。现有的研究人员和机构培养的cik细胞对肿瘤细胞的杀伤力较低，造成免疫细胞治疗方法的临床应用效果并不理想。

中国专利公开（公告）号为：cn104673751a，申请日为2015.03.24，为本申请人之前申请的发明专利，该专利内容为高效扩增cik细胞数量，着重在数量培养上，而对于如何提升cik细胞的杀伤力方面并未提及。

技术实现要素：

为了解决现有技术中的不足，本发明旨在提供一种通过激活sting通路实现cik细胞高效杀伤的培养方法，具体的说是一种通过添加ifn-β、氨基苯并咪唑作为诱导因子，激活体外扩增培养cik细胞的sting信号通路，提高所培育cik细胞可大幅提高对人子宫颈癌hela细胞、人乳腺癌mcf-7细胞、人结肠癌sw480细胞杀伤率的cik细胞培养方法，在通过保证cik细胞在高效扩增的前提下，提高cik细胞的杀伤力，促进各种肿瘤cik免疫治疗的细胞数量及杀伤力。

为了达到上述目的，本发明将采用以下技术方案：

一种通过激活sting通路实现cik细胞高效杀伤的培养方法，其特征在于培养步骤为：

第一步：单核细胞分离

将定量血样装到离心管中，对血样进行离心，弃去底部剩余；将获得的血细胞用生理盐水稀释，缓慢加入到装有血样容积20%-30%的淋巴细胞分离液的离心管中，进行离心后，吸弃上清；缓慢吸取白膜层细胞至新的离心管中，向离心管内加入生理盐水，混合均匀，得到白细胞稀释液，最终获得的白细胞稀释液为血样容积的70%-80%，将白细胞稀释液进行离心处理，吸弃上清；用血样容积5%-10%的生理盐水重悬，加入血样容积70%-80%的生理盐水离心后，弃去上清后，得到细胞沉淀；

第二步：接种培养瓶

取血样容积5%-10%的tcm-199培养基重悬细胞沉淀，再次添加血样容积25%-35%的tcm-199培养基，混匀后置于t175培养瓶中；用血样容积30%-60%的tcm-199培养基清洗离心管，清洗后，将洗涤液倒入t175培养瓶中；向t175培养瓶中分别加入hepes-tl、il-2、il-24、ifn-β后，将培养瓶放入co2培养箱中培养，所述ifn-β的浓度范围为5-15ng/ml；第2天，向培养瓶内添加il-1、cd3ak、egf；第4天，向培养瓶内添加胎牛血清及血样容积75%-80%的tcm-199培养基。第5天，向培养瓶内添加血样容积2-3倍的tcm-199培养基；

第三步：接种培养袋

在培养瓶中培养7天后，进行装袋培养，将培养瓶内细胞倒入培养袋，用tcm-199培养基洗涤培养瓶后，将洗涤液倒入培养袋，向培养袋中加入tcm-199培养基至终容积为血样容积15-18倍，同时添加egf、il-24、氨基苯并咪唑，用封口热合器热合培养袋进液管远端处，所述氨基苯并咪唑浓度范围为10-15μm；将培养袋放入co2培养箱中培养，co2培养箱的培养环境均为37℃、7.5%；

第四步：收取细胞

在培养袋中培养14天后，将细胞培养袋经70%-75%的酒精消毒后，混匀细胞培养袋内的细胞并放入生物安全柜中，用碘伏对剪刀以及培养袋上的出液管进行消毒，剪开培养袋出液管，将细胞培养液经离心后，弃去上清，获得cik细胞。

本发明所述氨基苯并咪唑作为激活剂，在sting通路中，sting还与cgmp相互作用及关联，调控atp的合成，进而促进细胞的能力合成，提高机体免疫力；而sting在与cgmp相结合后分为两个途径，其中一途径促进nf-κb，但是两个途径最终均会激活促进ifn-β的合成和分泌。本专利中添加ifn-β为促进sting通路中nf-κb的合成和分泌以及atp的合成，不但可以促进cik细胞的增殖，还可以提高cik细胞对肿瘤细胞的杀伤力。

本发明在培养过程中添加il-1、il-2、il-24、cd3ak、egf的基础上，加入ifn-β、氨基苯并咪唑，激活cik细胞内sting信号通路，提高免疫信号转导，可以发挥明显提高cik细胞对人子宫颈癌hela细胞、人乳腺癌mcf-7细胞、人结肠癌sw480细胞杀伤力的有益效果。

本发明通过诱导外周血单个核细胞成为cik细胞后，通过添加免疫激活剂作为诱导因子，有效激活体外扩增培养过程中cik细胞的sting通路，提高免疫信号转导，可以明显提高cik细胞对人子宫颈癌hela细胞、人乳腺癌mcf-7细胞、人结肠癌sw480细胞的杀伤效果，杀伤率最高可以达到83.14%、78.21%和76.62%。

附图说明

图1为诱导后显微镜下两组cik细胞图片。

图2为各组子宫颈癌hela细胞增殖的影响。

图3为各组mcf-7细胞增殖情况。

图4为各组sw480细胞增殖情况。

其中，图1中的图a为激活sting通路后的cik细胞；b为对照组培养的cik细胞。

具体实施方式

下面结合采用我们以前专利cik细胞高效培养方法和本发明所使用的激活sting通路的cik细胞培养方法之间的对比实验对本发明作进一步的说明：

一种通过激活sting通路实现cik细胞高效杀伤的培养方法，其特征在于培养步骤为：

第一步：单核细胞分离

将定量血样装到离心管中，对血样进行离心，弃去底部剩余；将获得的血细胞用生理盐水稀释，缓慢加入到装有血样容积20%-30%的淋巴细胞分离液的离心管中，进行离心后，吸弃上清；缓慢吸取白膜层细胞至新的离心管中，向离心管内加入生理盐水，混合均匀，得到白细胞稀释液，最终获得的白细胞稀释液为血样容积的70%-80%，将白细胞稀释液进行离心处理，吸弃上清；用血样容积5%-10%的生理盐水重悬，加入血样容积70%-80%的生理盐水离心后，弃去上清后，得到细胞沉淀；

第二步：接种培养瓶

取血样容积5%-10%的tcm-199培养基重悬细胞沉淀，再次添加血样容积25%-35%的tcm-199培养基，混匀后置于t175培养瓶中；用血样容积30%-60%的tcm-199培养基清洗离心管，清洗后，将洗涤液倒入t175培养瓶中；向t175培养瓶中分别加入hepes-tl、il-2、il-24、ifn-β后，将培养瓶放入co2培养箱中培养；第2天，向培养瓶内添加il-1、cd3ak、egf；第4天，向培养瓶内添加胎牛血清及血样容积75%-80%的tcm-199培养基。第5天，向培养瓶内添加血样容积2-3倍的tcm-199培养基；

第三步：接种培养袋

在培养瓶中培养7天后，进行装袋培养，将培养瓶内细胞倒入培养袋，用tcm-199培养基洗涤培养瓶后，将洗涤液倒入培养袋，向培养袋中加入tcm-199培养基至终容积为血样容积15-18倍，同时添加egf、il-24和氨基苯并咪唑，用封口热合器热合培养袋进液管远端处；将培养袋放入co2培养箱中培养；

第四步：收取细胞

在培养袋中培养14天后，将细胞培养袋经70%-75%的酒精消毒后，混匀细胞培养袋内的细胞并放入生物安全柜中，用碘伏对剪刀以及培养袋上的出液管进行消毒，剪开培养袋出液管，将细胞培养液经离心后，弃去上清，获得cik细胞。

下面将我们以前专利cik高效培养方法作为对比实验来进一步说明本发明的效果：

一、单核细胞分离

将采血管用浸润酒精的无尘纸擦拭洁净后放入生物安全柜。将60ml血样平均分装到50ml离心管中，2000rpm离心10min；离心后吸至距分界面0.5cm处为止，弃去底部剩余；用生理盐水按1:1的比例稀释血细胞；加入到装有15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管中，添加过程需缓慢，使其分界面呈清晰界面，1600rpm离心20min；离心后，吸弃上清，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加生理盐水至45ml，混匀后，1500rpm离心10min；离心后弃去上清，沉淀先用5ml生理盐水重悬，再加生理盐水45ml，混匀后取1ml样本于ep管中，用于计算细胞总量，1300rpm离心10min；离心后弃去上清，沉淀即为所需单核细胞。

二、cik细胞诱导及培养

1.cik细胞的诱导培养

用5mltcm-199培养基重悬外周血单核分离提取中所获得的细胞沉淀，再加入20mltcm-199培养基，混匀后加到t175培养瓶中；再加25ml的tcm-199培养基清洗50ml离心管，将洗涤液加到t175培养瓶中；向t175培养瓶中加入hepes-tl、il-2、il-24、ifn-β均为10ng/ml。将培养瓶放入37℃、7.5%的co2培养箱中培养。第2天，向瓶内添加il-1、cd3ak、egf均为10ng/ml。第4天，添加5ml胎牛血清，加50mltcm-199培养基。第5天，加140mltcm-199培养基。在培养瓶中培养7天后，进行装袋培养。旋开培养袋的进液管，取50ml注射器套筒插入进液管作为漏斗；将培养瓶内细胞倒入培养袋，用250mltcm-199培养基洗涤培养瓶，洗涤液倒入培养袋；重复洗涤一次；直接向培养袋中加tcm-199培养基，加至终容积为1000ml；并加入浓度为10ng/ml的egf和il-24，并加入氨基苯并咪唑至浓度为14μm，用封口热合器热合培养袋进液管远端处，热合两次；将培养袋放入37℃、7.5%co2培养箱中培养。

2．cik细胞的诱导培养对照组试验

用5mltcm-199培养基重悬外周血单核分离提取中所获得的细胞沉淀，再加入20mltcm-199培养基，混匀后加到t175培养瓶中；再加25ml的tcm-199培养基清洗50ml离心管，将洗涤液加到t175培养瓶中；向t175培养瓶中加入il-2、ifn-γ均为10ng/ml。将培养瓶放入37℃、5.0%的co2培养箱中培养。第2天，向瓶内添加cd3ak为10ng/ml。第4天，添加5ml胎牛血清，加50mltcm-199培养基。第5天，加140mltcm-199培养基。在培养瓶中培养7天后，进行装袋培养。旋开培养袋的进液管，取50ml注射器套筒插入进液管作为漏斗；将培养瓶内细胞倒入培养袋，用250mltcm-199培养基洗涤培养瓶，洗涤液倒入培养袋；重复洗涤一次；直接向培养袋中加tcm-199培养基，加至终容积为1000ml；并加入浓度为10ng/ml的egf和il-24，用封口热合器热合培养袋进液管远端处，热合两次；将培养袋放入37℃、5.0%co2培养箱中培养。培养14天后收获细胞。

3.cik细胞作用于子宫颈癌hela细胞、人乳腺癌mcf-7细胞、人结肠癌sw480细胞

将相同数量人子宫颈癌hela细胞、人乳腺癌mcf-7细胞、人结肠癌sw480细胞（均包括1×10⁵个细胞）接种至6培养孔板，放置在恒温培养箱中培养12h后均加入收获后的cik细胞溶液1ml（含cik细胞1×10⁶个），然后放置在37℃、5%co2培养箱中共培养。分别培养12h、24h、48h、72h。使用bd流式细胞仪检测各组人子宫颈癌hela细胞、人乳腺癌mcf-7细胞、人结肠癌sw480细胞及cik细胞的数量。

共检测人子宫颈癌hela细胞对照组、人乳腺癌mcf-7细胞对照组、人结肠癌sw480细胞对照组、人子宫颈癌hela细胞+cik细胞作用组、人乳腺癌mcf-7细胞+cik细胞作用组、人结肠癌sw480细胞+cik细胞作用组、人子宫颈癌hela细胞+cik细胞对照组、人乳腺癌mcf-7细胞+cik细胞对照组、人结肠癌sw480细胞+cik细胞对照组。

通过在培养过程中，本发明在添加il-1、il-2、il-24、cd3ak、egf以到达对cik细胞进行高效培养导外周血单个核细胞细胞成为cik细胞的同时，添加ifn-β和氨基苯并咪唑，诱并激活cik细胞的sting信号通路，提高cik细胞免疫信号转导，很大程度的提高了cik细胞对人子宫颈癌hela细胞、人乳腺癌mcf-7细胞、人结肠癌sw480细胞的杀伤效果。不需要额外添加其他试剂和细胞诱导及增殖相关的细胞因子。可有效提高cik细胞对人子宫颈癌hela细胞、人乳腺癌mcf-7细胞、人结肠癌sw480细胞的杀伤效果。

由于采用上述培养方法，本发明可显著提高cik细胞对人子宫颈癌hela细胞、人乳腺癌mcf-7细胞、人结肠癌sw480细胞的杀伤效果。具体的，对人子宫颈癌hela细胞、人乳腺癌mcf-7细胞、人结肠癌sw480细胞的杀伤率最高可以达到47.93%、48.74%和45.97%。而添加激活剂激活sting通路培养的cik细胞对人子宫颈癌hela细胞、人乳腺癌mcf-7细胞、人结肠癌sw480细胞最高可以达到83.14%、78.21%和76.62%。