非综合征性常染色体显性遗传性耳聋致病基因KCNQ4突变检测用试剂盒的制作方法

本发明涉及基因检测领域，具体涉及在诊断非综合征性常染色体显性遗传性耳聋dfna2中应用的kcnq4基因单个突变位点c.c1258t(p.r420w)分型检测试剂盒。
背景技术：
：kcnq4基因是1999年由kubisch等报道的一个钾通道基因，van等通过家族染色体连锁分析，最终将导致dfna2的基因定位于染色体1p34区段。随后发现钾离子通道家族的成员kcnq4基因就位于染色体1p34区段，正是dfna2的致病基因。在小鼠耳蜗中，kharkovets等发现kcnq4mrna大量分布在外毛细胞中；通过kcnq4特异抗体标记发现，kcnq4蛋白主要位于外毛细胞的基底膜部分，在前庭器官中，kcnq4局限分布于i型毛细胞和包裹感觉细胞的盏状传入神经末梢中，在中枢神经系统中，kcnq4分布于听觉传导通路的(非全部)核团神经元中，如耳蜗核、外侧丘系以及下丘中，在大脑的其他区域没有发现kcnq4的表达。kcnq4是第一个被发现的仅存于单一感觉通路中的离子通道。因此，将其作为药物靶点进行耳聋治疗有很好的特异性。kcnq4是染色体1p34区域的一个长约1.25mb的片段，其mrna全长4116bp，含有14个外显子，编码695个氨基酸组成的多肽，分子量约为77kda。典型的kcnq4通道由4个亚基组成，每个亚基由6个跨膜片段(s1-s6)以及分布在膜内侧的n端和c端组成。s4片段包含了通道的电压感受区，s5、s6及位于它们之间的p-loop，形成孔区。4个p-loops组成了通道的离子选择器。所有的kcnq4通道都有一个很长的c端，能够整合多条信号通路。kcnq4基因在内耳仅表达在外毛细胞上，而不表达在内毛细胞和血管纹上，其功能主要是参与受刺激后毛细胞的钾离子循环。kcnq4基因突变可引起表型为常染色体显性遗传的习语后高频听力损失为主的听力下降。在一个法国dfna2家庭的3个患者中，发现了位于kcnq4基因的突变位点g285s。同年，在一个美国dfna2家庭中也发现了kcnq4基因同一个氨基酸位点的突变g285c。这两个突变都改变了k+通道的标志序列(gyg)的第一个甘氨酸(g)，而这个标志序列正是k+的选择性过滤器。g285s突变改变了位于通道孔区的一个氨基酸残基，该位点突变不仅抑制了突变型kcnq4通道钾离子电流的产生，还能够抑制野生型kcnq4通道钾离子电流的产生，引起一个显性负效应，从分子水平上解释了dfna2的显性遗传机制。该标志序列(gyg)的第2个甘氨酸突变(g287r)也被发现是导致包含17个家庭成员耳聋的元凶。除了g285s、g285c和g287r外，kcnq4通道孔区的另外9种错义突变也随后被报道。kim及gao等都曾报道，将孔区的5种突变l274h、w276s、l281s、g285c、g296s以及c端的突变g321s表达在异源的表达系统中，发现由于通道滞留在内质网中而无法产生有功能的通道。将野生型kcnq4与突变体混合用于模拟临床上所见的dfna2能够产生幅度很小的电流。除了通道孔区的突变外，在跨膜区也发现有kcnq4的突变。在dfna2患者中还发现了缺失突变和插入突变。kcnq4基因突变的发现，不仅会促进该病的发病机理等基础研究的发展，还将大大促进非综合征性常染色体显性遗传性耳聋的基因诊断和治疗的开展。通过产前诊断筛查及新生儿kcnq4基因突变的普遍筛查，可以降低非综合征性常染色体显性遗传性耳聋患儿的出生率，并且实现症前诊断，从而指导携带致病基因的患者定期复查，预防疾病的发生，这将会大大减少耳聋患者的数量，减轻社会压力。因此，发现新的突变位点对于非综合征性常染色体显性遗传性耳聋的预防、诊断及治疗具有重要意义。但由于kcnq4基因的突变种类多样，每个位点变异后对蛋白的功能影响不同，增加了明确新的突变位点致病性的难度。kcnq4基因单个突变位点c.c1258t(p.r420w)至今尚未见到报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种非综合征性常染色体显性遗传性耳聋致病基因kcnq4突变检测用试剂盒。为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种检测kcnq4基因c.c1258t(p.r420w)突变的试剂盒，该试剂盒包括用于扩增dna片段的pcr反应试剂，所述pcr反应试剂包括pcr引物，该pcr引物扩增的目标片段包含人kcnq4基因(参考序列nm_004700)编码区第1258位所对应的碱基。优选的，所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取pcr扩增所需的模板dna的试剂。优选的，所述试剂盒还包括用于对pcr扩增的目标片段进行测序的试剂。优选的，所述pcr引物选自引物对p1或p2；引物对p1的序列为：kcnq4-e9f1：5`-actgatggtgccctctcctgc-3`；kcnq4-e9r1：5`-aacaggcccagacacccacga-3`；引物对p2的序列为：kcnq4-e9f2：5`-ccatggccctgcctgcc-3`；kcnq4-e9r2：5`-gacggcctaggagtccccca-3`；利用上述试剂盒检测kcnq4基因c.c1258t(p.r420w)突变的方法，包括以下步骤：1)采集待测个体的血液、体液或组织，然后提取dna；2)以步骤1)提取的dna为模板，以上述pcr引物进行pcr反应，得到pcr反应产物；从pcr反应产物中分离pcr反应扩增的目标片段，并对该目标片段所包含的对应于人kcnq4基因(参考序列nm_004700)编码区第1258位的碱基进行分型鉴定。优选的，所述分型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法，通过将测序结果与所述参考序列进行比对，确定待测个体对应于人kcnq4基因(参考序列nm_004700)编码区第1258位的基因型或等位基因类型。优选的，根据比对确定的基因型包括野生纯合型c/c或突变杂合型c/t。上述试剂盒在非综合征性常染色体显性遗传性耳聋病因学分析中的应用。使用该试剂盒并通过检测来自于待测样本(患者的kcnq4基因片段)中对应于人kcnq4基因(参考序列nm_004700)编码区第1258位是否存在c.c1258t突变，从而判断该患者非综合征性常染色体显性遗传性耳聋发生的遗传性原因。其中，kcnq4基因发生c.c1258t突变为错义突变，导致kcnq4基因编码的第420位氨基酸由精氨酸突变为色氨酸(p.r420w)。本发明的有益效果体现在：本发明所提出的试剂盒可用于快捷地检测kcnq4突变位点，通过检测来自患者的dna样本中是否存在kcnq4基因c.c1258t突变，可以判断该患者的非综合征性常染色体显性遗传性耳聋发生原因，进而为临床诊断提供依据。本发明所提出的试剂盒在用于非综合征性常染色体显性遗传性耳聋的诊断时：1)本发明将为在非综合征性常染色体显性遗传性耳聋患者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法；2)可以通过产前诊断筛查及新生儿kcnq4基因突变的普遍筛查，降低非综合征性常染色体显性遗传性耳聋患儿的出生率，为社会和家庭减轻负担；3)通过检测患者中是否存在kcnq4基因突变，这将有利于为不同类型非综合征性常染色体显性遗传性耳聋患者确定个体化治疗方案，避免人工耳蜗植入无效而造成的不必要的经济损失。附图说明图1为kcnq4基因编码区核苷酸与氨基酸的对照：突变位于kcnq4基因编码区第1258位中一个c碱基，突变后的碱基序列使第420位氨基酸由精氨酸突变为色氨酸。图2为pcr反应过程示意图：示出了反应温度和时间，其中↓表示每个循环降低0.5℃。图3为对pcr扩增产物进行电泳定量的琼脂糖凝胶电泳图谱：示出了定量marker(泳道1)的片段位置，扩增片段(泳道2)大小约为300bp。图4为kcnq4基因测序结果图：(a)野生型序列c/c；(b)杂合突变序列(患者序列，c/t)。图5为突变位点处氨基酸物种保守性分析：箭头所指是突变前氨基酸。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作详细说明，以下实施例用于解释本发明，而非对本发明的限定。本发明对1例非综合征耳聋患者进行医学全外显子测序，并应用sanger测序进行验证。该耳聋患者kcnq4基因发生c.c1258t(p.r420w)突变，听力正常人群kcnq4基因对应位点未发生突变。目前报道的与非综合征性常染色体显性遗传性耳聋相关的突变有20余种，尚无kcnq4基因c.c1258t突变的报道。参见图1，上述突变(c.c1258t)使位于kcnq4基因编码区的第1258位碱基发生由c到t的错义突变(野生型kcnq4基因的标准序列可以参考，nm_004700)，导致第420位氨基酸由精氨酸突变为色氨酸(p.r420w)，该位点在各个物种之间是高度保守的(图5)。检测上述突变(c.c1258t)可采用多种检测点突变的方法来进行，例如pcr(聚合酶链反应)-测序法、标记的kcnq4基因dna探针杂交法、限制性片段长度多态性方法或序列特异性引物的方法等。其中，采用pcr扩增-直接测序法来检测样本，包括下述步骤：1)采集待测个体的样本，例如血液，提取基因组dna；2)以该dna为模板，以针对kcnq4基因编码区第1258位碱基附近设计的pcr引物进行pcr反应，得到pcr扩增产物；3)将得到的pcr扩增产物进行直接测序分析，将测序所得到的序列与kcnq4正常基因的序列(参考序列nm_004700)进行比较，确定待测个体kcnq4基因是否存在的c.c1258t突变；4)根据以上结果判断待测个体是否为kcnq4基因突变c.c1258t导致的非综合征性常染色体显性遗传性耳聋。在上述步骤2)中使用的pcr引物可以依据已知的引物核苷酸序列设计：通常为15～30个碱基，gc含量为45～50％左右，在适当的温度下与目的基因末端特异性结合。引物可以利用现有的计算机程序设计。上述步骤2)所得到的pcr反应产物若使用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的kcnq4核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基因特异探针。根据检测方法的不同，用于检测kcnq4基因c.c1258t突变的试剂盒中，除了包括pcr反应试剂，还包括检测pcr扩增产物的试剂，其具体选自测序检测试剂、限制性长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂、探针杂交检测试剂。试剂盒容器内装有用以检测kcnq4基因c.c1258t突变的试剂成分，与之同时提供的还有经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。对于pcr反应试剂，例如，可含有扩增引物、dntps、用于pcr反应的dna聚合酶及其缓冲液等。实例1通过聋病门诊及资源收集网络收集各种非综合征性常染色体显性遗传性耳聋，建立资源库。在患者自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5～10ml血样，并建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。然后，应用酚氯仿抽提的方法提取基因组dna，定量后入库，-20℃保存，每份dna样品均详细对应于登记的患者临床资料。然后，应用在线引物设计软件primer3设计引物(包含kcnq4整个exon9区域)，以基因组dna为模板，pcr扩增。pcr扩增产物直接测序：测序引物与pcr扩增引物相同，正反向测序，应用abi公司3700dna测序仪。测序得到的序列与genbank中的序列(nm_004700)比较，确定kcnq4基因c.c1258t突变。具体如下：(一)待测血样提取与kcnq4基因编码区的pcr扩增1、待测对象血样dna的制备1.1研究对象对患者及100名无家族史的听力正常对照详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后，于2018年10月在西京医院(陕西省西安市)耳鼻咽喉头颈外科，采集血样5～10ml。1.2基因组dna提取第一天1)用pbs对收集到的血液进行对倍稀释。2)在离心管中加入2倍体积的淋巴分离液(18℃～28℃)，上面铺一层1倍体积已稀释的血液，室温、1000×g离心20分钟。3)吸弃上清液，小心吸出中间有核细胞层，转入5mlep管中，5000×g离心10分钟，然后用pbs洗一次，5000×g离心10分钟。4)将细胞悬于2mlte缓冲液(10mmtris.hcl，1mmedta，ph8.0)中，加10％的sds(十二烷基硫酸)至终浓度0.5％(100μl)，每毫升样品加入浓度为10mg/ml的蛋白酶k(solarbio公司)200μl，50℃水浴3～5小时。5)用等体积的饱和酚，加入混匀，5000×g离心10分钟。6)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积酚:氯仿混合物，混匀，5000×g离心10分钟。7)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积氯仿:异戊醇混合物，混匀，5000×g离心10分钟。8)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入1/10体积的乙酸钠，混匀。9)加入2.5倍体积的无水乙醇。10)-20℃沉淀dna过夜。第二天11)10000×g、4℃高速离心10分钟。12)弃上清液，加入75％乙醇2ml，10000×g高速离心5分钟。13)弃上清液，吹干。14)用te缓冲液溶解(200μlte/5ml全血，400te/10ml全血)。15)1％琼脂糖电泳和分光光度计定量。2、kcnq4基因编码区的pcr扩增2.1引物序列(使用primer3在线设计软件，参考序列：nm_004700，序列合成后用于此检测，引物设计完成时间为2018年12月)上游引物kcnq4-e9f1：5`-actgatggtgccctctcctgc-3`；下游引物kcnq4-e9r1：5`-aacaggcccagacacccacga-3`；2.2pcr反应体系的建立(表1)表1.kcnq4基因的pcr反应体系其中，pcr扩增使用的buffer、taq酶、dntp购自鼎国公司。pcr反应在biorads1000热循环仪上进行，反应过程(包括温度和时间)如图2所示：1)94℃预变性5分钟；2)94℃变性30秒，61℃(起始退火温度，后每个循环降低0.5℃)退火30秒，72℃延伸30秒，12个循环；3)再94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，25个循环；4)反应结束后再72℃延伸5分钟，4℃保存。(二)kcnq4基因编码区pcr扩增产物的纯化和定量1、pcr产物的纯化(96孔板法)1)向装有pcr产物的96孔板中加入50μl无菌水，混匀。2)将其转移到millipore纯化板中，真空抽滤约3分钟，纯化板中没有水即可。3)向纯化板中再加入50μl的去离子水，继续抽滤，直到纯化板中没有水为止。4)将纯化板从真空泵上取下，向板中加入20μl的去离子水，静置15分钟，再震荡15分钟，然后吸到一新96孔板内。5)保存在-20℃冰箱中。2、电泳定量2.1样品准备取一96孔点样板，每孔先加上样缓冲液6μl，在从装有pcr产物的腔板中，每孔用排枪移出pcr产物(2μl)，转移到点样板上、混匀、离心(腔板孔号要与96孔点样板一一对应)。2.2流程1)配胶(0.8％琼脂糖)：称取2.4g琼脂糖，悬浮于300ml0.5×tbe中(500ml锥形瓶)。2)溶胶：微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混匀。3)凉胶：待胶完全溶解，从微波炉中取出，晾至60℃左右，加入1滴eb(约10μl，10mg/ml)，摇匀。4)铺胶：平板两端用胶布封严，把250ml胶液全部倒入平板，插入梳尺。5)上胶：将平板放入已盛有电泳液(0.5×tbe，液面距胶面1至2mm)的电泳槽中，拔下梳尺。6)加样：用排枪按规定格式加样，最后用单枪加入dna标准品。7)走胶：盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。8)定量：当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相，进行定量。定量marker为dl2000(takara)，如图3所示，经过电泳后，有6条带可见，片段长度分别是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，dl2000的总浓度是300ng/5μl。电泳时取5μldl2000，因此每条带的含量为50ng。pcr产物电泳时取2μl(pcr产物)+6μl(上样缓冲液)进行电泳。根据pcr产物电泳后的灰度值与dl2000的灰度值的比较判断pcr产物大小和含量。(三)kcnq4基因编码区pcr扩增产物的直接测序1、pcr产物dna模板的纯度与用量要求dna纯度：od260/od280＝1.6～2.0。dna浓度：pcr产物10ng/μl。表2.dna用量pcr产物长度(bp)测序加入模板量(ng)100～2001～3200～5003～10500～10005～201000～200010～40>200040～1002、测序反应1)测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。2)为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。3)目前的反应体系为5μl，各种试剂加入量如表3所示。表3.kcnq4基因pcr扩增产物的测序反应体系其中，*bigdyev3.1为美国应用生物系统公司(abi)生产的一种用于测序反应的荧光染料。4)样品放于pcr仪(热循环仪)上，反应的过程见表4。表4.kcnq4基因pcr扩增产物的测序反应过程5)反应完的样品及时从pcr仪(热循环仪)上取下，短时间内进行纯化的样品放置于4℃冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-20℃冰箱冷冻。3、测序反应物的纯化和测序1)向每孔中加入20μl80％乙醇，4000rpm离心30min；将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1000rpm；2)在每孔中加入30μl70％乙醇，4000rpm离心10min，倒甩；3)重复第2步的操作；4)重复第2步的操作；5)将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；6)加入5μl甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；7)95℃变性5分钟，放置冰上2分钟，离心后上样。测序结果如图4所示。(四)检测耳聋相关基因kcnq4突变(c.c1258t)的试剂盒及其应用1、试剂盒的组成(1)扩增用引物：上游引物kcnq4-e9f1：5`-actgatggtgccctctcctgc-3`；下游引物kcnq4-e9r1：5`-aacaggcccagacacccacga-3`；(2)pcr扩增用taq酶5u/μl(3)10×缓冲液(含15mlmgcl2)(4)dntp2.5mm(5)big-dyemix2、使用方法主要包括如下步骤：1)pcr扩增用软件primer3对kcnq4基因的编码区设计pcr引物，pcr反应条件见图2。2)pcr产物纯化pcr产物电泳，凝胶纯化及电泳定量。3)测序反应及验证以pcr引物作为测序引物进行测序反应，在biorads1000热循环仪上进行测序反应。反应结束后，延伸产物上样于abiprism3700dna序列分析仪。将所得到的测序图谱进行分析，与标准序列(nm_004700)比较以确定突变是否存在。实例2pcr扩增引物(设计完成时间2018年12月)为以下任意一对引物，其他同实例1：上游引物kcnq4-e9f2：5`-ccatggccctgcctgcc-3`；下游引物kcnq4-e9r2：5`-gacggcctaggagtccccca-3`。<110>中国人民解放军第四军医大学<120>非综合征性常染色体显性遗传性耳聋致病基因kcnq4突变检测用试剂盒<160>4<210>1<211>21<212>dna<213>人工合成<400>1actgatggtgccctctcctgc21<210>2<211>21<212>dna<213>人工合成<400>2aacaggcccagacacccacga21<210>3<211>17<212>dna<213>人工合成<400>3ccatggccctgcctgcc17<210>4<211>20<212>dna<213>人工合成<400>4gacggcctaggagtccccca20当前第1页12