无创rs1801133基因型快速分型检测试剂盒的制作方法

本发明涉及医学检测技术、生物技术及临床分子诊断
技术领域：
，具体地说是一种无创5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)rs1801133基因型快速分型检测试剂盒,具体涉及无需创伤采血，采用口腔上皮细胞等样品即可检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因并分型的检测试剂盒及其临床应用。
背景技术：
：5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydrofolatereductase，mthfr)，主要作用是在叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接为dna甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一个较低的水平。此外叶酸的中间代谢产物在核苷酸合成过程中也有重要的作用，通过一碳单位代谢为嘌呤环的形成提供碳原子。mthfr是叶酸代谢限速酶，催化5，10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，从而在叶酸代谢、dna甲基化及修复中起重要作用。mthfr基因变异引起的mthfr酶活性降低可阻抑同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸，导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症，从而增加新生儿出生缺陷风险或自发性流产等风险，以及成年人的癌症、心血管疾病等疾病的发生。mthfr的rs1801133(c677t)是一种c>t错义突变，引起mthfr基因编码的蛋白质第222个氨基酸由ala变为val，导致酶活性和热稳定性下降。这种突变在亚洲人群很常见，所以具有较高的检测意义。若以个体的rs1801133cc基因型时其mthfr活性为100％、ct基因型的活性则为cc基因型的小于65％，tt基因型只有小于30％。因此，rs1801133与叶酸代谢相关疾病密切相关。rs1801133t等位基因携带者因叶酸代谢能力较弱(特别是tt基因型)，需加大叶酸服用剂量方能有效达到降低出生缺陷和高血压患者中风、心肌梗死和死亡风险。wilson等和moslev等的研究表明，妊娠妇女体内叶酸缺乏是神经管缺陷(neuraltubedefects，ntds)的一个重要危险因素。母亲在妊娠期胎儿器官形成的关键时期增补叶酸可有效降低胎儿发生ntds的危险性。此外、mthfr基因的缺陷对孕妇人群会引起神经管缺陷、先天性心脏病、唇腭裂、妊娠期高血压疾病、自发性流产、癌症、心脑血管疾病等多种病症叶酸属于b族维生素，人体不能合成叶酸，必须依靠外源性供给。叶酸在人体内以四氢叶酸的形式参与氨基酸的相互转换、dna合成等许多重要化合物的形成和代谢，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。遗传体质的差异导致了机体对叶酸利用能力的差异，因此，叶酸增补应因人而异，增补过多或过少都不利于胎儿健康和孕妇健康。从另一方面，叶酸增补不应仅仅局限在女性，男性补充叶酸有着同等重要的意义。研究证明，男性体内缺乏叶酸，会导致精子质量降低，精液中精子携带的染色体数量异常，引起新生儿出生缺陷。机体叶酸水平低下，也是引起不育不孕、自发性流产的重要原因之一。因此，新婚夫妇准备怀孕前，至少应该做叶酸代谢基因检测，这样更有利于优孕。因此，通过叶酸代谢基因检测，可以尽早发现不同个体对叶酸的吸收利用水平，从而筛查出容易引起叶酸缺乏的高危人群，实现个性化增补叶酸。技术实现要素：本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种无创5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)rs1801133基因型快速分型检测试剂盒。caps(cleavedamplificationpolymorphismsequence-taggedsites)技术，也称pcr-rflp，是用pcr扩增目的dna，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨的dna序列检测技术。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的dna片段条带。此项技术大大提高了目的dna的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短，需要的仪器设备较便宜，最关键的是，本发明探索出无需采血，只需用口腔拭子刮取口腔上皮细胞即可检测，大大提高了取材简便性，做到真正的全民检测。基于caps技术的优势，本发明探索了此方法来进行mthfr的rs1801133(c677t)检测并获得成功，目的是开发成为试剂盒，使mthfr的rs1801133(c677t)检测成为高效、大容量和低成本的检测项目，更好的应用于临床。本发明提供一种叶酸代谢相关基因mthfr遗传变异检测试剂盒及其应用，能有效地检测mthfr遗传变异rs1801133，有助于临床医生采取正确的叶酸服用剂量，叶酸代谢相关疾病的发病风险。本发明的技术方案是按以下方式实现的，本发明的无创rs1801133基因型快速分型检测试剂盒，该试剂盒包含有：(1)正向和反向引物：所述正向引物为mthfr-cut-f所示序列的核苷酸链或其互补链；所述反向引物为mthfr-cut-a所示序列的核苷酸链或其互补链；正向引物mthfr-cut-f，序列：5’-gcctctcctgactgtcatcc-3’；反向引物mthfr-cut-a，序列：5’-aggacggtgcggtgagagtg-3’；(2)反应试剂：a：口腔上皮dna提取液；b：pcr反应液：mthfrmix主反应液；c：cut反应液：hinfi酶及其缓冲液；d：tbe溶液：电泳缓冲液；e：胶粉：琼脂糖凝胶；f：上样浓缩液：溴酚蓝配置的loadingbuffer6x；g：指示带：dnamaker(1000-100bp)；h：显色剂：gold-view双链dna染色剂；(3)包含rs1801133cc、ct和tt基因型的质粒，作为阳性对照，以及阴性对照：去离子水。所述检测试剂盒的pcr反应体系为20μl，包括15ulmthfrmix主反应液，基因组dna模板5μl；酶切反应体系为20ul，包括10ulpcr反应产物，10ulcut反应液；上样体系6ul，包括cut产物5ul，上样浓缩液1ul；凝胶配制方法为0.5x的tbe溶液，配制成2％浓度的琼脂糖凝胶，含显色剂。所述检测试剂盒的pcr反应的条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性20秒、65℃退火20秒，72℃延伸20秒，35个循环；72℃终末延伸5分钟；4°保存。cut反应液的酶切反应的程序为：37°2小时，4°保存。d：tbe溶液：电泳缓冲液；电泳及分析的程序为：120v电压，50ma，电泳30min左右，直至溴酚蓝指示带移到凝胶中部；把凝胶放入凝胶成像分析系统，实验结果应于图1所示类似，其中cc型条带为282bp，tt型条带为176bp及106bp，ct型条带为282bp、176bp及106bp。所述检测试剂盒的检测结果，对有效扩增且阴阳性对照均符合预其时，样品检测结果可信，否则检测实验需要重复；样本扩增异常，酶切异常，需排除人为操作和仪器故障等问题后重新进行检测实验。一种用于叶酸代谢相关基因mthfr遗传变异检测的引物对，该引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物mthfr-cut-f所示序列的核苷酸链或其互补链；所述反向引物为mthfr-cut-a所示序列的核苷酸链或其互补链；正向引物mthfr-cut-f，序列：5’-gcctctcctgactgtcatcc-3’；反向引物mthfr-cut-a，序列：5’-aggacggtgcggtgagagtg-3’。一种用于叶酸代谢相关基因mthfr遗传变异检测的阳性质控，扩增序列连接到了空质粒载体当中，并进行了基因测序，包含野生、突变两种序列完全正确的质粒，以及其混合物。所述的无创rs1801133基因型快速分型检测试剂盒，在制备预防出生缺陷产品以及预防高血压患者中风产品中的应用。所述的无创rs1801133基因型快速分型检测试剂盒，在制备用于筛查叶酸缺乏高危人群的产品中的应用。本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：本发明的无创5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)rs1801133基因型快速分型检测试剂盒，本发明以一个聚合酶链式反应，反应体系中包含特异性的正向和反向引物，通过实时荧光定量检测来判断基因型。本发明仅需普通引物，无需探针，生产成本较低，有利于市场推广和产业化。本发明具有操作简单、分型准确快速、结果易判读等优势，可用于临床上与叶酸代谢相关基因mthfr遗传变异rs1801133的检测和筛查，使临床医生能预测孕妇、备孕夫妇或高血压患者叶酸代谢能力情况，协助医生选用合适剂量的叶酸，从而预防出生缺陷和高血压患者中风。附图说明附图1是本发明的实施例中的凝胶电泳图。具体实施方式下面结合附图对本发明的无创5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)rs1801133基因型快速分型检测试剂盒作以下详细说明。本发明的无创5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)rs1801133基因型快速分型检测试剂盒，该试剂盒用于鉴定rs1801133基因型，该试剂盒含有：(1)正向和反向引物：所述正向引物为mthfr-cut-f所示序列的核苷酸链或其互补链；所述反向引物为mthfr-cut-a所示序列的核苷酸链或其互补链；(2)反应试剂：a：口腔上皮dna提取液b：pcr反应液：mthfrmix主反应液；c：cut反应液：hinfi酶及其缓冲液；d：tbe溶液：电泳缓冲液；e：胶粉：琼脂糖凝胶；f：上样浓缩液：溴酚蓝配置的loadingbuffer6x；g：指示带：dnamaker(1000-100bp)；h：显色剂：gold-view双链dna染色剂；(3)包含rs1801133cc、ct和tt基因型的质粒(阳性对照)，以及阴性对照(去离子水)。作为本发明优选的技术方案，所述检测试剂盒的pcr反应体系为20μl，包括15ulmthfrmix主反应液，基因组dna模板5μl；酶切反应体系为20ul，包括10ulpcr反应产物，10ulcut反应液；上样体系6ul，包括cut产物5ul，上样浓缩液1ul；凝胶配制方法为0.5x的tbe溶液，配制成2％浓度的琼脂糖凝胶(含显色剂)。作为本发明优选的技术方案，所述检测试剂盒的pcr反应的条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性20秒、65℃退火20秒，72℃延伸20秒，35个循环；72℃终末延伸5分钟；4°保存酶切反应的程序为：37°2小时4°保存电泳及分析的程序为：120v电压，50ma，电泳30min左右，直至溴酚蓝指示带移到凝胶中部；把凝胶放入凝胶成像分析系统，实验结果应于图1所示类似，其中cc型条带为282bp，tt型条带为176bp及106bp，ct型条带为282bp、176bp及106bp。作为本发明优选的技术方案，所述检测试剂盒的检测结果，对有效扩增且阴阳性对照均符合预其时，样品检测结果可信，否则检测实验需要重复；样本扩增异常，酶切异常等，需排除人为操作和仪器故障等问题后重新进行检测实验。在本发明的另一个方面，提供一种用于叶酸代谢相关基因mthfr遗传变异检测的引物对，该引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物mthfr-cut-f所示序列的核苷酸链或其互补链；所述反向引物为mthfr-cut-a所示序列的核苷酸链或其互补链。在本发明的另一个方面，提供一种用于叶酸代谢相关基因mthfr遗传变异检测的阳性质控，扩增序列连接到了空质粒载体当中，并进行了基因测序，包含野生、突变两种序列完全正确的质粒，以及其混合物。在本发明的另一个方面，提供上述检测试剂盒的应用，包括在制备预防出生缺陷产品以及预防高血压患者中风产品中的应用。第一部分：试剂盒的组成及结果分析1.人基因组dna抽提：本试剂盒适合的样本包括不限于全血、唾液或口腔拭子等样本类型，基因组dna抽提使用商业化的试剂盒对组织中的dna进行提取和纯化。也可以使用本试剂提供的dna提取液提取口腔上皮细胞dna。2.试剂盒的配方与组成：表1反应体系配方组成成分及浓度体积2xpcrmix(含dye)10ul正向引物(1μm)2ul反向引物(1μm)2ul基因组dna(10-100ng/μl)5ulddh2o1ul表2cut反应液配方组成成分及浓度体积10xcutbufferh2ulhinfi(6000u/ul)1ulpcr反应液10ulddh2o7ul表3引物序列3.试剂盒实验反应程序：表4pcr程序及分析程序表5酶切反应程序阶段循环数(个)温度(℃)时间(小时)备注酶切1372-3冷却14长期5.结果分析参考图1，根据条带位置及数目对样本中的rs1801133基因型进行判断。其中结果可信的前提为：a、样本条带正常且肉眼可见、明亮。b、阴性质控品无扩增。c、三种阳性质控品实验结果应于图1所示类似，其中cc型条带为282bp，tt型条带为176bp及106bp，ct型条带为282bp、176bp及106bp。如果abc同时符合要求，那么标本符合野生型质控条带的为cc型，符合突变型质控条带的为tt型，符合杂合型质控条带的为ct型。如果abc有不符，那么需排除操作、试剂盒或样本问题后，重新进行实验。第二部分：检测结果的临床应用结合rs1801133基因型的叶酸服用基础剂量见表4，对于合并有其它高危因素的个体，可在此基础上对叶酸剂量进行增补。表6叶酸服用的建议量当前第1页12