长春花中艾里莫芬烷倍半萜的生物合成基因及应用的制作方法

本发明属于植物基因工程和医药技术领域，具体涉及一类具有抗菌作用的艾里莫芬烷倍半萜5-epi-jinkoh-eremol和debneyol的生物合成方法及应用。

背景技术：

植物真菌病是由植物病原真菌引起的病害。约占植物病害的70～80％，是经济植物减产的主要原因之一。在一种作物中可发现几种甚至几十种真菌病害，常见有霜霉、白粉、白锈、黑粉、锈粉、烟霉、黑痣、霉状物、蘑菇状物、棉絮状物、颗粒状物、绳索状物、粘质粒和小黑点等。农作物感病后引起产量下降和品质变劣，有些病原真菌(如镰刀菌、黄曲霉菌)在侵染植物过程中，还产生多种对人畜有害的真菌毒素，影响食品安全。许多真菌病害在环境条件不适宜时完全不表现病征。真菌病害的侵染循环类型最多，许多病菌可形成特殊的组织或孢子越冬，危害周期长，造成巨大经济损失。现阶段应对植物真菌病害方法有限，除选用优良抗病品种、加强栽培管理外，主要依靠施药防治。现有植物真菌防治药物多是微生物来源，具有环境不友好、易耐药、易残留等缺点。因此，寻找新的高效的植物来源的抗植物真菌药物迫在眉睫。

植物中的萜类化合物在其自身化学防御体系中发挥着重要作用，因此往往具有较强的抗真菌和抗细菌作用。艾里莫芬烷(eremophilane)倍半萜存在于多种植物中，研究发现多种艾里莫芬烷倍半萜衍生物具有抗肿瘤作用。此外，艾里莫芬烷倍半萜还具有较强的抗真菌作用。其中从病毒感染的烟草中发现的艾里莫芬烷倍半萜debneyol对黄瓜黑星病菌cladosporiumcucumerinum、豆刺盘孢colletotrichumlindemuthianum等真菌具有较好的抑制作用，提示艾里莫芬烷倍半萜debneyol及其类似物具有抗植物真菌病害的作用[phytochemistry,24,2191-219(1985)]。目前，主要通过从植物中提取或化学全合成的方法来获得艾里莫芬烷类倍半萜，具有能耗高，环境不友好等缺点。通过挖掘植物基因资源，利用生物合成方法生产艾里莫芬烷类倍半萜，有助于深入发现新的植物来源的具有抗植物真菌病害的艾里莫芬烷倍半萜，对该类倍半萜的开发利用具有现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于为了克服微生物来源的植物真菌病害抗菌剂所存在的不足，通过对具有较强抗病菌能力的药用植物长春花进行基因组数据分析和生化功能验证，确定了艾里莫芬烷倍半萜5-epi-jinkoh-eremol、debneyol生物合成相关基因对crtps3-crcyp。确定了5-epi-jinkoh-eremol、debneyol在植物化学防御中的抗菌作用。

本发明提供了一种编码萜类合酶crtps3的核苷序列，其核苷序列位于seqidno.1中第1-1686碱基处，其编码的氨基酸序列为seqidno.2。

本发明还提供了一种编码细胞色素p450酶crcyp的核苷序列，其核苷序列位于seqidno.1中第1687-3201碱基处，其编码的氨基酸序列为seqidno.3。

本发明还提供了含有所述crtps3和crcyp编码基因的重组表达质粒和含有重组质粒的重组微生物大肠杆菌escherichia.colic41(de3)和酿酒酵母saccharomycescerevisiaeby4741。

本发明公开了一种能够在大肠杆菌escherichia.colic41(de3)和酿酒酵母saccharomycescerevisiaeby4741中高效生产5-epi-jinkoh-eremol和debneyol的生物合成途径，可在实验室条件下发酵生产5-epi-jinkoh-eremol≥100mg/l和debneyol≥3mg/l。

本发明还公开了艾里莫芬烷倍半萜5-epi-jinkoh-eremol和debneyol对3种常见植物致病真菌和2种植物致病细菌的抗菌作用。

从克隆植物生物合成基因对出发，采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成，通过对其生物合成机制的研究揭示了艾里莫芬烷倍半萜5-epi-jinkoh-eremol和debneyol生物合成的途径。在此基础上运用代谢工程的原理，通过组合生物学对生物合成途径的合理优化，提高了5-epi-jinkoh-eremol和debneyol异源表达量。

本发明的艾里莫芬烷倍半萜5-epi-jinkoh-eremol和debneyol生物合成基因对的应用，包括(但不限于)：

(1)包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过紫外线或化学试剂诱变等。

(2)包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性或产量。这些外源宿主包括链霉菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。

(3)本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。

(4)包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。

(5)包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因可以在异源宿主中表达并通过dna芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。

(6)包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因可以通过遗传重组来构建重组质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。

(7)包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化法尼基焦磷酸合成5-epi-jinkoh-eremol和debneyol，并可以通过与其他天然产物的生物合成途径或部分生物合成途径重组，来获得新的艾里莫芬烷类倍半萜化合物。

因此，含有上述基因对的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

上述的蛋白质、基因簇、重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在合成5-epi-jinkoh-eremol和debneyol中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种合成5-epi-jinkoh-eremol和debneyol的方法，为发酵上述的重组菌，收集发酵产物，即得艾里莫芬烷倍半萜5-epi-jinkoh-eremol和debneyol化合物。

总之，本发明所提供的包含5-epi-jinkoh-eremol和debneyol生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解艾里莫芬烷类倍半萜化合物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

四、附图说明

图1.长春花中的5-epi-jinkoh-eremol和debneyol的生物合成途径；

图2.crtps3在酿酒酵母中催化生成5-epi-jinkoh-eremol的gc-ms检测结果；

图3.crtps3在大肠杆菌中催化生成5-epi-jinkoh-eremol的gc-ms检测结果；

图4.crcyp在酿酒酵母中催化生成debneyol的gc-ms检测结果；

图5.crcyp在大肠杆菌中催化生成debneyol的gc-ms检测结果；

图6.酿酒酵母中5-epi-jinkoh-eremol生物合成途径的优化结果；

图7.5-epi-jinkoh-eremol和debneyol对立枯丝核菌的抑菌圈；

图8.5-epi-jinkoh-eremol和debneyol对立枯丝核菌的抑菌圈量化结果；

图9.5-epi-jinkoh-eremol和debneyol对番茄早疫病菌的抑菌圈；

图10.5-epi-jinkoh-eremol和debneyol对番茄早疫病菌的抑菌圈量化结果；

图11.5-epi-jinkoh-eremol和debneyol对尖孢镰刀杆菌的抑菌圈；

图12.5-epi-jinkoh-eremol和debneyol对尖孢镰刀杆菌的抑菌圈量化结果。

五、具体实施方式

下面结合附图与具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计。

实施例1

长春花rna提取与crtps3-crcyp基因克隆

长春花倍半萜5-epi-jinkoh-eremol和debneyol合成酶基因的cdna序列在长春花基因组数据库中获得，其生物合成途径如图1所示。按试剂盒说明书操作，分别用trizol(invitrogen^tm)和hiscriptii1ststrandcdnasynthesiskit(诺唯赞vazyme)进行长春花叶片总rna的提取和反转录合成cdna。5-epi-jinkoh-eremol合成酶基因crtps3和debneyol合成酶基因crtps3的全长编码序列分别使用一下两对引物进行扩增(crtps3-f/r；crcyp-f/r)，扩增产物通过电泳纯化并连接平末端克隆载体peasy-blunt(全式金)进行dna测序。

实施例2

酿酒酵母表达载体的构建

对于提高酿酒酵母中倍半萜合成前体法尼基焦磷酸的含量，法尼基焦磷酸合成酶基因erg20和截短的羟甲基戊二酰辅酶a还原酶基因thmgp分别用同源重组的方法构建在pesc-leu载体上，得到pesc-leu-erg20和pesc-leu-thmgp两个质粒；对于5-epi-jinkoh-eremol的生物合成，crtps3的全长序列在5’端加上aaca后通过同源重组的方法分别构建在pesc-leu-erg20和pesc-leu-thmgp载体上，得到pesc-leu-erg20-crtps3和pesc-leu-thmgp-crtps3两个质粒；对于debneyol的生物合成，crcyp的全长序列在5’端加上aaca后通过同源重组的方法构建在pesc-ura载体上，得到pesc-ura-crcyp质粒；由于crcyp的氧化功能需要有nadph依赖的细胞色素p450还原酶的参与，因此，我们用同源重组的方法在pesc-ura-crcyp载体上插入了拟南芥的atr1，得到pesc-ura-crcyp-atr1质粒，为了在生化功能验证时提供阴性对照，我们用同源重组的方法在pesc-ura载体上插入了拟南芥的atr1，得到pesc-ura-atr1质粒。

实施例3

大肠杆菌表达载体的构建

为了优化大肠杆菌中法尼稀基焦磷酸的含量，我们用同源重组的方法在petduet-1载体上插入erg20，得到petduet-1-erg20质粒；对于5-epi-jinkoh-eremol的生物合成，crtps3的全长序列通过同源重组的方法插入到petduet-1-erg20载体上，得到petduet-1-erg20-crtps3质粒；对于debneyol的生物合成，crcyp的全长序列首先在5’端截短108bp并接上一段助溶肽makktsskgklppgps，然后通过同源重组的方法插入pacycduet-1载体上，得到pacycduet-1-crcyp质粒；同样，在pacycdut-1和pacycdut-1-crcyp载体上用同源重组的方法插入atr1得到pacycduet-1-atr1和pacycduet-1-crcyp-atr1质粒。

实施例4

在酿酒酵母中生物合成抗菌倍半萜debneyol和5-epi-jinkoh-eremol

对于生物合成5-epi-jinkoh-eremol的菌株，仅需转化pesc-leu-thmgp-crtps3质粒到酿酒酵母by4741即可；对于生物合成debneyol的菌株，需要同时转化pesc-leu-erg20-crtps3质粒和pesc-ura-crcyp-atr1质粒到by4741中。转化后的菌株挑取单克隆接种到5mlsd培养基中，30℃220rpm条件下震荡培养过夜，次日以1:50的比例接种到50ml的sg(syntheticgalactoseminimaldropoutmedium)培养基中，30℃220rpm条件下震荡培养5天。5-epi-jinkoh-eremol发酵液用正己烷萃取即得5-epi-jinkoh-eremol粗提物，debneyol发酵液用乙酸乙酯萃取即得debneyol粗提物。本实验所有酿酒酵母菌株的质粒转化都基于电击转化法：在ep管中加入40ul酿酒酵母电击感受态和300ng的质粒dna，轻轻混匀并转移到预冷的2mm规格电击杯中，快速放入bio-radmicropulser电击槽中，选择sc2模式进行电击转化，电击结束后立即用1m山梨醇将电击杯中的感受态细胞重悬并转移到ep管中，30℃孵育1小时后涂布在相应营养缺陷的sd(syntheticdextroseminimaldropoutmedium)培养中，30℃倒置培养48-72小时。

实施例5

在大肠杆菌中生物合成抗菌倍半萜

对于5-epi-jinkoh-eremol的生物合成，需要同时转化pirs质粒(cyr,a.；wilderman,p.r.；determan,m.；peters,r.j.j.am.chem.soc.2007,129,6684.)和petduet-1-erg20-crtps3质粒；对于生物合成debneyol，需要同时转化pirs质粒、petduet-1-erg20-crtps3和pacycduet-1-crcyp-atr1质粒。生物合成5-epi-jinkoh-eremol时直接挑取阳性克隆接种到含相应抗生素的5mltb培养基中，37℃220rpm活化4小时，然后以1:50的比例接种到含相应抗生素的50mltb培养基中，37℃220rpm培养到od600为0.4-0.6之间，在16℃160rpm条件下预冷20分钟后加1mmiptg(isopropylβ-d-thiogalacto-pyranoside)诱导表达72小时。生物合成debneyol时，在加入1mmiptg的同时还需要加入75mg/l的δ-amino-levulinicacid和3mg/l的riboflavin，16℃160rpm诱导表达72小时。5-epi-jinkoh-eremol发酵液用正己烷萃取得5-epi-jinkoh-eremol粗提物，debneyol发酵液用乙酸乙酯萃取得debneyol粗提物。本实验所有大肠杆菌菌株的质粒转化都基于热击转化法：在ep管中加入50ul大肠杆菌热击感受态细胞和100ng的质粒dna，轻轻弹匀并冰上静止20分钟，然后42℃准确热击45秒，立即插入冰上静止2分钟，加入250ulnzy培养基，37℃220rpm孵育45-60分钟后涂布在相应抗生素的nzy培养皿上，37℃倒置培养过夜。

实施例6

抗菌倍半萜的检测与分离纯化

5-epi-jinkoh-eremol和debneyol的检测都基于气相质谱联用分析方法：待测样品用正己烷溶解并稀释，按以下条件进行气相质谱分析，hp-5ms毛细管柱，进样量1ul，不分流进样，进样口温度250℃，烘箱温度50℃保持3分钟，然后20℃每分钟的速率升到70℃保持1分钟，接着15℃每分钟的速率升到300℃保持3分钟。electronionization离子源，能量强度70ev。发酵液用等体积的正己烷或乙酸乙酯超声萃取20分钟，有机层在减压条件下旋蒸干燥并复溶于5ml正己烷中，然后按1:40的比例过200-300目硅胶柱，上样后，硅胶柱先用6倍柱体积的正己烷洗脱，接着用正己烷丙酮40：1洗脱6个柱体积，接着正己烷丙酮30：1洗脱3个柱体积，接着正己烷丙酮20:1洗脱3个柱体积，接着10:1洗脱3个柱体积。含有目标产物的馏分经过气相色谱分析后合并浓缩，并用hplc进行进一步分离纯化，hplc选择c18反相色谱柱柱，甲醇水为流动相，进样后70％甲醇洗脱30分钟，接着100％甲醇洗脱10分钟。含有目标产物的馏分经过气相质谱分析后合并用氮气吹干，并溶于氘代氯仿中用于nmr分析。如图2-图6所示，通过在酿酒酵母by4741和大肠杆菌e.colic41(de3)表达包含crtps3和crcyp基因的基因簇，可高效异源生产5-epi-jinkoh-eremol和debneyol化合物。

实施例7

5-epi-jinkoh-eremol和debneyol对植物致病菌的抑制作用

5-epi-jinkoh-eremol和debneyol分别溶于dmso中，配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)，待培养基冷却到50℃时分别加入和至终浓度50mg/l，空白对照组加入等体积的dmso，配制pda培养皿后分别接种立枯丝核菌、番茄早疫病菌和尖孢镰刀杆菌，28℃培养72小时，测量菌圈大小。5-epi-jinkoh-eremol和debneyol分别用dmso配成1.5mg/ml待测液。丁香假单胞菌/野油菜黄单胞菌挑单克隆接种到3ml含50mg/lrif的kb/nyg液体培养基中，30℃220rpm培养od600＝1.0-1.5，配制50ml1.5％琼脂kb/nyg培养基，在培养基冷却到50℃时加入50mg/lrif和1ml丁香假单胞菌/野油菜黄单胞菌菌液，轻轻摇匀后配制固体培养板，待菌斑凝固后用0.5mm直径打孔器打孔并在孔内加入20ul待测液，30℃培养48小时，测量菌圈大小。如图7-图12所示。5-epi-jinkoh-eremol和debneyol两种化合物对3种植物真菌病害立枯丝核菌、番茄早疫病菌和尖孢镰刀杆菌均具有显著的抗菌作用，其中debneyol对番茄早疫病菌抗菌作用最好；5-epi-jinkoh-eremol对立枯丝核菌抗菌作用最好。

序列表

<110>于荣敏

<120>长春花中艾里莫芬烷倍半萜的生物合成基因及应用

<130>2018.12.27

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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