一种结合高压和低压模式的流式电转染装置的制作方法

本实用新型涉及电转染的方法，特别是涉及一种流式电转染装置，具体是涉及一种结合高压和低压模式的流式电转染装置。

背景技术：

细胞膜是包围在细胞外周的一层薄膜，厚度约为7～10nm，细胞膜的化学组成基本相同，主要由脂类、蛋白质和糖类组成。各成分含量分别约为 50％、40％、2％～10％。其中，脂质的主要成分为磷脂和胆固醇。此外，细胞膜中还含有少量水分、无机盐与金属离子等。磷脂双分子层是构成细胞膜的基本支架，是细胞与外界进行选择性物质交换的通透性屏障。细胞膜使细胞成为一个独立的生命单位，并拥有一个相对稳定的内环境。细胞可以通过细胞膜从周围环境摄取养料，排出代谢产物，使物质的转运达到平衡状态。所以，细胞膜的基本功能就是维持细胞内微环境的相对稳定并有选择地与外界环境进行物质交换。周围环境中的一些小分子物质可以通过被动运输通过细胞膜，但其它大分子物质则不能自主通过细胞膜。

70年代，科学家首次发现“电穿孔”术，其电场被用于在细胞膜上形成孔，而不会引起细胞永久损伤。研究发现，如果对细胞施加一定强度的电刺激并持续一段时间，就可以诱导细胞膜上产生一些微孔，使细胞的通透性增强，所谓细胞电穿孔(Electroporation)就是指细胞在外加脉冲电场的作用下，细胞膜脂双层上形成瞬时微孔的生物物理过程。电转染(Electrotransfection)是利用电穿孔技术将外源的生物大分子，如DNA、RNA或蛋白质导入细胞的技术。电转染术已应用于试管内和体内程序，如ECM600、Bio-Rad等产品。已知的试管内及体内应用的电转染，可将瞬时高压脉冲施加于位于实施区域周围的电极上。电极之间产生的电场会使细胞膜瞬时变成多孔的，外源分子通过自由扩散或者电流的作用进入该细胞。

在已知的电转染应用中，这类电场包括1000V/cm的单个方波，脉宽大约 100-100000μs。在电转染过程中，不受控制的电场和电击过程中产生的气泡，会通过改变电流在细胞壁形成永久的孔，会对细胞产生一定的损伤。而抗体生产中，工程细胞在电转染完7-21天进行蛋白质表达，对细胞活力的要求也相对较高。因此，在电转过程中提供合适的开孔电压和扩散电流，在获得高转染效率的同时，保证细胞存活率至关重要。

当细胞膜发生电穿孔时，其细胞膜表面发生跨膜电位变化，导致磷脂双分子层重排，从而导致细胞膜的通透性瞬时增大，使亲水分子、DNA、蛋白质、病毒颗粒、药物颗粒等正常情况下不能通过细胞膜的分子得以进入细胞。在短时间内撤除电刺激后，细胞膜可以自我恢复，重新成为选择性通透屏障。

与传统的化学转染和病毒转染相比，由于电转染具有无化学污染、不会对细胞造成永久性损伤、效率较高等优点，在生物物理学、分子生物学、临床医学等领域有着广阔的应用前景。

虽然电转染作用的机理并不完全清楚，但在本文中细胞电转染是公知的，包括细胞膜脂双层的破裂，导致在膜上形成暂时性的微孔，允许外源性分子通过扩散进入细胞。

现有技术中，主要有三类方法来完成细胞电转染的过程：

将细胞放置于一对相距数毫米至数厘米的平行电极之间。使细胞在电极之间的电场中受到电刺激，以实现电转染的目的。例如，专利US5389069。

使用微型针状电极扎入组织或细胞液中对细胞进行电击，达到电转染的目的。例如，专利号CN101020892A。

将一个腔室放置在一对平行电极之间，使得细胞的悬浮溶液在腔室中流动的同时受到电击。例如，专利号CN1195997A。在现有技术中公开的电转染设备及方法大部分不适用于处理大量的样品，也不适用于连续处理样品。也就是说，现有技术中得到的电转染室均是“静态”工作的，即：在电转染室处理完一批样品以后，需要对电转染室进行清洗、重新加入细胞等处理，才能继续下一批样品处理。在公开的技术中，电转染常常是在一次性单室试管中进行的，其用于电转染的最大容量通常小于1ml。在需要处理大量样品的场合中，这种技术冗长乏味，劳动强度大。

中国专利CN99812447公开了一种电打孔方法和电打孔仪器，可根据用户指定的脉冲和温度模式，产生和施加电场。该仪器包括带有构成电极结构一部分的帕耳帖(Peltier)装置的试管固定器，所述电极结构也是固定器的一部分。脉冲包括第一持续时间的低压脉冲，紧接着是第二持续时间高压脉冲，其后立即是第三持续时间的低压脉冲。低压电打孔的电场将分子积聚在细胞表面，适当的高压电场使细胞开孔，并且最终的低压电场将分子移送进细胞。分子可以是 DNA、DNA片段、化学制剂等；接收细胞可以是卵细胞、血小板、人体细胞、红细胞、哺乳动物细胞、植物的原生质体、植物花粉、脂质体、细菌、真菌、酵母、精子和其他合适的细胞。分子置于细胞的附近，或在细胞周围组织的间隙中、或含有细胞的液体介质中。

如果电压不够高或脉宽不够长，不能在细胞膜上形成有效大小或时长的小孔，外源分子就无法进入细胞；如果能量过于集中，会造成细胞膜永久性破坏，导致大量细胞的死亡。因此，紧接着高压脉冲放电之后，长时间的低电压脉冲对提高细胞的电转染效率、表达量及细胞活力是必要的。

中国专利CN201310086625公开了原代淋巴细胞进行电转染的方法，其特征包括：对原代淋巴细胞进行四次放电，放电之间进行两次暂停：第一次放电：电压为500～1500V的正向脉冲，持续时间20～60μs；第一次暂停：暂停持续时间600～1200μs；第二次放电：电压为500～1500V的负向脉冲，持续时间 20～60μs；第二次暂停：暂停持续时间600～1200μs；第三次放电：电压为 500～1500V的正向脉冲，持续时间10～50μs；第四次放电：电压为100～300V 的正向电泳电场，持续时间20～100ms。能够大幅度提高电转染的成功率，在外周血单核细胞转染绿色荧光蛋白细胞学实验结果中转染效率达到了50％左右，为开发肿瘤的生物治疗药物提供了关键技术支持。

虽然CN201310086625公开了通过正负方向高压脉冲电场和低压脉冲电场组合的方法，能够对细胞膜进行两个方向的电转染，提高电转染细胞总数和膜转染的数量，由此提高了电转染效率。但是该装置只能局限于单个电转杯，小体积电转染，不能满足进行肿瘤免疫治疗10¹⁰细胞总量的需求。况且即使将单个电转杯制成流式的电转杯，即便能够实现同一电极在极短的时间进行高压和低压的转换，由于细胞是在电转杯中流动的状态，细胞经过电极时不能同时接受高压和低压电场的作用，对于电转染效率和细胞的存活率难以做到与静态单个电转杯同样的电转染效果。

技术实现要素：

本实用新型是针对上述现有的技术存在的技术问题，提供了一种通过两组电极对相邻的形式，分别实施高压短脉宽和低压长脉宽，对流动的细胞进行电转染，在保证细胞存活率的前提下，显著提高细胞电转染效率和蛋白表达量，并能处理大体积样品的流式电转染装置。

为了达到上述目的，本实用新型所提供结合高压和低压的流式电转染装置的技术方案概述如下：一种流式电转染装置，包括管体，第一电极对，第二电极对，其特征在于，所述第一电极对和第二电极对相邻设置于管体的侧壁，所述管体与第一电极对形成腔体，所述管体与第二电极对形成腔体，所述第一电极对施加高压短脉宽信号，所述第二电极对施加低压长脉宽信号。所述长脉宽信号还可以为持续长脉宽信号。

所述第一电极对包括第一电极和第二电极，且第一电极和第二电极平行设置。

所述第二电极对包括第三电极和第四电极，且第三电极和第四电极平行设置。

所述第一电极对之间的距离小于等于所述第二电极对之间的距离。

所述高压为300-1000V，优选为600-800V，所述低压为50-200V，优选为 60-80V；

所述短脉宽为50-500μs，所述长脉宽为1-50ms。

所述装置还包括至少一组电极对，与管体连接的导管和泵，所述导管与管体密封连接，所述泵提供流体流动的动力，泵能够使管体形成正压或负压，推动或抽动液体在管体流动。

本实用新型所述的流式电转染装置用于细胞电转染的用途。

本实用新型技术方案带来的有益效果：

本实用新型的流式电转染装置，采用高压短脉宽开孔和低压长脉宽入孔的方式，保证细胞存活率的前提下，显著提高转染效率和蛋白表达量。

本实用新型的流式电转染装置能够进行大体积电转染，超过200ml，细胞量可达10¹¹以上，为抗体药物研发生产、免疫治疗研发与临床应用提供适用装置。

本实用新型的流式电转染装置结构设计新颖，具有开创性。

附图说明

图1本实用新型流式电转染装置结构示意图；

图2本实用新型流式电转染装置结构示意图；

图3本实用新型流式电转染装置结构示意图；

图4本实用新型流式电转染装置结构示意图；

附图标记：1-第一电极，2-第二电极，3-第三电极，4-第四电极，5-高低压腔体链接处，6-进液口，7-为出液口。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型的较佳实施例进行详细阐述，以使本实用新型的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本实用新型的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例一

电极的形状和尺寸的选择

本实用新型的结合高压和低压模式的流式电转染装置，包括第一电极对和第二电极对，第一电极对包括第一电极和第二电极，且第一电极和第二电极平行设置。第二电极对包括第三电极和第四电极，且第三电极和第四电极平行设置。第一电极、第二电极、第三电极和第四电极分别采用平面电极，平面电极的尺寸大小决定了单位时间内处理细胞的数量。

电转染腔室的长度、宽度和间距对电转染效果分别有不同的影响。在流速恒定的情况下，平面电极的长度影响电极内部溶液流动的时间，增加电极长度会增加气泡流过电极区域时与电极表面接触时间，增加气泡滞留的概率。平面电极的宽度影响电极内部溶液流动的速度和均匀度，流体中间区域流速快，边缘区域流速慢，电极宽度越大，偏差越明显。平面电极的间距影响电场的强度，根据公式E＝U/d，相同电压下，间距越大，电场越小。增加电极间距，如果要达到最佳的电转强度，就需要提高电压，增加仪器的输出。

实施例二

设置流体缓冲区域及两个液体腔连接的区域

在流速相同的情况下，单一电源对两个电极对进行控制，如果管体进液口截面为圆形，而平面电极腔室区域截面为方形，直接从圆形变为方形，则容易产生滞留区，滞留区溶液流速为零，此区域为无效电转区，且易累积气泡。因此需要在进液口和平面电极区域增加缓冲区，平缓过渡，避免产生滞留区，确保平面电极区域内溶液流速稳定。理论上，缓冲区域体积越大，则电极区流速越稳定。同理，在平面电极区和出液口之间也要增加缓冲区，避免快速收口，压强变化影响流速。缓冲区域溶液内压强逐渐变大，电解产生的气泡流过时，容易在管壁上累积气泡，如果气泡无法及时排出，体积逐渐变大，缓冲区的作用被抵消，无法起到稳定流速的效果。需要考虑缓冲区的形状，首先收口的方式可以增加溶液内压强，有利于气泡排出。其次不能有拐角产生滞留区，最后外形过渡应平滑，溶液内压强不能有剧烈变化。

实施例三

本实用新型的结合高压和低压模式的流式电转染装置如图1所示，包括第一电极对和第二电极对，第一电极对包括第一电极和第二电极，且第一电极和第二电极平行设置。第二电极对包括第三电极和第四电极，且第三电极和第四电极平行设置。第一电极对接受300-1000V高压，提供0.3-3KV/cm的电场，脉宽为10-500μs，流速为3-20ml/min，第一和第二电极间距d1为2-5mm；第二电极对接受10-200V，保障细胞存活，且能提高目的基因进入细胞拷贝数的低压电场，且脉宽为1-100ms，流速为3-20ml/min，第三和第四电极间距d2为2-10mm。第一电极和第二电极片的尺寸为(8-16)mm×(5-10)mm，第三电极和第四电极片的尺寸为(8-16)mm×(50-100)mm。采用导管和泵将样品液体从进液端匀速推进到由第一电极对组成的腔体，经过高压短脉宽电场，给予细胞开孔场强后流经过第二电极对组成的腔体，再进行低压长脉宽电场。电转染完成后，目标液体样本从出液口排出。

实施例四

细胞测试实验

收集处于对数生长期的CHO-S细胞(中国仓鼠卵巢细胞)，转速

1000rpm/min离心5分钟，弃上清，用电转染缓冲液重悬细胞，使得细胞的密度为1×10⁷个/ml升，加入需要电转染转入细胞的质粒pCDNA3.1-GFP，使质粒的浓度为5-30μg/ml，轻柔混合均匀，电转体积为10ml。

使用的流式电转染装置如实施例三所示：

对比实验一，单独在第一电极对上施加电脉冲，脉冲电压1000V，脉冲宽度100μs，脉冲次数3次，脉冲间隔1秒，流速为3-20ml/min；

对比实验二，单独在第二电极对上施加电脉冲，脉冲电压100V，脉冲宽度10ms，脉冲次数3次，脉冲间隔1秒，流速为3-20ml/min；

对比实验三(本实用新型装置)，同时在第一电极对和第二电极对上施加电脉冲，第一电极对的脉冲电压1000V，脉冲宽度100ms，脉冲次数1次，脉冲间隔1s，第二电极对的脉冲电压100V，脉冲宽度10ms，脉冲次数2次，脉冲间隔1s，流速为3-20ml/min。

电脉冲使腔体内形成电场，使得细胞膜上形成微孔，从而使液体样本内的目标物质能够进入细胞中。电转染完成后，目标液体样本从出液口排出，目标液体样本完全排出。将转染后的细胞悬液置于离心管内，1000转/分钟，离心5分钟。弃上清，加入CHO-S培养基重悬细胞，以2×10⁶个/ml的密度接种于三角锥形瓶内培养，置于摇床上培养，摇床转速125转/分钟，培养条件：温度37℃，二氧化碳浓度8％。24小时后在荧光显微镜下观察，并用流式细胞仪检测电转染效率和细胞存活率。

实验结果观察：

实验过程中能明显观察到，在脉冲过后，第一电极对腔中产生大量气泡，第二电极对腔中基本无气泡产生。

24小时后检测到实验四本实用新型装置细胞染转率为91.6％，细胞存活率为87.1％，荧光强度为1.1×10⁷；

对比实验一，单独第一电极对施压方式细胞染转率为88.3％，细胞存活率为76.1％，荧光强度为2.3×10⁶，细胞存活率下降，且荧光强度为本实用新型装置的1/10左右，而荧光强度直接与细胞的蛋白表达水平，即抗体生产量呈现正相关；

对比实验二，单独第二电极对施压方式由于未达到细胞足够开孔的电压，细胞染转率为28％，细胞存活率为96.5％，荧光强度为3.5×10⁵，转染效率显著下降，影响蛋白表达水平。

由此可见，本实用新型设计的结合高压和低压模式的流式电转染装置，可以显著提高细胞存活率、转染效率，特别是蛋白表达量。

虽然已详细描述本实用新型，但是在本实用新型的精神和范围内的修改对于本领域技术人员将是显而易见的。应当理解以上叙述的和/或在所附的权利要求书中的本实用新型的方面和各种实施方案的部分以及各种特征可进行组合或全部或部分进行互换。如本领域技术人员将意识到的，在前述各种实施方案的描述中，指代另一实施方案的那些实施方案可适当地与其它实施方案组合。

此外，本领域普通技术人员将意识到前述描述是仅作为举例，且不意欲限制本实用新型。