一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒的制作方法

本实用新型涉及核酸测序鉴定领域，尤其涉及一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒。

背景技术：

利用分子生物学技术对药物原料、辅料、制药用水、中间体、终产品和环境中的污染微生物进行鉴定、分类和追溯，是加强药品生产过程质量控制、提升产品质量与安全性、降低用药风险的有效手段。与传统的形态学观察、显微镜检、理化鉴别和生化分析等技术相比，分子生物学技术以生物核酸作为目标检测物，可以从根本性的遗传物质层面对菌株的种属及来源做出解释，检测结果更加准确，灵敏度更高，特异性更强，目前已逐渐成为国、内外药品质量标准发展的必然趋势。目前，《美国药典》(USP 40<1113>)、《欧洲药典》(EP 9.0<5.1.6>)、《日本药典》(JP 17<General Information G4>)、《中国药典》(通则9204)中均收载了分子生物学技术用于药品微生物质量控制的相关章节。

DNA特征序列(DNA条形码)分子鉴定是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的分子生物学分类方法。该方法以核酸测序技术为基础，通过筛选通用DNA特征序列，建立数据库和鉴定平台，运用生物信息学方法分析比对DNA数据，进而对物种进行鉴定，是对传统生物鉴定方法的有效补充和重大突破，近年来受到国内外药品质量标准制定机构的广泛关注，并逐渐成为物种鉴定和分类的研究热点。

16S rRNA基因全长涵盖了最全面的菌株遗传进化信息，但受到核酸测序方法操作性、测序质量、测序成本、核酸测序反应长度、特别是高通量核酸测序反应读长的限制，多数文献报道还是采用部分核酸序列(Partial Sequence)进行研究，具有鉴定和分类意义的核心区域尚待讨论。

目前，以16S rRNA核酸测序技术为基础的微生物鉴定方法已经建立，并应用于临床分离菌株的研究，但其用于药品质量控制及药品生产环境中常见污染菌的鉴定还鲜有报道，且基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒的也鲜有报道。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于克服现有技术中的缺陷，通过测定16S核糖体RNA 基因5'端可变区的核酸序列进行菌株鉴定，提供一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒，并提供一种简便、快速、规范化的基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法。

为了实现上述目的，本实用新型采取的技术方案包括：

本实用新型的第一个目的是提供一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒，包括盒体、盒盖和内衬，所述盒体内设置核酸提取试剂存放腔、PCR反应体系存放腔和PCR产物纯化试剂存放腔，在所述盒体与各存放腔之间均填充所述内衬。

为了进一步优化上述试剂盒，本实用新型采取的技术措施还包括：

进一步地，所述核酸提取试剂存放腔内设置数个试管，所述试管至少包括溶菌酶管、十二烷基硫酸钠溶液管、十六烷基三甲基溴化铵管；更进一步地，所述试管还包括TE缓冲液管、氯化钠溶液管、饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液管、无水乙醇管、70％乙醇溶液管。

进一步地，所述PCR反应体系存放腔内设置数个试管，所述试管至少包括引物管、DNA聚合酶管、PCR反应液管；其中，所述PCR反应液管内含有PCR 缓冲液、镁离子溶液和脱氧核苷三磷酸。

进一步地，所述PCR产物纯化试剂存放腔内设置数个试管，所述试管至少包括TE缓冲液管、乙酸钠溶液管和乙二胺四乙酸钠溶液管；更进一步地，所述试管还包括乙酸钠溶液管、无水乙醇管和75％乙醇溶液管。

进一步地，所述盒体内还设置至少放置上样缓冲液试管的备用存放腔；更进一步地，所述备用存放腔内可放置各类规格的离心管、中间试剂存放管等。

进一步地，所述盒体内还设置冷藏存放腔，所述冷藏存放腔与所述盒体为可拆卸安装；更进一步地，所述冷藏存放腔可直接抽出或放入所述盒体中，所述盒体和所述冷藏存放腔之间设置保冷材料。

进一步地，所述冷藏存放腔包括冷藏外腔室和冷藏内腔室，所述冷藏内腔室用于放置含有需在低温条件下存放的试剂的试管，所述冷藏外腔室和冷藏内腔室之间为一密封的中空结构，其内置保冷剂。更进一步地，所述冷藏外腔室的内壁和所述冷藏内腔室的外壁均设置防水密封层，所述保冷剂包括凝胶或水中的一种；更进一步地，所述保冷剂还包括保冰介质和隔热颗粒，所述保冰介质为甲基纤维素或丙烯酸聚合物，所述隔热颗粒为保丽龙材料。

进一步地，所述盒体上固定设置一卡扣件，所述盒盖设置一与所述卡扣件配合使用的凸块。

进一步地，所述盒体及各存放腔的形状及尺寸根据各试管的形状及尺寸进行匹配设置。

进一步地，所述盒盖的内部固定设置内衬。

本实用新型的第二个目的是提供一种采用上述试剂盒的基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，其包括如下步骤：

步骤一、选取待鉴定的细菌菌株，并提取和纯化所述菌株的基因组DNA；

步骤二、采用扩增引物PCR扩增步骤一中纯化后的基因组DNA的特征序列片段；

步骤三、提取和纯化步骤二中获得的PCR扩增产物；

步骤四、测定步骤二中纯化后的PCR扩增产物的序列，并采用通用性序列拼接软件，去除引物区，获得相应片段的DNA序列；

步骤五、将步骤四所述的相应片段的DNA序列导入标准核酸序列数据库进行序列比对，进行细菌菌株的鉴定；

其中，所述步骤一中，菌株的基因组DNA的提取和纯化采用溶菌酶 (Lysozyme)、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltriethylammnonium Bromide，CTAB)进行菌体破碎；采用苯酚-氯仿-异戊醇、乙醇沉淀核酸，获得符合质量控制要求的基因组DNA。

其中，所述步骤一中，所述菌株的基因组DNA的提取和纯化的具体步骤包括：取适量分离纯化后的菌体置于离心管中，加入TE缓冲液、溶菌酶，混匀、水浴加热；加入十二烷基硫酸钠溶液，水浴加热；加入氯化钠溶液、十六烷基三甲基溴化铵溶液，水浴加热；加入饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液，剧烈震荡，室温静置、离心，取上清液置于新的离心管中，重复操作1次；加入无水乙醇，低温条件下静置，离心、弃去上清液；加入70％乙醇溶液洗涤，离心、弃去上清液，室温风干至乙醇挥发完全；加入TE缓冲液，混匀后作为核酸提取溶液。该步骤也可替换为：取适量分离纯化后的菌体置于离心管中，加入溶菌酶溶液，混匀、水浴加热；加入十二烷基硫酸钠溶液，水浴加热；加入氯化钠溶液、十六烷基三甲基溴化铵溶液，水浴加热；将菌体裂解液转移至适宜的载体上，通过离心的方式去除菌体及裂解液，将核酸截留在适宜的载体上，加入饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液，无水乙醇溶液等洗涤，离心、弃去洗涤液；室温风干至乙醇挥发完全；加入适宜的缓冲液溶解核酸，离心将其从适宜的载体上洗脱下来，作为核酸提取溶液。两种可替换的步骤中，所使用的试剂用量及浓度均相同。

其中，步骤二中，所述扩增引物扩增16S rRNA中的V1～V3区片段的核酸序列，该扩增引物的序列如下所示：

正向引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

反向引物：5'-GTATTACCGCGGCTGCTGGC-3'；

所述PCR扩增反应体系以25μl为参照，包括：10×PCR缓冲液，25mmol/L 镁离子溶液2.5μl，2.5mmol/L dNTPs 2μl，10μmol/L引物对各0.5μl，模板DNA 0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.2μl，加无菌双蒸水至25μl；PCR扩增反应程序为：94℃，预变性3～5分钟；94℃，变性30秒；55～60℃，退火30秒；72℃，延伸30～60秒，28～32个循环；72℃，3～5分钟。

其中，所述步骤三中，PCR扩增产物的提取和纯化方法包括如下步骤：取适量的扩增产物与上样缓冲液混合在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳；将结束电泳的琼脂糖凝胶中的核酸扩增产物切下，加入TE缓冲液，水浴完全溶解；加入乙酸钠溶液和乙二胺四乙酸钠溶液，混匀；加入无水乙醇，静置、离心、弃上清液；加入乙醇洗涤，离心、弃上清液、将乙醇挥发完全；加入TE缓冲溶液，混匀后作为核酸扩增产物的纯化溶液。

本实用新型采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本实用新型建立了药品生产和质量控制中常见细菌污染物的核酸测序鉴定方法，对核酸测序结果进行质量核查，以通用测序引物定位的方式，建立了细菌核酸测序鉴定DNA特征序列；建立在本实用新型基础上的标准核酸测序数据库，可为药品微生物的检验结果提供可靠的判定依据。

本实用新型采用构建的标准核酸序列，按照统一的共性描述和规范编码录入细菌核酸测序鉴定标准核酸序列数据库，其可为细菌核酸测序鉴定方法提供客观、准确的判定依据；本实用新型所述的试剂盒可用于细菌污染物从分离纯化到核酸测序前的全部操作过程，实现细菌污染物的快速、一体化鉴定。

附图说明

图1为本实用新型一实施例中基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒的结构示意图。

图2为本实用新型另一实施例中细菌鉴定试剂盒内的冷藏存放腔的结构示意图。

其中，图中的附图标记为：盒体1；卡扣件11；盒盖2；凸块12；备用存放腔3；核酸提取试剂存放腔4；PCR反应体系放存放腔5；PCR产物纯化试剂存放腔6；冷藏存放腔7；冷藏外腔室71；冷藏内腔室72。

具体实施方式

本实用新型提供一种基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒，包括盒体、盒盖和内衬，所述盒体内设置核酸提取试剂存放腔、PCR反应体系存放腔和PCR 产物纯化试剂存放腔，在所述盒体与各存放腔之间均填充所述内衬；以及采用上述试剂盒的基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法。

下面结合附图和实施例，对本实用新型的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本实用新型的技术方案，而不能以此来限制本实用新型的保护范围。

实施例1-一较佳形式的基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒

如图1所示，本实施例中所述的细菌鉴定试剂盒包括盒体1、盒盖2和内衬，该盒体1和盒盖2在一侧边处实现折叠式铰接；在该铰接处相对侧，盒体1和盒盖2上分别对应固定设置相互配合使用的卡扣件11和凸块12，以实现该试剂盒的闭合，同时在盒盖2的内部固定设置内衬，从而有效避免在试剂盒闭合状态下其内部存放的试管的大位移移动。

上述细菌鉴定试剂盒的盒体1内设置核酸提取试剂存放腔4、PCR反应体系存放腔5、PCR产物纯化试剂存放腔6，在所述盒体1与核酸提取试剂存放腔4、 PCR反应体系存放腔5、PCR产物纯化试剂存放腔6之间均填充所述内衬；其中核酸提取试剂存放腔4、PCR反应体系存放腔5、PCR产物纯化试剂存放腔6内均设置数个试管，核酸提取试剂存放腔4至少放置溶菌酶管、十二烷基硫酸钠溶液管、十六烷基三甲基溴化铵管；PCR反应体系存放腔5至少放置引物管、DNA 聚合酶管、PCR反应液管，PCR反应液管内含有PCR缓冲液、镁离子溶液和脱氧核苷三磷酸；PCR产物纯化试剂存放腔6至少放置TE缓冲液管、乙酸钠溶液管和乙二胺四乙酸钠溶液管。

在上述核酸提取试剂存放腔4、PCR反应体系存放腔5、PCR产物纯化试剂存放腔6中，核酸提取试剂存放腔4还可选择性地放置TE缓冲液管、氯化钠溶液管、饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液管、无水乙醇管、70％乙醇溶液管；PCR产物纯化试剂存放腔6还可选择性的放置乙酸钠溶液管、无水乙醇管和75％乙醇溶液管。

在本实施例中，图中未示出，各存放腔的截面形状均为圆形，其中核酸提取试剂存放腔、PCR反应体系存放腔、PCR产物纯化试剂存放腔同列设置，各试管均为圆柱形试管，各存放腔的中部均固定一试管架，各试管均可嵌设在该试管架的通孔中。

实施例2-另一较佳形式的基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒

本实施例为为是实施例1的替换实施例1，其与实施例1仅在以下结构存在不同：

如图1所示，本实施例与实施例1相比，该试剂盒的盒体内还设置冷藏存放腔7和至少放置上样缓冲液试管的备用存放腔3，在该备用存放腔3内可放置各类规格的离心管、中间试剂存放管，以用于核酸及PCR扩增产物的提取和纯化。

如图2所示，本实施例中所述的冷藏存放腔7可直接抽出或放入盒体1中，盒体1和冷藏存放腔7之间设置保冷材料，在保冷材料的表面设置一防水层，以防止空气中的水蒸气在保冷材料的表面冷凝而打湿保冷材料，从而起到延长保冷材料的使用寿命；冷藏存放腔7包括冷藏外腔室71和冷藏内腔室72，冷藏内腔室72用于放置含有需在低温条件下存放的试剂的试管，低温存放试剂例如低温存放试剂核酸提取溶液(4℃保存)和核酸扩增产物的纯化溶液(4℃保存)。冷藏外腔室71和冷藏内腔72室之间为一密封的中空结构，其内置保冷剂，冷藏外腔室71的内壁和冷藏内腔室72的外壁均设置防水密封层，以防止保冷剂的泄漏，该保冷剂包括凝胶或水、以及保冰介质和隔热颗粒，其中，保冰介质为甲基纤维素或丙烯酸聚合物，隔热颗粒为保丽龙材料，采用上述保冷剂能有效延长、满足长时间试剂冷藏的使用需求。

在本实施例中，备用存放腔3和冷藏存放腔7的截面形状均为矩形，两者同列设置，并与核酸提取试剂存放腔4、PCR反应体系存放腔5、PCR产物纯化试剂存放腔6同排设置，各存放腔3～7的截面形状均为矩形，各试管均为圆柱形试管(图中未示出)，各存放腔内均设置可嵌入各试管的底板(图中未示出)，以利于试管存放的稳固性。

本实施例中所述的冷藏存放腔7在使用前需放置在冰箱中进行进行冷冻，待冷冻好后可取回放置在盒体中。

实施例3-采用实施例1或实施例2所述的试剂盒进行细菌核酸测序鉴定方法

本实施例所述的基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法包括以下步骤：

(1)细菌基因组DNA的提取与纯化

取适量分离纯化后的菌体置于离心管中，加入TE缓冲液450μl、溶菌酶(10 mg/ml)25μl，混匀，37℃水浴加热30分钟；加入5％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液 50μl，37℃水浴加热15分钟；加入1％氯化钠溶液80μl、5％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液70μl，65℃水浴加热15分钟；加入饱和苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1，v/v/v)溶液350μl，剧烈震荡，室温静置5分钟，离心(转速为每分钟12000转)10分钟，取上清液置于新的离心管中，重复操作1次；加入2倍体积无水乙醇，-20℃静置不少于30分钟，离心(转速为每分钟12000转)10 分钟，弃去上清液；加入适量75％乙醇(v/v)溶液洗涤，离心(转速为每分钟 12000转)10分钟，弃去上清液，室温风干至乙醇挥发完全；加入适宜体积的 TE缓冲液，混匀后作为核酸提取溶液(模板DNA)，置4℃冰箱中或冷藏存放腔中备用。采用紫外分光光度法测定模板DNA的浓度和纯度，应能够满足后续试验的要求，核酸浓度宜不低于10ng/μl，A260/A280比值宜在1.8～2.0之间；

(2)细菌DNA特征序列片段的扩增与检测

①16S rRNA基因序列扩增引物：

正向引物(16SV1F)：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

反向引物(16SV3R)：5'-GTATTACCGCGGCTGCTGGC-3'。

②PCR反应体系：

以25μl为参照，包括：10×PCR缓冲液〔含三羟甲基氨基甲烷(10mmol/L， pH 8.3～8.8)，镁离子溶液(25mmol/L)2.5μl，脱氧核苷三磷酸(dNTPs，2.5 mmol/L)2μl，引物对(10μmol/L)各0.5μl，模板DNA 0.5μl，高保真Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl，加无菌双蒸水至25μl。也可采用适宜的PCR扩增预混液或试剂盒操作。

③16S rRNA基因序列扩增程序：

94℃3～5分钟(预变性)；94℃30秒(变性)，60℃30秒(退火)，72℃30～60 秒(延伸)，28～32个循环；72℃3～5分钟。采用梯度PCR的方式。

④试验结果

取PCR扩增产物5μl、上样缓冲液1μl，混匀后上样，于100～150V电压下电泳，溴酚蓝条带移动至凝胶片的1/2～2/3处结束电泳。取凝胶片在紫外凝胶成像仪上检视，核酸扩增产物均在约500bp的位置出现一条目的条带。

(3)细菌DNA特征序列片段的纯化

将琼脂糖凝胶中的核酸扩增产物切下，置于离心管中，加入适量体积的TE 缓冲液，65℃水浴至凝胶块完全溶解；分别加入1/10体积乙酸钠溶液(3mol/L， pH5.2)和乙二胺四乙酸钠溶液(125mmol/L，pH 8.0)，混匀；加入2倍体积无水乙醇，-20℃静置30分钟；离心(转速为每分钟12000转)10分钟，弃去上清液；加入适量75％乙醇(v/v)溶液洗涤，离心(转速为每分钟12000转)10分钟，弃去上清液，室温风干至乙醇挥发完全；加入适宜体积的TE缓冲溶液，混匀后作为核酸扩增产物的纯化溶液，置4℃冰箱中或冷藏存放腔中备用。

取PCR扩增纯化产物5μl、上样缓冲液1μl，混匀后上样，于100～150V电压下电泳，溴酚蓝条带移动至凝胶片的1/2～2/3处结束电泳。取凝胶片在紫外凝胶成像仪上检视，核酸扩增产物均在约500bp的位置出现一条目的条带。

(4)核酸测序及标准核酸序列的建立

核酸测序的结果应进行序列拼接和质量评估，序列拼接时应采用通用性序列拼接软件，去除引物区，获得相应片段的DNA序列；为确保标准核酸序列的可靠性，序列拼接时，需对测序质量进行评估，去除测序结果两端的低质量部分。序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。测序结果的平均Q值应大于或等于 30。经序列拼接与质量核查后，获得长度一致的标准核酸序列，按照共性描述和统一的编码，录入标准核酸序列数据库，可为该方法的鉴定结果提供客观、准确的判定依据。

(5)埃希菌DNA特征序列的鉴定

收集国内外微生物菌株保藏中心的埃希菌和肠杆菌科其他标准菌株共10 株，包括ATCC来源2株、CMCC来源2株、CICC来源6株。分别采用形态学鉴定、生化鉴定的方法对菌株进行遗传信息确认；然后按照上述方法步骤提取基因组DNA、PCR、核酸测序、对标准菌株进行核酸测序，建立标准核酸序列。

将遗传信息确认的埃希菌和肠杆菌科其他标准菌株DNA特征序列聚类，构建NJ进化树。大肠埃希菌的核酸序列聚成一簇，说明大肠埃希菌DNA特征序列“种”的水平具有较好的鉴定和分类意义；埃希菌属的其他菌株与肠杆菌科产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌准确区分，说明埃希菌标准菌株DNA特征序列在“属”的水平具有较好的鉴定和分类意义。

(6)芽孢杆菌DNA特征序列鉴定方法的验证

收集国内外微生物菌株保藏中心的芽孢杆菌标准菌株共5株，包括ATCC来源2株、CICC来源3株。分别采用形态学鉴定、生化鉴定的方法对菌株进行遗传信息确认；然后按照上述方法步骤提取基因组DNA、PCR、核酸测序、对标准菌株进行核酸测序，建立标准核酸序列。

将鉴定结果确认为芽孢杆菌的DNA特征序列进行序列比对分析，并以梭菌为外源对照组，构建NJ进化树，结果显示：枯草芽孢菌DNA特征序列与其他种属可以明确区分。

由上述实施例可知，本实用新型所述的基于DNA特征序列的细菌鉴定试剂盒可用于细菌污染物从分离纯化到核酸测序前的全部操作过程，实现细菌污染物的快速、一体化鉴定。

以上对本实用新型的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本实用新型并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本实用新型进行的等同修改和替代也都在本实用新型的范畴之中。因此，在不脱离本实用新型的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本实用新型的范围内。