本发明涉及判定试样是否含有尾孢菌属或者假尾孢菌属的菌的方法。
背景技术：
：尾孢菌属的菌引发叶斑病。非专利文献1公开了通过免疫学方法在分子水平上迅速检测豆科植物中的尾孢菌属的菌的方法。现有技术文献非专利文献非专利文献1:mariagabrielalatorrerapelaet.al.“earlydetectionofcercosporaspeciesinsoybeanplants:immunologicandmolecularmethods”,americanjournalofplantsciences,2015,6,2939-2948技术实现要素：发明所要解决的课题本发明的目的是提供判定试样是否含有尾孢菌属或者假尾孢菌属的菌的新的方法。用于解决课题的手段本发明提供判定试样是否含有尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌中的至少一方的方法。本发明的方法具备以下工序：工序(a)，将所述试样添加到含有n,n,n’,n’-四甲基-1,4-苯二胺和5-(2,4-二磺基苯基)-3-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-2-(4-硝基苯基)-2h-四唑鎓的水溶液中，得到混合物，其中，所述水溶液具有5.1～6.5的ph值，工序(b)，对所述混合物照射具有400纳米～500纳米的波长的光，测定所述混合物的第1吸光度ay，工序(c)，对所述混合物照射具有超过500纳米且为800纳米以下的波长的光，测定所述混合物的第2吸光度ax，和工序(d)在满足以下算式(i)的情况下，判定所述试样含有尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌中的至少一方，ay/ax≥1.5(i)。取代工序(b)～工序(d)，本发明的方法具备工序(e)，在所述混合物为橙色的情况下，判定所述试样含有尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌中的至少一方。发明的效果本发明提供判定试样是否含有尾孢菌属或者假尾孢菌属的菌的新的方法。具体实施方式以下，详细说明本发明的实施方式。(第1实施方式)根据第1实施方式的方法具备以下4个工序(a)～(d)。(工序(a))工序(a)中，将试样添加到含有n,n,n',n'-四甲基-1,4-苯二胺(以下称为“tmpd”)和用以下化学式表示的化合物(以下称为“wst-8”)的水溶液中，得到混合物。tmpd可以作为n,n,n',n'-四甲基-1,4-苯二胺二盐酸盐(cas号：637-01-4)获得。wst-8可以作为5-(2,4-二磺基苯基)-3-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-2-(4-硝基苯基)-2h-四唑鎓,内盐,单钠盐(cas号：193149-74-5)获得。水溶液具有5.1～6.5的ph值。在水溶液具有低于5.1的ph值的情况下，不能检测尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌。更详细地，即使试样含有尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌中的至少一方，也会在后述的工序(d)中得出试样不含有尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌的任一方这样的错误结论。请参照后述的比较例2。在水溶液具有超过6.5的ph值的情况下，不能检测尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌。更详细地，即使试样不含有尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌的任一方，也会在后述的工序(d)中得出试样含有尾孢菌属的菌或者假尾孢菌属的菌这样的错误结论。请参照后述的比较例19。因此，水溶液具有5.1～6.5的ph值。本发明具有通过适当ph值条件下(即，5.1～6.5)的tmpd和wst-8的组合来检测尾孢菌属的菌或者假尾孢菌属的菌的特征。tmpd和wst-8的任一方的缺失都会使尾孢菌属的菌或者假尾孢菌属的菌的检测变得不可能。混合物期望在室温静置1天以上。(工序(b))工序(b)中，对工序(a)中得到的混合物照射具有400纳米～500纳米的波长的光，测定混合物的第1吸光度ay。作为一例，可以对混合物照射具有460纳米的波长的光，测定混合物的第1吸光度ay。(工序(c))工序(c)中，对工序(a)中得到的混合物照射具有超过500纳米且为800纳米以下的波长的光，测定混合物的第2吸光度ax。作为一例，可以照射具有610纳米的波长的光，测定混合物的第2吸光度ax。对工序(b)和工序(c)的顺序不限定。换言之，可以先进行工序(b)，然后进行工序(c)。或者，先进行工序(c)，然后进行工序(b)。(工序(d))工序(d)中，在满足以下算式(i)的情况下，判定所述试样含有尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌中的至少一方。ay/ax≥1.5(i)由后述的实施例可明确，在混合物含有尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌中的至少一方的情况下，ay/ax的值为1.5以上。另一方面，混合物不含有尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌的任一方的情况下，ay/ax的值小于1.5。换言之，在混合物含有tmpd、wst-8、以及尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌的至少一方的全部的情况下，具有400纳米～500纳米的波长的光被混合物充分吸收。具有超过500纳米且为800纳米以下的波长的光容易透射混合物。另一方面，在混合物不含有tmpd、wst-8、以及尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌中的至少一方的任一者的情况下，具有400纳米～500纳米的波长的光基本不被混合物吸收。具有超过500纳米且为800纳米以下的波长的光不易透射混合物。该吸收度的差反映在ay/ax的值上。(第2实施方式)根据第2实施方式的方法具备工序(a)和工序(e)。第2实施方式所包含的工序(a)与第1实施方式所包含的工序(a)相同。(工序(e))由后述的实施例也可明确，只要在试样含有尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌中的至少一方的情况下，混合物就变成橙色。另一方面，在试样不含有尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌的任一方的情况下，混合物由于tmpd的原因而变成紫色。因此，工序(e)中，在混合物变成橙色的情况下，判定试样含有尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌的至少一方。另一方面，在混合物不变成橙色的情况下，判定试样不含有尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌的任一方。判定可以通过目视容易地进行。考虑含有尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌的至少一方的混合物变成橙色的原因是因为，透明的wst-8由于尾孢菌属的菌或者假尾孢菌属的菌而被还原变成橙色的wst-8甲本发明还包含用于实施上述的判定方法的装置。本发明的装置至少具备wst-8和tmpd。本发明的装置还可以进一步具备：用于收容试样的容器、用于培养菌的培养基、能够照射具有规定波长的光的光源、用于测定吸光度的吸光度计、用于光学检测菌显色试剂的显色的光学传感器、用于显示检测的结果的显示元件等。(实施例)参照以下实施例更详细地说明本发明。(实施例1)本发明者使用金属钩切下将菌高粱尾孢菌(cercosporasorghi)培养3天以上而得的琼脂培养基。接着，本发明者们将切下的培养基添加到10％马铃薯葡萄糖液体培养基(difco研究所制、以下称为“10％pdb”)中，得到混合物。将混合物使用微量移液器进行搅拌。混合物使用细胞滤过器(从コーニング株式会社作为商品名#352235购得)进行过滤。这样，将琼脂培养基除去。本发明者使用血细胞计数板(从サンリード硝子有限会社作为商品名a131获得)，计算滤液中含有的孢子的浓度。接着，本发明者们基于该孢子的浓度使用10％pdb稀释混合物，以含有的孢子的数为10万个的方式制备试样溶液。将试样溶液(170微升)提供至透明平底96孔微板的各孔中。接着，在各孔中添加乙酸缓冲液(0.1m、ph值：5.5、20微升)。接着，在各孔中添加wst-8和tmpd的混合溶液(10微升)。1个孔中含有的混合物的体积为200微升。在此之前，本发明者将wst-8溶液(从株式会社同人化学研究所购得，包含在“microbialviabilityassaykit-wst”中)与tmpd水溶液(10mm、从东京化成工业株式会社购得)以9:1的体积比混合，制备wst-8和tmpd的混合溶液。将透明平底96孔微板在25摄氏度的温度下静置1天。本发明者们使用酶标仪(从tecan社购得、商品名“m1000pro”)，以10纳米间隔测定400纳米～800纳米的波长下的1个孔的吸光度。本发明者计算了460纳米下的吸光度ay相对于610纳米下的吸光度ax的比。计算出的比为3.3。该1个孔为橙色。实施例1重复4次。详细的实验结果示于表1。(实施例2)在实施例2中，除了代替乙酸缓冲液使用10％pdb以外，进行与实施例1同样的实验。混合溶液具有5.1的ph值。实施例2重复4次。(实施例3)在实施例3中，除了代替高粱尾孢菌(cercosporasorghi)使用玉米尾孢菌(cercosporazeae-maydis)以外，进行与实施例1同样的实验。(实施例4)在实施例4中，除了(i)代替高粱尾孢菌(cercosporasorghi)使用玉米尾孢菌(cercosporazeae-maydis)、和(ii)代替乙酸缓冲液使用含有双(2-羟基乙基)亚氨基三(羟基甲基)甲烷(cas号：6976-37-0、以下称为“bis-tris”)的缓冲液、(iii)缓冲液具有6.5的ph值以外，进行与实施例1同样的实验。(实施例5)在实施例5中，除了代替高粱尾孢菌(cercosporasorghi)使用煤污假尾孢菌(pseudocercosporafuligena)以外，进行与实施例1同样的实验。(比较例1)在比较例1中，除了缓冲液为具有7.5的ph值的hepes缓冲液(从シグマアルドリッチ社购得)以外，进行与实施例1同样的实验。hepes缓冲液(浓度：0.1m)的ph值用氢氧化钠调整。(比较例2)在比较例2中，除了(i)代替高粱尾孢菌(cercosporasorghi)使用玉米尾孢菌(cercosporazeae-maydis)、和(ii)乙酸缓冲液具有4.5的ph值以外，进行与实施例1同样的实验。(比较例3～比较例10)在比较例3～比较例10中，除了代替高粱尾孢菌(cercosporasorghi)分别使用米曲霉(aspergillusoryzae)、胶孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)、希金斯炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)、燕麦细镰孢霉菌(fusariumavenaceum)、木贼镰孢霉菌(fusariumavenaceum)、尖孢镰孢霉菌(fusariumoxysporum)、哈茨木霉(trichodermaharzianum)、和产黄青霉(penicilliumchrysogenum)以外，进行与实施例1同样的实验。比较例4重复3次。(比较例11)在比较例11中，除了不使用高粱尾孢菌(cercosporasorghi)以外，进行与实施例1同样的实验。比较例11重复3次。(比较例12～比较例15)在比较例12～比较例15中，除了(i)菌代替高粱尾孢菌(cercosporasorghi)分别使用希金斯炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)、木贼镰孢霉菌(fusariumavenaceum)、尖孢镰孢霉菌(fusariumoxysporum)、和哈茨木霉(trichodermaharzianum)、(ii)代替乙酸缓冲液使用10％pdb、和(iii)混合溶液具有5.1的ph值以外，进行与实施例1同样的实验。(比较例16)在比较例16中，除了(i)不使用高粱尾孢菌(cercosporasorghi)、(ii)代替乙酸缓冲液使用10％pdb、和(iii)混合溶液具有5.1的ph值以外，进行与实施例1同样的实验。比较例16重复3次。(比较例17)在比较例17中，除了(i)代替高粱尾孢菌(cercosporasorghi)使用木贼镰孢霉菌(fusariumavenaceum)、(ii)代替乙酸缓冲液使用含有bis-tris的缓冲液、和(iii)缓冲液具有6.5的ph值以外，进行与实施例1同样的实验。(比较例18)在比较例18中，除了(i)不使用高粱尾孢菌(cercosporasorghi)、(ii)代替乙酸缓冲液使用含有bis-tris的缓冲液、和(iii)缓冲液具有6.5的ph值以外，进行与实施例1同样的实验。比较例18重复3次。(比较例19)在比较例19中，除了(i)代替高粱尾孢菌(cercosporasorghi)使用木贼镰孢霉菌(fusariumavenaceum)、(ii)代替乙酸缓冲液使用hepes缓冲液、和(iii)hepes缓冲液具有7.5的ph值以外，进行与实施例1同样的实验。(比较例20)在比较例20中，除了(i)不使用高粱尾孢菌(cercosporasorghi)、(ii)代替乙酸缓冲液使用hepes缓冲液、和(iii)hepes缓冲液具有7.5的ph值以外，进行与实施例1同样的实验。以下的表1～表5显示实施例1～实施例5和比较例1～比较例20的结果。表1菌名介质ph缓冲液实施例1cercosporasorghitmpd5.5乙酸缓冲液实施例2cercosporasorghitmpd5.1无实施例3cercosporazeae-maydistmpd5.5乙酸缓冲液实施例4cercosporazeae-maydistmpd6.5bis-tris实施例5pseudocercosporafuligenatmpd5.5乙酸缓冲液比较例1cercosporasorghitmpd7.5hepes缓冲液比较例2cercosporazeae-maydistmpd4.5乙酸缓冲液比较例3aspergillusoryzaetmpd5.5乙酸缓冲液比较例4colletotrichumgloeosporioidestmpd5.5乙酸缓冲液比较例5colletotrichumhigginisianumtmpd5.5乙酸缓冲液比较例6fusariumavenaceumtmpd5.5乙酸缓冲液比较例7fusariumequisetitmpd5.5乙酸缓冲液比较例8fusariumoxysporumtmpd5.5乙酸缓冲液比较例9trichodermaharzianumtmpd5.5乙酸缓冲液比较例10penicilliumchrysogenumtmpd5.5乙酸缓冲液表2菌名介质ph缓冲液比较例11无tmpd5.5乙酸缓冲液比较例12colletotrichumhigginisianumtmpd5.1无比较例13fusariumequisetitmpd5.1无比较例14fusariumoxysporumtmpd5.1无比较例15trichodermaharzianumtmpd5.1无比较例16无tmpd5.1无比较例17fusariumequisetitmpd6.5bis-tris比较例18无tmpd6.5bis-tris比较例19fusariumequisetitmpd7.5hepes缓冲液比较例20无tmpd7.5hepes缓冲液表3ay的值ax的值ay/ax的值液体的颜色实施例1(第1次)0.290.151.87橙实施例1(第2次)0.520.068.24橙实施例1(第3次)0.530.068.72橙实施例1(第4次)0.560.0510.68橙实施例2(第1次)0.270.112.36橙实施例2(第2次)0.470.133.69橙实施例3(第3次)0.480.114.51橙实施例4(第3次)0.750.089.43橙实施例31.400.187.57橙实施例40.760.184.14橙实施例52.020.287.2橙表4ay的值ax的值ay/ax的值液体的颜色比较例10.370.201.82橙比较例20.140.160.91紫比较例30.200.260.78紫比较例4(第1次)0.190.280.66紫比较例4(第2次)0.160.320.50紫比较例4(第3次)0.170.340.49紫比较例50.120.230.53紫比较例60.180.220.81紫比较例70.270.360.74紫比较例80.240.390.62紫比较例90.170.350.49紫比较例100.230.340.67紫表5ay的值ax的值ay/ax的值液体的颜色比较例11(第1次)0.110.340.32浅紫比较例11(第2次)0.100.340.31浅紫比较例11(第3次)0.150.340.45浅紫比较例120.130.190.65紫比较例130.300.291.04紫比较例140.250.241.01紫比较例150.190.270.71紫比较例16(第1次)0.100.260.39浅紫比较例16(第2次)0.100.280.37浅紫比较例16(第3次)0.150.290.52浅紫比较例170.360.261.35紫比较例18(第1次)0.120.350.36浅紫比较例18(第2次)0.170.350.48浅紫比较例18(第3次)0.110.290.38浅紫比较例190.710.292.44橙比较例200.150.230.65浅紫如上述表所表明的那样，在满足以下的条件(i)、条件(ii)、和条件(iii)的情况下，选择性地判定试样含有尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌中的至少一方。条件(i)水溶液含有tmpd。条件(i)水溶液具有5.1～6.5的ph值。条件(ii)ay/ax的值为1.5以上。将实施例3与比较例2比较可明确，在水溶液具有4.5的ph值的情况下，尽管试样含有尾孢菌属的菌、且水溶液含有tmpd，ay/ax的值也小于1.5。另一方面，将实施例2和实施例4、与比较例1和比较例19比较可明确，在水溶液具有7.5的ph值的情况下，无论试样是否含有尾孢菌属的菌，ay/ax的值都为1.5以上。换言之，在水溶液具有7.5的ph值的情况下，即使试样含有尾孢菌属的菌，ay/ax的值也为1.5以上。将实施例1～实施例5、与比较例2～比较例18和比较例20比较可明确，如果试样不含有尾孢菌属的菌或者假尾孢菌属的菌，则ay/ax的值小于1.5。产业可利用性本发明提供判定试样是否含有尾孢菌属的菌和假尾孢菌属的菌中的至少一方的方法。当前第1页12