减少酵母中乙酸产生的选择的乙酰辅酶A合酶的制作方法

本发明的组合物和方法涉及由于表达选择的乙酰辅酶合酶(acs)而具有减少的乙酸产生的酵母。此类酵母还可以被修饰以减少甘油和/或增加乙醇产生。所述酵母可用于从含碳水化合物的底物生产乙醇。

背景技术：

基于酵母的乙醇生产是基于糖向乙醇的转化。当前通过此方法实现的年燃料乙醇产量在世界范围内为约900亿升。据估计，乙醇生产成本的约70％是原料。因为乙醇生产量如此之大，所以甚至小的产率提升对于该产业也具有巨大的经济影响。一摩尔葡萄糖转化为两摩尔乙醇和两摩尔二氧化碳的转化是氧化还原中性的，其最大理论产率为约51％。当前的工业产率为约45％；因此，存在增加乙醇产生的机会。

二氧化碳、甘油和酵母生物质是乙醇发酵的主要副产物。在酵母生长和发酵期间，生成过剩的nadh，其用于产生甘油以用于氧化还原平衡和渗透保护的目的。甘油被认为是低价值产品，并且已采用若干种方法来减少甘油产生。

先前已经描述了具有异源磷酸转酮酶途径的工程化酵母细胞(例如，wo2015148272)。这些细胞表达异源磷酸转酮酶(pkl；ec4.1.2.9)和磷酸转乙酰酶(pta；ec2.3.1.8)，任选地具有其他酶，以使碳通量远离甘油途径导向，并且朝向乙酰辅酶a的合成导向，所述乙酰辅酶a然后转化为乙醇。与在其他方面相同的亲本酵母细胞相比，这些细胞能够在发酵过程中增加乙醇生产。不幸的是，这种修饰也产生增加的乙酸。

乙酸对包括酵母在内的大多数微生物均具有毒性。野生型酵母仅产生少量的乙酸(例如，在含有60g/l葡萄糖的培养基中产生100-300mg/l乙酸)。表达pkl的酵母中的乙酸产量大大提高(例如在同一培养基中为1-2g/l)。在工业谷物乙醇生产的条件下(其中发酵的葡萄糖的总量达到300g/l)，推算表达pkl的酵母菌株的乙酸产生可为5-10g/l。实际上，因为细胞由于乙酸中毒而停止生长，未观察到这样的浓度。

若干个研究人员试图过表达乙酰辅酶合酶(acs)以减少表达pkl的酵母中乙酸的积累。例如，面包酵母含有两种acs同工酶(acs1和acs2)。acs1受严格的翻译后控制，在葡萄糖存在下会经受分解代谢物失活(dejong-gubbels,p.等人(1997)femsmicrobiologyletters[fems微生物学快报]153:75-81)，而acs2的乙酸的km比acs1的高约30倍(vandenberg等人(1996)j.biol.chem[生物化学杂志].271:28953-59)。在专门针对减少酵母中乙酸产生的研究中，dejong-gubbels等人得出的结论是，两种天然酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)acs的任何一种过表达均不能降低酵母培养基中的乙酸水平((1998)femsmicrobiologyletters[fems微生物学快报]165:15-20)。在后来的应用研究中，尝试使用天然acsi酶或鼠伤寒沙门氏菌(salmonella.typimurium)acs的突变体(l614p)(据报道其能抵抗分解代谢物失活)。尽管鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)的酶完成的比acsi好，但乙酸的减少仅适中。

除了由某些酵母产生之外，一些用于生产乙醇的原料天然含有乙酸，这对酵母具有同样的不利影响。因此，出于各种原因，需要改变酵母代谢途径来最大化乙醇产生，同时不增加不期望的途径副产物(如乙酸)的产生。

技术实现要素：

本发明的组合物和方法涉及由于表达选择的乙酰辅酶合酶(acs)而表现出减少的乙酸产生的酵母。所述组合物和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。

1.在一个方面，提供了经修饰的酵母细胞，所述酵母细胞包含：

(i)编码源自属于甲烷丝菌(methanosaeta)属的古细菌微生物的乙酰辅酶合酶的外源基因，

(ii)编码源自子囊菌纲(ascomycete)酵母的低亲和力乙酰辅酶合酶的外源基因，

(iii)过表达的内源性低亲和力乙酰辅酶a合酶，和/或

(iv)编码功能上相似的蛋白质的外源基因，所述蛋白质与seqidno:4、seqidno:6或seqidno:10的多肽或其活性片段具有至少80％氨基酸序列同一性，

其中与除不包含所述外源基因外其他相同的酵母细胞相比，所述经修饰的细胞产生减少量的乙酸和/或在增加量的乙酸存在下生长。

2.在一些实施例中，如段落1所述的经修饰的酵母细胞进一步包含遗传修饰，所述遗传修饰在不存在外源基因的情况下导致酵母细胞产生增加量的乙酸。

3.在如段落2所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，所述遗传修饰是引入磷酸转酮酶途径的一个或多个基因或者缺失或破坏甘油合成途径的基因。

4.在如前述段落中任一项所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，产生的乙酸的量的减少是至少20％、至少30％或至少40％。

5.在如前述段落中任一项所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，所述功能上相似的蛋白质与seqidno:3或seqidno:9的多肽或其活性片段具有至少90％、至少95％或至少97％氨基酸序列同一性。

6.在一些实施例中，如前述段落中任一项所述的经修饰的酵母细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶或其他目的蛋白质的基因。

7.在另一方面，提供了一种在淀粉水解产物发酵过程中减少酵母细胞产生的乙酸的量的方法，所述方法包括，在所述酵母中引入：

(i)编码源自属于甲烷丝菌属的古细菌微生物的乙酰辅酶合酶的外源基因，

(ii)编码源自子囊菌纲酵母的“低亲和力”乙酰辅酶合酶的外源基因，

(iii)导致内源性低亲和力乙酰辅酶a合酶过表达的遗传改变，和/或(iv)编码功能上相似的蛋白质的外源基因，所述蛋白质与seqidno:3或seqidno:9的多肽或其活性片段具有至少80％氨基酸序列同一性。

8.在如段落7所述的方法的一些实施例中，所述酵母细胞进一步包含遗传修饰，所述遗传修饰在不存在外源基因的情况下将导致酵母细胞产生增加量的乙酸。

9.在如段落8所述的方法的一些实施例中，所述遗传修饰是引入磷酸转酮酶途径的基因或者缺失或破坏甘油合成途径的基因。

10.在如段落7-9中任一项所述的方法的一些实施例中，产生的乙酸的量的减少是至少20％、至少30％或至少40％。

11.在如段落7-10中任一项所述的方法的一些实施例中，所述功能上相似的蛋白质与seqidno:3或seqidno:9的多肽或其活性片段具有至少90％、至少95％或至少97％氨基酸序列同一性。

12.在另一方面，提供了通过如段落7-11中任一项所述的方法产生的经修饰的酵母细胞。

根据包括附图的说明书，本发明的经修饰的细胞和方法的这些和其他方面以及实施例将是清楚的。

附图说明

图1是载体px(deltatdh_acssalty)的功能图，所述载体是用于表达本文所述的各种乙酰辅酶a合酶的所有构建体的原型。

图2是载体ppath1(tdh_a2_ade2)的功能图。此载体携带来自动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)的磷酸转酮酶、来自植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)的磷酸转乙酰酶、和来自肠沙门菌(salmonellaenterica)的酰化乙醛脱氢酶的三个表达盒。这三种酶一起形成称为“磷酸转酮酶途径”的代谢途径。

图3是显示表达各种同源和异源acs酶的高乙酸生产菌株a2的衍生物中乙酸生成减少的图。菌株是a2的亲本菌株，并以野生型酵母菌株的典型量产生乙酸。

具体实施方式

i.定义

在详细地描述本发明的组合物和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。

如本文所使用的，术语“基因”与术语“等位基因”同义，是指编码和指导蛋白或rna表达的核酸。

如本文所使用的，术语“野生型”和“天然的”可互换使用，并且是指自然界中发现的基因、蛋白质、菌株和生物化学途径。

如本文所使用的，“基因缺失”是指所述基因从宿主细胞的基因组中除去。缺失可以是完全的(意指整个基因(即至少整个编码序列被去除))或部分的(意指仅去除了一部分编码序列或调控序列但是阻止了功能性基因产物的产生)。

如本文所使用的，“途径的减弱”或“通过途径的通量的减弱”(即生物化学途径)，泛指通过代谢途径减少或完全阻止生物化学底物或中间产物的通量的任何基因或化学操作。可以通过各种众所周知的方法实现途径的减弱。此类方法包括，但不限于：完全或部分缺失一个或多个基因、用编码具有减少的催化活性或增加的km值的酶的突变体形式替代这些基因的野生型等位基因、修饰启动子或控制一种或多个基因表达的其他调控元件、针对减少的稳定性工程化所述酶或编码这些酶的mrna、将酶错误指导进不太可能与底物和中间体相互作用的细胞区室、使用干扰rna等。

如本文所使用的，“基因的破坏”泛指任何基本上阻止细胞产生功能性基因产物的基因操作。基因破坏的示例性方法包括完全或部分缺失基因以及在编码或调控序列中制造突变。

如本文所使用的，术语“遗传操作”和“遗传改变”可互换使用，并且是指核酸序列的改变/变化。改变可包括但不限于核酸序列中至少一种核酸的取代、缺失、插入或化学修饰。

如本文所使用的，“表达多肽”和相似术语是指使用细胞的翻译装置(例如，核糖体)产生多肽的细胞过程。

如本文所使用的，“过表达多肽”、“提高多肽的表达”和类似术语是指与不包括指定的遗传修饰的亲本或“野生型细胞”所观察到的相比，以比正常较高的水平表达多肽。可以通过使用具有内源基因的更强启动子和/或使用合适的启动子，将基因的另外拷贝引入细胞(例如，以另外的表达盒的形式)来实现过表达。

如本文所使用的，“表达盒”是指包含氨基酸编码序列、启动子、终止子以及允许在细胞中产生所编码的多肽所需的其他核酸序列的核酸。表达盒可以是外源的(即，引入细胞中)或内源的(即，存在于细胞中)。

如本文所使用的，“厌氧发酵”是指在不存在氧的情况下的生长。

如本文所使用的，“需氧发酵”是指在氧存在下的生长。

如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白质”(和/或它们各自的复数形式)可互换地使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文中使用用于氨基酸残基的常规一字母或三字母代码。聚合物可以是线性的或支化的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还包括天然地修饰的或通过干预而修饰的氨基酸聚合物；例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分偶联。该定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。

如本文所使用的，功能上和/或结构上相似的蛋白质被认为是“相关的蛋白质”。此类蛋白质可衍生自不同属和/或物种的生物体，或甚至不同纲的生物体(例如，细菌和真菌)。相关的蛋白质还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或者通过免疫交叉反应性确定的同源物。

如本文所使用的，术语“氨基酸序列同一性百分比”或相似术语是指当使用具有默认参数的clustalw算法比对时，具体序列具有至少一定百分比的与指定参考序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基。参见thompson等人(1994)nucleicacidsres.[核酸研究]22:4673-80。clustalw算法的默认参数是：

如本文所使用的，单数冠词“一种(a)”、“一种(an)”以及“所述”涵盖复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文特此并入。除非另有说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：

ec酶学委员会

kda千道尔顿

kb千碱基

mw分子量

w/v重量/体积

w/w重量/重量

v/v体积/体积

wt％重量百分比

℃摄氏度

h2o水

h2o2过氧化氢

dh2o或di去离子水

dih2o去离子水，milli-q过滤

g或gm克

μg微克

mg毫克

kg千克

lb磅

μl和μl微升

ml和ml毫升

mm毫米

μm微米

mol摩尔

mmol毫摩尔

m摩尔的

mm毫摩尔的

μm微摩尔的

nm纳米

u单位

ppm份/百万份

sec和″秒

min和′分钟

hr和h小时

etoh乙醇

eq.当量

pcr聚合酶链式反应

dna脱氧核糖核酸

δ与缺失有关

bp碱基对

ii.表达选择的乙酰辅酶合酶的酵母

本发明的组合物和方法涉及使用选择的乙酰辅酶合酶(acs)减少工程化酵母细胞中乙酸的产生。选择的acs是在筛选了许多不同的分类学上趋异的acs后确定的。若干个acs优于文献中任何报道。来自鬃毛甲烷菌(methanosaetaconcilii)acs的古细菌acs是表现最出色的，而来自酿酒酵母和鲁氏结合酵母(zygosaccharomycesrouxii)的低亲和力acs(acs2)也比先前报道的最高效acs表现更好。与过量产生乙酸的酵母产生的乙酸量相比，来源于引入编码这些酶之一的外源基因(或过表达内源基因)的酵母中乙酸产生的降低是至少10％、至少20％、至少30％、且甚至至少40％。

所选择的乙酰辅酶合酶(acs)的使用将减少产生不必要的过量乙酸的酵母中乙酸的产生，所述酵母包括但不限于工程酵母(如miasnikov(wo2015148272)和pronk等人(wo2011010923)描述的那些)、和/或减少发酵培养基中天然存在的外源乙酸的量。

iii.与影响醇生产的另外的突变的组合

在一些实施例中，本发明经修饰的细胞可以另外地表达异源磷酸转酮酶(pkl；ec4.1.2.9)和磷酸转乙酰酶(pta；ec2.3.1.8)，任选地还有其他酶，以使碳通量远离甘油途径导向，并且朝向乙酰辅酶a的合成导向，所述乙酰辅酶a然后转化为乙醇。示例性磷酸转酮酶可以从阴道加德纳菌(gardnerellavaginalis)(uniprot/trembl登录号：wp_016786789)获得。示例性磷酸转乙酰酶可以从植物乳杆菌(uniprot/trembl登录号：wp_003641060)获得。在一些实施方案中，本发明的经修饰的细胞可以进一步具有用于制造ac-coa的人工替代途径，所述途径在缺氧条件下不会促进细胞中的氧化还原辅因子失衡，如miasnikov所述(wo2015148272)。

本发明的经修饰的细胞可以进一步包括导致天然甘油生物合成途径减弱的突变，已知所述突变可增加醇生产。用于减弱酵母中甘油生物合成途径的方法是已知的，并包括例如通过破坏基因gpd1、gpd2、gpp1和/或gpp2中的一个或多个来降低或消除内源性nad依赖性甘油3-磷酸脱氢酶(gpd)或磷酸甘油磷酸酶(gpp)活性。参见例如美国专利号9,175,270(elke等人)、8,795,998(pronk等人)和8,956,851(argyros等人)。

在一些实施例中，本发明的经修饰的细胞还可包括编码具有nad+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因和/或编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因。例如，在美国专利号8,795,998(pronk等人)中描述了与甘油途径减弱进行组合的此类基因的引入。然而，在本发明组合物和方法的大多数实施例中，不需要引入乙酰化乙醛脱氢酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶，因为通过减弱导致氧化还原辅因子失衡的用于制备乙酰辅酶a的天然生物合成途径消除了对这些活性的需要。

在一些实施例中，本发明的经修饰的细胞可以进一步具有酵母中用于制备ac-coa的减弱的天然生物合成途径，所述途径在缺氧条件下利于细胞中的氧化还原辅因子失衡，并且因此需要产生甘油以恢复氧化还原平衡。在一些实施例中，组合物和方法涉及编码醛脱氢酶(ec1.2.1.3)的天然基因(例如ald2、ald3、ald4、ald5和ald6)中的一种、几种或所有的破坏。天然酵母ac-coa途径(包括醛脱氢酶)在文献中有很好的描述。这些天然基因的缺失已在以下文献中描述：例如，kozak等人(2014)metabolicengineering[代谢工程]21:46-59。

在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包含丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自由以下组成的组的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸盐；(c)2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐；(d)2-酮异戊酸盐至异丁醛；和(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包括编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，包含丁醇生物合成途径的经修饰的酵母细胞进一步包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，酵母细胞在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或取代。在一些实施例中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自下组，该组由以下组成：pdc1、pdc5、pdc6、及其组合。在一些实施例中，酵母细胞在编码fra2、ald6、adh1、gpd2、bdh1、和ymr226c的一个或多个内源多核苷酸中进一步包含缺失、突变和/或取代。

在一些实施例中，本发明的经修饰的细胞包括编码除了acs酶之外的目的蛋白的任何数目的其他目的基因。目的蛋白包括选择性标记、碳水化合物加工酶以及其他商业上相关的多肽，包括但不限于选自下组的酶，该组由以下组成：脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。目的蛋白可以被分泌、糖基化和以其他方式修饰。

iv.经修饰的酵母用于增加醇生产的用途

本发明的组合物和方法包括用于在发酵反应中使用经修饰的酵母增加醇生产的方法。这类方法不限于特定的发酵过程。预期本发明的工程化酵母是任何醇发酵设施中常规酵母的“滴入式(drop-in)”替代品。虽然主要旨在用于燃料乙醇生产，但是本发明的酵母也可以用于生产可饮用酒精，包括葡萄酒和啤酒。

v.适合修饰的酵母细胞

酵母是被归类为真菌界成员的单细胞真核微生物，并且包括来自子囊菌门和担子菌门的生物。可以用于醇生产的酵母包括但不限于酵母属物种(saccharomycesspp.)，包括酿酒酵母(s.cerevisiae)、以及克鲁维酵母属(kluyveromyces)、lachancea和裂殖酵母属(schizosaccharomyces)物种。许多酵母菌株是可商购的，其中许多已被选择或基因工程化以获得所希望的特征，例如高醇生产、快速生长速率等。一些酵母已经被基因工程化以产生异源酶，例如葡糖淀粉酶或α-淀粉酶。

vi.碳水化合物底物和方法

从大量碳水化合物底物生产乙醇是众所周知的，对酶和化学条件以及机械方法的无数变化和改进也是如此。据信本发明的组合物和方法与此类底物和条件完全相容。

实例

实例1.构建用于测试乙酰辅酶a合酶的表达载体

以相应宿主的染色体dna为模板，通过pcr扩增酿酒酵母基因acs1和acs2的编码区以及鲁氏结合酵母(z.rouxii)基因acs2的编码区。基于已知的氨基酸序列，合成了编码鼠伤寒沙门氏菌acs突变体l641p的基因和编码鬃毛甲烷菌acsa1的基因。优化了合成基因的密码子组成，以对应于酿酒酵母高表达基因的密码子偏好。编码此研究的各种acs的所有基因的核苷酸和氨基酸序列以seqidno:1-10列出。使用常规基因工程方法组装了载体px(deltatdh_acssalty)(图1)。该载体中所有酵母来源的元件(即thd3启动子和eno2转录终止子、酵母δ-元件的3′和5′序列、以及ura3选择标记)均来自酵母染色体dna。细菌序列(即cole1复制起点和氨苄青霉素抗性基因)来自众所周知的puc19载体。用于表达其他acs的载体与px(deltatdh_acssalty)相同，除了鼠伤寒沙门氏菌acsl641p变体的编码序列被seqidno:1、3、5或9的序列代替外。

实例2.测试不同acs对酵母中乙酸产生的影响

为了测试不同acs帮助酵母吸收过量乙酸的能力，使用了过量产生乙酸的酵母的测试菌株。通过用载体path1(tdh_a2_ade2)的大swai片段转化可商购的酿酒酵母菌株的ura3(ade2突变体)获得此菌株(在本文中称为a2)(图2)。菌株a2表达三种酶：组成了“磷酸转乙酰酶途径”的磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶和酰化乙醛脱氢酶。相比于野生型前体菌株菌株a2产生显著更高水平的乙酸。菌株a2中乙酸产生增加的原因是，首先，磷酸转酮酶反应的产物乙酰磷酸是化学不稳定的，并且可以自发水解成乙酸和磷酸；其次，在磷酸转酮酶途径中形成的乙酰辅酶a减少了从乙酸合成它的代谢需求(酵母通常使用该代谢途径厌氧生产胞质ac-coa)。

用指导五个不同acs表达的五个载体系列将菌株a2(其是尿嘧啶营养缺陷体)转化为尿嘧啶原养型。除了acs编码序列，载体是相同的。原型载体是表达鼠伤寒沙门氏菌acsl641p变体的px(deltatdh_acssalty)(图1)。在所有情况下，各个载体的大swai片段均用作转化dna(包括所有功能性酵母元件，但排除载体在细菌中繁殖所需的序列)。从五次转化的每一次中选择八个随机选择的转化体，并在含有60g/l葡萄糖、0.67g/l不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮源、2g/l尿素的培养基中培养。在32℃摇床中培养48小时。然后通过hplc分析培养基中的发酵产物。这些试验的结果总结在表1和图3的图中。

令人惊讶的是，来自酿酒酵母的acs2(编码“低亲和力”的acs)的过表达有效地减少了培养基中乙酸的积累。这些观察结果与公开的文献相反，所述文献描述了acs1和acs2的过表达均对酵母培养物中的乙酸积累没有明显的影响(dejong-gubbels等人(1998)femsmicrobiologyletters[fems微生物学快报]165:15-20)。嗜渗酵母(鲁氏结合酵母)的acs2的效果不及其来自酿酒酵母的相似物质，但仍比先前被描述为可用于降低酵母中的乙酸产量的“行业标准”acs(即，来自鼠伤寒沙门氏菌acs的l641p突变体形式)稍微较好。这项研究表现的最佳是由鬃毛甲烷菌(m.concilii)的acsa1基因编码的酶，其是已知利用乙酸作为首选碳源的来自土壤的古细菌微生物。

表1.高乙酸菌株a2及其表达acs的衍生菌株产生的乙酸

序列

来自酿酒酵母菌株的acs1基因的多核苷酸序列(seqidno:1)：

atgtcgccctctgccgtacaatcatcaaaactagaagaacagtcaagtgaaattgacaagttgaaagcaaaaatgtcccagtctgcctccactgcgcagcagaagaaggaacatgagtatgaacatttgacctcggtcaagatcgtgccacaacggcccatctcagatagactgcagcccgcaattgctacccactattctccacacttggacgggttgcaggactatcagcgcttgcacaaggagtctattgaagaccctgctaagttcttcggttctaaagctacccaatttttaaactggtctaagccattcgataaggtgttcatcccagaccctaaaacgggcaggccctccttccagaacaatgcatggttcctcaacggccaattaaacgcctgttacaactgtgttgacagacatgccttgaagacccctaacaagaaagccattattttcgaaggtgacgagcctggccaaggctattccattacctacaaggaactacttgaagaagtttgtcaagtggcacaagtgctgacttactctatgggcgttcgcaagggcgatactgttgccgtgtacatgcctatggtcccagaagcaatcataaccttgttggccatttcccgtatcggtgccattcactccgtagtctttgccgggttttcttccaactccttgagagatcgtatcaacgatggggactctaaagttgtcatcactacagatgaatccaacagaggtggtaaagtcattgagactaaaagaattgttgatgacgcgctaagagagaccccaggcgtgagacacgtcttggtttatagaaagaccaacaatccatctgttgctttccatgcccccagagatttggattgggcaacagaaaagaagaaatacaagacctactatccatgcacacccgttgattctgaggatccattattcttgttgtatacgtctggttctactggtgcccccaagggtgttcaacattctaccgcaggttacttgctgggagctttgttgaccatgcgctacacttttgacactcaccaagaagacgttttcttcacagctggagacattggctggattacaggccacacttatgtggtttatggtcccttactatatggttgtgccactttggtctttgaagggacgcctgcatacccaaattactcccgttattgggatattattgatgaacacaaagtcacccaattttatgttgcgccaactgctttgcgtttgttgaaaagagctggtgattcctacatcgaaaatcattccttaaaatctttgcgttgcttgggttcggtcggtgagccaattgctgctgaagtttgggagtggtactctgaaaaaataggtaaaaatgaaatccccattgtagacacctactggcaaacagaatctggttcgcatctggtcaccccgctggctggtggtgtcacaccaatgaaaccgggttctgcctcattccccttcttcggtattgatgcagttgttcttgaccctaacactggtgaagaacttaacaccagccacgcagagggtgtccttgccgtcaaagctgcatggccatcatttgcaagaactatttggaaaaatcatgataggtatctagacacttatttgaacccttaccctggctactatttcactggtgatggtgctgcaaaggataaggatggttatatctggattttgggtcgtgtagacgatgtggtgaacgtctctggtcaccgtctgtctaccgctgaaattgaggctgctattatcgaagatccaattgtggccgagtgtgctgttgtcggattcaacgatgacttgactggtcaagcagttgctgcatttgtggtgttgaaaaacaaatctagttggtccaccgcaacagatgatgaattacaagatatcaagaagcatttggtctttactgttagaaaagacatcgggccatttgccgcaccaaaattgatcattttagtggatgacttgcccaagacaagatctggcaaaattatgagacgtattttaagaaaaatcctagcaggagaaagtgaccaactaggcgacgtttctacattgtcaaaccctggcattgttagacatctaattgattcggtcaagttgtaa

来自酿酒酵母菌株的acs1p的氨基酸序列(seqidno:2)：

mspsavqsskleeqsseidklkakmsqsastaqqkkeheyehltsvkivpqrpisdrlqpaiathysphldglqdyqrlhkesiedpakffgskatqflnwskpfdkvfipdpktgrpsfqnnawflngqlnacyncvdrhalktpnkkaiifegdepgqgysitykelleevcqvaqvltysmgvrkgdtvavympmvpeaiitllaisrigaihsvvfagfssnslrdrindgdskvvittdesnrggkvietkrivddalretpgvrhvlvyrktnnpsvafhaprdldwatekkkyktyypctpvdsedplfllytsgstgapkgvqhstagyllgalltmrytfdthqedvfftagdigwitghtyvvygpllygcatlvfegtpaypnysrywdiidehkvtqfyvaptalrllkragdsyienhslkslrclgsvgepiaaevwewysekigkneipivdtywqtesgshlvtplaggvtpmkpgsasfpffgidavvldpntgeelntshaegvlavkaawpsfartiwknhdryldtylnpypgyyftgdgaakdkdgyiwilgrvddvvnvsghrlstaeieaaiiedpivaecavvgfnddltgqavaafvvlknksswstatddelqdikkhlvftvrkdigpfaapkliilvddlpktrsgkimrrilrkilagesdqlgdvstlsnpgivrhlidsvkl

来自酿酒酵母菌株的acs2基因的多核苷酸序列(seqidno:3)：

atgacaatcaaggaacataaagtagttcatgaagctcacaacgtaaaggctcttaaggctcctcaacatttttacaacagccaacccggcaagggttacgttactgatatgcaacattatcaagaaatgtatcaacaatctatcaatgagccagaaaaattctttgataagatggctaaggaatacttgcattgggatgctccatacaccaaagttcaatctggttcattgaacaatggtgatgttgcatggtttttgaacggtaaattgaatgcatcatacaattgtgttgacagacatgcctttgctaatcccgacaagccagctttgatctatgaagctgatgacgaatccgacaacaaaatcatcacatttggtgaattactcagaaaagtttcccaaatcgctggtgtcttaaaaagctggggcgttaagaaaggtgacacagtggctatctatttgccaatgattccagaagcggtcattgctatgttggctgtggctcgtattggtgctattcactctgttgtctttgctgggttctccgctggttcgttgaaagatcgtgtcgttgacgctaattctaaagtggtcatcacttgtgatgaaggtaaaagaggtggtaagaccatcaacactaaaaaaattgttgacgaaggtttgaacggagtcgatttggtttcccgtatcttggttttccaaagaactggtactgaaggtattccaatgaaggccggtagagattactggtggcatgaggaggccgctaagcagagaacttacctacctcctgtttcatgtgacgctgaagatcctctatttttgttatacacttccggttccactggttctccaaagggtgtcgttcacactacaggtggttatttattaggtgccgctttaacaactagatacgtttttgatattcacccagaagatgttctcttcactgccggtgacgtcggctggatcacgggtcacacctatgctctatatggtccattaaccttgggtaccgcctcaataattttcgaatccactcctgcctacccagattatggtagatattggagaattatccaacgtcacaaggctacccatttctatgtggctccaactgctttaagattaatcaaacgtgtaggtgaagccgaaattgccaaatatgacacttcctcattacgtgtcttgggttccgtcggtgaaccaatctctccagacttatgggaatggtatcatgaaaaagtgggtaacaaaaactgtgtcatttgtgacactatgtggcaaacagagtctggttctcatttaattgctcctttggcaggtgctgtcccaacaaaacctggttctgctaccgtgccattctttggtattaacgcttgtatcattgaccctgttacaggtgtggaattagaaggtaatgatgtcgaaggtgtccttgccgttaaatcaccatggccatcaatggctagatctgtttggaaccaccacgaccgttacatggatacttacttgaaaccttatcctggtcactatttcacaggtgatggtgctggtagagatcatgatggttactactggatcaggggtagagttgacgacgttgtaaatgtttccggtcatagattatccacatcagaaattgaagcatccatctcaaatcacgaaaacgtctcggaagctgctgttgtcggtattccagatgaattgaccggtcaaaccgtcgttgcatatgtttccctaaaagatggttatctacaaaacaacgctactgaaggtgatgcagaacacatcacaccagataatttacgtagagaattgatcttacaagttaggggtgagattggtcctttcgcctcaccaaaaaccattattctagttagagatctaccaagaacaaggtcaggaaagattatgagaagagttctaagaaaggttgcttctaacgaagccgaacagctaggtgacctaactactttggccaacccagaagttgtacctgccatcatttctgctgtagagaaccaatttttctctcaaaaaaagaaataa

来自酿酒酵母菌株的acs2p的氨基酸序列(seqidno:4)：

mtikehkvvheahnvkalkapqhfynsqpgkgyvtdmqhyqemyqqsinepekffdkmakeylhwdapytkvqsgslnngdvawflngklnasyncvdrhafanpdkpaliyeaddesdnkiitfgellrkvsqiagvlkswgvkkgdtvaiylpmipeaviamlavarigaihsvvfagfsagslkdrvvdanskvvitcdegkrggktintkkivdeglngvdlvsrilvfqrtgtegipmkagrdywwheeaakqrtylppvscdaedplfllytsgstgspkgvvhttggyllgaalttryvfdihpedvlftagdvgwitghtyalygpltlgtasiifestpaypdygrywriiqrhkathfyvaptalrlikrvgeaeiakydtsslrvlgsvgepispdlwewyhekvgnkncvicdtmwqtesgshliaplagavptkpgsatvpffginaciidpvtgvelegndvegvlavkspwpsmarsvwnhhdrymdtylkpypghyftgdgagrdhdgyywirgrvddvvnvsghrlstseieasisnhenvseaavvgipdeltgqtvvayvslkdgylqnnategdaehitpdnlrrelilqvrgeigpfaspktiilvrdlprtrsgkimrrvlrkvasneaeqlgdlttlanpevvpaiisavenqffsqkkk

来自鲁氏结合酵母菌株cbs762的acs2基因的核苷酸序列(seqidno:5)

atgacaactaaggaacataagaccgttcatgaggataaaccatttacaaagacgaagtttggttcattggaaaatggtgatactacttggtttttaaacggtgagttgaatgctgcttacaactgtgttgatagacatgcttttgccaatcctgataaaccagcattgatctacgaagcggatgaagaagcagacaacagggttgttacattcggtgagcttttgagacaagtttctcaagttgctggtgttcttcacagctggggggttagaaaaggtgataccgtcgcagtttatctaccaatgattcctgaagctgttgttgcaatgttggccgttgccagattaggtgcaattcattctgttgtttttgcaggtttttcagcaggttccttgaaggatcgtgttgtagacgcaggttgtaaagttgttattacttgtgatcaaggtaaaagaggtagcaaaaccgttcatacaaagaaaattgtcgatgaaggtttaaatggaatttctcaagtttctcatattcttgtcttccaaaggacaggtgctgaagggatcccaatgacacctggcagagattactggtggcacgaagaagctgctaagcaaagaggttacattccaccagttccttgtagtgctgaagatccattattcctcttgtacacttcaggttccaccgggtcaccaaagggtgtggtccattcaaccggtggttatctattgggtgcagccatgaccactagatatgtgtttgacatccatccagaagatgtcttattcacagcaggtgatgttggttggattacaggtcatacttatgctctttatggtccattagcgctaggtactgcatcaatcatctttgaatcaacaccagcttatcctgattacggtagatattggagaatcattcagcgtcataaggcaactcatttctacgtggctccaacagccatgagattgattaagcgtgtaggtgaggctgaaattccaaaatacgatctatcttcactaagagttcttggatcagtcggtgaaccaatttcaccagatctttgggaatggtacaacgaaaaaattggtcacaacaactgtgtcgtttgtgataccatgtggcaaaccgaatctggttctcatttaattgctccattagcaggtgcagtcccaacaaaacctggttccgctacagttccattctttggtgttgatgcttgtatcattgacccagtcactggtgttgaattacaaggtaatgacgtggaaggtgttttggcagtaaaatcatcttggccatctatggcaagatcagtttggcaaaatcacaaccgtttccaggagacttacttgcaaccataccctggttactactttacaggtgatggtgcaggtagagaccatgatggttactactggatcagaggtagagttgatgatgtggttaacgtttctggccacagattgtccactgctgaaattgaagcttcattgaccaaccatgataatgtttctgaatctgctgtcgtaggtattcctgacgaattgaccggtcaaaccgtcattgccttcgttgcattgaaagatggtactccaagtcaaggtgatgcgagtgctaacgttcgtcgtgaattggtgctccaagttagaggtgaaattggtccatttgctgctcctaaatgtgtcatcttggttaaagatctgccaaagactagatccggtaaaatcatgagaagagtcctaagaaaagttgcatctaatgaagctgatcaactgggtgatctatctactatggctaacgctgaagtcgttccaggtatcattgcagctgttgatgaacaatattttgctgagaagaagaaataa

来自鲁氏结合酵母菌株cbs762的acs2p的氨基酸序列(seqidno:6)：

mttkehktvheaqnvvarhapehfyksqpglgyvkdmkqyqemykqsvedpetffgtkaqellhwdkpftktkfgslengdttwflngelnaayncvdrhafanpdkpaliyeadeeadnrvvtfgellrqvsqvagvlhswgvrkgdtvavylpmipeavvamlavarlgaihsvvfagfsagslkdrvvdagckvvitcdqgkrgsktvhtkkivdeglngisqvshilvfqrtgaegipmtpgrdywwheeaakqrgyippvpcsaedplfllytsgstgspkgvvhstggyllgaamttryvfdihpedvlftagdvgwitghtyalygplalgtasiifestpaypdygrywriiqrhkathfyvaptamrlikrvgeaeipkydlsslrvlgsvgepispdlwewynekighnncvvcdtmwqtesgshliaplagavptkpgsatvpffgvdaciidpvtgvelqgndvegvlavksswpsmarsvwqnhnrfqetylqpypgyyftgdgagrdhdgyywirgrvddvvnvsghrlstaeieasltnhdnvsesavvgipdeltgqtviafvalkdgtpsqgdasanvrrelvlqvrgeigpfaapkcvilvkdlpktrsgkimrrvlrkvasneadqlgdlstmanaevvpgiiaavdeqyfaekkk

合成的、酵母采用的编码鼠伤寒沙门氏菌acsl641p突变体的dna序列(seqidno:7)：

atgaaccaacaagacatagaacaagtagtaaaagccgtattattaaagatgaaagactcctctcaaccagcctcaaccgtacacgaaatgggtgtttttgcctctttggatgacgctgtcgctgcagccaaaagagcccaacaaggtttgaagtcagttgctatgagacaattagcaatccatgccattagagaagcaggtgaaaaacacgccagagaattggctgaattagcagtatccgaaactggtatgggtagagttgatgacaaattcgctaagaatgtcgctcaagcaagaggtacaccaggtgtcgaatgtttgagtcctcaagtattaacaggtgacaatggtttgaccttaattgaaaacgccccatggggtgttgtcgcttctgttacaccatcaaccaatcctgctgcaactgttataaataacgcaatctctttgatcgccgctggtaactcagtagtttttgctccacatcctgcagccaaaaaggtttcccaaagagcaattacattgttaaatcaagccgtcgtagctgcaggtggtccagaaaatttgttagtaaccgttgctaaccctgatatcgaaactgcacaaagattattcaagtatccaggtatcggtttgttagttgtcacaggtggtgaagctgtagttgatgccgctagaaaacacaccaataagagattgattgcagccggtgcaggtaacccacctgtcgtagttgatgaaactgctgacttaccaagagctgcacaatccatcgttaagggtgcaagtttcgataacaacatcatctgcgctgacgaaaaggttttaattgtcgtagattctgtcgctgacgaattgatgagattaatggaaggtcaacatgcagttaaattgacagccgctcaagccgaacaattgcaaccagttttgttgaaaaatatagatgaacgtggtaaaggtaccgtatcaagagattgggttggtagagacgcaggtaaaattgcagccgctataggtttgaacgttcctgatcaaactagattgttgttcgttgaaacaccagctaaccatcctttcgcagtaacagaaatgatgatgccagttttacctgttgtcagagttgctaatgtcgaagaagccatagctttggcagttcaattagaaggtggttgtcatcacaccgcagccatgcactccagaaatatcgataatatgaaccaaatggccaacgctatcgacacttctattttcgttaaaaacggtccatgcattgctggtttgggtttaggtggtgaaggttggactacaatgaccataaccactcctactggtgaaggtgtcacttctgcaagaacatttgtaagattgagaagatgtgtcttagtagatgctttcagaattgtttag

鼠伤寒沙门氏菌acsl641p突变体的氨基酸序列(seqidno:8)：msqthkhaipaniadrclinpeqyetkykqsindpdtfwgeqgkildwitpyqkvkntsfapgnvsikwyedgtlnlaancldrhlqengdrtaiiwegddtsqskhisyrelhrdvcrfantlldlgikkgdvvaiympmvpeaavamlacarigavhsvifggfspeavagriidsssrlvitadegvragrsiplkknvddalknpnvtsvehvivlkrtgsdidwqegrdlwwrdliekaspehqpeamnaedplfilytsgstgkpkgvlhttggylvyaattfkyvfdyhpgdiywctadvgwvtghsyllygplacgattlmfegvpnwptparmcqvvdkhqvnilytaptairalmaegdkaiegtdrsslrilgsvgepinpeawewywkkigkekcpvvdtwwqtetggfmitplpgaielkagsatrpffgvqpalvdneghpqegategnlvitdswpgqartlfgdherfeqtyfstfknmyfsgdgarrdedgyywitgrvddvlnvsghrlgtaeiesalvahpkiaeaavvgiphaikgqaiyayvtlnhgeepspelyaevrnwvrkeigplatpdvlhwtdslpktrsgkimrrilrkiaagdtsnlgdtstladpgvvekpleekqaiamps

合成的、酵母采用的编码鬃毛甲烷菌acsa1p的dna序列(seqidno:9)：

atgttgaagttggccggtaaagaagataagaagttgaaaaccactgttttccaagacgaaaccagaattttcaacccaccaaaagaattggtcgaaaagtccatagttatgcaatggatgaagaagaagggtttcaagaccgaaaaagaaatgagagcttggtgttcctctgatgaacactatttggaattttgggacgaaatggctaagacctatgttgattggcataagacttacaccaaggttatggatgattccgaaatgccatacttccattggtttactggtggtgaaatcaacattacctacaacgctgttgatagacatgctaaaggtgctaagaaagataaggttgcctacatctggattccagaacctactgatcaaccagttcaaaagattacttacggtgacttgtacaaagaagtcaacaagtttgctaacggtttgaagtctttgggtttgaaaaagggtgacagagtctctatctacatgccaatgattccacaattgccaattgctatgttggcttgtgctaagttgggtgttattcactctgttgttttctccggtttttccagtaaaggtttgatggatagagctgctgattgtggttcaagagctattattactgttgacggtttctacagaagaggtaaaccagttccattgaagccaaatgctgatgaagctgctggtggtgctccatctgttgaaaagattatcgtttacaaaagagccggtgtcgatgtctctatgaaggaaggtagagatgtttggtggcatgatttggttaagggtcaatctgaagaatgtgaaccagtttgggttgatccagaacatagattgtacatcttgtacacctctggtactactggtaagccaaaaggtattgaacatgcaactggtggtaatgctgttggtccagctcaaactttacattgggttttcgatttgaaggatgatgatgtatggtggtgtactgctgatattggttgggttactggtcattcttacatcgtttatgccccattgattttgggtatgacctctttgatgtatgaaggtgctgcagattatccagattttggtagatggtggaagaacatccaagatcataaggttactgtcttgtatactgctccaactgctgttagaatgttcatgaagcaaggtgctgaatggccagataagtatgatttgtcctccttgagattattgggttctgttggtgaacctattaaccctgaagcctggatgtggtatagagaacatattggtagaggtgaattgcaaatcatggatacttggtggcaaactgaaaccggtacttttttgaactctccattgcctattaccccattgaaaccaggttcttgtacttttccattgccaggttacgatatctccattttggacgaagaaggtaacgaagttccattaggttcaggtggtaatatcgttgctttgaaaccatacccatctatgttgagagctttttggggtgacaaagaaagattcatgaaggaatactggcaattctactgggatgttccaggtagaagaggtgtttatttggctggtgataaggctcaaagagataaggacggttacttcttcattcaaggtagaatcgatgatgttttgtccgttgctggtcatagaattgctaatgctgaagttgaatctgctttggttgctcatccaaaaattgctgaagctgcagttgttggtaaacctgatgaagtaaaaggtgaatctatcgttgccttcgttatcttgagagttggtaatgaaccatctccagaattggctaaagatgccattgctttcgttagaaaaactttgggtccagttgctgctcctactgaagttcattttgttaacgatttgccaaagactagatccggtaagatcatgagaagagttgttaaggctagagctttgggtaatccagttggtgatatttccactttgatgaatcctgaagccgttgatggtattccaaagatcgtttaa

鬃毛甲烷菌acsa1p的氨基酸序列(seqidno:10)：

mlklagkedkklkttvfqdetrifnppkelveksivmqwmkkkgfktekemrawcssdehylefwdemaktyvdwhktytkvmddsempyfhwftggeinitynavdrhakgakkdkvayiwipeptdqpvqkitygdlykevnkfanglkslglkkgdrvsiympmipqlpiamlacaklgvihsvvfsgfsskglmdraadcgsraiitvdgfyrrgkpvplkpnadeaaggapsvekiivykragvdvsmkegrdvwwhdlvkgqseecepvwvdpehrlyilytsgttgkpkgiehatggnavgpaqtlhwvfdlkdddvwwctadigwvtghsyivyaplilgmtslmyegaadypdfgrwwkniqdhkvtvlytaptavrmfmkqgaewpdkydlsslrllgsvgepinpeawmwyrehigrgelqimdtwwqtetgtflnsplpitplkpgsctfplpgydisildeegnevplgsggnivalkpypsmlrafwgdkerfmkeywqfywdvpgrrgvylagdkaqrdkdgyffiqgriddvlsvaghrianaevesalvahpkiaeaavvgkpdevkgesivafvilrvgnepspelakdaiafvrktlgpvaaptevhfvndlpktrsgkimrrvvkaralgnpvgdistlmnpeavdgipkiv