重组微生物、使用重组微生物的吡哆胺或其盐的制造方法、及使用重组微生物的吡哆醛或其盐的制造方法与流程

本公开文本涉及能生产吡哆胺或其盐的重组微生物及使用该重组微生物的吡哆胺或其盐的制造方法、以及能生产吡哆醛或其盐的重组微生物及使用该重组微生物的吡哆醛或其盐的制造方法。

背景技术：

吡哆胺及其盐是维生素b6中的一种，其具有糖基化反应抑制作用，这是已知的。吡哆胺及其盐抑制例如与各种老化反应相关的糖基化终产物(advancedglycationendproducts；age)向体内的蓄积。age是通过蛋白质的糖基化而生成的物质的总称，认为age的蓄积可使糖尿病、动脉粥样硬化症、慢性肾功能衰竭、阿尔茨海默型认知症等疾病恶化。因此，吡哆胺及其盐是被期待能通过防止age的蓄积来实施上述疾病的预防、治疗的有前景的物质。

另外，吡哆胺及其盐还具有作为精神分裂症药物的活性是已知的，面向其实用化进行了各种研究。此外，对利用吡哆胺及其盐所具有的各种生理活性的健康食品、化妆品的开发也正在推进。

吡哆胺及其盐可进行化学合成。例如，国际公开第2006/066806号公开了以丙氨酸和甲酸作为起始物质来化学合成吡哆胺二盐酸盐的方法。另外，国际公开第2005/077902号公开了从吡哆醇化学合成吡哆胺的方法。

另一方面，也研究了生物合成吡哆胺。国际公开第2007/142222号公开了使用无色杆菌属等的特定微生物从吡哆醛得到吡哆胺的方法。另外，国际公开第2007/142222号还公开了通过在吡哆醇存在下培养梭链枝顶孢霉(acremoniumfusidioides)而将一定量的吡哆醇转化为吡哆醛的实验。

日本特开平9-107985号公报公开了维生素b6的制造方法，所述方法在好氧条件下于培养基中对属于根瘤菌属的具有维生素b6生产能力的微生物进行培养，从培养液中得到所生成的维生素b6。

作为涉及维生素b6合成的研究，国际公开第2004/035010号公开了对枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的yaad及yaae中至少一方的活性较之亲本生物而言增强的生物进行培养、制造维生素b6混合物的方法。日本特开2000-23690号公报记载了使用了苜蓿根瘤菌(rhizobiummeliloti)ifo14782的无细胞提取物的维生素b6混合物的生产。journalofmolecularcatalysisb：enzymatic、2010、vol.67、p.104-110公开了通过序列修饰被改造为能利用l-谷氨酸的吡哆胺-丙酮酸转氨酶(ppat)。记载了通过在饱和量的吡哆醛存在下对表达具有该修饰序列的ppat的大肠杆菌进行孵育，能够生产吡哆胺。

另外，吡哆醛也是维生素b6中的一种，是生物的生存所需要的营养素。维生素b6不仅可用于食品、食品添加物，而且还具有医药品、化妆品原料等广泛用途。吡哆醛具有作为单独成分有用的用途。例如，磷酸吡哆醛被用作活性型的维生素b6剂，吡哆醛是能成为用于制造磷酸吡哆醛的中间体的物质。吡哆醛作为医药品、化妆品、食品、或用于制造它们的中间体是有用的。日本特公昭43-5712号公报公开了吡哆醛-羰基衍生物的制造方法，其特征在于，在利用吡哆醇氧化酶进行的从吡哆醇向吡哆醛的转化酶反应中，向反应液中添加羰基试剂。另外，thejournalofbiologicalchemistry，1999，vol.274，no.33，8月13日发行，pp.23185-23190也记载了这样的转化酶。

技术实现要素：

发明所要解决的课题

但是，通过基于化学合成的吡哆胺合成并未得到高的反应收率。例如，国际公开第2006/066806号中记载的方法中，由于经过多个化学反应而合成吡哆胺二盐酸盐，因此反应收率降低。另外，国际公开第2005/077902号中记载的方法中，生成吡哆胺的二聚体和三聚体，反应收率也不算高。

另一方面，在作为使用了特定种类的微生物的方法的、国际公开第2007/142222号中记载的方法中，从吡哆醛向吡哆胺转化的效率根据微生物种类而大幅度变动，并且整体而言并不算高。另外，国际公开第2007/142222号中记载的在吡哆醇存在下培养梭链枝顶孢霉的实验中，大部分产物是吡哆醛而非吡哆胺。此外，日本特开平9-107985号公报的记载中，生成的维生素b6几乎都是吡哆醇(pyridoxine)，极少生成吡哆胺。

国际公开第2004/035010号中虽然记载了通过在培养基中培养使yaad、yaae的基因高水平表达的微生物来得到维生素b6，但产物是吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、磷酸吡哆胺等的混合物，无法选择性地得到吡哆胺。

如上所述，吡哆胺或其盐的化学合成(例如国际公开第2006/066806号、国际公开第2005/077902号)经过多个反应及纯化工序，并未得到高的收率。另外，虽然在微生物中也存在具有吡哆胺合成能力的微生物(例如国际公开第2007/142222号、日本特开平9-107985号公报)，但要新发现这样的微生物耗费劳力，另外，尚未能在维生素b6族中选择性地合成吡哆胺或其盐，也未得到高的吡哆胺生产效率。另外，通过这样从天然存在的微生物种类中筛选特定微生物种类的途径，无法得到何种酶或基因对于高效生产维生素b6是重要的这样的分子生物学信息。

此外，还有针对维生素b6的生产使用了利用基因重组技术制备的重组微生物的例子(国际公开第2004/035010号及journalofmolecularcatalysisb：enzymatic、2010、vol.67、p.104-110)，但在物质生产时，使用通常的培养基而非选择性地得到了维生素b6(国际公开第2004/035010号)，或者以饱和量使用昂贵的原料吡哆醛而得到了吡哆胺(journalofmolecularcatalysisb：enzymatic、2010、vol.67、p.104-110)，无法达成廉价且选择性良好地生产吡哆胺或其盐。

鉴于如上所述的情况，本公开文本的第一方式中，提供能高生产效率且廉价地从吡哆醇或其盐生产吡哆胺或其盐的重组微生物、及使用该重组微生物高生产效率且廉价地从吡哆醇或其盐生产吡哆胺或其盐的方法。

另外，对于吡哆醛生产而言，能够用于工业生产的效率良好的酶生产方法尚未实用化。国际公开公报2004/035010号中记载的方法及日本特开2000-23690号公报中记载的方法中，利用酶法得到吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺的混合物，但这些方法不是能够选择性地(也即，并非以与吡哆醇、吡哆胺的混合物的形式、而是以高纯度的吡哆醛的形式)得到吡哆醛的方法。

日本特公昭43-5712号公报中记载的方法中，必须向反应体系中添加羰基试剂。羰基试剂将生成的吡哆醛转化为羰基衍生物。但是，生成羰基衍生物的方法大多不适合将吡哆醛作为中间体供于后续反应。

本申请的发明人从吡哆醛的工业生产的观点考虑，尝试了制备导入编码吡哆醇脱氢酶的基因而得到的、可用于工业的重组微生物。关于这样的基因重组微生物的宿主细胞，从成本及制造的容易性的观点考虑，优选为原核生物，但在例如所导入的基因为真核生物的基因的情况下，要将编码在真核生物中表达的蛋白质的基因导入至原核生物并使其表达时伴有诸多困难，常常无法表达保持活性状态的蛋白质。因此，本公开文本的第二方式中，提供具有并且表达导入的吡哆醇脱氢酶的重组微生物。

用于解决课题的手段

本公开文本的第一方式包括以下方案。

<1>

重组微生物，其具有编码吡哆醇脱氢酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码氨基酸再生酶的基因，所述吡哆胺合成酶具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性，所述氨基酸再生酶具有使所述吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸再生的酶活性，

所述编码吡哆醇脱氢酶的基因、所述编码吡哆胺合成酶的基因及所述编码氨基酸再生酶的基因中的至少两者是从菌体外导入的基因，或者是内源于菌体但其表达得到增强的基因。

<2>

如<1>所述的重组微生物，其中，所述吡哆胺合成酶为吡哆胺-丙酮酸转氨酶、吡哆胺-草酰乙酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、或磷酸吡哆胺转氨酶。

<3>

如<1>或<2>所述的重组微生物，其中，所述吡哆醇脱氢酶包含下述的部分氨基酸序列(a)及部分氨基酸序列(b)中的至少一者，且具有吡哆醇脱氢酶活性，

(a)nx1x2ex3yg(序列号97)

(其中，x1表示v、c、i、a、m、s、g或l，

x2表示g或a，

x3表示f或l)；

(b)x4x5x6kgx7(序列号98)

(x4表示i、v、f或l，

x5表示s、t、n、c或m，

x6表示c、v、a、i、w或f，

x7表示g、a、s或c)。

<4>

如<1>～<3>中任一项所述的重组微生物，其中，所述吡哆醇脱氢酶由酶编号ec1.1.1.65表示。

<5>

如<1>～<4>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆醇脱氢酶的基因来源于酿酒酵母。

<6>

如<1>～<5>中任一项所述的重组微生物，其中，

所述编码吡哆醇脱氢酶的基因具有序列号7及序列号53～序列号59中任一者的核苷酸序列，或

具有序列号13及序列号75～81中任一者的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域，或

具有在严格条件下与下述dna杂交、且编码具有吡哆醇脱氢酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述dna为具有与序列号7及序列号53～序列号59中任一者的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna、或具有与序列号13及序列号75～81中任一者的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域互补的核苷酸序列的dna。

<7>

如<1>～<6>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆醇脱氢酶的基因具有序列号7的核苷酸序列，或具有在严格条件下与下述dna杂交、且编码具有吡哆醇脱氢酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述dna为具有与序列号7的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna。

<8>

如<1>～<4>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆醇脱氢酶的基因来源于粟酒裂殖酵母。

<9>

如<1>～<4>及<8>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆醇脱氢酶的基因具有序列号8的核苷酸序列，或具有在严格条件下与下述dna杂交、且编码具有吡哆醇脱氢酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述dna为具有与序列号8的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna。

<10>

如<1>～<9>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆醇脱氢酶的基因具有编码下述氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列为序列号1、序列号2及序列号22～序列号28中任一者的氨基酸序列、或与序列号1、序列号2及序列号22～28的氨基酸序列中的至少一者具有80％以上的序列同一性且具有吡哆醇脱氢酶活性的氨基酸序列。

<11>

如<1>～<10>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆醇脱氢酶的基因具有编码下述氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列为序列号1或序列号2的氨基酸序列、或者与序列号1的氨基酸序列及序列号2的氨基酸序列中的至少一者具有80％以上的序列同一性且具有吡哆醇脱氢酶活性的氨基酸序列。

<12>

如<1>～<11>中任一项所述的重组微生物，其中，所述吡哆胺合成酶包含下述的部分氨基酸序列(c)、部分氨基酸序列(d)、部分氨基酸序列(e)、部分氨基酸序列(f)、部分氨基酸序列(g)及部分氨基酸序列(h)中的至少一者，且具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性，

(c)x8x9x10x11x12x13(序列号99)

(x8表示l、m、i或v，

x9表示h或q，

x10表示g、c或a，

x11表示e或d，

x12表示p或a，

x13表示v、i、l或a)；

(d)x14x15tpsgtx16x17(序列号100)

(x14表示h或s，

x15表示d或e，

x16表示i、v或l，

x17表示n或t)；

(e)x18dx19vsx20x21(序列号101)

(x18表示v、i或a，

x19表示a、t或s，

x20表示s、a或g，

x21表示f、w或v)；

(f)x22x23x24kcx25gx26x27p(序列号102)

(x22表示g或s，

x23表示p、s或a，

x24表示n、g、s、a或q，

x25表示l或m，

x26表示a、s、c或g，

x27表示p、t、s或a)；

(g)x28x29x30x31sx32gx33x34(序列号103)

(x28表示g或d，

x29表示v或i，

x30表示v、t、a、s、m、i或l，

x31表示f、m、l、i或v，

x32表示s、g、a、t、i、l或h，

x33表示r、m或q，

x34表示g、r、a、d、h或k)；

(h)x35x36rx37x38hmgx39x40a(序列号104)

(x35表示l或v，

x36表示t、i、v或l，

x37表示i、v或l，

x38表示g或s，

x39表示p、a或r，

x40表示t、v或s)。

<13>

如<1>～<12>中任一项所述的重组微生物，其中，所述吡哆胺合成酶由酶编号ec2.6.1.30表示。

<14>

如<1>～<13>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因来源于百脉根中慢生根瘤菌。

<15>

如<1>～<14>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因具有序列号9及序列号60～序列号66中任一者的核苷酸序列，或

具有序列号14的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域或序列号82～序列号88中任一者的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域，或

具有在严格条件下与下述dna杂交、且编码具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述dna为具有与序列号9及序列号60～序列号66中任一者的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna、或具有与序列号14的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域或序列号82～序列号88中任一者的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域互补的核苷酸序列的dna。

<16>

如<1>～<15>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因具有序列号9的核苷酸序列，或具有在严格条件下与下述dna杂交、且编码具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述dna为具有与序列号9的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna。

<17>

如<1>～<16>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因具有编码下述氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列为序列号3及序列号29～序列号35中任一者的氨基酸序列、或与序列号3及序列号29～序列号35的氨基酸序列中的至少一者具有80％以上的序列同一性且具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性的氨基酸序列。

<18>

如<1>～<17>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因具有编码下述氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列为序列号3的氨基酸序列、或与序列号3的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性且具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性的氨基酸序列。

<19>

如<12>～<18>中任一项所述的重组微生物，其中，所述氨基酸再生酶为丙氨酸脱氢酶。

<20>

如<19>所述的重组微生物，其中，所述丙氨酸脱氢酶在从丙酮酸及nh3生成l-丙氨酸的反应时能利用nadph作为辅酶。

<21>

如<19>或<20>所述的重组微生物，其中，所述丙氨酸脱氢酶包含下述的部分氨基酸序列(i)、部分氨基酸序列(j)、部分氨基酸序列(k)及部分氨基酸序列(l)中的至少一者，且具有从丙酮酸及nh3生成l-丙氨酸的活性，

(i)ex41kx42x43ex44rx45x46(序列号105)

(x41表示i、t、s、f、n或v，

x42表示n、m、a、v、l、t或d，

x43表示h、n、l或q，

x44表示y、n或f，

x45表示v或i，

x46表示g或a)；

(j)x47x48x49kvkepx50(序列号106)

(x47表示m或l，

x48表示i、l或v，

x49表示v、l、i或m，

x50表示q、l、v、n或i)；

(k)lx51tylhla(序列号107)

(x51表示f或y)；

(l)x52dx53ax54dqgg(序列号108)

(x52表示v或a，

x53表示v或i，

x54表示i或v)。

<22>

如<19>～<21>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码氨基酸再生酶的基因来源于希瓦氏菌属菌株ac10。

<23>

如<19>～<22>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码氨基酸再生酶的基因具有序列号11及序列号67～序列号74中任一者的核苷酸序列，或

具有序列号15及序列号89～序列号96中任一者的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域，或

具有在严格条件下与下述dna杂交、且编码具有丙氨酸再生酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述dna为具有与序列号11及序列号67～序列号74中任一者的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna、或具有与序列号15及序列号89～序列号96中任一者的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域互补的核苷酸序列的dna。

<24>

如<19>～<23>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码氨基酸再生酶的基因具有序列号11的核苷酸序列，或具有在严格条件下与下述dna杂交、且编码具有丙氨酸再生酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述dna为具有与序列号11的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna。

<25>

如<19>～<24>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码氨基酸再生酶的基因具有编码下述氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列为序列号5及序列号45～序列号52中任一者的氨基酸序列、或与序列号5及序列号45～序列号52的氨基酸序列中的至少一者具有80％以上的序列同一性且具有丙氨酸再生酶活性的氨基酸序列。

<26>

如<19>～<25>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码氨基酸再生酶的基因具有编码下述氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列为序列号5的氨基酸序列、或与序列号5的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性且具有丙氨酸再生酶活性的氨基酸序列。

<27>

如<1>～<11>中任一项所述的重组微生物，其中，所述吡哆胺合成酶由酶编号ec2.6.1.31或ec2.6.1.1表示。

<28>

如<1>～<11>及<27>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因来源于大肠杆菌。

<29>

如<1>～<11>、<27>及<28>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因具有序列号10的核苷酸序列，或具有在严格条件下与下述dna杂交、且编码具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述dna为具有与序列号10的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna。

<30>

如<1>～<11>及<27>～<29>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码吡哆胺合成酶的基因具有编码下述氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列为序列号4的氨基酸序列、或与序列号4的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性且具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性的氨基酸序列。

<31>

如<27>～<30>中任一项所述的重组微生物，其中，所述氨基酸再生酶为谷氨酸脱氢酶。

<32>

如<31>所述的重组微生物，其中，所述编码氨基酸再生酶的基因来源于大肠杆菌。

<33>

如<31>或<32>所述的重组微生物，其中，所述编码氨基酸再生酶的基因具有序列号12的核苷酸序列，或具有在严格条件下与下述dna杂交、且编码具有谷氨酸再生酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述dna为具有与序列号12的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna。

<34>

如<31>～<33>中任一项所述的重组微生物，其中，所述编码氨基酸再生酶的基因具有编码下述氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列为序列号6的氨基酸序列、或与序列号6的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性且具有谷氨酸再生酶活性的氨基酸序列。

<35>

如<1>～<34>中任一项所述的重组微生物，所述重组微生物为重组大肠杆菌。

<36>

吡哆胺或其盐的制造方法，其中，使<1>～<35>中任一项所述的重组微生物或所述重组微生物的培养物、或者所述重组微生物或所述培养物的处理物与吡哆醇或其盐接触从而生产吡哆胺或其盐。

<37>

如<36>所述的制造方法，其中，所述重组微生物或所述重组微生物的培养物、或者所述重组微生物或所述培养物的处理物包含所述吡哆醇脱氢酶、所述吡哆胺合成酶、及所述氨基酸再生酶。

<38>

如<36>或<37>所述的制造方法，其中，所述重组微生物的处理物或所述重组微生物的培养物的处理物是利用包括选自由加热处理、冷却处理、细胞的机械性破坏、超声波处理、冻融处理、干燥处理、加压或减压处理、渗透压处理、细胞的自体消化、表面活性剂处理、酶处理、细胞分离处理、纯化处理及提取处理组成的组中的1种以上的处理而得到的处理物。

本公开文本的第二方式包括以下方案。

<39>

重组微生物，其是导入以下的(1)～(7)中记载的多核苷酸中的至少一者而得到的：

(1)编码包含序列号1的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸；

(2)多核苷酸，其编码包含在序列号1的氨基酸序列中缺失、添加或取代1个～50个氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白质，所述蛋白质具有合成吡哆醇或其盐或者吡哆醛或其盐的活性；

(3)多核苷酸，其编码包含与序列号1的氨基酸序列具有至少60％的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质，所述蛋白质具有合成吡哆醇或其盐或者吡哆醛或其盐的活性；

(4)包含序列号13的核苷酸序列的多核苷酸；

(5)多核苷酸，其包含在序列号13的核苷酸序列中缺失、添加或取代1个～150个核苷酸而得到的核苷酸序列，并且编码具有合成吡哆醇或其盐或者吡哆醛或其盐的活性的蛋白质；

(6)多核苷酸，其包含与序列号13的核苷酸序列具有至少60％的序列同一性的核苷酸序列，并且编码具有合成吡哆醇或其盐或者吡哆醛或其盐的活性的蛋白质；

(7)多核苷酸，其在严格条件下与包含与序列号13的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交，并且编码具有合成吡哆醇或其盐或者吡哆醛或其盐的活性的蛋白质。

<40>

如<39>所述的重组微生物，所述重组微生物为重组细菌。

<41>

如<40>所述的重组微生物，所述重组微生物为重组大肠杆菌。

<42>

如<39>～<41>中任一项所述的重组微生物，其中，所述蛋白质是被分类为ec编号1.1.1.65的酶。

<43>

如<39>～<42>中任一项所述的重组微生物，其中，所述蛋白质为来源于酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶。

<44>

吡哆醛或其盐的制造方法，其包括使<39>～<43>中任一项所述的重组微生物与吡哆醇或其盐接触的工序。

<45>

吡哆醛或其盐的制造方法，其包括使培养<39>～<43>中任一项所述的重组微生物而得到的培养物或培养物的处理物与吡哆醇或其盐接触的工序。

发明效果

根据本公开文本的第一方式，可提供能高生产效率且廉价地从吡哆醇或其盐生产吡哆胺或其盐的重组微生物、及使用该重组微生物高生产效率且廉价地从吡哆醇或其盐生产吡哆胺或其盐的方法。

根据本公开文本的第二方式，可提供具有并表达导入的吡哆醇脱氢酶的重组微生物。

附图说明

[图1-1]示出了序列号1及序列号22～序列号28的序列的比对。

[图1-2]示出了序列号1及序列号22～序列号28的序列的比对。

[图2-1]示出了序列号3及序列号29～序列号35的序列的比对。

[图2-2]示出了序列号3及序列号29～序列号35的序列的比对。

[图3-1]示出了序列号36～序列号44的序列的比对。

[图3-2]示出了序列号36～序列号44的序列的比对。

具体实施方式

本公开文本的第一方式(以下简称为第一方式)提供重组微生物(以下称为第一方式涉及的重组微生物)，所述重组微生物具有编码吡哆醇脱氢酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码氨基酸再生酶的基因，所述吡哆胺合成酶具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性，所述氨基酸再生酶具有使所述吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸再生的酶活性，所述编码吡哆醇脱氢酶的基因、所述编码吡哆胺合成酶的基因及所述编码氨基酸再生酶的基因中的至少两者是从菌体外导入的基因或原本内源于菌体但其表达得到增强的基因。本公开文本的第二方式(以下简称为第二方式)提供导入下述多核苷酸而得到的重组微生物：(1)编码包含序列号1的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸；(2)多核苷酸，其编码包含在序列号1的氨基酸序列中缺失、添加或取代1个～50个氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白质；(3)多核苷酸，其编码包含与序列号1的氨基酸序列具有至少60％的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；(4)包含序列号13的核苷酸序列的多核苷酸；(5)多核苷酸，其包含在序列号13的核苷酸序列中缺失、添加或取代1个～150个核苷酸而得到的核苷酸序列；(6)多核苷酸，其包含与序列号13的核苷酸序列具有至少60％的序列同一性的核苷酸序列；或(7)多核苷酸，其在严格条件下与包含与序列号13的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交。“本公开文本”的记载以包含第一方式和第二方式的含义使用。需要说明的是，本公开文本中，所谓导入，是指以能在菌体内表达的方式导入。另外，用语“重组”以与“基因重组”相同的含义使用。

<第一方式>

迄今为止，无论通过化学方法还是生物学方法，高生产效率且廉价地从吡哆醇或其盐生产吡哆胺或其盐的方法均是未知的。吡哆胺的结构如下所示。

[化学式1]

但是，本申请的发明人发现，令人惊奇的是，通过使用具有如上所述构成的重组微生物或所述重组微生物的培养物、或者所述重组微生物或所述培养物的处理物，能够高生产效率且廉价地从吡哆醇或其盐生产吡哆胺或其盐。其理由虽然不一定明确，但推测其原因在于，通过同时存在上述3种酶，从而从吡哆醇或其盐生成吡哆胺或其盐的过程中的各反应的平衡及该过程中产生的副产物等、消耗的原料等的量由于上述3种酶的协同作用而变得有利于从吡哆醇或其盐生成吡哆胺或其盐。另外，推测由于编码上述3种酶的基因中的至少两者各自被从菌体外导入、或内源于菌体但其表达得到增强，因此能够基于被导入或增强的基因而以高表达量表达酶，进一步提高了吡哆胺或其盐的生产效率。

这样的上述3种酶的协同作用是迄今为止尚未被发现的，由此，能够通过使用吡哆醇或其盐来高效率地制造吡哆胺或其盐，而无需如化学合成方法那样逐一进行多步骤的反应。而且，通过使用第一方式涉及的重组微生物，能够避免作为副产物而大量生成维生素b6族所包括的其他物质。另外，吡哆醇是较之吡哆醛而言能够在工业上廉价地获得的原料，由于可以将吡哆醇作为起始物质，因而能够廉价地制造吡哆胺或其盐。

<吡哆醇脱氢酶>

吡哆醇脱氢酶是也被称为吡哆醛还原酶或者吡哆醇-4-脱氢酶的酶。吡哆醇脱氢酶可以是由酶编号ec1.1.1.65表示的酶，也可以是由其他酶编号表示的酶。吡哆醇脱氢酶是具有催化向吡哆醛加成氢而转化为吡哆醇的反应或者其逆反应的酶活性的酶。需要说明的是，吡哆醛、吡哆醇也可能根据周围的环境而以盐的形式存在，但为了简化表述，本公开文本中关于酶的活性的记载省略提及盐而进行表述。吡哆醇脱氢酶在向吡哆醛加成氢时，作为辅酶而消耗nadh(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或nadph(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，在从吡哆醇脱去氢时，作为辅酶而消耗nad⁺(氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或nadp⁺(氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)。在通常条件下，该酶所催化的反应的平衡大大偏向吡哆醇生成侧，因此，一直认为即使将吡哆醇脱氢酶用于消耗吡哆醇的反应也无法达成高收率。但是，第一方式中，通过如上述那样与特定的其他酶组合，得到了预料之外的效果，即，能够以高生产效率达成以吡哆醇或其盐作为原料的吡哆胺或其盐的生产。

吡哆醇脱氢酶优选来源于例如属于子囊菌(ascomycota)门的微生物，也可以来源于属于酵母(saccharomycotina)亚门或盘菌(pezizomycotina)亚门的微生物。更具体而言，吡哆醇脱氢酶可以是例如来源于酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)的吡哆醇脱氢酶(具有序列号1的氨基酸序列)、来源于真贝酵母(saccharomyceseubayanus)的吡哆醇脱氢酶(具有序列号22的氨基酸序列)、来源于德布尔有孢酵母(torulasporadelbrueckii)的吡哆醇脱氢酶(具有序列号23的氨基酸序列)、来源于拜尔结合酵母(zygosaccharomycesbailii)的吡哆醇脱氢酶(具有序列号24的氨基酸序列)、来源于马克斯克鲁维酵母(kluyveromycesmarxianus)的吡哆醇脱氢酶(具有序列号26的氨基酸序列)、来源于米曲霉(aspergillusoryzae)的吡哆醇脱氢酶(具有序列号25的氨基酸序列)、来源于白色念珠菌(candidaalbicans)的吡哆醇脱氢酶(具有序列号27的氨基酸序列)、来源于解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)的吡哆醇脱氢酶(具有序列号28的氨基酸序列)等。这些微生物中，米曲霉属于盘菌亚门，除此以外属于酵母亚门。

前述ec1.1.1.65的吡哆醇脱氢酶也可以是来源于例如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)等的吡哆醇脱氢酶。需要说明的是，酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶具有序列号1的氨基酸序列，粟酒裂殖酵母的吡哆醇脱氢酶具有序列号2的氨基酸序列。

<吡哆胺合成酶>

第一方式中使用的所谓吡哆胺合成酶，是指具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性的任意的酶。需要说明的是，吡哆醛、吡哆胺也可能根据周围的环境而以盐的形式存在，但为了简化表述，本公开文本中关于酶的活性的记载省略提及盐而进行表述。作为吡哆胺合成酶的例子，可举出例如吡哆胺-丙酮酸转氨酶(例如由酶编号ec2.6.1.30表示的酶)、天冬氨酸转氨酶(例如由ec2.6.1.1表示的酶)、吡哆胺-草酰乙酸转氨酶(例如由ec2.6.1.31表示的酶)及磷酸吡哆胺转氨酶(例如由ec2.6.1.54表示的酶)。

需要说明的是，由ec2.6.1.1表示的天冬氨酸转氨酶是以磷酸吡哆醛作为辅酶的全酶，具有将天冬氨酸的氨基转移至2-氧代戊二酸、生成谷氨酸和草酰乙酸的酶活性。已知该天冬氨酸转氨酶在未与磷酸吡哆醛结合的脱辅基酶(apoenzyme)的状态下，将谷氨酸或天冬氨酸的氨基转移至吡哆醛而合成吡哆胺(journalofbiologicalchemistry，1962年1月，vol.237，no.1，p.127-132)。也即，由ec2.6.1.1表示的天冬氨酸转氨酶的脱辅基酶的形态为ec2.6.1.31的吡哆胺-草酰乙酸转氨酶。因此，天冬氨酸转氨酶在作为辅酶的磷酸吡哆醛不存在或量少时以脱辅基酶的形式存在，合成吡哆胺。

吡哆胺合成酶在从吡哆醛或其盐合成吡哆胺或其盐时，将特定的氨基酸的氨基部分氧化成(＝o)，使该氨基转移而生成吡哆胺或其盐。例如，吡哆胺-丙酮酸转氨酶能利用l-丙氨酸及d-丙氨酸中的任何，吡哆胺-草酰乙酸转氨酶及脱辅基酶的状态的天冬氨酸转氨酶能利用d-天冬氨酸、l-天冬氨酸、d-谷氨酸、及l-谷氨酸中的任何，磷酸吡哆胺转氨酶能利用d-谷氨酸。

前述吡哆胺-丙酮酸转氨酶也可来源于例如属于变形菌门、放线菌门、螺旋体门或厚壁菌门的微生物。吡哆胺-丙酮酸转氨酶可以是来源于例如百脉根中慢生根瘤菌(mesorhizobiumloti)、人苍白杆菌(ochrobactrumanthropi)、假单胞菌(pseudomonas)属(例如假单胞菌属菌株ma-1)等的吡哆胺-丙酮酸转氨酶。需要说明的是，例如，百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶具有序列号3的氨基酸序列。

此外，吡哆胺-丙酮酸转氨酶也可以是例如来源于中慢生根瘤菌属菌株yr577(mesorhizobiumsp.yr577)的吡哆胺-丙酮酸转氨酶(具有序列号29的氨基酸序列)、来源于氧化水杨酸盐假氨基杆菌(pseudaminobactersalicylatoxidans)的吡哆胺-丙酮酸转氨酶(具有序列号30的氨基酸序列)、来源于岸滨芽孢杆菌(bauldialitoralis)的吡哆胺-丙酮酸转氨酶(具有序列号31的氨基酸序列)、来源于抗锑斯科曼氏球菌(skermanellastibiiresistens)的吡哆胺-丙酮酸转氨酶(具有序列号32的氨基酸序列)、来源于根瘤菌属菌株ac44/96(rhizobiumsp.ac44/96)的吡哆胺-丙酮酸转氨酶(具有序列号33的氨基酸序列)、来源于托莱多欧文氏菌(erwiniatoletana)的吡哆胺-丙酮酸转氨酶(具有序列号34的氨基酸序列)、来源于人参雷夫松氏菌(herbiconiuxginsengi)的吡哆胺-丙酮酸转氨酶(具有序列号35的氨基酸序列)。

前述吡哆胺-草酰乙酸转氨酶也可以是来源于例如大肠杆菌(escherichiacoli)、穴兔(oryctolaguscuniculus)、褐家鼠(rattusnorvegicus)等的吡哆胺-草酰乙酸转氨酶。需要说明的是，例如，大肠杆菌的吡哆胺-草酰乙酸转氨酶具有序列号4的氨基酸序列。前述天冬氨酸转氨酶也可以是来源于例如大肠杆菌(escherichiacoli)、绿色木霉(trichodermaviride)等的天冬氨酸转氨酶。另外，前述磷酸吡哆胺转氨酶也可以是来源于例如丁酸梭状芽孢杆菌(clostridiumbutyricum)的磷酸吡哆胺转氨酶。

<氨基酸再生酶>

第一方式中使用的所谓氨基酸再生酶，是指具有使前述吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸再生的酶活性的任意的酶。吡哆胺具有氨基，认为在合成吡哆胺时消耗氨基酸作为氨基的提供源。需要说明的是，氨基酸也可能根据周围的环境而以盐的形式存在，但为了简化表述，本公开文本中关于酶的活性的记载省略提及盐而进行表述。

例如，前述吡哆胺合成酶消耗l-丙氨酸时，可使用能使l-丙氨酸再生的酶作为氨基酸再生酶。另外，前述吡哆胺合成酶消耗l-谷氨酸或l-天冬氨酸时，可使用能使l-谷氨酸或l-天冬氨酸再生的酶作为氨基酸再生酶。

作为这样的氨基酸再生酶的例子，可举出丙氨酸脱氢酶(例如由酶编号1.4.1.1表示的酶)、谷氨酸脱氢酶(例如由酶编号1.4.1.2、或1.4.1.3、或1.4.1.4表示的酶)、通过氨基酸序列的修饰而能利用nadp⁺/nadph作为辅酶的修饰型丙氨酸脱氢酶等。需要说明的是，第一方式中，有时将使用nadh或nadph作为辅酶、从丙酮酸及nh3生成l-丙氨酸的酶活性称为丙氨酸再生酶活性，将使用nadh或nadph作为辅酶、从2-氧代戊二酸及nh3生成l-谷氨酸的酶活性称为谷氨酸再生酶活性。

作为与吡哆胺合成酶的优选组合，可举出作为吡哆胺合成酶的吡哆胺-丙酮酸转氨酶与作为氨基酸再生酶的丙氨酸脱氢酶的组合、及作为吡哆胺合成酶的吡哆胺-草酰乙酸转氨酶或天冬氨酸转氨酶与作为氨基酸再生酶的谷氨酸脱氢酶的组合。氨基酸再生酶优选具有使吡哆胺合成酶(其由从菌体外导入的基因或内源于菌体但其表达得到增强的基因编码)所消耗的氨基酸再生的酶活性。

前述氨基酸再生酶可以是例如来源于希瓦氏菌(shewanella)属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶(具有序列号36的氨基酸序列)，也可以是来源于嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila)的丙氨酸脱氢酶(具有序列号37的氨基酸序列)、来源于根瘤菌属菌株lpu83的丙氨酸脱氢酶(具有序列号38的氨基酸序列)、来源于门多萨假单胞菌(pseudomonasmendocina)的丙氨酸脱氢酶(具有序列号39的氨基酸序列)、来源于大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)的丙氨酸脱氢酶(具有序列号40或序列号41的氨基酸序列)、来源于金色链霉菌(streptomycesaureofaciens)的丙氨酸脱氢酶(具有序列号42的氨基酸序列)、来源于柱孢鱼腥蓝细菌(anabaenacylindrica)的丙氨酸脱氢酶(具有序列号43的氨基酸序列)、来源于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的丙氨酸脱氢酶(具有序列号44的氨基酸序列)等。或者，前述氨基酸再生酶也可以是例如来源于大肠杆菌(escherichiacoli)等的谷氨酸脱氢酶。前述氨基酸再生酶(例如丙氨酸脱氢酶或谷氨酸脱氢酶)优选在使氨基酸再生的反应时能利用nadph(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)作为辅酶。

例如，丙氨酸脱氢酶的情况下，优选为在从丙酮酸及nh3生成l-丙氨酸的反应时能利用nadph作为辅酶的丙氨酸脱氢酶。使用能利用nadph作为辅酶的氨基酸再生酶时，nadph/nadp⁺比由于nadph的消耗而变化，影响吡哆醇脱氢酶所催化的反应的平衡、速度，能够进一步提高吡哆胺或其盐的生产效率。另外，大多数丙氨酸脱氢酶能利用nadh(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作为辅酶，但无法利用nadph。使用能利用nadph作为辅酶的丙氨酸脱氢酶时，如上所述，nadph/nadp⁺比由于nadph的消耗而变化，影响吡哆醇脱氢酶所催化的反应的平衡、速度，能够进一步提高吡哆胺或其盐的生产效率。另外，前述氨基酸再生酶(例如丙氨酸脱氢酶或谷氨酸脱氢酶)也优选在使氨基酸再生的反应时能利用nadh(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)及nadph(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)这两者作为辅酶。作为这样的丙氨酸脱氢酶的例子，可举出具有后述的序列号5及序列号45～序列号52中任一者的氨基酸序列的蛋白质，但不限于此。

前述吡哆醇脱氢酶、吡哆胺合成酶、及氨基酸再生酶均可以是将具有该酶活性的已知的氨基酸序列以未经修饰的方式而含有(例如，由生物中天然存在的基因编码的氨基酸序列，例如由上述例示的微生物等天然的微生物所具有的基因编码的氨基酸序列)的蛋白质，也可以是具有对这样的氨基酸序列在不丧失其酶活性(上述的酶活性)的范围内加以序列修饰而得到的氨基酸序列的蛋白质。作为这样的修饰，可举出氨基酸残基的插入、缺失、取代及向氨基酸序列n末端或c末端或这两者添加追加的氨基酸残基。在存在氨基酸残基的插入、缺失及取代中的一者以上的情况下，插入、缺失及取代各自在存在的情况下可以是例如1～30个氨基酸残基、或者1～20个氨基酸残基、或者1～10个氨基酸残基、或者1～5个氨基酸残基，氨基酸残基的插入、缺失及取代的总数可以是例如1～50个氨基酸残基、或者1～30个氨基酸残基、或者1～10个氨基酸残基、或者1～5个氨基酸残基。另外，作为添加至末端的氨基酸残基的数目，在存在的情况下，每一个末端可以是例如1～50个氨基酸残基、或者1～30个氨基酸残基、或者1～10个氨基酸残基、或者1～5个氨基酸残基。这样的追加的氨基酸残基可形成用于向细胞外分泌等的信号序列。作为信号序列的例子，可举出大肠杆菌的ompa信号序列等。

或者，各酶可以是具有已知的具有该酶活性的氨基酸序列(例如，由生物中天然存在的基因编码的氨基酸序列)自身的蛋白质；或具有与已知的具有该酶活性的氨基酸序列(例如，由生物中天然存在的基因编码的氨基酸序列)具有80％以上、或者85％以上、或者90％以上、或者95％以上的序列同一性的氨基酸序列、并且具有所期望的酶活性(上述的酶活性)的蛋白质。此处，序列同一性可使用例如blast(注册商标，nationallibraryofmedicine)程序基于默认参数进行评价。

例如，吡哆醇脱氢酶可以是例如具有序列号1或序列号2的氨基酸序列的蛋白质，也可以是具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列是对序列号1或序列号2的氨基酸序列进行氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的氨基酸残基中的一者以上而得到的。关于氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的氨基酸残基的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆醇脱氢酶也可以是具有序列号1或序列号2的氨基酸序列的蛋白质；或具有与序列号1的氨基酸序列及序列号2的氨基酸序列中的至少一者具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

使用上述那样的具有与序列号1的氨基酸序列及序列号2的氨基酸序列中的一者以上类似的氨基酸序列的蛋白质时，该蛋白质应具有作为吡哆醇脱氢酶的活性。吡哆醇脱氢酶活性例如可通过下述方法测定：向含有作为底物的吡哆醇及需要的nad⁺或nadp⁺的水溶液中加入作为试验对象的蛋白质，使用高效液相色谱法对生成的吡哆醛进行定量；或者，使生成的吡哆醛与三羟基甲基氨基甲烷这样的胺之间形成席夫碱，通过测定415nm等处的吸光度等，对该席夫碱进行定量。

或者，吡哆醇脱氢酶也可以是具有序列号1、序列号2、及序列号22～序列号28中任一者的氨基酸序列的蛋白质；或具有与序列号1的氨基酸序列、序列号2的氨基酸序列、序列号22的氨基酸序列、序列号23的氨基酸序列、序列号24的氨基酸序列、序列号25的氨基酸序列、序列号26的氨基酸序列、序列号27的氨基酸序列、及序列号28的氨基酸序列中的至少一者具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。该蛋白质也应具有作为吡哆醇脱氢酶的活性。

或者，吡哆醇脱氢酶也可以是包含下述的部分氨基酸序列(a)及部分氨基酸序列(b)中的至少一者、且具有吡哆醇脱氢酶活性的吡哆醇脱氢酶。

(a)nx1x2ex3yg(序列号97)

(其中，x1表示v、c、i、a、m、s、g或l，

x2表示g或a，

x3表示f或l)；

(b)x4x5x6kgx7(序列号98)

(x4表示i、v、f或l，

x5表示s、t、n、c或m，

x6表示c、v、a、i、w或f，

x7表示g、a、s或c)。

可以是具有上述氨基酸序列的蛋白质。

图1-1及图1-2中示出了序列号1及序列号22～序列号28的序列的比对。图1-1及图1-2中，scplr表示酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶，seplr表示真贝酵母的吡哆醇脱氢酶，tdplr表示德布尔有孢酵母的吡哆醇脱氢酶，zbplr表示拜尔结合酵母的吡哆醇脱氢酶，kmplr表示马克斯克鲁维酵母的吡哆醇脱氢酶，aoplr表示米曲霉的吡哆醇脱氢酶，caplr表示白色念珠菌的吡哆醇脱氢酶，ylplr表示解脂耶氏酵母的吡哆醇脱氢酶。部分氨基酸序列(a)相当于与酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶的自n末端起第55位～第61位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基，部分氨基酸序列(b)相当于与酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶的自n末端起第86位～第91位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。本公开文本中序列彼此的比对可使用例如blast(注册商标，nationallibraryofmedicine)程序基于默认参数进行。部分氨基酸序列(a)优选存在于蛋白质的自n末端起第45位～第71位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第46位～第66位的氨基酸残基的区域内。部分氨基酸序列(b)优选存在于蛋白质的自n末端起第76位～第101位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第79位～第96位的氨基酸残基的区域内。

本公开文本中，所谓酶b的氨基酸序列中的“与酶a的自n末端起第x位的氨基酸残基对应的氨基酸残基”，是指将前述酶a的氨基酸序列与酶b的氨基酸序列进行比对时，与酶a的氨基酸序列的自n末端起第x位的氨基酸残基对应的、酶b的氨基酸序列上的氨基酸残基。

由图1-1及图1-2可知，部分氨基酸序列(a)及部分氨基酸序列(b)是在一组吡哆醇脱氢酶之间高度保守的区域。因此认为，包含部分氨基酸序列(a)及部分氨基酸序列(b)中的至少一者的吡哆醇脱氢酶的变异(variation)作为本公开文本中的吡哆醇脱氢酶发挥功能的可能性高。另外，与酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶的自n末端起第60位的酪氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基、及与酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶的自n末端起第89位的赖氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基均被认为是nadph结合残基(journalofbiologicalchemistry1990，274(33)，23185-23190)，是在吡哆醇脱氢酶的功能上重要的残基。认为只要保留了这些残基，则作为本公开文本中的吡哆醇脱氢酶发挥功能的可能性高。

作为包含与酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶的自n末端起第60位的酪氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(a-1)。吡哆醇脱氢酶也可包含部分氨基酸序列(a-1)代替部分氨基酸序列(a)。

(a-1)x1x2nx3x4ex5ygx6x7(序列号109)

x1表示f、l、i、m、y或v，

x2表示f、i、y、l、w或v，

x3表示v、c、i、a、m、s、g或l，

x4表示g或a，

x5表示f或l，

x6表示p、k、r、g、e、t、a、n或s，

x7表示d、n、h、k、e、p、l或i。

部分氨基酸序列(a-1)相当于与酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶的自n末端起第53位～第63位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(a-1)优选存在于蛋白质的自n末端起第43位～第73位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第45位～第68位的氨基酸残基的区域内。

作为包含与酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶的自n末端起第89位的赖氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(b-1)。吡哆醇脱氢酶也可包含部分氨基酸序列(b-1)代替部分氨基酸序列(b)。

(b-1)x1x2x3x4x5x6x7x8kgx9(序列号110)

x1表示r、k、a、s或n，

x2表示k、s、e、q、d或a，

x3表示d、h、n、y、e、k、c、q或r，

x4表示v、t、i、m或l，

x5表示v、i、l、f、m或t，

x6表示i、v、f或l，

x7表示s、t、n、c或m，

x8表示c、v、a、i、w或f，

x9表示g、a、s或c。

部分氨基酸序列(b-1)相当于与酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶的自n末端起第81位～第91位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(a-1)优选存在于蛋白质的自n末端起第71位～第101位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第74位～第96位的氨基酸残基的区域内。

另外，吡哆胺合成酶可以是例如具有序列号3的氨基酸序列的蛋白质，也可以是具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列是对序列号3的氨基酸序列进行氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的氨基酸残基中的一者以上而得到的。关于氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的氨基酸残基的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆胺合成酶也可以是具有序列号3的氨基酸序列的蛋白质；或具有与序列号3的氨基酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

使用上述那样的具有与序列号3的氨基酸序列类似的氨基酸序列的蛋白质时，该蛋白质应具有作为吡哆胺合成酶的活性(从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性，在第一方式中也称为吡哆胺合成酶活性)。从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性例如可通过下述方法测定：向含有作为底物的吡哆醛及需要的氨基酸(具有与序列号3的氨基酸序列类似的氨基酸序列的蛋白质的情况下为例如l-丙氨酸)的水溶液中加入作为试验对象的蛋白质，使用高效液相色谱法等对生成的吡哆胺的量进行定量。

或者，吡哆胺合成酶也可以是具有序列号3及序列号29～序列号35中任一者的氨基酸序列的蛋白质；或具有与序列号3的氨基酸序列、序列号29的氨基酸序列、序列号30的氨基酸序列、序列号31的氨基酸序列、序列号32的氨基酸序列、序列号33的氨基酸序列、序列号34的氨基酸序列、及序列号35的氨基酸序列中的至少一者具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。该蛋白质也应具有作为吡哆胺合成酶的活性。这种情况下，从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性例如可通过下述方法测定：向含有作为底物的吡哆醛及l-丙氨酸的水溶液中加入作为试验对象的蛋白质，使用高效液相色谱法等对生成的吡哆胺的量进行定量。

或者，吡哆胺合成酶也可以是包含下述的部分氨基酸序列(c)、部分氨基酸序列(d)、部分氨基酸序列(e)、部分氨基酸序列(f)、部分氨基酸序列(g)及部分氨基酸序列(h)中的至少一者、且具有从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性的吡哆胺合成酶。这种情况下，从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性例如可通过下述方法测定：向含有作为底物的吡哆醛及l-丙氨酸的水溶液中加入作为试验对象的蛋白质，使用高效液相色谱法等对生成的吡哆胺的量进行定量。

(c)x8x9x10x11x12x13(序列号99)

(x8表示l、m、i或v，

x9表示h或q，

x10表示g、c或a，

x11表示e或d，

x12表示p或a，

x13表示v、i、l或a)；

(d)x14x15tpsgtx16x17(序列号100)

(x14表示h或s，

x15表示d或e，

x16表示i、v或l，

x17表示n或t)；

(e)x18dx19vsx20x21(序列号101)

(x18表示v、i或a，

x19表示a、t或s，

x20表示s、a或g，

x21表示f、w或v)；

(f)x22x23x24kcx25gx26x27p(序列号102)

(x22表示g或s，

x23表示p、s或a，

x24表示n、g、s、a或q，

x25表示l或m，

x26表示a、s、c或g，

x27表示p、t、s或a)；

(g)x28x29x30x31sx32gx33x34(序列号103)

(x28表示g或d，

x29表示v或i，

x30表示v、t、a、s、m、i或l，

x31表示f、m、l、i或v，

x32表示s、g、a、t、i、l或h，

x33表示r、m或q，

x34表示g、r、a、d、h或k)；

(h)x35x36rx37x38hmgx39x40a(序列号104)

(x35表示l或v，

x36表示t、i、v或l，

x37表示i、v或l，

x38表示g或s，

x39表示p、a或r，

x40表示t、v或s)。

图2-1及图2-2中示出了序列号3及序列号29～序列号35的序列的比对。图2-1及图2-2中，mlppat表示百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶，msppat表示中慢生根瘤菌属菌株yr577的吡哆胺-丙酮酸转氨酶，psppat表示氧化水杨酸盐假氨基杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶，blppat表示岸滨芽孢杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶，ssppat表示抗锑斯科曼氏球菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶，rsppat表示根瘤菌属菌株ac44/96的吡哆胺-丙酮酸转氨酶，etppat表示托莱多欧文氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶，hgppat表示人参雷夫松氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶。部分氨基酸序列(c)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第65位～第70位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基，部分氨基酸序列(d)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第144位～第152位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基，部分氨基酸序列(e)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第170位～第176位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基，部分氨基酸序列(f)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第194位～第203位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基，部分氨基酸序列(g)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第329位～第337位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基，部分氨基酸序列(h)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第343位～第353位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(c)优选存在于蛋白质的自n末端起第55位～第80位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第56位～第75位的氨基酸残基的区域内。部分氨基酸序列(d)优选存在于蛋白质的自n末端起第134位～第162位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第139位～第157位的氨基酸残基的区域内。部分氨基酸序列(e)优选存在于蛋白质的自n末端起第160位～第186位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第165位～第181位的氨基酸残基的区域内。部分氨基酸序列(f)优选存在于蛋白质的自n末端起第184位～第213位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第189位～第208位的氨基酸残基的区域内。部分氨基酸序列(g)优选存在于蛋白质的自n末端起第319位～第347位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第324位～第342位的氨基酸残基的区域内。部分氨基酸序列(h)优选存在于蛋白质的自n末端起第333位～第363位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第338位～第358位的氨基酸残基的区域内。

由图2-1及图2-2可知，部分氨基酸序列(c)、部分氨基酸序列(d)、部分氨基酸序列(e)、部分氨基酸序列(f)、部分氨基酸序列(g)及部分氨基酸序列(h)是在一组吡哆胺-丙酮酸转氨酶之间高度保守的区域。因此认为，包含部分氨基酸序列(c)～部分氨基酸序列(h)中的至少一者的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的变异作为本公开文本中的吡哆胺合成酶发挥功能的可能性高。另外，认为与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第197位的赖氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基对于与吡哆醛的结合是重要的，与自n末端起第68位的谷氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基对于催化活性是重要的，与自n末端起第171位的天冬氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基及与自n末端起第146位的苏氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基辅助与吡哆醛的结合，与自n末端起第336位的精氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基及与自n末端起第345位的精氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基对于氨基酸识别是重要的(journalofbiologicalchemistry，2008，vol.283，no.2pp1120-1127)，是在吡哆醇合成酶的功能上重要的残基。认为只要保留了这些残基，则作为本公开文本中的吡哆醇合成酶发挥功能的可能性高。但是，与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第68位的谷氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基除了谷氨酸以外也可以是天冬氨酸。另外，与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第336位的精氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基除了精氨酸以外也可以是甲硫氨酸或谷氨酰胺。

作为包含与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第68位的谷氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(c-1)。吡哆胺合成酶也可包含部分氨基酸序列(c-1)代替部分氨基酸序列(c)。

(c-1)x1x2x3x4x5x6x7x8x9x10x11x12x13x14x15x16x17x18x19(序列号111)

x1表示v、l、i或m，

x2表示i、l或v，

x3表示l、m、i或v，

x4表示h或q，

x5表示g、c或a，

x6表示e或d，

x7表示p或a，

x8表示v、i、a或l，

x9表示l、m、p或v，

x10表示g或a，

x11表示l或i，

x12表示e或q，

x13表示a或g，

x14表示a或v，

x15表示a或l，

x16表示a、l、h或y，

x17表示s、g或a，

x18表示l、f、v或a，

x19表示i、f、v或l。

部分氨基酸序列(c-1)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第63位～第81位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(c-1)优选存在于蛋白质的自n末端起第53位～第91位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第58位～第86位的氨基酸残基的区域内。

作为包含与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第146位的苏氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(d-1)。吡哆胺合成酶也可包含部分氨基酸序列(d-1)代替部分氨基酸序列(d)。

(d-1)x1x2x3x4x5x6x7x8tpsgtx9x10x11x12x13x14x15x16(序列号112)

x1表示v、i、l或m，

x2表示v或i，

x3表示s、a、v、c或f，

x4表示v、i、a、l或t，

x5表示c或v，

x6表示h、n或a，

x7表示h或s，

x8表示d或e，

x9表示i、v或l，

x10表示n或t，

x11表示p或d，

x12表示i、v、l或a，

x13表示d、n、e、a、g、q、v、r或p，

x14表示a、e、q或d，

x15表示i或l，

x16表示g或a。

部分氨基酸序列(d-1)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第138位～第158位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(d-1)优选存在于蛋白质的自n末端起第128位～第168位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第133位～第163位的氨基酸残基的区域内。

作为包含与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第171位的天冬氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(e-1)。吡哆胺合成酶也可包含部分氨基酸序列(e-1)代替部分氨基酸序列(e)。

(e-1)x1x2x3x4x5x6dx7vsx8x9x10x11x12(序列号113)

x1表示g、d或a，

x2表示a、g、k、t、q、r或e，

x3表示y、n、l或f，

x4表示l、f、m或v，

x5表示i、l或y，

x6表示v、a或i，

x7表示a、s或t，

x8表示s、a或g，

x9表示f、w或v，

x10表示g、a或l，

x11表示g或s，

x12表示m、v或l。

部分氨基酸序列(e-1)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第165位～第179位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(e-1)优选存在于蛋白质的自n末端起第155位～第189位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第160位～第184位的氨基酸残基的区域内。

作为包含与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第197位的赖氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(f-1)。吡哆胺合成酶也可包含部分氨基酸序列(f-1)代替部分氨基酸序列(f)。

(f-1)x1x2x3x4x5x6x7x8x9kcx10gx11x12px13x14x15x16x17x18x19s(序列号114)

x1表示a、s、v或i，

x2表示d、g或a，

x3表示i、l、f、v或m，

x4表示y、f、l或c，

x5表示v或i，

x6表示t或a，

x7表示g或s，

x8表示p、s或a，

x9表示n、g、s、q或a，

x10表示l或m，

x11表示a、s、c或g，

x12表示p、t、s或a，

x13表示g、a或s，

x14表示l或v，

x15表示t、s或a，

x16表示m、i、l、v或f，

x17表示m、l、v、a或i，

x18表示g、a、h或s，

x19表示v、i或a。

部分氨基酸序列(f-1)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第188位～第211位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(f-1)优选存在于蛋白质的自n末端起第178位～第221位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第183位～第216位的氨基酸残基的区域内。

作为包含与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第336位的精氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(g-1)。吡哆胺合成酶也可包含部分氨基酸序列(g-1)代替部分氨基酸序列(g)。

(g-1)x1x2x3x4x5sx6gx7x8(序列号115)

x1表示y、f、h或s，

x2表示g或d，

x3表示v或i，

x4表示v、t、a、s、m、i或l，

x5表示f、m、l、i或v，

x6表示s、g、a、t、i、l或h，

x7表示r、m或q，

x8表示g、r、a、d、h或k。

部分氨基酸序列(g-1)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第328位～第337位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(g-1)优选存在于蛋白质的自n末端起第318位～第347位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第323位～第342位的氨基酸残基的区域内。

作为包含与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第345位的精氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(h-1)。吡哆胺合成酶也可包含部分氨基酸序列(h-1)代替部分氨基酸序列(h)。

(h-1)x1x2x3x4x5rx6x7hmgx8x9ax10x11(序列号116)

x1表示l、q、k、a、f、y或w，

x2表示g、n、h或d，

x3表示k、r或n，

x4表示l或v，

x5表示t、i、v或l，

x6表示i、v或l，

x7表示g或s，

x8表示p、a或r，

x9表示t、v或s，

x10表示q、r、e、k、h、y或g，

x11表示p或g。

部分氨基酸序列(h-1)相当于与百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的自n末端起第340位～第355位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(h-1)优选存在于蛋白质的自n末端起第330位～第365位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第335位～第360位的氨基酸残基的区域内。

或者，吡哆胺合成酶可以是例如具有序列号4的氨基酸序列的蛋白质，也可以是具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列是对序列号4的氨基酸序列进行氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的氨基酸残基中的一者以上而得到的。关于氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的氨基酸残基的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆胺合成酶也可以是具有序列号4的氨基酸序列的蛋白质；或具有与序列号4的氨基酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

使用上述那样的具有与序列号4的氨基酸序列类似的氨基酸序列的蛋白质时，该蛋白质应具有作为吡哆胺合成酶的活性(从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性)。从吡哆醛合成吡哆胺的酶活性例如可通过下述方法测定：向含有作为底物的吡哆醛及需要的氨基酸(具有与序列号4的氨基酸序列类似的氨基酸序列的蛋白质的情况下为例如l-谷氨酸或l-天冬氨酸或者它们的盐)的水溶液中加入作为试验对象的蛋白质，使用高效液相色谱法等对生成的吡哆胺的量进行定量。

另外，氨基酸再生酶也可使用例如具有对来源于希瓦氏菌属菌株ac10的氨基酸再生酶的氨基酸序列(序列号36)进行d198a的氨基酸取代而得到的氨基酸序列(序列号5)的蛋白质。该蛋白质为由酶编号1.4.1.1表示的丙氨酸脱氢酶。不限于此，可使用对由酶编号1.4.1.1表示的丙氨酸脱氢酶进行nadp⁺对应的氨基酸取代(aminoacidsubstitutiontousenadp⁺)而得到的丙氨酸脱氢酶。如下述的journalofmolecularcatalysisb：enzymatic30(2004)173-176所记载的，大多数丙氨酸脱氢酶能使用nad⁺(氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作为辅酶，但无法使用nadp⁺(氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)。但是，具有进行上述d198a的氨基酸取代而得到的序列号5的氨基酸序列的蛋白质能使用nad⁺和nadp⁺这两者作为辅酶(参见上述文献)。需要说明的是，具有序列号5的氨基酸序列的蛋白质在逆反应(从丙酮酸及nh3使l-丙氨酸再生)时当然也能使用nadh和nadph这两者。

对于来源于希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶以外的丙氨酸脱氢酶，也可进行同样的氨基酸取代。此处，将丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列中的、与序列号36的氨基酸序列的自n末端起第198位的天冬氨酸残基在比对上对应的残基取代为丙氨酸残基的情况称为nadp⁺对应的氨基酸取代。作为氨基酸再生酶的丙氨酸脱氢酶也可以是具有对来源于嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila)的丙氨酸脱氢酶进行nadp⁺对应的氨基酸取代(这种情况下为d198a)而得到的氨基酸序列(序列号45)的蛋白质、具有对来源于根瘤菌属菌株lpu83(rhizobiumsp.lpu83)的丙氨酸脱氢酶进行nadp⁺对应的氨基酸取代(这种情况下为d198a)而得到的氨基酸序列(序列号46)的蛋白质、具有对来源于门多萨假单胞菌(pseudomonasmendocina)的丙氨酸脱氢酶进行nadp⁺对应的氨基酸取代(这种情况下为d198a)而得到的氨基酸序列(序列号47)的蛋白质、具有对来源于大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)的丙氨酸脱氢酶进行nadp⁺对应的氨基酸取代(这种情况下为d198a)而得到的氨基酸序列(序列号48或序列号49)的蛋白质、具有对来源于金色链霉菌(streptomycesaureofaciens)的丙氨酸脱氢酶进行nadp⁺对应的氨基酸取代(这种情况下为d198a)而得到的氨基酸序列(序列号50)的蛋白质、具有对来源于柱孢鱼腥蓝细菌(anabaenacylindrica)的丙氨酸脱氢酶进行nadp⁺对应的氨基酸取代(这种情况下为d198a)而得到的氨基酸序列(序列号51)的蛋白质、具有对来源于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的丙氨酸脱氢酶进行nadp⁺对应的氨基酸取代(这种情况下为d196a)而得到的氨基酸序列(序列号52)的蛋白质等。

需要说明的是，在可利用nad⁺的反应条件的情况下，可在不进行nadp⁺对应的氨基酸取代的情况下使用上述的氨基酸再生酶，除此以外，通常也可使用由酶编号1.4.1.1表示的丙氨酸脱氢酶。

另外，氨基酸再生酶也可以是例如具有序列号6的氨基酸序列的、来源于大肠杆菌的谷氨酸脱氢酶。谷氨酸脱氢酶具有使用nadh或nadph作为辅酶从2-氧代戊二酸及nh3生成l-谷氨酸的酶活性。

另外，氨基酸再生酶可以是例如具有序列号5的氨基酸序列的蛋白质，也可以是具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列是对序列号5的氨基酸序列进行氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的氨基酸残基中的一者以上而得到的。关于氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的氨基酸残基的程度的例子，如上所述。

或者，氨基酸再生酶也可以是具有序列号5的氨基酸序列的蛋白质；或具有与序列号5的氨基酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

使用上述那样的具有与序列号5的氨基酸序列类似的氨基酸序列的蛋白质时，该蛋白质应具有丙氨酸再生酶活性。另外，优选保持序列号5的氨基酸序列的自n末端起第198位的ala残基或与其在序列比对上对应的ala残基。

或者，氨基酸再生酶也可以是具有序列号5及序列号45～序列号52中任一者的氨基酸序列的蛋白质；或具有与序列号5、序列号45、序列号46、序列号47、序列号48、序列号49、序列号50、序列号51及序列号52的氨基酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

使用上述那样的具有与序列号5、序列号45、序列号46、序列号47、序列号48、序列号49、序列号50、序列号51及序列号52的氨基酸序列类似的氨基酸序列的蛋白质时，该蛋白质应具有丙氨酸再生酶活性。另外，优选保持序列号5的氨基酸序列的自n末端起第198位的ala残基或与其在序列比对上对应的ala残基。

或者，氨基酸再生酶可以是例如具有序列号6的氨基酸序列的蛋白质，也可以是具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列是对序列号6的氨基酸序列进行氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的氨基酸残基中的一者以上而得到的。关于氨基酸残基的取代、缺失、插入、及向氨基酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的氨基酸残基的程度的例子，如上所述。

或者，氨基酸再生酶也可以是具有序列号6的氨基酸序列的蛋白质；或具有与序列号6的氨基酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

使用上述那样的具有与序列号6的氨基酸序列类似的氨基酸序列的蛋白质时，该蛋白质应具有谷氨酸再生酶活性。

氨基酸再生酶活性例如可通过下述方法测定：向含有需要的底物及根据需要使用的nadp或nadph的水溶液中加入作为试验对象的蛋白质，使用高效液相色谱法等对作为反应产物的所期望的氨基酸的量进行定量。例如，丙氨酸再生酶活性例如可通过下述方法测定：向含有丙酮酸、nh3及nadh或nadph的水溶液中加入作为试验对象的蛋白质，使用高效液相色谱法等对作为反应产物的l-丙氨酸的量进行定量。另外，谷氨酸再生酶活性例如可通过下述方法测定：向含有2-氧代戊二酸、nh3及nadh或nadph的水溶液中加入作为试验对象的蛋白质，使用高效液相色谱法等对作为反应产物的l-谷氨酸的量进行定量。

或者，丙氨酸脱氢酶也可以是包含部分氨基酸序列(i)、部分氨基酸序列(j)、部分氨基酸序列(k)及部分氨基酸序列(l)中的至少一者、且具有从丙酮酸及nh3生成l-丙氨酸的活性的酶。对于这样的丙氨酸脱氢酶，也可通过将与希瓦氏菌属菌株ac10的自n末端起第198位的天冬氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基取代为丙氨酸残基，从而使其能使用nad⁺和nadp⁺这两者作为辅酶。

(i)ex41kx42x43ex44rx45x46(序列号105)

(x41表示i、t、s、f、n或v，

x42表示n、m、a、v、l、t或d，

x43表示h、n、l或q，

x44表示y、n或f，

x45表示v、或i，

x46表示g或a)；

(j)x47x48x49kvkepx50(序列号106)

(x47表示m或l，

x48表示i、l或v，

x49表示v、l、i或m，

x50表示q、l、v、n或i)；

(k)lx51tylhla(序列号107)

(x51表示f或y)；

(l)x52dx53ax54dqgg(序列号108)

(x52表示v或a，

x53表示v或i，

x54表示i或v)。

图3-1及图3-2中示出了序列号36～序列号44的序列的比对。图3-1及图3-2中，ssadh表示希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶，ahadh表示嗜水气单胞菌的丙氨酸脱氢酶，rsadh表示根瘤菌属菌株lpu83的丙氨酸脱氢酶，pmadh表示门多萨假单胞菌的丙氨酸脱氢酶，bjadh1表示大豆慢生根瘤菌的丙氨酸脱氢酶中的一种，bjadh2表示大豆慢生根瘤菌的丙氨酸脱氢酶中的另一种，saadh表示金色链霉菌的丙氨酸脱氢酶，acadh表示柱孢鱼腥蓝细菌的丙氨酸脱氢酶，bsadh表示枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶。部分氨基酸序列(i)相当于与希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶的自n末端起第8位～第17位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基，部分氨基酸序列(j)相当于与希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶的自n末端起第70位～第78位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基，部分氨基酸序列(k)相当于与希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶的自n末端起第91位～第98位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基，部分氨基酸序列(l)相当于与希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶的自n末端起第265位～第273位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(i)优选存在于蛋白质的自n末端起第2位～第27位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第3位～第22位的氨基酸残基的区域内。部分氨基酸序列(j)优选存在于蛋白质的自n末端起第60位～第88位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第65位～第83位的氨基酸残基的区域内。部分氨基酸序列(k)优选存在于蛋白质的自n末端起第81位～第108位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第86位～第103位的氨基酸残基的区域内。部分氨基酸序列(l)优选存在于蛋白质的自n末端起第255位～第283位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第260位～第278位的氨基酸残基的区域内。

由图3-1及图3-2可知，部分氨基酸序列(i)、部分氨基酸序列(j)、部分氨基酸序列(k)及部分氨基酸序列(l)是在一组丙氨酸脱氢酶之间高度保守的区域。因此认为，包含部分氨基酸序列(i)～部分氨基酸序列(l)中的至少一者的丙氨酸脱氢酶的变异作为本公开文本中的氨基酸再生酶发挥功能的可能性高。另外，认为与希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶的自n末端起第15位的精氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基及与自n末端起第75位的赖氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基对于与nadh的结合是重要的，与自n末端起第96位的组氨酸残基及自n末端起第270位的天冬氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基在蛋白质的结构形成上是重要的(j.mol.biol.，2008，377，1161-1173、enzymeandmicrobialtechnology，2018，110，61-68)，是在丙氨酸脱氢酶的功能上重要的残基。认为只要保留了这些残基，则作为本公开文本中的氨基酸再生酶发挥功能的可能性高。

作为包含与希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶的自n末端起第15位的精氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(i-1)。丙氨酸脱氢酶也可包含部分氨基酸序列(i-1)代替部分氨基酸序列(i)。

(i-1)gx1px2ex3kx4x5ex6rx7x8x9x10px11x12x13x14x15x16(序列号117)

x1表示v、i、l或c，

x2表示t、k或r，

x3表示i、v、t、s、f或n，

x4表示n、m、a、d、v、l或t，

x5表示h、n、q或l，

x6表示y、n或f，

x7表示v或i，

x8表示g或a，

x9表示m、l或i，

x10表示v、t、i或s，

x11表示s、a、t、q、h、n、l或g，

x12表示s、a、n、g或v，

x13表示v或a，

x14表示r、k、n、q、s、a、l或h，

x15表示e、q、d、v或a，

x16表示l、a、v、f或y。

部分氨基酸序列(i-1)相当于与希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶的自n末端起第4位～第26位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(i-1)优选存在于蛋白质的自n末端起第2位～第36位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第3位～第31位的氨基酸残基的区域内。

作为包含与希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶的自n末端起第75位的赖氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(j-1)。丙氨酸脱氢酶也可包含部分氨基酸序列(j-1)代替部分氨基酸序列(j)。

(j-1)x1x2x3x4kvkepx5x6x7ex8x9x10(序列号118)

x1表示d、e、q或k，

x2表示m或l，

x3表示i、l或v，

x4表示v、l、i或m，

x5表示q、l、i、v或n，

x6表示a、t、s、p、m、k、r、q、v、i或e，

x7表示v、i、e、n、q、t、a、d、h、m、n、v、a、s、i、d、g、w或k，

x8表示r、c、y或w，

x9表示a、e、r、q、k、t、s、m、n、v、p、g、c或h，

x10表示m、l、k、r、q、e、w、f或y。

部分氨基酸序列(j-1)相当于与希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶的自n末端起第69位～第84位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(j-1)优选存在于蛋白质的自n末端起第59位～第94位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第64位～第89位的氨基酸残基的区域内。

作为包含与希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶的自n末端起第96位的组氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(k-1)。丙氨酸脱氢酶也可包含部分氨基酸序列(k-1)代替部分氨基酸序列(k)。

(k-1)x1x2x3x4x5x6lx7tylhlax8x9x10x11x12x13x14x15lx16x17x18x19(序列号119)

x1表示l或f，

x2表示r、k、c、s、h、g或q，

x3表示h、e、p、s、d、r、k、q或a，

x4表示d、g、q、h、e、s、n或m，

x5表示q或h，

x6表示i、l、v、t、c或a，

x7表示f或y，

x8表示p或a，

x9表示d、s、n、h或e，

x10表示l、m、p、r、v、q、e或k，

x11表示p、a、v、q、k、e、d、t、n、r、s或m，

x12表示q、c或l，

x13表示t、a或v，

x14表示e、i、q、a、r、k、t、d或n，

x15表示e、d、l、a、g、h、y或s，

x16表示i、m、v、l、t或k，

x17表示t、k、s、d、h、e、a、n、r、g或q，

x18表示s、g、c、a或k，

x19表示g、k、r、q或d。

部分氨基酸序列(k-1)相当于与希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶的自n末端起第85位～第111位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(k-1)优选存在于蛋白质的自n末端起第75位～第121位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第80位～第116位的氨基酸残基的区域内。

作为包含与希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶的自n末端起第270位的天冬氨酸残基在比对上对应的氨基酸残基的区域的其他表述，可举出以下的部分氨基酸序列(l-1)。丙氨酸脱氢酶也可包含部分氨基酸序列(l-1)代替部分氨基酸序列(l)。

(l-1)x1x2x3x4x5dx6ax7dqggx8x9x10x11(序列号120)

x1表示g、r或s，

x2表示s、a或g，

x3表示a或v，

x4表示i、l、m或v，

x5表示v或a，

x6表示v或i，

x7表示i或v，

x8表示c或i，

x9表示v、i、a、f、s或c，

x10表示e或a，

x11表示t或d。

部分氨基酸序列(l-1)相当于与希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶的自n末端起第261位～第277位的氨基酸残基在比对上对应的氨基酸残基。部分氨基酸序列(l-1)优选存在于蛋白质的自n末端起第251位～第287位的氨基酸残基的区域内，更优选存在于自n末端起第256位～第282位的氨基酸残基的区域内。

<编码吡哆醇脱氢酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码氨基酸再生酶的基因>

编码吡哆醇脱氢酶的基因可以是编码上述的吡哆醇脱氢酶的任意的基因。编码吡哆胺合成酶的基因可以是编码上述的吡哆胺合成酶的任意的基因。编码氨基酸再生酶的基因可以是编码上述的氨基酸再生酶的任意的基因。这些基因所编码的酶不限于已知的具有该酶活性的氨基酸序列(例如，由生物中天然存在的基因编码的氨基酸序列)，也可以是具有与前述已知的氨基酸序列不同的、经修饰的氨基酸序列的酶。

这样的基因可以是作为具有各酶的微生物而在上文中示例的微生物(成为来源的微生物)所天然具有的基因等已知的基因，也可以是对核苷酸序列进行了修饰而成的基因，以使其编码下述修饰氨基酸序列，所述修饰氨基酸序列是在能得到所期望的酶活性的范围内如上述那样对该酶的已知的氨基酸序列进行修饰而得到的。作为这样的修饰氨基酸序列的例子，可举出上述那样的与序列号1～6的氨基酸序列中的任一者类似的氨基酸序列。另外，可在密码子的简并的范围内使编码特定的氨基酸序列的基因的核苷酸序列变化。这种情况下，从基因的表达效率的方面考虑，优选使用在成为重组微生物的宿主的微生物中使用频率高的密码子。

需要说明的是，基因的核苷酸序列也可根据应编码的氨基酸序列、基于密码子表进行设计。设计的核苷酸序列可通过利用基因重组技术修饰已知的核苷酸序列来得到，也可通过化学合成核苷酸序列来得到。

作为修饰核苷酸序列的方法，可举出例如位点特异性突变法(kramer，w.andfrita，h.j.，methodsinenzymology，vol.154，p.350(1987))、重组pcr法(pcrtechnology，stocktonpress(1989)、化学合成特定部分的dna的方法、对基因进行羟基胺处理的方法、对保有基因的菌株进行紫外线照射处理、或用亚硝基胍、亚硝酸等化学药剂进行处理的方法、使用市售的突变导入试剂盒的方法等。

例如，前述编码吡哆醇脱氢酶的基因、前述编码吡哆胺合成酶的基因、及前述编码氨基酸再生酶的基因均可以是未经修饰而具有编码具有该酶活性的多核苷酸的已知的核苷酸序列(例如，上述示例的微生物等生物中天然存在的基因所具有的核苷酸序列)的dna，也可以是具有对这样的核苷酸序列在编码的酶不丧失其酶活性(上述的酶活性)的范围内加以序列修饰而得到的核苷酸序列的dna。作为这样的修饰，可举出核苷酸的插入、缺失、取代及向核苷酸序列5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸。在存在核苷酸的插入、缺失及取代中的一者以上的情况下，插入、缺失及取代各自在存在的情况下可以是例如1～90个核苷酸、或者1～60个核苷酸、或者1～30个氨基酸残基、或者1～20个氨基酸残基、或者1～15个核苷酸、或者1～10个核苷酸、或者1～5个核苷酸，核苷酸的插入、缺失及取代的总数可以是例如1～100个核苷酸、或者1～50个核苷酸、或者1～30个核苷酸、或者1～10个核苷酸、或者1～5个核苷酸。核苷酸的插入、缺失可以局部地存在，但优选就核苷酸序列整体而言不发生大规模的移码。另外，作为添加至末端的核苷酸的数目，在存在的情况下，可以是每一个末端为例如1～150个核苷酸、或者1～100个核苷酸、或者1～50个核苷酸、或者1～30个核苷酸、或者1～10个核苷酸、或者1～5个核苷酸。这样的追加的核苷酸可编码用于向细胞外分泌等的信号序列。

或者，编码各酶的基因也可以是具有编码具有该酶活性的多核苷酸的已知的核苷酸序列(例如，生物中天然存在的基因的核苷酸序列)自身的dna，或具有与前述已知的核苷酸序列具有80％以上、或者85％以上、或者90％以上、或者95％以上的序列同一性的核苷酸序列、且编码具有所期望的酶活性(上述的酶活性)的酶的dna。此处，序列同一性可使用例如blast(注册商标，nationallibraryofmedicine)程序基于默认参数进行评价。

或者，编码各酶的基因也可以是具有编码具有该酶活性的多核苷酸的已知的核苷酸序列(例如生物中天然存在的基因的核苷酸序列)自身的dna，或具有在严格条件下与具有与前述已知的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna杂交的核苷酸序列、且编码具有所期望的酶活性(上述的酶活性)的酶的dna。另外，严格条件下的杂交可如下所述地实施。

杂交中，以包含与作为基准的核苷酸序列互补的核苷酸序列或其部分序列的dna作为探针，与作为对象的dna进行杂交，在严格条件下洗涤后，确认探针是否与作为对象的核酸明显地杂交。探针的长度可使用例如连续的20个核苷酸以上、优选50个核苷酸以上、进一步优选100个核苷酸以上、进一步优选200个核苷酸以上。也优选使用具有与作为基准的核苷酸序列相同的核苷酸长度、在全长范围内互补的dna作为探针。所谓用于杂交的条件，可示例本领域技术人员为了检测特定的杂交信号而通常使用的条件。优选表示严格的杂交条件和严格的洗涤条件。可举出例如在含有6×ssc(柠檬酸钠氯化钠，salinesodiumcitrate)(1×ssc的组成：0.15mnacl、0.015m柠檬酸钠、ph7.0)、0.5％sds、5×登哈特(denhardt)及100mg/ml鲱鱼精子dna的溶液中与探针一同于55℃保温一夜这样的条件等。可示例随后在0.2×ssc中于42℃洗涤过滤器等。作为严格条件，为过滤器的洗涤工序中的0.1×ssc、50℃的条件，作为更严格的条件，可举出相同工序中的0.1×ssc、65℃的条件。

例如，编码吡哆醇脱氢酶的基因可以是例如具有序列号7的核苷酸序列(编码酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶的基因的核苷酸序列)的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号7的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna杂交，且编码具有吡哆醇脱氢酶活性的蛋白质。

或者，编码吡哆醇脱氢酶的基因可以是例如具有序列号7的核苷酸序列的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列是对序列号7的核苷酸序列施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有吡哆醇脱氢酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆醇脱氢酶也可以是具有序列号7的核苷酸序列的dna、或具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列与序列号7的核苷酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有吡哆醇脱氢酶活性的蛋白质。

或者，编码吡哆醇脱氢酶的基因可以是例如具有序列号8的核苷酸序列(编码粟酒裂殖酵母的吡哆醇脱氢酶的基因的核苷酸序列)的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号8的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna杂交，且编码具有吡哆醇脱氢酶活性的蛋白质。

或者，编码吡哆醇脱氢酶的基因可以是例如具有序列号8的核苷酸序列的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列是对序列号8的核苷酸序列施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有吡哆醇脱氢酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆醇脱氢酶也可以是具有序列号8的核苷酸序列的dna、或具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列与序列号8的核苷酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有吡哆醇脱氢酶活性的蛋白质。

或者，编码吡哆醇脱氢酶的基因可以是例如具有序列号7及序列号53～序列号59中任一者的核苷酸序列的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号7及序列号53～序列号59中任一者的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna杂交，且编码具有吡哆醇脱氢酶活性的蛋白质。

或者，编码吡哆醇脱氢酶的基因可以是例如具有序列号7及序列号53～序列号59中任一者的核苷酸序列的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列是对序列号7及序列号53～序列号59中任一者的核苷酸序列施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有吡哆醇脱氢酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆醇脱氢酶可以是具有序列号7及序列号53～序列号59中任一者的核苷酸序列的dna、或具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列与序列号7的核苷酸序列、序列号53的核苷酸序列(编码真贝酵母的吡哆醇脱氢酶的基因的核苷酸序列)、序列号54的核苷酸序列(编码德布尔有孢酵母的吡哆醇脱氢酶的基因的核苷酸序列)、序列号55的核苷酸序列(编码拜尔结合酵母的吡哆醇脱氢酶的基因的核苷酸序列)、序列号57的核苷酸序列(编码马克斯克鲁维酵母的吡哆醇脱氢酶的基因的核苷酸序列)、序列号56的核苷酸序列(编码米曲霉的吡哆醇脱氢酶的基因的核苷酸序列)、序列号58的核苷酸序列(编码白色念珠菌的吡哆醇脱氢酶的基因的核苷酸序列)、及序列号59的核苷酸序列(编码解脂耶氏酵母的吡哆醇脱氢酶的基因的核苷酸序列)中的至少一者具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有吡哆醇脱氢酶活性的蛋白质。

在以大肠杆菌等原核生物作为宿主的重组微生物中进行表达的情况下，也可为了容易表达而优化密码子。例如，可对核苷酸序列进行修饰而使得以高频率使用在成为宿主的原核生物中编码各氨基酸的密码子之中的使用频率最高的密码子作为该氨基酸的密码子。从这样的观点考虑，作为包含编码吡哆醇脱氢酶的基因的dna，可使用例如具有序列号13及序列号75～序列号81中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域的dna，也可使用具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号13及序列号75～序列号81中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域互补的核苷酸序列的dna杂交，且编码具有吡哆醇脱氢酶活性的蛋白质。对于序列号13及序列号75～序列号81的核苷酸序列而言，均是自其5’末端起17个核苷酸成为上游区，起始密码子位于第18位核苷酸～第20位核苷酸。因此，也可使用这些核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域作为编码吡哆醇脱氢酶的基因区。

或者，编码吡哆醇脱氢酶的基因可以是例如具有序列号13及序列号75～序列号81中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列是对序列号13及序列号75～序列号81中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有吡哆醇脱氢酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆醇脱氢酶也可以是具有序列号13及序列号75～序列号81中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域的dna、或具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列与序列号13的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号75的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码真贝酵母的吡哆醇脱氢酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号76的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码德布尔有孢酵母的吡哆醇脱氢酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号77的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码拜尔结合酵母的吡哆醇脱氢酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号79的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码马克斯克鲁维酵母的吡哆醇脱氢酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号78的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码米曲霉的吡哆醇脱氢酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号80的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码白色念珠菌的吡哆醇脱氢酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、及序列号81的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码解脂耶氏酵母的吡哆醇脱氢酶的基因的密码子优化核苷酸序列)中的至少一者具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有吡哆醇脱氢酶活性的蛋白质。

编码吡哆胺合成酶的基因可以是例如具有序列号9的核苷酸序列(编码百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的核苷酸序列)的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号9的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna杂交，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。

或者，编码吡哆胺合成酶的基因可以是例如具有序列号9的核苷酸序列的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列是对序列号9的核苷酸序列施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆胺合成酶也可以是具有序列号9的核苷酸序列的dna、或具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列与序列号9的核苷酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。

或者，编码吡哆胺合成酶的基因可以是例如具有序列号10的核苷酸序列(编码大肠杆菌的吡哆胺-草酰乙酸转氨酶的基因的核苷酸序列)的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号10的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna杂交，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。

或者，编码吡哆胺合成酶的基因可以是例如具有序列号10的核苷酸序列的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列是对序列号10的核苷酸序列施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆胺合成酶也可以是具有序列号10的核苷酸序列的dna、或具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列与序列号10的核苷酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。

或者，编码吡哆胺合成酶的基因可以是例如具有序列号9及序列号60～序列号66中任一者的核苷酸序列的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号9及序列号60～序列号66中任一者的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna杂交，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。

或者，编码吡哆胺合成酶的基因可以是例如具有序列号9及序列号60～序列号66中任一者的核苷酸序列的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列是对序列号9及序列号60～序列号66中任一者的核苷酸序列施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆胺合成酶也可以是具有序列号9及序列号60～序列号66中任一者的核苷酸序列的dna、或具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列与序列号9的核苷酸序列、序列号60(编码中慢生根瘤菌属菌株yr577的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的核苷酸序列)的核苷酸序列、序列号61(编码氧化水杨酸盐假氨基杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的核苷酸序列)的核苷酸序列、序列号62(编码岸滨芽孢杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的核苷酸序列)的核苷酸序列、序列号63(编码抗锑斯科曼氏球菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的核苷酸序列)的核苷酸序列、序列号64(编码根瘤菌属菌株ac44/96的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的核苷酸序列)的核苷酸序列、序列号65(编码托莱多欧文氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的核苷酸序列)的核苷酸序列、及序列号66(编码人参雷夫松氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的核苷酸序列)的核苷酸序列中的至少一者具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。

在以大肠杆菌等原核生物作为宿主的重组微生物中进行表达的情况下，也可为了容易表达而如上所述地优化密码子。从这样的观点考虑，作为包含编码吡哆胺合成酶的基因的dna，可使用例如具有序列号14的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域或序列号82～序列号88中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域的dna，也可使用具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号14的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域或序列号82～序列号88中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域互补的核苷酸序列的dna杂交，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。对于序列号14的核苷酸序列而言，自其5’末端起17个核苷酸成为上游区，起始密码子位于第18位核苷酸～第20位核苷酸。因此，也可使用该核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域作为编码吡哆胺合成酶的基因区。同样地，对于序列号82～序列号88的核苷酸序列而言，均是自其5’末端起17个核苷酸成为上游区，起始密码子位于第18位核苷酸～第20位核苷酸。因此，也可使用这些核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域作为编码吡哆胺合成酶的基因区。

或者，编码吡哆胺合成酶的基因可以是例如具有序列号14的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域或序列号82～序列号88中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列是对序列号14的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域或序列号82～序列号88中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，吡哆胺合成酶也可以是具有序列号14的核苷酸序列中的第18位核苷酸～3’末端为止的区域或序列号82～序列号88中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域的dna、或具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列与序列号14的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码百脉根中慢生根瘤菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号82的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码中慢生根瘤菌属菌株yr577的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号83的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码氧化水杨酸盐假氨基杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号84的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码岸滨芽孢杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号85的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码抗锑斯科曼氏球菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号86的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码根瘤菌属菌株ac44/96的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号87的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码托莱多欧文氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的密码子优化核苷酸序列)、及序列号88的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码人参雷夫松氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因的密码子优化核苷酸序列)中的至少一者具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有吡哆胺合成酶活性的蛋白质。

编码氨基酸再生酶的基因可以是例如具有序列号11的核苷酸序列(编码希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列)的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号11的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna杂交，且编码具有丙氨酸再生酶活性的蛋白质。

或者，编码氨基酸再生酶的基因可以是例如具有序列号11的核苷酸序列的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列是对序列号11的核苷酸序列施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有丙氨酸再生酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，氨基酸再生酶也可以是具有序列号11的核苷酸序列的dna、或具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列与序列号11的核苷酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有丙氨酸再生酶活性的蛋白质。

或者，编码氨基酸再生酶的基因可以是例如具有序列号12的核苷酸序列(编码大肠杆菌的谷氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列)的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号12的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna杂交，且编码具有谷氨酸再生酶活性的蛋白质。

或者，编码氨基酸再生酶的基因可以是例如具有序列号12的核苷酸序列的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列是对序列号12的核苷酸序列施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有谷氨酸再生酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，氨基酸再生酶也可以是具有序列号12的核苷酸序列的dna或具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列与序列号12的核苷酸序列具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有谷氨酸再生酶活性的蛋白质。

编码氨基酸再生酶的基因可以是例如具有序列号11及序列号67～序列号74中任一者的核苷酸序列的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号11及序列号67～序列号74中任一者的核苷酸序列互补的核苷酸序列的dna杂交，且编码具有丙氨酸再生酶活性的蛋白质。

或者，编码氨基酸再生酶的基因可以是例如具有序列号11及序列号67～序列号74中任一者的核苷酸序列的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列是对序列号11及序列号67～序列号74中任一者的核苷酸序列施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有丙氨酸再生酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，氨基酸再生酶也可以是具有序列号11及序列号67～序列号74中任一者的核苷酸序列的dna、或具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列与序列号11的核苷酸序列、序列号67的核苷酸序列(编码嗜水气单胞菌的丙氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列)、序列号68的核苷酸序列(编码根瘤菌属菌株lpu83的丙氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列)、序列号69的核苷酸序列(编码门多萨假单胞菌的丙氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列)、序列号70的核苷酸序列(编码大豆慢生根瘤菌的丙氨酸脱氢酶中的一种的基因的核苷酸序列)、序列号71的核苷酸序列(编码大豆慢生根瘤菌的丙氨酸脱氢酶中的另一种的基因的核苷酸序列)、序列号72的核苷酸序列(编码金色链霉菌的丙氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列)、序列号73的核苷酸序列(编码柱孢鱼腥蓝细菌的丙氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列)、及序列号74的核苷酸序列(编码枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列)中的至少一者具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有丙氨酸再生酶活性的蛋白质。

在以大肠杆菌等原核生物作为宿主的重组微生物中进行表达的情况下，也可为了容易表达而如上所述地优化密码子。从这样的观点考虑，作为包含编码氨基酸再生酶的基因的dna，可使用例如具有序列号15及序列号89～序列号96中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域的dna，也可使用具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列在严格条件下与具有与序列号15及序列号89～序列号96中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域互补的核苷酸序列的dna杂交，且编码具有丙氨酸再生酶活性的蛋白质。对于序列号15及序列号89～序列号96的核苷酸序列而言，均是自其5’末端起17个核苷酸成为上游区，起始密码子位于第18位核苷酸～第20位核苷酸。因此，也可使用这些核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域作为编码丙氨酸再生酶的基因区。

或者，编码氨基酸再生酶的基因可以是例如具有序列号15及序列号89～序列号96中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域的dna，也可以是具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列是对序列号15及序列号89～序列号96中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域施以核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的5’末端或3’末端或这两者添加追加的核苷酸中的一者以上而得到的，且编码具有丙氨酸再生酶活性的蛋白质。关于核苷酸的取代、缺失、插入、及向核苷酸序列的n末端或c末端或这两者添加追加的核苷酸的程度的例子，如上所述。

或者，氨基酸再生酶也可以是具有序列号15及序列号89～序列号96中任一者的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域的dna、或具有下述核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列与序列号15的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码对希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列施以d198a的氨基酸取代而得到的氨基酸序列的密码子优化核苷酸序列)、序列号89的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码对嗜水气单胞菌的丙氨酸脱氢酶施以nadp⁺对应的氨基酸取代而得到的氨基酸序列的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号90的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码对根瘤菌属菌株lpu83的丙氨酸脱氢酶施以nadp⁺对应的氨基酸取代而得到的氨基酸序列的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号91的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码对门多萨假单胞菌的丙氨酸脱氢酶施以nadp⁺对应的氨基酸取代而得到的氨基酸序列的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号92的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码对大豆慢生根瘤菌的丙氨酸脱氢酶中的一种施以nadp⁺对应的氨基酸取代而得到的氨基酸序列的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号93的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码对大豆慢生根瘤菌的丙氨酸脱氢酶中的另一种施以nadp⁺对应的氨基酸取代而得到的氨基酸序列的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号94的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码对金色链霉菌的丙氨酸脱氢酶施以nadp⁺对应的氨基酸取代而得到的氨基酸序列的基因的密码子优化核苷酸序列)、序列号95的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码对柱孢鱼腥蓝细菌的丙氨酸脱氢酶施以nadp⁺对应的氨基酸取代而得到的氨基酸序列的基因的密码子优化核苷酸序列)、及序列号96的核苷酸序列的第18位核苷酸～3’末端为止的区域(编码对枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶施以nadp⁺对应的氨基酸取代而得到的氨基酸序列的基因的密码子优化核苷酸序列)中的至少一者具有例如80％以上、或85％以上、或90％以上、或95％以上的序列同一性，且编码具有丙氨酸再生酶活性的蛋白质。

<具有编码吡哆醇脱氢酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码氨基酸再生酶的基因的重组微生物>

在本公开文本涉及的重组微生物内，编码吡哆醇脱氢酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码具有使该吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸再生的酶活性的氨基酸再生酶的基因各自可以是内源于菌体的基因，可以是内源于菌体但其表达得到增强的基因，也可以是从菌体外导入至菌体内的基因。其中，编码吡哆醇脱氢酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码具有使该吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸再生的酶活性的氨基酸再生酶的基因中的至少两者是从菌体外导入的基因或内源于菌体但其表达得到增强的基因。

换言之，编码吡哆醇脱氢酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码具有使该吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸再生的酶活性的氨基酸再生酶的基因各自可以是内源于重组前的宿主微生物的基因组的基因，可以是内源于宿主微生物的基因组但通过进行启动子的置换等操作而使其表达增强的基因，也可以是使用质粒等载体从菌体外导入至菌体内的基因。第一方式中，在发挥由前述3种酶的组合带来的吡哆胺生产能力的同时，对于编码吡哆醇脱氢酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码具有使该吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸再生的酶活性的氨基酸再生酶的基因中的至少两者，分别从宿主微生物的细胞外导入、或者通过启动子的置换等而使内源于宿主微生物的细胞的该基因的表达增强，从而使该基因的表达升高，进一步增强了由前述3种酶的组合带来的吡哆胺生产能力。此处，对编码吡哆醇脱氢酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码具有使该吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸再生的酶活性的氨基酸再生酶的基因各自进行导入或表达增强时，可以实施从宿主微生物的细胞外的导入、和通过启动子的置换等进行的该基因表达的增强之中的仅一方，也可实施这两方。

若不对编码吡哆醇脱氢酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码具有使该吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸再生的酶活性的氨基酸再生酶的基因中的至少两者实施上述那样的基因表达的升高，则无法得到用于高水平生产吡哆胺或其盐的充分的生产能力。需要说明的是，此处所谓氨基酸再生酶，是指具有使吡哆胺合成酶所消耗的特定的氨基酸种类再生的酶活性的氨基酸再生酶，因此，也可认为吡哆胺合成酶与氨基酸再生酶构成一种配对(pair)。由于对编码吡哆醇脱氢酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码具有使该吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸再生的酶活性的氨基酸再生酶的基因中的至少两者施以上述那样的基因表达的升高，因此，重组微生物的菌体内存在上述的配对，且对上述配对中的至少一方施以基因表达的升高。

关于实施从菌体外的导入及内源于菌体的基因的表达增强中的至少一方的对象，可以是编码吡哆醇脱氢酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码具有使该吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸再生的酶活性的氨基酸再生酶的基因中的仅两者。对编码吡哆醇脱氢酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码具有使前述吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸再生的酶活性的氨基酸再生酶的基因中的两者各自实施从菌体外的导入及内源于菌体的基因的表达增强中的至少一方时，可对编码吡哆醇脱氢酶的基因及编码吡哆胺合成酶的基因各自实施从菌体外的导入及内源于菌体的基因的表达增强中的至少一方，可对编码吡哆醇脱氢酶的基因及编码氨基酸再生酶的基因各自实施从菌体外的导入及内源于菌体的基因的表达增强中的至少一方，也可对编码吡哆胺合成酶的基因及编码氨基酸再生酶的基因各自实施从菌体外的导入及内源于菌体的基因的表达增强中的至少一方。

从提高吡哆胺或其盐的生产的生产效率的观点考虑，优选对编码吡哆醇脱氢酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码氨基酸再生酶的基因中的全部各自实施从菌体外的导入及内源于菌体的基因的表达增强中的至少一方。从提高吡哆胺或其盐的生产效率的观点考虑，优选至少对编码氨基酸再生酶的基因实施从菌体外的导入及内源于菌体的基因的表达增强中的至少一方。需要说明的是，从菌体外导入酶基因并非一定限于用于补充宿主微生物中不存在的酶基因，还可基于使内源于宿主微生物的酶基因的表达也增强的目的而实施。关于宿主微生物中不存在的酶基因，可使用例如kegg、brenda这样的酶数据库容易地进行确认。

在通过用其他启动子置换内源于宿主微生物的基因的启动子来增强该基因的表达的情况下，作为这样的其他启动子(新导入的启动子)，只要能够在宿主微生物中增强基因的表达(与启动子置换前相比能够加以增强)即可，没有特别限定，可以是构成型启动子，也可以是诱导型启动子。启动子的置换可使用常规的基因重组技术进行。需要说明的是，内源于宿主微生物的启动子的序列只要对基于新导入的启动子的表达不造成在实用上成为问题的不良影响，则可部分或完全地残留。

宿主微生物为例如原核生物时，作为可用作新导入的启动子的启动子的例子，可举出来源于大肠杆菌的trp启动子、lac启动子、gapdh启动子、来源于λ噬菌体的pl启动子及pr启动子、来源于枯草芽孢杆菌的葡糖酸合成酶启动子(gnt)、碱性蛋白酶启动子(apr)、中性蛋白酶启动子(npr)、α-淀粉酶启动子(amy)等。另外，也可利用如tac启动子这样独自进行了修饰或设计而得到的启动子序列。

宿主微生物为例如丝状菌时，作为可用作新导入的启动子的启动子的例子，可举出纤维二糖水解酶(cbh)启动子、内切葡聚糖酶(egl)启动子、木聚糖酶iii(xyn3)启动子、u6启动子、α-淀粉酶(amy)启动子等。

宿主微生物为例如酵母时，作为可用作新导入的启动子的启动子的例子，可举出醇脱氢酶(adh1)启动子、磷酸甘油酸激酶(pgk1)启动子、肽链延伸因子(tef)启动子、3-磷酸甘油脱氢酶(gpd)启动子、半乳糖激酶(gal1)启动子、金属硫蛋白(cup1)启动子、抑制性酸性磷酸酶(pho5)启动子、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)启动子等。需要说明的是，上述启动子的序列的来源不限于成为宿主微生物的酵母。也可使用如巨细胞病毒(cmv)启动子等这样的外源的启动子。

从宿主微生物的菌体外导入基因(外源(heterogenous)基因)时，作为其方法，只要能够将基因导入至菌体内(细胞内)、使该基因所编码的酶表达即可，没有特别限定，可举出利用保有酶基因的质粒进行的转化、酶基因向基因组的导入、及它们的组合。在导入基因时，也可将组入了该基因的表达载体导入至菌体内。该表达载体只要组入了前述基因的核苷酸序列即可，没有特别限定，但基于提高转化效率、翻译效率等的观点，更优选为显示如下所示的构成的质粒载体、噬菌体载体。

表达载体只要含有前述基因的核苷酸序列、能将前述宿主微生物转化即可，没有特别限定。根据需要，除了该核苷酸序列以外，也可含有构成其他区域的核苷酸序列(以下也简称为“其他区域”)。作为其他区域，可举出例如通过转化而得到的重组微生物产生所期望的酶所需要的控制区域、自主复制所需要的区域等。

另外，基于容易筛选前述重组微生物这样的观点，可还含有编码能成为筛选标记的筛选基因的核苷酸序列。

作为产生所期望的酶所需要的控制区域，可举出启动子序列(包括控制转录的操纵基因序列)、核糖体结合序列(sd序列)、转录终止序列等。

对于以酵母作为宿主微生物时能够使用的表达载体而言，除了前述基因的核苷酸序列以外，基于前述基因的表达效率的观点，优选还含有启动子序列。作为启动子序列，只要能够在以酵母作为宿主微生物的转化体中表达前述基因即可，可使用任何。作为例子，可举出上文中作为宿主微生物为酵母时能够用作新导入的启动子的启动子的例子而记载的启动子。

另外，前述表达载体可含有分泌信号。由此，在重组微生物产生所期望的酶的情况下，能够将该酶分泌至细胞外。

作为分泌信号，只要能够从成为宿主微生物的酵母分泌所期望的酶即可，没有特别限定。基于分泌效率的观点，优选使用α因子信号序列、蔗糖酶信号序列、酸性磷酸酶信号序列、葡糖淀粉酶信号序列等。

作为具有以上那样的启动子序列、分泌信号的表达载体，具体而言，可举出prs423、prs424、yeplac195等。

对于以丝状菌作为宿主微生物时能够使用的表达载体而言，除了前述基因的核苷酸序列以外，基于前述基因的表达效率的观点，优选还含有启动子序列。作为启动子序列，只要能够在以丝状菌作为宿主微生物的转化体中表达前述基因即可，可使用任何。作为例子，可举出上文中作为宿主微生物为丝状菌时能够用作新导入的启动子的启动子的例子而记载的启动子。

对于丝状菌而言合适的表达载体记载于vandenhondel，c.a.m.j.j.等(1991)in：bennett，j.w.andlasure，l.l.(eds.)moregenemanipulationsinfungi.academicpress，pp.396-428。

另外，也可使用如puc18、pbr322、puc100、psl1180(pharmaciainc.制)、pfb6及曲霉(aspergillus)prax、木霉(trichoderma)ptex等常用的其他表达载体。

对于以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、放线菌等原核生物作为宿主微生物时能够使用的表达载体而言，除了前述基因的核苷酸序列以外，基于前述基因的表达效率的观点，优选还含有启动子序列。另外，除了启动子序列以外，还可含有核糖体结合序列、转录终止序列等。

作为启动子序列的例子，可举出上文中作为宿主微生物为原核生物时能够用作新导入的启动子的启动子的例子而记载的启动子。

作为核糖体结合序列，可举出来源于大肠杆菌或来源于枯草芽孢杆菌的序列，但只要为在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等所期望的宿主微生物内发挥功能的序列即可，没有特别限定。

作为前述核糖体结合序列，可举出例如通过dna合成来制备与16s核糖体rna的3’末端区域互补的序列中的、具有4个以上连续核苷酸的共有序列而得到的序列等。

转录终止序列不一定是必需的，可利用ρ因子非依赖性的转录终止序列，例如脂蛋白终止子、trp操纵子终止子等。

这些控制区域在表达载体上的序列顺序没有特别限定，若考虑转录效率，则期望自5’末端侧上游以启动子序列、核糖体结合序列、编码目标酶的基因、转录终止序列的顺序排列。

作为宿主微生物为原核生物时能够使用的表达载体的具体例子，可举出具有能够在大肠杆菌中自主复制的区域的pbr322、puc18、bluescriptiisk(+)、pkk223-3、psc101、具有能够在枯草芽孢杆菌中自主复制的区域的pub110、ptz4、pc194、ρ11、等。

另外，作为能够在2种以上的宿主微生物内自主复制的表达载体的例子，可利用phv14、trp7、yep7及pbs7等作为表达载体。

需要说明的是，从宿主微生物的菌体外导入基因时，该基因可以是具有宿主微生物的基因组中不存在的核苷酸序列的基因，也可以是具有存在于宿主微生物的基因组中的核苷酸序列的基因。即使宿主微生物的基因组中原本存在相同的基因，通过从菌体外导入基因也能得到更强的基因表达，利用增强的酶活性，能够进一步提高吡哆胺或其盐的生产效率。

从菌体外(细胞外)向菌体内(细胞内)导入基因时所需要的基因组dna的制备、dna的切割及连接、转化、pcr(链式聚合酶反应，polymerasechainreaction)、作为引物使用的寡核苷酸的设计、合成等的方法可使用本领域技术人员所熟知的通常的方法来实施。这些方法记载于sambrook，j.等，“molecularcloningalaboratorymanual，secondedition”，coldspringharborlaboratorypress，(1989)等。可举出例如使用感受态细胞的方法、使用电穿孔的方法。

作为宿主微生物，只要是在存在编码吡哆醇脱氢酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码氨基酸再生酶的基因时能够使它们表达的微生物即可，没有特别限定。作为宿主微生物的例子，可举出酵母、丝状菌、及原核生物。作为酵母的例子，可举出酿酒酵母等酵母(saccharomyces)属的酵母、粟酒裂殖酵母等裂殖酵母(schizosaccharomyces)属的酵母、汉逊酵母(hansenula)属的酵母、及毕赤酵母(pichia)属的酵母。作为丝状菌的例子，可举出里氏木霉或绿色木霉等木霉(trichoderma)属丝状菌、黑曲霉或米曲霉等曲霉(aspergillus)属丝状菌、特异腐质霉(humicolainsolens)等腐质霉(humicola)属丝状菌、及解纤维枝顶孢霉或梭链枝顶孢霉等枝顶孢霉(acremonium)属的丝状菌。另外，作为原核生物的例子，可举出大肠杆菌等埃希氏菌(escherichia)属细菌、希瓦氏菌属菌株ac10等希瓦氏菌(schewanella)属细菌、百脉根中慢生根瘤菌等中慢生根瘤菌(mesorhizobium)属细菌、苜蓿根瘤菌等根瘤菌(rhizobium)属细菌、枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌(bacillus)属枯草芽孢杆菌等枯草芽孢杆菌、变铅青链霉菌(streptomyceslividans)等链霉菌(streptomyces)属放线菌等放线菌。

通过向这些宿主微生物中导入(转化)例如含有所期望的基因的表达载体，从而能够将所期望的基因导入至宿主微生物中。并且，被导入的基因利用例如表达载体中含有的启动子的活性而能够在得到的重组微生物中高水平表达。

作为将表达载体等重组dna移入宿主微生物的细胞的方法，例如，宿主微生物为大肠杆菌时，可使用基于钙处理的感受态细胞法、电穿孔法等。通过培养如此得到的重组微生物，能够以高表达量稳定地生产导入的基因所编码的酶。

另外，编码这些酶的dna可从重组微生物中取出，也可使其移入其他微生物。另外，也可容易地实施下述操作：使用该dna作为模板，利用pcr来扩增编码酶的dna片段，用限制性内切酶等进行处理后，使其与其他载体dna片段结合，重新导入宿主微生物中。

<吡哆胺或其盐的制造方法>

一实施方式中，吡哆胺或其盐的制造方法包括使第一方式涉及的重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物与吡哆醇或其盐接触从而生产吡哆胺或其盐的工序。

作为吡哆醇的盐的例子，可举出吡哆醇与酸形成的盐。作为酸的例子，可举出盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等。吡哆醇的盐为例如吡哆醇盐酸盐。

作为吡哆胺的盐的例子，可举出吡哆胺与酸形成的盐。作为酸的例子，可举出盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、磷酸等。从作为医药使用的观点考虑，吡哆胺的盐优选为向医药用途中的应用进展最大的吡哆胺二盐酸盐。

需要说明的是，将这样的使用重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物制造吡哆胺或其盐的方法也简称为“使用重组微生物的吡哆胺或其盐的制造方法”。

所谓重组微生物的培养物，是指培养重组微生物而得到的、包含菌体和周围的培养基等的产物。也可不使用培养物，例如，也可将预先制备的经干燥或冷冻的重组微生物的细胞直接添加至反应体系。

培养重组微生物时，作为培养基，只要是含有适量的碳源、氮源、无机物及其他营养素的培养基，则可使用合成培养基或天然培养基中的任何。培养可在含有前述培养成分的液体培养基中使用振荡培养、通气搅拌培养、连续培养或分批补料式培养(fed-batchculture)等通常的培养方法进行。

更具体而言，前述重组微生物的培养的条件与原本的宿主微生物的培养条件同样，可使用已知的条件。

作为用于培养基的成分，可使用已知的成分。例如，可适当组合使用肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨、nz胺及马铃薯等有机营养源、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉及有机酸等碳源、硫酸铵、尿素及氯化铵等氮源、磷酸盐、镁、钾及铁等无机营养源、维生素类。

需要说明的是，在利用前述含有筛选标记的表达载体转化得到的重组微生物的培养中，例如，在前述筛选标记具有耐药性时，使用含有与其对应的药剂的培养基，在前述筛选标记为营养缺陷性时，使用不含有与其对应的营养素的培养基。

培养条件根据前述重组微生物、培养基、培养方法的种类适当选择即可，只要是重组微生物生长、能够生产吡哆醇脱氢酶、吡哆胺合成酶、及氨基酸再生酶的条件即可，没有特别限制。

培养基的ph在例如4～8的范围内选择即可，也可以是5～8的范围。

培养温度为例如20℃～45℃，优选为24℃～37℃。对于培养而言，根据微生物的种类，可进行好氧培养，也可进行厌氧培养。

培养时间为例如1天～7天。培养时间可以以目标酶的产生量成为最大的方式进行设定。

另外，所谓前述重组微生物的处理物，是指在不丧失重组微生物所产生的吡哆醇脱氢酶、吡哆胺合成酶、及氨基酸再生酶的活性的范围内对重组微生物进行任意的处理而得到的产物。作为这样的处理，可举出例如包括选自由加热处理、冷却处理、机械性破坏、超声波处理、冻融处理、干燥处理、加压或减压处理、渗透压处理、自体消化、表面活性剂处理及酶处理(例如细胞溶解处理)组成的组中的1种以上的处理等。即使由于这样的处理而导致重组微生物自身死亡，只要该微生物所产生的酶的活性残留，则可用于反应。

所谓前述培养物的处理物，是指在不丧失重组微生物所产生的吡哆醇脱氢酶、吡哆胺合成酶、及氨基酸再生酶的活性的范围内对重组微生物的培养物进行任意的处理而得到的产物。作为这样的处理，可举出包括选自由加热处理、冷却处理、细胞的机械性破坏、超声波处理、冻融处理、干燥处理、加压或减压处理、渗透压处理、细胞的自体消化、表面活性剂处理、酶处理(例如细胞破坏处理)、细胞分离处理、纯化处理及提取处理组成的组中的1种以上的处理。例如，可将重组微生物的细胞从培养基等中分离，将分离后的细胞添加至反应体系。这样的分离可使用过滤或离心分离等手段。或者，可实施用于将吡哆醇脱氢酶、吡哆胺合成酶、及氨基酸再生酶从夹杂物中分离的纯化处理，将包含通过该纯化处理得到的酶的溶液添加至反应体系。或者，可将使用甲醇、乙腈等有机溶剂或有机溶剂与水的混合溶剂对培养物进行提取而得到的提取物添加至反应体系。这样的纯化物或提取物可不包含重组微生物的细胞。即使该微生物的细胞不存在，只要酶的活性残留，则可用于反应。

上述那样的细胞的破碎或者溶解处理可通过按照溶菌酶处理、冻融、超声波破碎等已知的方法破坏重组微生物的细胞膜来进行。

第一方式涉及的重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物与吡哆醇或其盐的接触优选在以下这样的条件下进行。

接触优选在含有作为底物的吡哆醇或其盐的溶液中进行。对于溶液的ph而言，只要可维持吡哆醇脱氢酶、吡哆胺合成酶、及氨基酸再生酶的酶活性则没有特别限定，优选为6.0～9.0，更优选为7.0～8.5。只要可维持吡哆醇脱氢酶、吡哆胺合成酶、及氨基酸再生酶的酶活性，则溶液的温度、溶液的ph也没有特别限定，优选为20～70℃，更优选为25℃～50℃。

作为溶液的介质，可使用水或水性介质、有机溶剂、或者水或水性介质与有机溶剂的混合液。作为水性介质，可使用例如磷酸缓冲液、hepes(n-2-羟基乙基哌嗪-n-乙磺酸)缓冲液、tris[三(羟基甲基)氨基甲烷]盐酸缓冲液等缓冲液。作为有机溶剂，只要是不抑制反应的有机溶剂则可以是任何，可使用例如丙酮、乙酸乙酯、二甲基亚砜、二甲苯、甲醇、乙醇、丁醇等。

第一方式涉及的重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物与吡哆醇或其盐的接触优选在振荡或搅拌下进行。例如，这样的接触可在溶液中进行。例如，可向含有前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物的溶液中以底物溶液的形态或者固体的形态添加吡哆醇或其盐。另外，可向含有前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物的溶液中进一步添加由吡哆胺合成酶消耗的氨基酸。前述氨基酸可被包含在含有吡哆醇或其盐的底物溶液中，与吡哆醇或其盐一同被添加至含有前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物的溶液。另外，前述氨基酸可被包含在与含有吡哆醇或其盐的底物溶液不同的底物溶液中、或者以固体的形态被添加至含有前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物的溶液。

在反应开始时或反应中途，为了将反应液的ph维持为合适的范围，也可添加酸、碱。作为可添加至反应溶液的碱的例子，除了氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物以外，还可举出氢氧化铵、氢氧化钙、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、焦磷酸钾、氨等溶解于水而使液性为碱性的物质。作为可添加至反应溶液的酸的例子，可举出盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、磷酸等。

上述接触可在例如空气气氛下进行，也可在脱氧气氛下进行。脱氧气氛可通过利用非活性气体的置换、减压、沸腾、将它们组合来达成。至少优选利用非活性气体的置换、即使用非活性气体气氛。作为上述非活性气体，可举出例如氮气、氦气、氩气、二氧化碳等，优选为氮气。

优选实施方式中，所使用的重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物包含前述吡哆醇脱氢酶、前述吡哆胺合成酶、及具有使前述吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸再生的酶活性的氨基酸再生酶。因此，通过前述接触，共存于反应溶液中的前述吡哆醇脱氢酶、前述吡哆胺合成酶、及具有使前述吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸再生的酶活性的氨基酸再生酶协同作用，以高生产效率生产吡哆胺或其盐。需要说明的是，前述重组微生物的处理物或前述培养物的处理物并非必须包含存活状态的前述重组微生物，但从能够基于代谢而持续地供给参与反应的物质的观点考虑，优选包含存活状态的前述重组微生物。

对于重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物的添加时期而言，可在反应开始时一并添加，也可在反应中分批地或连续地添加。同样地，成为原料的吡哆胺可在反应开始时一并添加，也可在反应中分批地或连续地添加。

反应溶液可包含利用吡哆胺合成酶生成吡哆胺或其盐时所消耗的氨基酸。该氨基酸可在反应开始时一并添加，也可在反应中分批地或连续地添加。例如，使用吡哆胺-丙酮酸转氨酶作为吡哆胺合成酶时，反应溶液可包含l-丙氨酸或d-丙氨酸。另外，使用吡哆胺-草酰乙酸转氨酶或天冬氨酸转氨酶作为吡哆胺合成酶时，反应溶液可包含l-天冬氨酸、d-天冬氨酸、l-谷氨酸、及d-谷氨酸中的至少一者。需要说明的是，氨基酸也可能根据周围的环境而以盐的形式存在，本说明书中，也将这些包括在内记载为氨基酸，例如，l-谷氨酸的记载不仅包括未形成盐的l-谷氨酸，也包括形成了盐的l-谷氨酸(例如l-谷氨酸钠一水合物)。对于形成了盐的情况下的反离子而言，作为阳离子，可举出钠离子、钾离子等；作为阴离子，可举出氯化物离子、乙酸根离子、硝酸根离子等。

吡哆醇或其盐在反应溶液中的浓度为例如10mm～1m，或者可以为50mm～800mm，或者也可以为70mm～500mm。另外，前述氨基酸(利用吡哆胺合成酶生成吡哆胺或其盐时所消耗的氨基酸)在反应溶液中的浓度为例如0.1mm～2m，或者可以为1mm～1m，或者可以为2mm～500mm，或者可以为2mm～400mm，或者可以为5mm～150mm，或者也可以为10mm～100mm。或者，可以为5mm～800mm、10mm～400mm、或10mm～200mm。

第一方式涉及的吡哆胺或其盐的制造方法中，即使反应溶液中的前述氨基酸的浓度为较低的浓度，也能够以高生产效率制造吡哆胺或其盐。如此即使是较低浓度的氨基酸浓度也能够以高生产效率制造吡哆胺或其盐的情况是令人意外的效果。迄今为止，关于从吡哆醛制造吡哆胺，journalofmolecularcatalysisb：enzymatic、2010、vol.67、p.104-110中使用较高浓度的谷氨酸，国际公开第2007/142222号的实施例中使用较高浓度的丙氨酸及谷氨酸。吡哆胺具有氨基，认为消耗了氨基酸作为其提供源。因此认为，journalofmolecularcatalysisb：enzymatic、2010、vol.67、p.104-110、国际公开第2007/142222号中，考虑氨基酸的消耗而使反应溶液中含有高浓度的氨基酸。第一方式涉及的吡哆胺或其盐的制造方法中，能够得到上述那样的效果的理由虽然不一定明确，但认为在第一方式涉及的重组微生物中，由于存在氨基酸再生酶而能使氨基酸再生，因此，即使不存在高浓度的氨基酸，吡哆胺或其盐的生产也不会停止，可实现高生产效率的生产。结果，根据第一方式涉及的吡哆胺或其盐的制造方法，能够节省因大量添加氨基酸而产生的成本，另外，也能够节省实施用于在反应中监视氨基酸的浓度、维持高氨基酸浓度的操作的劳力。

作为使前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物与吡哆醇或其盐接触的方法，可举出下述方法：将前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物加入含有吡哆醇或其盐的溶液，一边搅拌一边使反应进行的方法；将前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物加入含有吡哆醇或其盐的溶液，一边振荡一边使反应进行的方法；将前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物与吡哆醇或其盐在溶液中充分地混合后，静置使反应进行的方法等。基于反应效率的观点，可优选举出将前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物加入含有吡哆醇或其盐的溶液，一边搅拌一边使反应进行的方法。

作为可用于反应的反应容器，没有特别限定。优选为下述反应容器，所述反应容器能够以将添加的前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物与含有吡哆醇或其盐的溶液充分混合的方式进行搅拌，并且，具有以保持为吡哆醇脱氢酶、吡哆胺合成酶、及氨基酸再生酶的最适温度范围内的方式调节温度的功能。

对于前述重组微生物、前述重组微生物的培养物或者前述重组微生物或前述培养物的处理物与吡哆醇或其盐的接触时间(反应时间)而言，只要可维持吡哆醇脱氢酶、吡哆胺合成酶、及氨基酸再生酶的酶活性则没有特别限定，例如为30分钟～100小时，或者也可以为2小时～50小时。另外，反应可以以批量式进行，可以以半批量式(在反应中途逐次添加底物及前述微生物、前述培养物或前述处理物中的一方或两方)进行，也可以以连续式进行。在半批量式、连续式的情况下，实施供给新的原料及前述重组微生物、前述培养物或前述处理物中的一方或两方等操作，因此，反应时间的上限没有特别限定。

上述的方法中，通过以吡哆醇或其盐作为原料并使用第一方式涉及的重组微生物或前述培养物、或者前述重组微生物或前述培养物的处理物，能够廉价地以高生产效率制造吡哆胺或其盐，而无需像化学合成方法的情况那样经过烦杂的步骤。通过上述的方法得到的吡哆胺或其盐可用于制造例如利用其生理活性的制品。例如，可用于糖尿病、动脉粥样硬化症、慢性肾功能衰竭、阿尔茨海默型认知症等由于age的蓄积导致的疾病、精神分裂症的预防、治疗、健康食品、化妆品这样的用途。

<第二方式>

迄今为止，以吡哆醇作为底物、选择性且高效率地生产吡哆醛的重组微生物是未知的。

以下示出吡哆醇及吡哆醛的结构。需要说明的是，本公开文本中，对于用语吡哆醇及吡哆醛而言，只要未特别明确记载将盐除外的内容，则各自以也包括其盐的含义使用。吡哆醇的盐包括例如吡哆醇盐酸盐、吡哆醇硫酸盐、吡哆醇硝酸盐、吡哆醇磷酸盐。吡哆醛的盐包括例如吡哆醛盐酸盐、吡哆醛硫酸盐、吡哆醛硝酸盐、吡哆醛磷酸盐。

[化学式2]

<第二方式涉及的重组微生物>

[序列号1的氨基酸序列]

序列号1的氨基酸序列为来源于酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶。吡哆醇脱氢酶如下所示，是催化从吡哆醇和nadp⁺生成吡哆醛和nadph和h⁺的反应、及其反方向的反应的氧化还原酶。来源于酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶被分类为以国际生物化学联合会(i.u.b.)酶学委员会报告为基准的酶编号ec1.1.1.65。

[化学式3]

第二方式涉及的重组微生物中，被导入宿主微生物的多核苷酸为以下的(1)～(7)中的任一者所示的多核苷酸中的至少一者。

[(1)编码包含序列号1的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸]

第二方式涉及的重组微生物中，被导入宿主微生物的多核苷酸优选为编码包含序列号1的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。只要是编码包含序列号1的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，则可使用任何密码子。优选使用包含序列号13的核苷酸序列的多核苷酸。

[(2)编码包含在序列号1的氨基酸序列中缺失、添加或取代1个～50个氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸]

第二方式涉及的重组微生物中，被导入宿主微生物的多核苷酸可以是编码包含在序列号1的氨基酸序列中缺失、添加或取代1个～50个氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸。前述蛋白质具有合成吡哆醇或吡哆醛的活性。优选具有被分类为ec1.1.1.65的酶活性。

第二方式中，所谓合成吡哆醇的活性，是指以吡哆醛作为底物合成吡哆醇的能力，所谓合成吡哆醛的活性，是指以吡哆醇作为底物合成吡哆醛的能力。

在序列号1的氨基酸序列中缺失、添加或取代的氨基酸残基数目优选为1～40个或1～30个，进一步优选为1～20个或1～15个，特别优选为1～10个或1～5个。

合成吡哆醇的活性例如可通过下述方法确认：使上述的(1)～(7)中任一者的多核苷酸所编码的蛋白质在磷酸缓冲生理盐水等合适的环境下与吡哆醛及nadph接触，检测吡哆醇的生成。合成吡哆醛的活性可通过下述方法确认：使上述的(1)～(7)中任一者的多核苷酸所编码的蛋白质在磷酸缓冲生理盐水等合适的环境下与吡哆醇及nadp⁺接触，检测吡哆醛的生成。

吡哆醛或吡哆醇的检测可通过已知的方法、例如高效液相色谱法(hplc)进行。

[(3)编码包含与序列号1的氨基酸序列具有60％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸]

第二方式涉及的重组微生物中，被导入宿主微生物的多核苷酸可以是编码与序列号1的氨基酸序列具有至少60％的序列同一性、且具有合成吡哆醇或吡哆醛的活性的蛋白质的多核苷酸。前述蛋白质优选具有被分类为ec1.1.1.65的酶活性。

序列同一性优选为至少70％，进一步优选为至少80％或至少85％以上，特别优选为至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。

[(4)包含序列号13的核苷酸序列的多核苷酸]

第二方式涉及的重组微生物中，被导入宿主微生物的多核苷酸优选为包含序列号13的核苷酸序列的多核苷酸。

包含序列号13的核苷酸序列的多核苷酸编码包含序列号1的氨基酸序列的蛋白质、即酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶。

[(5)包含在序列号13的核苷酸序列中缺失、添加或取代1个～150个核苷酸而得到的核苷酸序列的多核苷酸]

第二方式涉及的重组微生物中，被导入宿主微生物的多核苷酸可以是包含在序列号13的核苷酸序列中缺失、添加或取代1个～150个核苷酸而得到的核苷酸序列的多核苷酸。前述多核苷酸所编码的蛋白质具有合成吡哆醇或吡哆醛的活性，优选具有被分类为ec1.1.1.65的酶活性。

在序列号13的核苷酸序列中缺失、添加或取代的核苷酸数目优选为1～140个、1～120个、1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个或1～50个，进一步优选为1～40个、1～30个、1～20个或1～15个，特别优选为1～10个或1～5个。

[(6)包含与序列号13的核苷酸序列具有60％以上的序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸]

第二方式涉及的重组微生物中，被导入宿主微生物的多核苷酸可以是包含与序列号13的核苷酸序列具有60％以上的序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸。前述多核苷酸所编码的蛋白质具有合成吡哆醇或吡哆醛的活性，前述蛋白质优选具有被分类为ec1.1.1.65的酶活性。

序列同一性优选为至少70％，进一步优选为至少80％或至少85％以上，特别优选为至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。

[(7)在严格条件下与包含与序列号13的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸]

第二方式涉及的重组微生物中，被导入宿主微生物的多核苷酸可以是在严格条件下与包含与序列号13的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸。前述多核苷酸所编码的蛋白质具有合成吡哆醇或吡哆醛的活性，前述蛋白质优选具有被分类为ec1.1.1.65的酶活性。

此处，所谓严格条件，是指形成特异性的杂交体、且不形成非特异性的杂交体的条件。对于严格条件而言，可基于molecularcloning3rd(j.sambrook等，coldspringharborlab.press，2001)的记载，适当设定对应所比较的序列的条件。该文献通过参照并入本说明书中。

典型的严格条件例如表示严格的杂交条件和严格的洗涤条件。例如，可举出在含有6×ssc(1×ssc的组成：0.15mnacl、0.015m柠檬酸钠、ph7.0)、0.5％sds、5×登哈特(denhardt)及100mg/ml鲱鱼精子dna的溶液中与探针一同于55℃保温一夜这样的条件等。可示例随后在0.2×ssc中于42℃洗涤过滤器等。作为严格条件，为过滤器的洗涤工序中的0.1×ssc、50℃的条件，作为更严格的条件，可举出相同工序中的0.1×ssc、65℃的条件。

此处，与序列号1的氨基酸序列的序列同一性如下表示：与作为比较对象的氨基酸序列进行最优比对时，将相同的氨基酸的数目除以序列号1的氨基酸残基数目即345得到的值乘以100并以％表示。

另外，与序列号13的多核苷酸序列的序列同一性如下表示：与作为比较对象的多核苷酸序列进行最优比对时，将相同的核苷酸的数目除以序列号13的多核苷酸的核苷酸数目即1055得到的值乘以100并以％表示。

所谓最优比对，是指在2个序列之间一致的氨基酸或核苷酸的数目成为最大的比对。序列彼此的最优比对可通过已知的方法、例如在blast(注册商标，nationallibraryofmedicine)程序的默认参数中关闭掩码过滤(maskfiltering)而使用来进行。

前述的(2)、(3)、(5)或(6)中的任一者中记载的多核苷酸中，优选在序列号1的氨基酸序列或序列号13的核苷酸序列中缺失、添加或取代的氨基酸残基数目或核苷酸数目少者，另外，优选与序列号1的氨基酸序列或序列号13的核苷酸序列的同一性高者。但是，只要是不影响酶活性、或影响少的变异，则即使缺失、添加或取代的氨基酸残基数目或核苷酸数目多，也能够发挥由第二方式涉及的重组微生物带来的效果。例如，本领域技术人员公知，具有类似性质的氨基酸之间的取代对于蛋白质的功能影响少。作为其他的例子，编码1个氨基酸的密码子存在多种，即使是编码相同氨基酸序列的多核苷酸，也存在由于使用的密码子不同而导致与序列号13的核苷酸序列的区别增多的情况，这是本领域技术人员公知的。

第二方式涉及的重组微生物由于被导入的基因而表达具有以吡哆醇作为底物合成吡哆醛的能力的蛋白质、或具有以吡哆醛作为底物合成吡哆醇的能力的蛋白质，优选表达具有被分类为ec1.1.1.65的酶活性的蛋白质。

第二方式涉及的重组微生物由于被导入的基因而表达具有以吡哆醇作为底物合成吡哆醛的能力的蛋白质、或具有以吡哆醛作为底物合成吡哆醇的能力的蛋白质的情况通过已知的方法进行确认即可。可以使导入基因而得到的重组微生物与作为底物的吡哆醇或吡哆醛接触，检测作为酶反应的产物的吡哆醇或吡哆醛的生成，由此确认前述蛋白质的表达。为在合成吡哆醇或吡哆醛的前后进行其他反应的重组微生物时，可参考该前后的反应、在理论上确认从作为底物的吡哆醇或吡哆醛生成了作为酶反应的产物的吡哆醇或吡哆醛。

<第二方式涉及的重组微生物的制备>

[宿主]

关于在制备第二方式涉及的重组微生物时成为宿主的微生物，可使用通常用于蛋白质的表达的微生物作为宿主。作为宿主微生物的例子，可举出酵母、丝状菌、及原核生物。作为酵母的例子，可举出酿酒酵母等酵母(saccharomyces)属的酵母、粟酒裂殖酵母等裂殖酵母(schizosaccharomyces)属的酵母、汉逊酵母(hansenula)属的酵母、及毕赤酵母(pichia)属的酵母。以酿酒酵母作为宿主时，通过除了内源性的吡哆醇脱氢酶之外还导入前述的(1)～(7)中任一者的多核苷酸，从而能够得到能选择性且高效地生产吡哆醛的微生物。

作为丝状菌的例子，可举出里氏木霉或绿色木霉等木霉(trichoderma)属丝状菌、黑曲霉或米曲霉等曲霉(aspergillus)属丝状菌、特异腐质霉等腐质霉(humicola)属丝状菌、及解纤维枝顶孢霉或梭链枝顶孢霉等枝顶孢霉(acremonium)属的丝状菌。

作为细菌的例子，可示例埃希氏菌属(escherichia)细菌、芽孢杆菌属(bacillus)细菌、棒状杆菌(corynebacterium)属细菌、红球菌(rhodococcus)属等。特别优选使用工业应用实绩丰富的大肠杆菌(escherichiacoli)。作为大肠杆菌以外的宿主，可举出例如短芽孢杆菌(bacillusbrevis)、巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、桥石短芽孢杆菌(brevibacilluschoshinensis)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)及红串红球菌(rhodococcuserythropolis)。

[多核苷酸向宿主的导入]

向宿主中导入多核苷酸的方法是已知的。可通过例如“molecularcloning3rdedition”(j.sambrook等；coldspringharborlaboratorypress，2001)等中记载的分子生物学、生物工程、及基因工程的领域中已知的常规方法，向宿主中导入目标多核苷酸。例如，准备含有前述(1)～(6)中记载的多核苷酸的表达载体，利用该表达载体转化任意的宿主微生物，从而可得到重组微生物。

宿主为细菌的情况下，作为向宿主细菌的细胞中导入表达载体等重组dna的方法，可使用基于钙处理的感受态细胞法、电穿孔法等。通过培养如此得到的重组细菌，能够使大量的吡哆醇脱氢酶稳定地表达。

表达载体只要含有前述的(1)～(7)中的任一者中记载的多核苷酸即可，没有特别限定，可采用基因工程的领域中已知的常规表达载体。表达载体可根据需要而含有前述多核苷酸的表达所需要的控制区域及自主复制所需要的区域等使得能够利用重组微生物产生蛋白质的要素。作为表达所需要的控制区域，可举出启动子序列(包括控制转录的操纵基因序列)、核糖体结合序列(sd序列)、转录终止序列、限制性内切酶切割序列等，或者其他基因。其他基因可以是例如具有以生成的吡哆醇或吡哆醛作为中间体、转化为其他物质的作用的蛋白质。

作为启动子序列的例子，可举出来源于大肠杆菌的作为色氨酸操纵子的trp启动子、作为乳糖操纵子的lac启动子、来源于λ噬菌体的pl启动子及pr启动子、来源于枯草芽孢杆菌的葡糖酸合成酶启动子(gnt)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)启动子、谷氨酸脱羧酶a(gada)启动子、丝氨酸羟甲基转移酶(glya)启动子、碱性蛋白酶启动子(apr)、中性蛋白酶启动子(npr)或α-淀粉酶启动子(amy)等。

另外，也可利用如tac启动子这样独自进行了修饰或设计而得到的启动子序列。

作为核糖体结合序列，可举出来源于大肠杆菌或来源于枯草芽孢杆菌的序列，但只要为在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等所期望的宿主细胞内发挥功能的序列即可，没有特别限定。

作为前述核糖体结合序列，可举出例如通过dna合成来制备与16s核糖体rna的3’末端区域互补的序列中的、具有4个以上连续核苷酸的共有序列而得到的序列等。

转录终止序列不一定是必需的，可利用ρ因子非依赖性的转录终止序列，例如脂蛋白终止子、trp操纵子终止子等。

这些控制区域在表达载体上的序列顺序没有特别限定，若考虑转录效率，则期望自5’末端侧上游以启动子序列、核糖体结合序列、编码目标蛋白质的基因、转录终止序列的顺序排列。

作为此处所谓表达载体的具体例，可利用包含能够在大肠杆菌中自主复制的区域的pbr322、puc18、bluescriptiisk(+)、pkk223-3、psc101、包含能够在枯草芽孢杆菌中自主复制的区域的pub110、ptz4、pc194、ρ11、等作为表达载体。

另外，作为能够在2种以上的宿主内自主复制的表达载体的例子，可利用phv14、trp7、yep7及pbs7等作为表达载体。

<吡哆醛的制造方法>

第二方式涉及的吡哆醛的制造方法包括使第二方式涉及的重组微生物与吡哆醇接触的工序。将上述的表达载体导入所期望的宿主微生物而得到的重组微生物生产前述表达载体所含有的多核苷酸所编码的蛋白质。生产的蛋白质以吡哆醇作为底物生成吡哆醛。

可通过培养第二方式涉及的重组微生物而使其增殖。培养的条件与宿主细胞的培养条件同样，可使用已知的条件。

作为培养基，只要是含有适量的碳源、氮源、无机物及其他营养素的培养基，则可使用合成培养基或天然培养基中的任何。作为用于培养基的成分，可使用已知的成分。例如，可适当组合使用肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨、nz胺及马铃薯等有机营养源、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉及有机酸等碳源、硫酸铵、尿素及氯化铵等氮源、磷酸盐、镁、钾及铁等无机营养源、维生素类。

需要说明的是，在利用前述含有筛选标记的表达载体转化得到的重组微生物的培养中，例如，在前述筛选标记具有耐药性时，使用含有与其对应的药剂的培养基，在前述筛选标记为营养缺陷性时，使用不含有与其对应的营养素的培养基。培养基的ph在ph4～ph8的范围内选择即可。

可在含有前述培养基的液体培养基中，使用振荡培养、通气搅拌培养、连续培养、分批补料式培养等通常的培养方法对重组微生物进行培养。

培养条件根据宿主、培养基、培养方法的种类适当选择即可，只要是重组微生物生长、能够产生第二方式涉及的重组微生物的条件即可，没有特别限制。

培养温度为例如20℃～45℃，优选为24℃～37℃，进行好氧培养。

例如，宿主为大肠杆菌的情况下，作为培养重组大肠杆菌的培养基，通常使用lb(lysogenybroth，溶菌肉汤)培养基、m9培养基等，更优选为使这样的培养基中含有0.1μg/ml以上的fe离子及co离子作为成分而得到的培养基。将重组大肠杆菌接种于培养基后，于适当的培养温度(通常为20℃～50℃)使其生长即可。

为了制造吡哆醛，使培养第二方式涉及的重组微生物而得到的培养物或培养物的处理物与作为底物的吡哆醇接触即可。第二方式涉及的重组微生物所生成的重组蛋白质能够以吡哆醇作为底物生成吡哆醛。

培养重组微生物而得到的培养物只要是由重组微生物的培养得到的即可，没有特别限定。培养物可以是从培养基中回收的菌体，也可以是从培养基中回收的上述(1)～(7)中的任一者中记载的多核苷酸所编码的蛋白质。或者，也可直接使用包含菌体的培养基、或不含菌体但含有重组微生物所生成的重组蛋白质的培养基。

所谓培养物的处理物，是指在不丧失第二方式涉及的重组微生物所产生的重组蛋白质的活性的范围内对重组微生物的培养物进行任意的处理而得到的产物。作为这样的处理，可举出包括选自由加热处理、冷却处理、细胞的机械性破坏、超声波处理、冻融处理、干燥处理、加压或减压处理、渗透压处理、细胞的自体消化、表面活性剂处理、酶处理(例如细胞破坏处理)、细胞分离处理、纯化处理及提取处理组成的组中的1种以上的处理。例如，可将重组微生物的细胞从培养基等中分离，将分离后的细胞添加至反应体系。这样的分离可使用过滤或离心分离等手段。或者，可实施用于将第二方式涉及的重组微生物所产生的重组蛋白质从夹杂物中分离的纯化处理，将包含通过该纯化处理得到的酶的溶液添加至反应体系。或者，可将使用甲醇、乙腈等有机溶剂或有机溶剂与水的混合溶剂对培养物进行提取而得到的提取物添加至反应体系。这样的纯化物或提取物可不包含重组微生物的菌体。即使该菌体不存在，只要第二方式涉及的重组微生物所产生的重组蛋白质的活性残留，则可用于制造吡哆醇或吡哆醛。

上述那样的细胞的破碎或者溶解处理可通过按照溶菌酶处理、冻融、超声波破碎等已知的方法破坏重组微生物的细胞膜来进行。

第二方式中，培养物的处理物可以是将菌体或上述的(1)～(7)中的任一者中记载的多核苷酸所编码的蛋白质固定化于例如珠、膜等固相而得到的处理物。将菌体或蛋白质固定化于固相的方法可使用以往已知的方法。

为了制造吡哆醛，可以在第二方式涉及的重组微生物的培养中使重组微生物与作为底物的吡哆醇接触。为了使重组微生物与吡哆醇接触，例如，向培养基中加入吡哆醇即可。吡哆醇可自培养起初即包含于培养基中，也可在开始培养后、例如微生物进入增殖期后添加。

第二方式涉及的吡哆醛的制造方法中，生成的吡哆醛可从经培养的重组微生物自身、培养基及其他中回收，也可不经回收而直接供于所期望的下一工序。回收吡哆醛的方法可使用在该领域中惯用的方法。另外，下一工序只要是使用吡哆醛的工序即可，没有特别限定。作为下一工序的例子，可举出将吡哆醛磷酸化的工序等。

如上所述，通过第二方式涉及的重组微生物及吡哆醛的制造方法，能够选择性地且以高效率制造吡哆醛。

需要说明的是，本公开文本中，用语“工序”不仅包括独立的工序，即使在无法与其他工序明确区分的情况下，只要能达成该工序所期望的目的，则也包括于本用语中。另外，本说明书中使用“～”示出的数值范围表示包含“～”的前后所记载的数值(分别作为最小值及最大值)在内的范围。

本公开文本中，提及组合物中的各成分的量的情况下，组合物中存在多种属于各成分的物质时，只要没有特别的说明，则表示存在于组合物中的该多种物质的总量。

实施例

通过以下的实施例进一步说明实施方式，但本公开文本不受以下实施例的任何限定。另外，只要没有特别的说明，则表示实施例的组合物中的所含成分量的“％”是以质量为基准。

<分析条件>

吡哆醇盐酸盐、吡哆醛盐酸盐、吡哆胺二盐酸盐通过高效液相色谱法进行定量。它们的分析条件如下。

色谱柱：shodex(注册商标)asahipakodp-506e(昭和电工株式会社)

保护柱：shodex(注册商标)asahipakodp-50g6a(昭和电工株式会社)

柱温：30℃

泵流速：1.0ml/min

洗脱液：50mm磷酸缓冲液(ph2.0)

检测：uv254nm

比较例1.ppat表达株的制备

委托genscript公司合成将来源于百脉根中慢生根瘤菌maff303099的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列按大肠杆菌进行密码子优化而得到的核苷酸序列，得到具有序列号14的核苷酸序列的合成dna。使用该合成dna作为模板，以具有序列号18的核苷酸序列的寡核苷酸及具有序列号19的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，通过pcr扩增包含目的基因的dna片段。用ecori及bamhi处理该扩增后的dna片段，将得到的dna片段与puc18(takarabioinc.制)的利用ecori及bamhi得到的处理物使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号14的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat。此处，ppat为吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的简称。

比较例2.ppat-plr表达株的制备

委托genscript公司合成将来源于酿酒酵母的吡哆醛还原酶基因的核苷酸序列按大肠杆菌进行密码子优化而得到的核苷酸序列，得到具有序列号13的核苷酸序列的合成dna。使用该合成dna作为模板，以具有序列号16的核苷酸序列的寡核苷酸及具有序列号17的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，通过pcr扩增包含目的基因的dna片段。用sali及hindiii处理该扩增后的dna片段，将得到的dna片段与用sali及hindiii处理比较例1中制备的puc18-ppat而得到的处理物使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号13的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-plr。此处，plr为吡哆醛还原酶基因(相当于吡哆醇脱氢酶)的简称。需要说明的是，大肠杆菌dh5α原本不具有吡哆醇脱氢酶的基因。另外，大肠杆菌dh5α原本不具有能使吡哆胺-丙酮酸转氨酶所消耗的l-丙氨酸再生的丙氨酸再生酶的基因。因此，此处得到的ppat-plr表达株虽然从菌体外导入了编码吡哆醇脱氢酶的基因、前述编码吡哆胺合成酶的基因及前述编码氨基酸再生酶的基因中的两者，但不具有编码具有使被导入的吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸再生的酶活性的氨基酸再生酶的基因，因此，相当于比较例。

比较例3ppat-adh表达株的制备

委托genscript公司合成向来源于希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列导入在所编码的氨基酸序列中成为d198a的突变、且按大肠杆菌进行密码子优化而得到的核苷酸序列，得到具有序列号15的核苷酸序列的合成dna。使用该合成dna作为模板，以具有序列号20的核苷酸序列的寡核苷酸及具有序列号21的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，通过pcr扩增包含目的基因的dna片段。用bamhi及sali处理该扩增后的dna片段，将得到的dna片段与用bamhi及sali处理比较例1中制备的puc18-ppat而得到的处理物使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养该转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号15的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-adh。此处，adh为丙氨酸脱氢酶基因的简称。如前文中所述，大肠杆菌dh5α原本不具有吡哆醇脱氢酶的基因，因此，此处得到的ppat-adh表达株相当于比较例。

实施例1ppat-adh-plr表达株的制备

委托genscript公司合成向来源于希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列导入在所编码的氨基酸序列中成为d198a的突变、且按大肠杆菌进行密码子优化而得到的核苷酸序列，得到具有序列号15的核苷酸序列的合成dna。使用该合成dna作为模板，以具有序列号20的核苷酸序列的寡核苷酸及具有序列号21的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，通过pcr扩增包含目的基因的dna片段。用bamhi及sali处理该扩增后的dna片段，将得到的dna片段与用bamhi及sali处理比较例2中制备的puc18-ppat-plr而得到的处理物使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养该转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号15的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-adh-plr。

试验1以吡哆醇作为原料的吡哆胺的制造

将使用puc18、比较例1～3及实施例1中制备的质粒各自转化而得到的dh5α接种于500ml具挡板锥形瓶中的100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基，于30℃振荡培养24小时。将培养液以8000rpm离心分离20分钟，将以沉淀物形式得到的菌体悬浮于1ml水中，配制菌体悬浮液。

用水溶解吡哆醇盐酸盐及l-丙氨酸，配制含有吡哆醇盐酸盐(600mm)及l-丙氨酸(600mm)的底物液。使用25％氨水将底物液的ph调节为ph8.0。将500μl底物液与1000μl菌体悬浮液混合，使其于37℃反应24小时。采集一部分反应液，在上述所示的分析条件下分析。将结果示于表1。需要说明的是，表1所示的所谓收率，表示得到的吡哆胺二盐酸盐的摩尔量相对于底物液中的吡哆醇盐酸盐的摩尔量之比。

[表1]

如表1所示，具备编码吡哆醇脱氢酶的基因、编码吡哆胺合成酶的基因、及编码具有使前述吡哆胺合成酶所消耗的氨基酸再生的酶活性的氨基酸再生酶的基因中的全部、且这些基因中的两者以上被从细胞外导入时，以高生产效率生产了吡哆胺二盐酸盐。

试验2以吡哆醇作为原料的吡哆胺的制造(l-丙氨酸浓度的研究)

将使用实施例1中制备的质粒(puc18-ppat-adh-plr)转化而得到的dh5α接种于500ml具挡板锥形瓶中的100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基，于30℃振荡培养24小时。将培养液以8000rpm离心分离20分钟，将以沉淀物形式得到的菌体悬浮于0.5ml水中，配制菌体悬浮液。

用水溶解吡哆醇盐酸盐，使用25％氨水调节为ph8.0，配制含有吡哆醇盐酸盐(600mm)的底物液(1)。用水溶解l-丙氨酸，使用25％氨水调节为ph8.0，配制含有l-丙氨酸(1,200mm)的底物液(2)。将500μl底物液(1)与规定量的底物液(2)混合。向各混合液中加入500μl菌体悬浮液，进一步添加水，从而配制1,500μl的反应液，使其于37℃反应24小时。使此时的底物液(2)的量以反应液中的l-丙氨酸的浓度分别成为0mm、1mm、5mm、10mm、50mm、200mm、400mm、及800mm的方式变化。采集一部分反应液，在上述所示的分析条件下进行分析，由此对吡哆醇盐酸盐、吡哆醛盐酸盐、吡哆胺二盐酸盐进行定量。结果示于表2。需要说明的是，表2所示所谓收率，表示得到的吡哆胺二盐酸盐的摩尔量相对于底物液中的吡哆醇盐酸盐的摩尔量之比。

[表2]

表2

如表2所示，关于底物混合液中的l-丙氨酸的浓度，以广范围的l-丙氨酸浓度达成了高收率。在l-丙氨酸的浓度为0mm至50mm的浓度范围内，生成了l-丙氨酸浓度以上的吡哆胺。这表明，通过导入丙氨酸脱氢酶，能够使在用于生成吡哆胺的反应中所消耗的l-丙氨酸再生，即使在l-丙氨酸浓度低的情况下，由于l-丙氨酸的再生，吡哆胺生成反应仍然得以进行。

试验3以吡哆醇作为原料的吡哆胺的制造(l-丙氨酸浓度的研究)

将使用实施例1中制备的质粒(puc18-ppat-adh-plr)转化而得到的dh5α接种于500ml具挡板锥形瓶中的100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基，于30℃振荡培养24小时。将培养液以8000rpm离心分离20分钟，将以沉淀物形式得到的菌体悬浮于0.5ml水中，配制菌体悬浮液。

用水溶解吡哆醇盐酸盐，使用25％氨水调节为ph8.0，配制含有吡哆醇盐酸盐(600mm)的底物液。将500μl该底物液、500μl菌体悬浮液、及余量的水混合而配制1,500μl的反应液，以成为饱和溶解度的方式添加l-丙氨酸粉末，使其于37℃反应24小时。采集一部分反应液，在上述所示的分析条件下进行分析，由此对吡哆醇盐酸盐、吡哆醛盐酸盐、吡哆胺二盐酸盐进行定量。结果，反应收率为39％。也即，以更低的浓度使用l-丙氨酸的情况下更能达成高收率。

如此表明，根据第一方式涉及的吡哆胺或其盐的制造方法，即使不大量添加消耗的氨基酸而仅使用较少的量，也能够从吡哆醇或其盐以高生产效率廉价地生产吡哆胺或其盐。

实施例2ppat-adh-seplr表达质粒的制备

委托eurofins公司合成将来源于真贝酵母的吡哆醛还原酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入sali、在3’末端导入hindiii而得到的基因，得到具有序列号75的核苷酸序列的合成dna。用sali/hindiii处理该合成dna，将得到的dna片段与用sali及hindiii处理比较例3中制备的puc18-ppat-adh而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号75的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-adh-seplr。

实施例3ppat-adh-tdplr表达质粒的制备

委托eurofins公司合成将来源于德布尔有孢酵母的吡哆醛还原酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入sali、在3’末端导入hindiii而得到的基因，得到具有序列号76的核苷酸序列的合成dna。用sali/hindiii处理该合成dna，将得到的dna片段与用sali及hindiii处理比较例3中制备的puc18-ppat-adh而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号76的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-adh-tdplr。

实施例4ppat-adh-zbplr表达质粒的制备

委托genscript公司合成将来源于拜尔结合酵母的吡哆醛还原酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入sali、在3’末端导入hindiii而得到的基因，得到具有序列号77的核苷酸序列的合成dna。用sali/hindiii处理该合成dna，将得到的dna片段与用sali及hindiii处理比较例3中制备的puc18-ppat-adh而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号77的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-adh-zbplr。

实施例5ppat-adh-aoplr表达质粒的制备

委托genscript公司合成将来源于米曲霉的吡哆醛还原酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入sali、在3’末端导入hindiii而得到的基因，得到具有序列号78的核苷酸序列的合成dna。用sali/hindiii处理该合成dna，将得到的dna片段与用sali及hindiii处理比较例3中制备的puc18-ppat-adh而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号78的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-adh-aoplr。

实施例6ppat-adh-kmplr表达质粒的制备

委托genscript公司合成将来源于马克斯克鲁维酵母的吡哆醛还原酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入sali、在3’末端导入hindiii而得到的基因，得到具有序列号79的核苷酸序列的合成dna。用sali/hindiii处理该合成dna，将得到的dna片段与用sali及hindiii处理比较例3中制备的puc18-ppat-adh而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号79的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-adh-kmplr。

实施例7ppat-adh-caplr表达质粒的制备

委托eurofins公司合成将来源于白色念珠菌的吡哆醛还原酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入sali、在3’末端导入hindiii而得到的基因，得到具有序列号80的核苷酸序列的合成dna。用sali/hindiii处理该合成dna，将得到的dna片段与用sali及hindiii处理比较例3中制备的puc18-ppat-adh而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号80的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-adh-caplr。

实施例8ppat-adh-ylplr表达质粒的制备

委托genscript公司合成将来源于解脂耶氏酵母的吡哆醛还原酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入sali、在3’末端导入hindiii而得到的基因，得到具有序列号81的核苷酸序列的合成dna。用sali/hindiii处理该合成dna，将得到的dna片段与用sali及hindiii处理比较例3中制备的puc18-ppat-adh而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号81的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-adh-ylplr。

试验4以吡哆醇作为原料的吡哆胺的制造

将使用实施例2～8中制备的质粒各自转化而得到的dh5α接种于500ml具挡板锥形瓶中的100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基，于30℃振荡培养24小时。取40ml培养液，以5000rpm离心分离5分钟，将以沉淀物形式得到的菌体悬浮于0.9ml水中，配制菌体悬浮液。

用水溶解吡哆醇盐酸盐及l-丙氨酸，配制含有吡哆醇盐酸盐(500mm)及l-丙氨酸(500mm)的底物液。使用25％氨水将底物液的ph调节为ph8.0。将400μl底物液、500μl水及100μl菌体悬浮液混合，使其于37℃反应1小时。采集一部分反应液，在上述的分析条件下进行分析。结果示于表3。需要说明的是，表3所示的所谓吡哆胺生产量以将实施例1中制备的ppat-adh-plr表达株所生产的吡哆胺二盐酸盐的摩尔量设为100而得到的相对量表示。

[表3]

如表3所示，通过导入来源于真贝酵母的吡哆醛还原酶基因、来源于德布尔有孢酵母的吡哆醛还原酶基因、来源于拜尔结合酵母的吡哆醛还原酶基因、来源于米曲霉的吡哆醛还原酶基因、来源于马克斯克鲁维酵母的吡哆醛还原酶基因、来源于白色念珠菌的吡哆醛还原酶基因、或来源于解脂耶氏酵母的吡哆醛还原酶基因作为编码吡哆醇脱氢酶的基因来代替实施例1中使用的来源于酿酒酵母的吡哆醛还原酶基因，也能够从吡哆醇盐酸盐生产吡哆胺二盐酸盐。

比较例4adh-plr表达质粒的制备

使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)将用sali及hindiii处理比较例2中制备的puc18-ppat-plr并回收而得到的吡哆醛还原酶基因(plr)片段、用bamhi及sali处理比较例3中制备的puc-ppat-adh并回收而得到的丙氨酸脱氢酶基因(adh)片段、和puc18的利用bamhi及hindiii得到的处理物进行连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒，将得到的质粒命名为puc18-adh-plr。

实施例9msppat-adh-plr表达质粒的制备

委托eurofins公司合成将来源于中慢生根瘤菌属菌株yr577的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入ecori、在3’末端导入bamhi而得到的基因，得到具有序列号82的核苷酸序列的合成dna。用ecori/bamhi处理该合成dna，将得到的dna片段与用ecori及bamhi处理比较例4中制备的puc18-adh-plr而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号82的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-msppat-adh-plr。

实施例10psppat-adh-plr表达质粒的制备

委托eurofins公司合成将来源于氧化水杨酸盐假氨基杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入ecori、在3’末端导入bamhi而得到的基因，得到具有序列号83的核苷酸序列的合成dna。用ecori/bamhi处理该合成dna，将得到的dna片段与用ecori及bamhi处理比较例4中制备的puc18-adh-plr而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号83的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-psppat-adh-plr。

实施例11blppat-adh-plr表达质粒的制备

委托eurofins公司合成将来源于岸滨芽孢杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入ecori、在3’末端导入bamhi而得到的基因，得到具有序列号84的核苷酸序列的合成dna。用ecori/bamhi处理该合成dna，将得到的dna片段与用ecori及bamhi处理比较例4中制备的puc18-adh-plr而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号84的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-blppat-adh-plr。

实施例12ssppat-adh-plr表达质粒的制备

委托eurofins公司合成将来源于抗锑斯科曼氏球菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入ecori、在3’末端导入bamhi而得到的基因，得到具有序列号85的核苷酸序列的合成dna。用ecori/bamhi处理该合成dna，将得到的dna片段与用ecori及bamhi处理比较例4中制备的puc18-adh-plr而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号85的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ssppat-adh-plr。

实施例13rsppat-adh-plr表达质粒的制备

委托eurofins公司合成将来源于根瘤菌属菌株ac44/96的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入ecori、在3’末端导入bamhi而得到的基因，得到具有序列号86的核苷酸序列的合成dna。用ecori/bamhi处理该合成dna，将得到的dna片段与用ecori及bamhi处理比较例4中制备的puc18-adh-plr而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号86的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-rsppat-adh-plr。

实施例14etppat-adh-plr表达质粒的制备

委托eurofins公司合成将来源于托莱多欧文氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入ecori、在3’末端导入bamhi而得到的基因，得到具有序列号87的核苷酸序列的合成dna。用ecori/bamhi处理该合成dna，将得到的dna片段与用ecori及bamhi处理比较例4中制备的puc18-adh-plr而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号87的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-etppat-adh-plr。

实施例15hgppat-adh-plr表达质粒的制备

委托eurofins公司合成将来源于人参雷夫松氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因的核苷酸序列以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、在5’末端导入ecori、在3’末端导入bamhi而得到的基因，得到具有序列号88的核苷酸序列的合成dna。用ecori/bamhi处理该合成dna，将得到的dna片段与用ecori及bamhi处理比较例4中制备的puc18-adh-plr而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号88的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-hgppat-adh-plr。

试验5以吡哆醇作为原料的吡哆胺的制造

将使用实施例9～15中制备的质粒各自转化而得到的dh5α接种于500ml具挡板锥形瓶中的100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基，于30℃振荡培养24小时。取40ml培养液，以5000rpm离心分离5分钟，将以沉淀物形式得到的菌体悬浮于0.9ml水中，配制菌体悬浮液。

用水溶解吡哆醇盐酸盐及l-丙氨酸，配制含有吡哆醇盐酸盐(500mm)及l-丙氨酸(500mm)的底物液。使用25％氨水将底物液的ph调节为ph8.0。将400μl底物液、500μl水与100μl菌体悬浮液混合，使其于37℃反应1小时。采集一部分反应液，在上述的分析条件下进行分析。结果示于表4。需要说明的是，表4所示的所谓吡哆胺生产量以将实施例1中制备的ppat-adh-plr表达株所生产的吡哆胺二盐酸盐的摩尔量设为100而得到的相对量表示。

[表4]

如表4所示，通过导入来源于中慢生根瘤菌属菌株yr577的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因、来源于氧化水杨酸盐假氨基杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因、来源于岸滨芽孢杆菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因、来源于抗锑斯科曼氏球菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因、来源于根瘤菌属菌株ac44/96的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因、来源于托莱多欧文氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因、或来源于人参雷夫松氏菌的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因作为编码吡哆胺-丙酮酸转氨酶的基因来代替实施例1中使用的来源于百脉根中慢生根瘤菌maff303099的吡哆胺-丙酮酸转氨酶基因，也能够从吡哆醇盐酸盐生产吡哆胺二盐酸盐。

实施例16ppat-ahadh-plr表达质粒的制备

委托eurofins公司合成向来源于嗜水气单胞菌的丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列导入在所编码的氨基酸序列中成为d198a的突变、且以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、进而在5’末端导入bamhi、在3’末端导入sali而得到的核苷酸序列，得到具有序列号89的核苷酸序列的合成dna。用bamhi/sali处理该合成dna，将得到的dna片段与用bamhi及sali处理比较例2中制备的puc18-ppat-plr而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号89的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-ahadh-plr。

实施例17ppat-rsadh-plr表达质粒的制备

委托eurofins公司合成向来源于根瘤菌属菌株lpu83的丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列导入在所编码的氨基酸序列中成为d198a的突变、且以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、进而在5’末端导入bamhi、在3’末端导入sali而得到的核苷酸序列，得到具有序列号90的核苷酸序列的合成dna。用bamhi/sali处理该合成dna，将得到的dna片段与用bamhi及sali处理比较例2中制备的puc18-ppat-plr而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号90的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-rsadh-plr。

实施例18ppat-pmadh-plr表达质粒的制备

委托eurofins公司合成向来源于门多萨假单胞菌的丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列导入在所编码的氨基酸序列中成为d198a的突变、且以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、进而在5’末端导入bamhi、在3’末端导入sali而得到的核苷酸序列，得到具有序列号91的核苷酸序列的合成dna。用bamhi/sali处理该合成dna，将得到的dna片段与用bamhi及sali处理比较例2中制备的puc18-ppat-plr而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号91的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-pmadh-plr。

实施例19ppat-bjadh1-plr表达质粒及ppat-bjadh2-plr表达质粒的制备

来源于大豆慢生根瘤菌的丙氨酸脱氢酶基因在大豆慢生根瘤菌中存在2种。委托eurofins公司合成向这2种来源于大豆慢生根瘤菌的丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列导入在所编码的氨基酸序列中成为d198a的突变、且以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、进而在5’末端导入bamhi、在3’末端导入sali而得到的核苷酸序列，得到具有序列号92及序列号93的核苷酸序列的2种合成dna。用bamhi/sali处理包含序列号92的该合成dna，将得到的dna片段与用bamhi及sali处理比较例2中制备的puc18-ppat-plr而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号92的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-bjadh1-plr。

同样地用bamhi/sali处理包含序列号93的该合成dna，将得到的dna片段与用bamhi及sali处理比较例2中制备的puc18-ppat-plr而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号93的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-bjadh2-plr。

实施例20ppat-saadh-plr表达质粒的制备

委托eurofins公司合成向来源于金色链霉菌的丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列导入在所编码的氨基酸序列中成为d198a的突变、且以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、进而在5’末端导入bamhi、在3’末端导入sali而得到的核苷酸序列，得到具有序列号94的核苷酸序列的合成dna。用bamhi/sali处理该合成dna，将得到的dna片段与用bamhi及sali处理比较例2中制备的puc18-ppat-plr而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号94的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-saadh-plr。

实施例21ppat-acadh-plr表达质粒的制备

委托eurofins公司合成向来源于柱孢鱼腥蓝细菌的丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列导入在所编码的氨基酸序列中成为d198a的突变、且以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、进而在5’末端导入bamhi、在3’末端导入sali而得到的核苷酸序列，得到具有序列号95的核苷酸序列的合成dna。用bamhi/sali处理该合成dna，将得到的dna片段与用bamhi及sali处理比较例2中制备的puc18-ppat-plr而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号95的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-acadh-plr。

实施例22ppat-bsadh-plr表达质粒的制备

委托eurofins公司合成向来源于枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列导入在所编码的氨基酸序列中成为d196a的突变、且以按大肠杆菌进行密码子优化的方式设计、进而在5’末端导入bamhi、在3’末端导入sali而得到的核苷酸序列，得到具有序列号96的核苷酸序列的合成dna。用bamhi/sali处理该合成dna，将得到的dna片段与用bamhi及sali处理比较例2中制备的puc18-ppat-plr而得到的dna片段使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接。使用该连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。从如此得到的转化体中提取质粒。

按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号96的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-ppat-bsadh-plr。

试验6以吡哆醇作为原料的吡哆胺的制造

将使用实施例16～22中制备的质粒各自转化而得到的dh5α接种于500ml具挡板锥形瓶中的100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基，于30℃振荡培养24小时。取40ml培养液，以5000rpm离心分离5分钟，将以沉淀物形式得到的菌体悬浮于0.9ml水中，配制菌体悬浮液。

用水溶解吡哆醇盐酸盐及l-丙氨酸，配制含有吡哆醇盐酸盐(500mm)及l-丙氨酸(500mm)的底物液。使用25％氨水将底物液的ph调节为ph8.0。将400μl底物液、500μl水与100μl菌体悬浮液混合，使其于37℃反应1小时。采集一部分反应液，在上述的分析条件下进行分析。结果示于表5。需要说明的是，表5所示的所谓吡哆胺生产量以将实施例1中制备的ppat-adh-plr表达株所生产的吡哆胺二盐酸盐的摩尔量设为100而得到的相对量表示。

[表5]

如表5所示，通过导入来源于嗜水气单胞菌的丙氨酸脱氢酶基因、来源于根瘤菌属菌株lpu83的丙氨酸脱氢酶基因、来源于门多萨假单胞菌的丙氨酸脱氢酶基因、来源于大豆慢生根瘤菌的丙氨酸脱氢酶基因(大豆慢生根瘤菌的2种丙氨酸脱氢酶基因中的各基因)、来源于金色链霉菌的丙氨酸脱氢酶基因、来源于柱孢鱼腥蓝细菌的丙氨酸脱氢酶基因、或来源于枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶基因作为编码丙氨酸脱氢酶的基因来代替实施例1中使用的来源于希瓦氏菌属菌株ac10的丙氨酸脱氢酶基因，也能够从吡哆醇盐酸盐生产吡哆胺二盐酸盐。

实施例23表达包含序列号1的氨基酸序列的蛋白质的大肠杆菌的制备

委托genscript公司制备将编码酿酒酵母的吡哆醇脱氢酶基因(序列号1)的核苷酸序列按大肠杆菌进行密码子优化而得到的dna(序列号13)。以得到的合成dna作为模板，使用序列号18及序列号17所示的寡核苷酸作为引物，通过聚合酶链式反应(pcr)法扩增目的基因。用ecori/hindiii处理扩增后的dna，将得到的dna片段与puc18(takarabioinc.制)的ecori/hindiii处理物使用ligationhigh(东洋纺株式会社制)连接，得到表达载体。利用含有表达载体的连接产物转化大肠杆菌dh5α(东洋纺株式会社制)。在lb琼脂培养基中培养转化体，从氨苄青霉素耐性株中筛选具有目标质粒的菌株。

为了确认筛选得到的菌株含有包含序列号13的核苷酸序列的多核苷酸，从得到的转化体中提取质粒。按照通常的确定核苷酸序列的方法，确认了被导入质粒的dna片段的核苷酸序列为序列号13的核苷酸序列。将得到的质粒命名为puc18-plr。

实施例24利用吡哆醇脱氢酶表达株以吡哆醇作为底物合成吡哆醛

将使用puc18-plr转化而得到的大肠杆菌dh5α株接种于2mllb液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)，在试管中于37℃振荡培养24小时。将1ml的培养液以13000rpm离心分离5分钟，将得到的菌体悬浮于1ml水中，得到菌体悬浮液。

将吡哆醇盐酸盐及β-nadp⁺以分别成为100mm的方式溶解于水，得到底物液。将100μl的底物液、100μl的1mtris-hcl(ph8.0)、及700μl的水混合，向其中添加100μl的菌体悬浮液，开始反应。于37℃反应1小时。

在反应结束后，采集一部分反应液，通过高效液相色谱法(hplc)进行分析。

经过1小时的反应得到37.2μg的吡哆醛，每od660的吡哆醛生成速率为2.1×10^-3μmol/min/od660。

·hplc的分析条件

色谱柱：shodexasahipakodp-506e(商品名，昭和电工株式会社制)

保护柱：shodexasahipakodp-50g6a(商品名，昭和电工株式会社制)

柱温：30℃

泵流速：1.0ml/分钟

洗脱液：50mm磷酸缓冲液(ph2.0)

检测：uv294nm。

比较例5利用酵母以吡哆醇作为底物合成吡哆醛

将酿酒酵母x-2180-1a(atcc26486)接种于2ml的ypd液体培养基，在试管中于30℃振荡培养24小时。将1ml的培养液以13000rpm离心分离5分钟，将得到的菌体悬浮于1ml水中，得到菌体悬浮液。

作为底物液，配制与实施例24的底物液相同的组成的底物液，在与实施例24的反应条件相同的条件下进行反应。

在反应结束后，采集一部分反应液，通过高效液相色谱法(hplc)，在与实施例24同样的条件下进行分析。

经过1小时的反应未能得到吡哆醛。

实施例25利用吡哆醇脱氢酶表达株以吡哆醛作为底物合成吡哆醇

与实施例24同样地配制菌体悬浮液，将吡哆醛盐酸盐及β-nadph以分别成为100mm的方式溶解于水，得到底物液。将100μl的底物液、100μl的1mtris-hcl(ph8.0)、及700μl的水混合，向其中添加100μl的菌体悬浮液，开始反应。

在反应结束后，采集一部分反应液，通过高效液相色谱法(hplc)，在与实施例24同样的条件下进行分析。

经过1小时的反应得到815.5μg的吡哆醇，每od660的吡哆醇生成速率为4.5×10^-2μmol/min/od660。

比较例6利用酵母以吡哆醛作为底物合成吡哆醇(每od660的吡哆醇生成速率)

与比较例5同样地配制菌体悬浮液，作为底物液，配制与实施例25的底物液相同的组成的底物液，在与实施例25的反应条件相同的条件下进行反应。

在反应结束后，采集一部分反应液，通过高效液相色谱法(hplc)，在与实施例24同样的条件下进行分析。

经过1小时的反应得到10.9μg的吡哆醇，每od660的吡哆醇生成速率为1.7×10^-4μmol/min/od660。

实施例24～25及比较例5～6的结果示于表6。实施例24及25中，较之比较例5及6而言，吡哆醛或吡哆醇的收量及生成速率显著优异。特别地，在吡哆醛合成方面，实施例24中能够生产吡哆醛(其在比较例5中为检测灵敏度以下)。

[表6]

实施例26利用吡哆醇脱氢酶表达株以吡哆醇作为底物合成吡哆醛

将使用puc18-plr转化而得到的大肠杆菌dh5α株接种于100mllb液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)，在具挡板锥形瓶中于37℃振荡培养24小时。将40ml的培养液以8000rpm离心分离20分钟，将得到的菌体悬浮于400μl水中，得到菌体悬浮液。作为底物液，配制与实施例24的底物液相同的组成的底物液，在与实施例24的反应条件相同的条件下进行反应。于37℃反应30分钟。

在反应结束后，采集一部分反应液，通过高效液相色谱法(hplc)，在与实施例24同样的条件下进行分析。

经过30分钟的反应得到262.4μg的吡哆醛，每单位干燥菌体重量的吡哆醛生成速率为5.8μmol/min/g干燥细胞。

比较例7利用干酵母以吡哆醇作为底物合成吡哆醛

将supercameliadryyeast(商品名，nisshinfoodsinc.)以成为100mg/ml的方式悬浮于水中，得到菌体悬浮液。

作为底物液，配制与实施例24的底物液相同的组成的底物液，在与实施例24的反应条件相同的条件下进行反应。

在反应结束后，采集一部分反应液，通过高效液相色谱法(hplc)，在与实施例24同样的条件下进行分析。

经过30分钟的反应得到34.1μg的吡哆醛，每单位干燥菌体重量的吡哆醛生成速率为0.9μmol/min/g干燥细胞。

实施例27利用吡哆醇脱氢酶表达株以吡哆醛作为底物合成吡哆醇

与实施例26同样地配制菌体悬浮液，作为底物液，配制与实施例25的底物液相同的组成的底物液，在与实施例25的反应条件相同的条件下进行反应。

在反应结束后，采集一部分反应液，通过高效液相色谱法(hplc)，在与实施例24同样的条件下进行分析。

经过30分钟的反应得到1457.4μg的吡哆醇，每单位干燥菌体重量的吡哆醇生成速率为33.5μmol/min/g干燥细胞。

比较例8利用干酵母以吡哆醛作为底物合成吡哆醇(每单位干燥菌体重量的吡哆醇生成速率)

与比较例7同样地配制菌体悬浮液，作为底物液，配制与实施例25的底物液相同的组成的底物液，在与实施例25的反应条件相同的条件下进行反应。

在反应结束后，采集一部分反应液，通过高效液相色谱法(hplc)，在与实施例24同样的条件下进行分析。

经过30分钟的反应得到325.3μg的吡哆醇，每单位干燥菌体重量的吡哆醇生成速率为13.9μmol/min/g干燥细胞。

实施例26～27及比较例7～8的结果示于表7。实施例26及27中，较之比较例7及8而言，吡哆醛或吡哆醇的收量及生成速率显著优异。实施例26中，得到比较例7的约8倍的吡哆醛收量，每1g干燥菌体重量的生成速率为约6.5倍。实施例27中得到比较例8的约4.5倍的吡哆醇收量，每1g干燥菌体重量的生成速率为约2.5倍。

[表7]

将于2017年5月12日提出申请的日本专利申请2017-095571号及于2017年5月12日提出申请的日本专利申请2017-095573号的公开内容整体通过参照并入本说明书中。

本说明书中记载的全部文献、专利申请及技术标准通过参照被并入本说明书中，各文献、专利申请及技术标准通过参照被并入的程度与具体且分别地记载的情况的程度相同。