专利名称：一种1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法
技术领域：
本发明涉及一种具有生理活性的环状氨基酸的合成方法，具体地说是1，4，5， 6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法。
背景技术：
1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸(L-ectoine， CAS号96702-03-3)是1985 年在极端嗜盐外硫红螺菌属的光合紫细菌Halochloris中发现的一种新型环状氨基酸，是 耐盐微生物为维持渗透压平衡而在细胞内产生的一种相容性溶质。随着核磁共振和高效液 相等分析技术的应用，越来越多的实验证明1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸不仅是中 度嗜盐菌和耐盐菌主要的相容性溶质，在产生放线菌素的微小链霉菌等非嗜盐菌中也可以 检测到。 国内外研究表明，1，4，5，6_四氢-2_甲基-4-嘧啶羧酸能够通过体内合成和体 外转运两种途径在细胞内积累，达到调节细胞内外渗透压平衡的作用，在苜蓿中华根瘤菌 等菌株中还可以诱导菌株产生一系列与渗透压有关基因的表达，使其合成自身的相容性溶 质，如海藻糖、谷氨酸盐等。 在逆境下，1 ， 4， 5， 6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸对酶、DNA、细胞膜等生物大分子具 有很强的保护作用，对一些性质不稳定的酶，如乳酸脱氢酶等保护作用显著，与常见的相容 性溶质脯氨酸、甜菜碱相比具有显著的优越性。1，4，5，6-四氢_2-甲基-4-嘧啶羧酸可以 发挥与分子伴侣相似的作用，能够识别错误折叠的蛋白质，并且抑制蛋白质聚合体的形成。
1，4，5，6_四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的渗透压调节作用及稳定蛋白质水合层，保 护酶、DNA等生物大分子和细胞膜结构的作用，可以帮助细胞及动植物抵抗冷冻、干旱、高 温、高盐、辐射等各种逆境。在农业、化妆品、食品、医药等领域具有广泛的应用前景。专利 文献W00219978公开了 1，4，5，6-四氢-2-甲基_4_嘧啶羧酸在口腔护理中的应用，专利文 献DE102004016129公开了其在皮肤护理及疾病预防中的应用。专利文献W02006097263公 开了其在治疗及预防胃肠道疾病中的应用。 1，4，5，6_四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸广泛的用途及商业价值受到了广泛关注，其 合成方法也得到了不断的改进。其最初的批量生产技术被称为"细菌挤奶"技术，在盐浓度 高的环境下诱导细菌合成并蓄积1 ， 4， 5， 6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，再在低渗透压环境 下使其释放1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，通过循环性的升高和降低盐浓度，获得 目标产物，产率为3. 3g/L/h。该方法工艺复杂，产品收获不具备连续性，较高的盐浓度则对 反应容器具有腐蚀性，并且菌株合成的产物均在细胞内，其合成受到1 ， 4， 5， 6-四氢-2-甲 基_4-嘧啶羧酸浓度阈值的限制，浓度达到一定值，合成即受到抑制。 针对上述问题，Torsten等发明一种利用转基因非嗜盐菌连续合成分泌1，4， 5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的方法，产率达到40mg/L/h(Continuous Synthesis and Excretion of theCompatible Solute Ectoine by a Transgenic, Nonhalophilic Bacterium. A卯l EnvironMicrobiol. 2007 ;73 (10) :3343-7)。专利文献CN101314785公开了一种利用盐单胞菌属菌株发酵合成1，4，5，6-四氢_2-甲基-4-嘧啶羧酸的方法。产物 大部分分泌至培养基中，可以实现连续培养，并将盐浓度降低了 1/2至2/3。
然而，迄今为止，1，4，5，6_四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的合成方法仍是发酵法，尚 无关于1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法。这种利用微生物发酵合成 1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的方法具有的共同缺陷是细胞生长缓慢、制备工艺 复杂，产率较低，很难满足需求。急需一种可大规模进行生产的人工合成方法。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种1，4，5，6_四氢_2-甲基-4-嘧啶羧酸的人 工合成方法，其工艺简单且产率高，可大规模生产，满足社会的需求。
本发明是通过以下技术方案实现的 —种1，4，5，6_四氢_2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法，包括以下步骤
(l)N-乙酰化二氨基丁酸的合成反应 取4-硝基苯酚醋酸酯、无机碱，混合，加入到L-2，4-二氨基丁酸水溶液中进 行反应，边反应边搅拌，生成2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混 合物，其中，L-2，4-二氨基丁酸、无机碱与4-硝基苯酚醋酸酯的摩尔比为1 : (2.0 5.0) : (1.0 3. 0)，反应温度为20。C 70。C，搅拌速度为50 100rpm，反应时间为8 20小时; 反应完成后，用CH^l2进行萃取，得萃取液，然后干燥，减压蒸馏，3(TC 7(rC下真 空干燥，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物；
(2)1，4，5，6-四氢-2_甲基_4_嘧啶羧酸的合成反应 将上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物溶于极性有 机溶剂，然后加入三乙胺，三乙胺与L-2，4-二氨基丁酸的摩尔比为2 : 1，加热回流36 60小时，减压蒸去有机溶剂，然后用柱层析进行纯化，即得到1 ， 4， 5， 6-四氢-2-甲基-4-嘧
啶羧酸。合成反应式如下
<formula>formula see original document page 4</formula>四氢嘧啶(L) 所述步骤(1)中，无机碱选自NaOH、 KOH、 Ca (OH) 2中的任一种。
所述步骤(1)中，反应温度为25°C 35t:，反应时间为10 16小时。
所述步骤(2)中，极性有机溶剂选自正丁醇、乙醇、甲醇中的任一种。
所述步骤(2)中，加热回流的温度为80°C 120°C。 所述步骤(2)中，柱层析的流动相为正丁醇/乙酸/水，体积比为12 :3:5。
所述步骤(2)中，柱层析的吸附剂为200 300目硅胶。 本发明的基本原理是首先利用4-硝基苯酚醋酸酯与L_2，4- 二氨基丁酸反应生 成2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸，然后通过2-乙酰胺基-4-氨基 丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸反应生成1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸。
本发明的合成工艺步骤简单，环境污染小，收率可达50% 70 % ，适于工业化生产。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明 实施例1人工合成制备1，4，5，6_四氢_2-甲基_4_嘧啶羧酸，步骤如下
(1)4-硝基苯酚醋酸酯(3.62g，20翻l)与NaOH(l. 68g，40mmo1)混合，加入到 200mlL-2，4-二氨基丁酸水溶液中(0. lmmol/ml) ， 25。C下80rpm搅拌14小时，反应完成后， 以CH2C12进行萃取，萃取液以无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除CH2C12及剩余的4-硝基苯酚 醋酸酯，5(TC下真空干燥4小时，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁 酸混合物。 (2)将上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基_4_乙酰氨基丁酸混合物溶于 80ml正丁醇，加入2g三乙胺，8(TC加热回流48小时，减压蒸去有机溶剂，以正丁醇/乙酸/ 水(体积比为12 : 3 : 5)进行柱层析(200-300目硅胶)，得到产物。
采用核磁共振及质谱对产物进行定性鉴别，确定为1，4，5，6_四氢_2-甲基-4-嘧 啶羧酸，数据如下 力NMR(300MHz， D20) :2. 23卯m(s， 3H， CH3_C = N) ， 2. 09ppm(m， 2H， -CH2_CH-N)， 3. 42ppm(m， 2H， NH-Q^-) ， 4. 16卯m(t， 1H， N-CH_C02H); 13C NMR (300MHz， D20) :17. 4卯m(q， ￡H3) ， 21. 8ppm(t， gi2-CH_N，丄JCH = 130Hz)， 38. 3ppm(t， NH,VjCH = 145Hz) ， 51. 4ppm (d， ￡H_C02H) ， 167. 23ppm (s， ￡ = N)， 179. 4卯m(s， ￡ = 0); ESI-MS (M/Z) : 142 (M+') ， 97 (M+' _C02H)。 高效液相色谱对1， 4， 5， 6-四氢-2-甲基_4_嘧啶羧酸合成量进行测定，色谱柱为 TSK-GEL，流动相为50mmol/L磷酸盐缓冲液(p朋.0)，流速为1. Oml/min，吸收波长为210nm， 测得产率为54%，纯度为95%。 实施例2人工合成制备1，4，5，6_四氢-2_甲基-4-嘧啶羧酸，步骤如下
(1) 4-硝基苯酚醋酸酯(5. 43g， 30mmo1)与K0H(2. 25g， 40,1)混合，加入到 200mlL-2，4-二氨基丁酸水溶液中(0. lmmol/ml) ， 25。C下80rpm搅拌12小时，反应完成后， 以CH2C12进行萃取，萃取液以无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除CH2C12及剩余的4-硝基苯酚 醋酸酯，5(TC下真空干燥4小时，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁 酸混合物。
(2)将上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基_4_乙酰氨基丁酸混合物溶于 100ml乙醇，加入2g三乙胺，12(TC加热回流48小时，减压蒸去有机溶剂，以正丁醇/乙酸/ 水(体积比为12 : 3 : 5)进行柱层析(200-300目硅胶)，得到产物。
采用核磁共振及质谱对产物进行定性鉴别，确定为1，4，5，6_四氢_2-甲基-4_嘧 啶羧酸，数据如下 力NMR(300MHz， D20) :2. 23卯m(s， 3H， CH3_C = N) ， 2. 09ppm(m， 2H， -CH2_CH-N)， 3. 42ppm(m， 2H， NH-Q^-) ， 4. 16卯m(t， 1H， N-CH_C02H); 13C NMR (300MHz， D20) :17. 4卯m(q， ￡H3) ， 21. 8ppm(t， ￡H2-CH_N， ^CH = 130Hz)， 38. 3ppm(t， NH,VjCH = 145Hz) ， 51. 4ppm(d， ￡H_C02H) ， 167. 23ppm(s， ￡ = N)， 179. 4卯m(s， ￡ = 0);ESI-MS (M/Z) : 142 (M+') ， 97 (M+' _C02H)。 高效液相色谱对1， 4， 5， 6-四氢-2-甲基_4_嘧啶羧酸合成量进行测定，色谱柱为 TSK-GEL，流动相为50mmol/L磷酸盐缓冲液(p朋.0)，流速为1. Oml/min，吸收波长为210nm， 测得产率为62 % ，纯度为87 % 。 实施例3人工合成制备1，4，5，6_四氢-2_甲基-4-嘧啶羧酸，步骤如下
(1)4-硝基苯酚醋酸酯(5. 43g，30mmo1)与NaOH(l. 68g，40mmo1)混合，加入到 200mlL-2，4-二氨基丁酸水溶液中(0. lmmol/ml) ， 30。C下80rpm搅拌14小时，反应完成后， 以CH2C12进行萃取，萃取液以无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除CH2C12及剩余的4-硝基苯酚 醋酸酯，5(TC下真空干燥4小时，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁 酸混合物。 (2)将上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基_4_乙酰氨基丁酸混合物溶于 80ml正丁醇，加入2g三乙胺，120。C加热回流36小时，减压蒸去有机溶剂，以正丁醇/乙酸 /水(体积比为12 : 3 : 5)进行柱层析(200-300目硅胶)，得到产物。
采用核磁共振及质谱对产物进行定性鉴别，确定为1，4，5，6_四氢_2-甲基-4_嘧 啶羧酸，数据如下 力NMR(300MHz， D20) :2. 23卯m(s， 3H， CH3_C = N) ， 2. 09ppm(m， 2H， -CH2_CH-N)， 3. 42ppm(m， 2H， NH-Q^-) ， 4. 16卯m(t， 1H， N-CH_C02H); 13C NMR (300MHz， D20) :17. 4卯m(q， ￡H3) ， 21. 8ppm(t， gi2-CH_N，丄JCH = 130Hz)， 38. 3ppm(t， NH,VjCH = 145Hz) ， 51. 4ppm (d， ￡H_C02H) ， 167. 23ppm (s， ￡ = N)， 179. 4卯m(s， ￡ = 0); ESI-MS (M/Z) : 142 (M+') ， 97 (M+' _C02H)。 高效液相色谱对1， 4， 5， 6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸合成量进行测定，色谱柱为 TSK-GEL，流动相为50mmol/L磷酸盐缓冲液(p朋.0)，流速为1. Oml/min，吸收波长为210nm， 测得产率为67 % ，纯度为99 % 。 实施例4人工合成制备1，4，5，6_四氢-2_甲基-4-嘧啶羧酸，步骤如下
(1)4-硝基苯酚醋酸酯(5. 43g，30mmo1)与NaOH(l. 68g，40mmo1)混合，加入到 200mlL-2，4-二氨基丁酸水溶液中(0. lmmol/ml) ， 30。C下80rpm搅拌20小时，反应完成后， 以CH2C12进行萃取，萃取液以无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除CH2C12及剩余的4-硝基苯酚 醋酸酯，6(TC下真空干燥4小时，得到2-乙酰胺基_4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物。 (2)将上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基_4_乙酰氨基丁酸混合物溶于 80ml正丁醇，加入2g三乙胺，8(TC加热回流60小时，减压蒸去有机溶剂，以正丁醇/乙酸/ 水(体积比为12 : 3 : 5)进行柱层析(200-300目硅胶)，得到产物。
采用核磁共振及质谱对产物进行定性鉴别，确定为1，4，5，6_四氢_2-甲基-4_嘧 啶羧酸，数据如下 力NMR(300MHz， D20) :2. 23卯m(s， 3H， CH3_C = N) ， 2. 09ppm(m， 2H， -CH2_CH-N)， 3. 42ppm(m， 2H， NH-Q^-) ， 4. 16卯m(t， 1H， N-CH_C02H); 13C NMR (300MHz， D20) :17. 4卯m(q， ￡H3) ， 21. 8ppm(t， ￡H2-CH_N，丄JCH = 130Hz)， 38. 3ppm(t， NH-C仏VjCH = 145Hz) ， 51. 4ppm (d， ￡H_C02H) ， 167. 23ppm (s， ￡ = N)， 179. 4卯m(s， ￡ = 0); ESI-MS (M/Z) : 142 (M+') ， 97 (M+' _C02H)。 高效液相色谱对1， 4， 5， 6-四氢-2-甲基_4_嘧啶羧酸合成量进行测定，色谱柱为 TSK-GEL，流动相为50mmol/L磷酸盐缓冲液(p朋.0)，流速为1. Oml/min，吸收波长为210nm， 测得产率为67 % ，纯度为97 % 。 实施例5人工合成制备1，4，5，6_四氢-2_甲基-4-嘧啶羧酸，步骤如下 (1)4-硝基苯酚醋酸酉旨(3.62g，20翻l)与NaOH(l. 68g，40,1)混合，加入到
200mlL-2，4-二氨基丁酸水溶液中(0. lmmol/ml) ， 30。C下80rpm搅拌14小时，反应完成后，
以CH2C12进行萃取，萃取液以无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除CH^l2，6(TC下真空干燥4小
时，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物。 (2)将上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物溶于
100ml甲醇，加入2g三乙胺，ll(TC加热回流60小时，减压蒸去有机溶剂，以正丁醇/乙酸/
水(体积比为12 : 3 : 5)进行柱层析(200-300目硅胶)，得到产物。 采用核磁共振及质谱对产物进行定性鉴别，确定为1，4，5，6_四氢_2-甲基-4_嘧
啶羧酸，数据如下 力NMR(300MHz， D20) :2. 23卯m(s， 3H， CH3_C = N) ， 2. 09ppm(m， 2H， -CH2_CH-N)， 3. 42ppm(m， 2H， NH-Q^-) ， 4. 16卯m(t， 1H， N-CH_C02H); 13C NMR (300MHz， D20) :17. 4卯m(q， ￡H3) ， 21. 8ppm(t， gi2-CH_N， ^CH = 130Hz)， 38. 3ppm(t， NH,VjCH = 145Hz) ， 51. 4ppm (d， ￡H_C02H) ， 167. 23ppm (s， ￡ = N)， 179. 4卯m(s， ￡ = 0); ESI-MS (M/Z) : 142 (M+') ， 97 (M+' _C02H)。 高效液相色谱对1， 4， 5， 6-四氢-2-甲基_4_嘧啶羧酸合成量进行测定，色谱柱为 TSK-GEL，流动相为50mmol/L磷酸盐缓冲液(p朋.0)，流速为1. Oml/min，吸收波长为210nm， 测得产率为59%，纯度为94%。
权利要求
一种1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法，其特征在于，包括以下步骤(1)N-乙酰化二氨基丁酸的合成反应取4-硝基苯酚醋酸酯、无机碱，混合，加入到L-2，4-二氨基丁酸水溶液中进行反应，边反应边搅拌，生成2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物，其中，L-2，4-二氨基丁酸、无机碱与4-硝基苯酚醋酸酯的摩尔比为1∶(2.0～5.0)∶(1.0～3.0)，反应温度为20℃～70℃，搅拌速度为50～100rpm，反应时间为8～20小时；反应完成后，用CH2Cl2进行萃取，得萃取液，然后干燥，减压蒸馏，30℃～70℃下真空干燥，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物；(2)1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的合成反应将上述2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物溶于极性有机溶剂，然后加入三乙胺，三乙胺与L-2，4-二氨基丁酸的摩尔比为2∶1，加热回流36～60小时，减压蒸去有机溶剂，然后用柱层析进行纯化，即得到1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸；合成反应式如下F2009102294668C0000011.tif
2. 根据权利要求1所述的一种1，4，5，6-四氢_2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法 其特征在于所述步骤(1)中，无机碱选自NaOH、KOH、Ca(OH)2中的任一种。
3. 根据权利要求1所述的一种1，4，5，6-四氢_2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法 其特征在于所述步骤(1)中，反应温度为25°C 35t:，反应时间为10 16小时。
4. 根据权利要求1所述的一种1，4，5，6-四氢_2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法 其特征在于所述步骤(2)中，极性有机溶剂选自正丁醇、乙醇、甲醇中的任一种。
5. 根据权利要求1所述的一种1，4，5，6-四氢_2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法 其特征在于所述步骤(2)中，加热回流的温度为80°C 120°C。
6. 根据权利要求l所述的一种1，4，5，6-四氢_2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法 其特征在于所述步骤(2)中，柱层析的流动相为正丁醇/乙酸/水，体积比为12 :3:5
7. 根据权利要求1所述的一种1，4，5，6-四氢_2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法 其特征在于所述步骤(2)中，柱层析的吸附剂为200 300目硅胶。
全文摘要
本发明公开了一种1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的人工合成方法，包括以下步骤(1)取4-硝基苯酚醋酸酯、无机碱，混合，加入到L-2，4-二氨基丁酸水溶液中进行反应，边反应边搅拌，生成2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物，然后用CH2Cl2进行萃取，得萃取液，然后干燥，减压蒸馏，真空干燥，得到2-乙酰胺基-4-氨基丁酸和2-氨基-4-乙酰氨基丁酸混合物；(2)将上述反应混合物溶于极性有机溶剂，然后加入三乙胺，加热回流，减压蒸去有机溶剂，然后用柱层析进行纯化，即得。本发明的合成工艺步骤简单，环境污染小，收率可达50％～70％，适于工业化生产。
文档编号C07D239/06GK101698662SQ20091022946
公开日2010年4月28日 申请日期2009年10月26日 优先权日2009年10月26日
发明者厉保秋 申请人:山东大学