变体ICOS配体免疫调节蛋白及相关组合物和方法与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年10月18日提交的标题为“变体icos配体免疫调节蛋白及相关组合物和方法”的美国临时专利申请62/574,161的优先权，该申请的内容通过引用以其全文并入。

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本公开涉及用于调节癌症和免疫学疾病的治疗中的免疫应答的治疗组合物。在一些方面，本公开涉及icos配体(icosl)的特定变体，其表现出改善的结合，例如对同源结合配偶体蛋白icos或cd28中的一个或两个的亲和力或选择性改善。

背景技术：

在由抗原呈递细胞(apc)或靶细胞与淋巴细胞之间形成的免疫突触(is)中发生的过程中通过干预来调节免疫应答具有越来越高的医学兴趣。从机制上讲，is中的细胞表面蛋白能涉及多个蛋白靶标与它们所结合的单个蛋白之间的协调且经常同时发生的相互作用。is相互作用与两个细胞的连接密切相关，并且此结构中的单个蛋白可以与同一细胞上的蛋白质(顺式)以及相关细胞上的蛋白质(反式)(可能同时)二者相互作用。尽管已知可以调节is的治疗剂，但仍需要改进的治疗剂。提供了满足这些需求的免疫调节蛋白，包括可溶性蛋白或能够在细胞上表达的跨膜免疫调节蛋白。

技术实现要素：

本文提供了变体icos配体(icosl)多肽，其在icosl参考多肽的免疫球蛋白超家族(igsf)结构域中包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述icosl参考多肽是截短的细胞外结构域，其包含连续的氨基酸序列和参照seqidno:32中所示的icosl细胞外结构域序列的至少25个氨基酸的c末端截短，所述连续的氨基酸序列包含参照seqidno:32所示的icosl细胞外结构域序列的氨基酸1-112。在所提供的任何实施方案中的一些中，与icosl参考多肽对icos或cd28的一个或多个胞外域的结合相比，变体icosl多肽表现出与相同的一个或多个胞外域的结合有所变化。在所提供的任何实施方案中的一些中，与icosl参考多肽对icos或cd28的一个或多个胞外域的结合相比，变体icosl多肽表现出增加的与相同的一个或多个胞外域的结合。

在任何这样的实施方案中的一些中，c末端截短具有至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少125个氨基酸残基。在任何所提供的实施方案中的一些中，icosl参考多肽在以seqidno:32的氨基酸204-209所示的蛋白酶切割位点中有所改变或缺乏以seqidno:32的氨基酸204-209所示的蛋白酶切割位点。在一些实例中，icosl参考多肽包含seqidno:545所示的氨基酸序列。在一些方面，icosl参考多肽由seqidno:545所示的氨基酸序列组成。

本文提供了一种变体icosl配体(icosl)多肽，其在icosl参考多肽中含有一个或多个氨基酸修饰，其中icosl参考多肽由seqidno:545中所示的氨基酸序列组成。本文还提供了一种变体icosl配体(icosl)多肽，其在icosl参考多肽的免疫球蛋白超家族(igsf)域中包含一个或多个氨基酸修饰，其中icosl参考多肽在对应于参照seqidno:32的氨基酸204-209的一个或多个氨基酸中有所改变。在任何所提供的实施方案中的一些中，与icosl参考多肽对一个或多个其结合配偶体的结合相比，变体icosl多肽表现出与该一个或多个结合配偶体的结合有所改变。在任何所提供的实施方案中的一些中，与icosl参考多肽对一个或多个其结合配偶体的结合相比，变体icosl多肽表现出与该一个或多个结合配偶体的结合增加。

在任何所提供的实施方案中的一些中，所述改变(例如，修饰)包括对应于参照seqidno:32的氨基酸204-209的一个或多个连续氨基酸的缺失。在一些情况下，icosl参考多肽包含seqidno:600-605中任何一个所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，icosl参考多肽由seqidno:600-605中任何一个所示的氨基酸序列组成。

在任何所提供的实施方案中的一些中，所述改变(例如，修饰)包括在对应于seqidno:32所示的位置的位置207和208中的一处或两处的至少一个氨基酸取代。在一些实例中，该至少一个氨基酸取代是n207a、n207g或l208g或其保守氨基酸取代。

在任何所提供的实施方案中的一些中，参考icosl多肽包含seqidno:623-628中任何一个所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方案的一些中，参考icosl多肽由seqidno:623-628中任何一个所示的氨基酸序列组成。

在任何所提供的实施方案中的一些中，当变体icosl多肽从细胞表达时，表现出减少的蛋白水解切割。在一些实例中，该细胞是哺乳动物细胞。在某些情况下，该细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞系或其衍生物。

在任何这样的实施方案中的一些中，氨基酸修饰是氨基酸取代、插入或缺失。在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰在与选自以下参照seqidno:32的位置相对应的位置：10、11、13、16、18、20、25、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、138、139、140、142、143、144、146、148、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227。在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰在与选自以下参照seqidno:32的位置相对应的位置：10、11、13、16、18、20、25、26、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、137、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227。

在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰选自m10v、m10i、v11e、s13g、e16v、s18r、a20v、s25g、f27s、f27c、n30d、y33del、q37r、k42e、t43a、y47h、n52a、n52c、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52mn52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、s54a、s54p、n57a、n57d、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57y、n57w、r61s、r61c、y62f、l67p、a71t、g72r、l74q、r75q、d77g、f78l、l80p、n84q、e90a、k92r、f93l、h94e、h94d、l96f、l96i、v97a、l98f、s99g、q100a、q100d、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100p、q100r、q100s、q100t、q100v、l102r、g103e、v107a、v107i、s109g、s109n、v110d、v110n、v110a、e111del、t113e、h115r、h115q、v116a、a117t、n119q、f120i、s121g、v122a、v122m、f120s、s126t、s126r、h129p、s130g,s132f、q133h、e135k、f138l、t139s、c140del、c140d、s142f、i143v、i143t、n144d、y146c、v151a、y152c、y152h,w153r、i154f、n155h、n155q、k156m、d158g、l161p、l161m、l166q、n168q、f172s、l173s、m175t、t190a、t190s、s192g、v193m、n194d、c198r、n201s、l203p、l203f、n207q、l208p、v210a、s212g、d217v、i218t、i218n、e220g、r221g、r221i、i224v、t225a、n227k或其保守氨基酸取代。

在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰选自m10v、m10i、v11e、s13g、e16v、s18r、a20t、a20v、s25g、r26s、f27c、f27s、n30d、y33del、q37r、t38p、k42e、t43a、y47h、n52a、n52c、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52p、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、s54a、s54f、s54p、n57a、n57d、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57w、n57y、r61c、r61s、y62f、l67p、a71t、g72r、l74q、r75q、d77g、f78l、l80p、n84q、d89g、e90a、k92r、f93l、h94d、h94e、l96f、l96i、v97a、l98f、s99g、q100a、q100d、q100e、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100p、q100r、q100s、q100t、q100v、l102r、g103e、v107a、v107i、s109g、s109n、v110a、v110d、v110n、e111del、t113e、h115q、h115r、v116a、a117t、n119q、f120i、f120s、s121g、v122a、v122m、s126r,s126t、h129p、s130g、s132f、q133h、e135k、t137a、f138l、t139s、c140del、c140d、s142f、i143t、i143v、n144d、y146c、v151a、y152c、y152h、w153r、i154f、n155h、n155q、k156m、d158g、l161m、l161p、q164l、l166q、n168q、f172s、l173s、m175t、t190a、t190s、s192g、v193a、v193m、n194d、c198r、n201s、l203f、l203p、n207q、l208p、v210a、s212g、d217g、d217v、i218n、i218t、e220g、r221g、r221i、r221k、i224v、t225a、t225s、n227k或其保守氨基酸取代。

在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰在与位置52、57或100相对应的位置。在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰选自n52a、n52c、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、n57a、n57d、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57y、n57w、q100a、q100d、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100p、q100r、q100s、q100t或q100v。在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰选自n52a、n52c、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、s54a、s54p、n57a、n57d、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57y、n57w、q100a、q100d、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100p、q100r、q100s、q100t或q100v。在一些实例中，一个或多个氨基酸修饰选自n52y/n57y/f138l/l203p、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c140d/t225a、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n52h/s99g、n57y/q100p、n52s/s130g/y152c、n52s/y152c、n52s/c198r、n52y/n57y/y152c、n52y/n57y/h129p/c198r、n52h/l161p/c198r、n52s/t113e、n52d/s54p、n52k/l208p、n52s/y152h、n52d/v151a、n52h/i143t、n52s/l80p、n52s/r75q/l203p、n52s/d158g、n52d/q133h、n52s/n57y/h94d/l96f/l98f/q100r、n52s/n57y/h94d/l96f/l98f/q100r/g103e/f120s、n52h/f78l/q100r、n52h/n57y/q100r/v110d、n52h/n57y/r75q/q100r/v110d、n52h/n57y/q100r、n52h/n57y/l74q/q100r/v110d、n52h/q100r、n52h/s121g、a20v/n52h/n57y/q100r/s109g、n52h/n57y/r61s/q100r/v110d/l173s、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y、n52s/f120s、n52s/v97a、n52s/g72r、n52s/a71t/a117t、n52s/e220g、y47h/n52s/v107a/f120s、n52h/n57y/q100r/v110d/s132f/m175t、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r、q37r/n52h/n57y/q100r/v110n/s142f/c198r/d217v/r221g、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/v116a/l161m/f172s/s192g/c198r、f27s/n52h/n57y/v110n、n52s/h94e/l96i/s109n/l166q、s18r/n52s/f93l/i143v/r221g、a20t/n52d/y146c/q164l、v11e/n30d/n52h/n57y/h94e/l96i/l98f/n194d/v210a/i218t、n52s/h94e/l96i/v122m、n52h/n57y/h94e/l96i/f120i/s126t/w153r/i218n、m10v/s18r/n30d/n52s/s126r/t139s/l203f、s25g/n30d/n52s/f120s/n227k、n30d/n52s/l67p/q100k/d217g/r221k/t225s、n52h/n57y/q100r/v110d/a117t/t190s/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/f172s/c198r、s25g/f27c/n52h/n57y/q100r/v110d/e135k/l173s/c198r、n52h/n57y/v110a/c198r/r221i、m10i/s13g/n52h/n57y/d77g/v110a/h129p/i143v/f172s/v193m/c198r、n52h/n57y/r61c/y62f/q100r/v110n/f120s/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/n144d/f172s/c198r、n52s/h94e/l98f/q100r、n52s/e90a、n30d/k42e/n52s、n52s/f120s/i143v/i224v、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/c198r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/c198r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52s/s54p、t38p/n52s/n57d、n52h/c140del/t225a、n52h/f78l/q100r/c198r、n52h/n57y/r75q/q100p/v110d、n52h/n57y/l74q/v110d/s192g、n52h/s121g/c198r、n52s/f120s/n227k、n52s/a71t/a117t/t190a/c198r、t43a/n52h/n57y/l74q/d89g/v110d/f172s、n52h/n57y/q100r/v110d/s132f/m175t、n52d、n52h/n57y/q100r/v107i/v110d/i154f/c198r/r221g、n52q/n207q、n52q/n168q、n52q/n84q、n52q/n119q、n52q/n84q/n168q、n52q/n84q/n207q、n52q/n119q/n155q、n52h/n84q/n119q、n52h/n84q、n52h/n84q/n168q/n207q、n52q/n84q/n155q/n168q、n52q/n84q/n119q/n168q、n52q/n84q/n119q/n207q、n52q/n84q/n119q/n155q、n52q/n84q/n119q/n155q/n207q、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、q100r/f138l、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102r/h115r/f172s/c198r、n52h/v122a/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/q100r/h115r/i143t/f172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/e90a/h115r、n30d/k42en52s/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r/r221i、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r、n30d/k42e/n52s/h115r/f172s/n194d、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52s/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100ph115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s、n52h/q100r/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52a/n57f/q100s、n52a/n57h/q100s、n52a/n57y/q100a、n52d/n57a/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52h/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57f、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52r/n57y/q100p、n52r/n57y/q100s、n52s/n57a/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100s、n52s/n57y/q100m、n52s/n57y/q100v、n52t/n57h/q100s、n52t/n57h/q100a、n52t/n57y/q100a、n52v/n57l/q100a、n52h/n57y/q100k、n52k/n57y/q100r、n52l/n57h/q100r、n52r/n57f/q100n、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100r、n52r/n57f/q100t、n52r/n57h/q100k、n52r/n57l/q100s、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52r/n57y/q100r、n52c/n57e/q100s、n52g/n57p/q100d、n52g/n57v/q100g、n52g/n57v、n52l/n57v、n52p/n57p、n52p/n57s/q100g、n52s/n57l/q100g、n52t/n57k/q100p、n52v/n57t/q100l或n57q/q100p。

在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰选自n52y/n57y/f138l/l203p、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c140d/t225a、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n52h/s99g、n57y/q100p、n52s/s130g/y152c、n52s/y152c、n52s/c198r、n52y/n57y/y152c、n52y/n57y/h129p/c198r、n52h/l161p/c198r、n52s/t113e、n52d/s54p、n52k/l208p、n52s/y152h、n52d/v151a、n52h/i143t、n52s/l80p、f120s/y152h/n201s、n52s/r75q/l203p、n52s/d158g、n52d/q133h、n52s/n57y/h94d/l96f/l98f/q100r、n52s/n57y/h94d/l96f/l98f/q100r/g103e/f120s、n52s/g103e、n52h/f78l/q100r、n52h/n57y/q100r/v110d、n52h/n57y/r75q/q100r/v110d、n52h/n57y/q100r、n52h/n57y/l74q/q100r/v110d、n52h/q100r、n52h/s121g、a20v/n52h/n57y/q100r/s109g、n52h/n57y/r61s/q100r/v110d/l173s、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y、n52s/f120s、n52s/v97a、n52s/g72r、n52s/a71t/a117t、n52s/e220g、y47h/n52s/v107a/f120s、n52h/n57y/q100r/v110d/s132f/m175t、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r、q37r/n52h/n57y/q100r/v110n/s142f/c198r/d217v/r221g、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/v116a/l161m/f172s/s192g/c198r、f27s/n52h/n57y/v110n、n52s/h94e/l96i/s109n/l166q、s18r/n52s/f93l/i143v/r221g、a20t/n52d/y146c/q164l、v11e/n30d/n52h/n57y/h94e/l96i/l98f/n194d/v210a/i218t、n52s/h94e/l96i/v122m、n52h/n57y/h94e/l96i/f120i/s126t/w153r/i218n、m10v/s18r/n30d/n52s/s126r/t139s/l203f、s25g/n30d/n52s/f120s/n227k、n30d/n52s/l67p/q100k/d217g/r221k/t225s、n52h/n57y/q100r/v110d/a117t/t190s/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/f172s/c198r、s25g/f27c/n52h/n57y/q100r/v110d/e135k/l173s/c198r、n52h/n57y/v110a/c198r/r221i、m10i/s13g/n52h/n57y/d77g/v110a/h129p/i143v/f172s/v193m,c198r、n52h/n57y/r61c/y62f/q100r/v110n/f120s/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/n144d/f172s/c198r、n52s/h94e/l98f/q100r、n52s/e90a、n30d/k42e/n52s、n52s/f120s/i143v/i224v、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/c198r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/c198r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52s/s54p、t38p/n52s/n57d、n52h/c140del/t225a、n52h/f78l/q100r/c198r、n52h/n57y/r75q/q100p/v110d、n52h/n57y/l74q/v110d/s192g、n52h/s121g/c198r、n52s/f120s/n227k、n52s/a71t/a117t/t190a/c198r、t43a/n52h/n57y/l74q/d89g/v110d/f172s、n52h/n57y/q100r/v110d/s132f/m175t、n52h/n57y/q100r/v107i/v110d/i154f/c198r/r221g、n52q/n207q、n52q/n168q、n52q/n84q、n52q/n119q、n52q/n84q/n168q、n52q/n84q/n207q、n52q/n119q/n155q、n52h/n84q/n119q、n52h/n84q、n52h/n84q/n168q/n207q、n52q/n84q/n155q/n168q、n52q/n84q/n119q/n168q、n52q/n84q/n119q/n207q、n52q/n84q/n119q/n155q、n52q/n84q/n119q/n155q/n207q、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、q100r/f138l、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102r/h115r/f172s/c198r、n52h/v122a/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/q100r/h115r/i143t/f172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/e90a/h115r、n30d/k42en52s/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r/r221i、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r、n30d/k42e/n52s/h115r/f172s/n194d、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52s/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s、n52h/q100r/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52a/n57f/q100s、n52a/n57h/q100s、n52a/n57y/q100a、n52d/n57a/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52h/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57f、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52r/n57y/q100p、n52r/n57y/q100s、n52s/n57a/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100s、n52s/n57y/q100m、n52s/n57y/q100v、n52t/n57h/q100s、n52t/n57h/q100a、n52t/n57y/q100a、n52v/n57l/q100a、n52h/n57y/q100k、n52k/n57y/q100r、n52l/n57h/q100r、n52r/n57f/q100n、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100r、n52r/n57f/q100t、n52r/n57h/q100k、n52r/n57l/q100s、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52r/n57y/q100r、n52c/n57e/q100s、n52g/n57p/q100d、n52g/n57v/q100g、n52g/n57v、n52l/n57v、n52p/n57p、n52p/n57s/q100g、n52s/n57l/q100g、n52t/n57k/q100p、n52v/n57t/q100l、n57q/q100p或r26s/n52h/n57y/v110d/t137a/c198r。

在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰是n52h/q100r。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽具有seqidno:567所示的序列。

在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰是n52h/n57y/q100r。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含seqidno:565所示的序列。

在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰是n52l/n57h/q100r。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含seqidno:761所示的序列。

在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰是n52d。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含seqidno:548所示的序列。

在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰是n52h/n57y/q100p。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含seqidno:570所示的序列。

在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰选自f120s/y152h/n201s、e111del、y33del、n168q/n207q、n84q/n207q、n155q/n207q、n119q/n168q、n119q/n207q、n119q/n155q、n84q/n119q、n84q/n155q/n168q、n84q/n168q/n207q、n84q/n155h/n207q、n155q/n168q/n207q、n119qn155q/n168q、n119q/n168q/n207q、n84q/n119q/n207q、n119q/n155h/n207q、n84q/n119q/n155q、n84q/n119q/n155q/n168q、n84q/n155q/n168q/n207q、n84q/n119q/n155q/n207q、n84q/n119q/n155q/n168q/n207q或f138l/l203p。

在任何此类实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰选自c198r、d158g、e16v、e90a、f120s、f138l、f172s、h115r、h115x、i143t、i143v、i224v、k156m、k42e、k92r、l102r、l203p、l208p、n194d、n30d、n52a、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52q、n52r、n52s、n52t、n52y、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57s、n57v、n57w、n57y、q100a、q100d、q100e、q100k、q100m、q100p、q100r、q100s、q100t、q133h、r221i、r75q、s54a、s54p、t113e、t225a、v110d、v122a、y146c、y152c、a117t、a20v、a71t、a91g、a91g、ae88d、c140del、c198r、d158g、d77g、d90k、e117g、e135k、e16v、e81a、e88d、e90a、f120i、f120s、f138l、f172s、f27c、f92y、g72r、h115r、h115x、h129p、h94e、i118v、i127t、i143t、i143v、i154f、i218n、i218t、i224v、k156m、k169e、k36g、k42e、k89r、k92r、k93r、l102r、l161p、l166q、l173s、l203f、l203p、l208p、l209p、l40m、l70q、l70r、l74q、l80p、l96i、l98f、m10i、m10v、n115q、n119q、n122s、n144d、n155x、n168q、n168x、n178s、n194d、n207q、n207x、n227k、n25s、n30d、n52v、n57a、n57f、n57h、n57l、n57m、n57s、n57v、n57w、n57y、n63s、n84q、q100g、q100n、q100v、r221g、s109g、s109n、s114t、s121g、s126r、s126t、s130g、s132f、s13g、s18r、s192g、s212g、s25g、s54a、s54p、s99g、t113e、t120s、t130a、t139s、t190a、t199s、t225a、t41i、v107i、v110a、v110d、v11e、v122a、v122m、v193m、v210a、w153r、y146c、y152c或y152h。

在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰选自n52s、n52h、n52d、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n57y、n52s/c198r、n52s/t113e、s54a、n52d/s54p、n52k/l208p、n52h/i143t、n52s/r75q/l203p、n52s/d158g、n52d/q133h、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52s/e90a、n52s/f120s/i143v/i224v、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115x/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、q100r、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、n57y/q100p、q100r/f138l、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102r、h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115rf172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/q100r/h115r/i143tf172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、n52s/e90a/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r/r221i、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r、n30d/k42e/n52s/h115r/f172s/n194d、n30d/k42e/n52s/h115r、n52s/e90a/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r、n52a/n57h/q100s、n52a/n57y/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100m、n52t/n57h/q100s、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100t、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52g/n57p/q100d、n52g/n57v/q100g、n52g/n57v、n52l/n57v、n52s/n57l/q100g或n52t/n57k/q100p；或n52s、n52h、n52d、n52y/n57y/f138l/l203p、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c140del/t225a、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n52h/s99g、n57y、n57y/q100p、n52s/s130g/y152c、n52s/y152c、n52s/c198r、n52y/n57y/y152c、n52y/n57y/h129p/c198r、n52h/l161p/c198r、n52s/t113e、s54a、n52d/s54p、n52k/l208p、n52s/y152h、n52h/i143t、n52s/l80p、n52s/d158g、n52d/q133h、l70q/a91g/n144d、l70q/a91g/e117g/i118v/t120s/t130a、l70r/a91g/i118v/t120s/t130a/t199s、l70q/e81a/a91g/i118v/t120s/i127t/t130a、n63s/l70q/a91g/s114t/i118v/t120s/t130a、t41i/a91g、e88d/k89r/d90k/a91g/f92y/k93r/n122s/n178s、e88d/k89r/d90k/a91g/f92y/k93r、ae88d/k89r/d90k/a91g/f92y/k93r、k36g/l40m、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r、n52s/f120s/n227k、n52s/n194d、n52s/f120s、n52s/g72r、n52s/a71t/a117t/t190a/c198r、n52h/n57y/q100r/v107i/v110d/s132f/i154f/c198r/r221g、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r、v11e/n30d/n52h/n57y/h94e/l96i/l98f/n194d/v210a/i218t、n52s/h94e/l96i/v122m、n52h/n57y/h94e/l96i/f120i/s126t/w153r/i218n、m10v/s18r/n30d/n52s/s126r/t139s/l203f、s25g/n30d/n52s/f120s/n227k、n52h/n57y/q100r/v110d/f172s/c198r、s25g/f27c/n52h/n57y/q100r/v110d/e135k/l173s/c198r、n52h/n57y/v110a/c198r/r221i、m10i/s13g/n52h/n57y/d77g/v110a/h129p/i143v/f172s/v193m、c198r、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/n144d/f172s/c198r、n52s/h94e/l98f/q100r、n52s/e90a、n52s/f120s/i143v/i224v、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s、n52h/q100r/h115x/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52s/h94e/l96i/s109n/l166q/、n52h/n57y/q100r/c198r、n52h/n57y/l74q/v110d/s192g、n52h/q100r、n52h/s121g/c198r、a20v/n52h/n57y/q100r/s109g、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、l70q/a91g/i118a/t120s/t130a/k169e、q100r、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、n52h、n57y、n57y/q100p、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102rh115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115rf172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/q100r/h115r/i143tf172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、n30d/k42e/n52s/h115r/c198rr221i、n52s/e90a/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r、n52s/h115r/f172s/c198r、n119q、n207q、n52q/n207x、n168x/n207x、n52q/n168q、n84q/n207q、n119qn155x、n52q/n119q、n52q/n84q/n207q、n119q/n155q/n168q、n52h/n84q/n119q、n52q/n84q/n155x/n168x、n52a/n57f/q100s、n52a/n57h/q100s、n52a/n57y/q100a、n52d/n57a/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52h/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57f、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52r/n57y/q100p、n52r/n57y/q100s、n52s/n57a/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100s、n52s/n57y/q100m、n52s/n57y/q100v、n52t/n57h/q100s、n52t/n57h/q100a、n52t/n57y/q100a、n52v/n57l/q100a、n52h/n57y/q100k、n52k/n57y/q100r、n52l/n57h/q100r、n52r/n57f/q100n、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100r、n52r/n57f/q100t、n52r/n57l/q100s、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52g/n57v、n52l/n57v、n52s/n57l/q100g或n52t/n57k/q100p。在任何所提供的实施方案中的一些中，与参考icosl多肽对icos或cd28的胞外域的结合相比，变体icosl多肽表现出增加的对相同胞外域的结合。

在任何所提供的实施方案中一些中，一个或多个氨基酸修饰选自c198r、d158g、e16v、e90a、f120s、f138l、f172s、h115r、i143v、i224v、k156m、k42e、k92r、l102r、l203p、l208p、n194d、n30d、n52a、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52q、n52r、n52s、n52t、n52y、n57f、n57h、n57l、n57m、n57s、n57v、n57w、n57y、q100a、q100e、q100g、q100k、q100m、q100p、q100r、q100s、q133h、s212g、s54a、s54p、t113e、v110d、v122a、y146c、y152c或t225a。

在一些实例中，一个或多个氨基酸修饰选自n52a/n57y/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100m、n52t/n57h/q100s、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100t、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52g/n57v、n52l/n57v、n52s/n57l/q100g、n52t/n57k/q100p、n52s、n52h、n52d、n52y/n57y/f138l/l203p、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n57y、n52s/c198r、n52s/t113e、s54a、n52d/s54p、n52k/l208p、n52h/i143t、n52s/d158g、n52d/q133h、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52s/e90a、n52s/f120s/i143v/i224v、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s、n52h/q100r/h115x/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、q100r、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、n52h、n57y、n57y/q100p、q100r/f138l、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102rh115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115rf172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/q100r/h115r/i143t/f172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、n52s/e90a/h115r、n52s/e90a/h115r或n30d/k42e/n52s/h115r。在任何所提供的实施方案中的一些中，与参考icosl多肽对icos或cd28的胞外域的结合相比，变体icosl多肽表现出增加的对相同胞外域的结合。

在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含seqidno:546-599、734-781、783、786、788、792、796、798、800、802、804、806、808、811、813、815、817、818、820、822、824、826、827、829、831、833、834、836、838、840-843、845、847、848、850-853、855、857、907、910中的任何一个所示的氨基酸序列，或者表现出与seqidno:546-599、734-781、783、786、788、792、796、798、800、802、804、806、808、811、813、815、817、818、820、822、824、826、827、829、831、833、834、836、838、840-843、845、847、848、850-853、855、857、907、910中的任何一个至少90％、91％％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽由seqidno:546-599、734-781、783、786、788、792、796、798、800、802、804、806、808、811、813、815、817、818、820、822、824、826、827、829、831、833、834、836、838、840-843、845、847、848、850-853、855、857、907、910中的任何一个所示的氨基酸序列或表现出与seqidno:546-599、734-781、783、786、788、792、796、798、800、802、804、806、808、811、813、815、817、818、820、822、824、826、827、829、831、833、834、836、838、840-843、845、847、848、850-853、855、857、907、910至少90％、91％％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成。

在含有igv结构域或其特异性结合片段、igc结构域或其特异性结合片段或二者的变体icos配体(icosl)多肽的任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽在icosl参考多肽或其特异性结合片段中含有一个或多个氨基酸修饰，该一个或多个氨基酸修饰对应于选自参照seqidno:32的n52a、n52c、n52d、n52g、n52k、n52l、n52m、n52r、n52t、n52v、n57a、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57w、q100a、q100d、q100g、q100l、q100m、q100n、q100r、q100s、q100t或q100v的氨基酸修饰。在任何所提供的实施方案中的一些中，一个或多个氨基酸修饰选自n52a/n57f/q100s、n52a,/n57h/q100s、n52a/n57y/q100a、n52d/n57a/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52h/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57f、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52r/n57y/q100p、n52r/n57y/q100s、n52s/n57a/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100s、n52s/n57y/q100m、n52s/n57y/q100v、n52t/n57h/q100s、n52t/n57h/q100a、n52t/n57y/q100a、n52v/n57l/q100a、n52h/n57y/q100k、n52k/n57y/q100r、n52l/n57h/q100r、n52r/n57f/q100n、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100r、n52r/n57f/q100t、n52r/n57h/q100k、n52r/n57l/q100s、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52r/n57y/q100r、n52c/n57e/q100s、n52g/n57p/q100d、n52g/n57v/q100g、n52g/n57v、n52l/n57v、n52p/n57p、n52p/n57s/q100g、n52s/n57l/q100g、n52t/n57k/q100p、n52v/n57t/q100l或n57q/q100p。

在任何所提供的实施方案中的一些中，icosl参考多肽是哺乳动物icosl或其特异性结合片段。在一些实例中，icosl参考多肽是人icosl或其特异性结合片段。

在任何所提供的实施方案中的一些中，icosl参考多肽含有(i)seqidno:32所示的氨基酸序列，(ii)与seqidno:32具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)包含igv结构域或igc结构域或其特异性结合片段或二者的(i)或(ii)的一部分。在任何所提供的实施方案中的一些中，igv结构域或igc结构域的特异性结合片段的长度为至少50、60、70、80、90、100、110或更多个氨基酸；或igv结构域的特异性结合片段的长度为如seqidno:5的氨基酸19-129所示的igv结构域的长度的至少80％，和/或igc结构域的特异性结合片段的长度为如seqidno:5的氨基酸141-227所示的igc结构域的长度的至少80％。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含igv结构域或其特异性片段和igc结构域或其特异性片段。

在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含seqidno:638-685中任一个所示的氨基酸序列，或表现出与seqidno：638-685中任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在所提供的任何实施方案的一些中，变体icosl多肽由seqidno：638-685中任一个所示的氨基酸序列或表现出与seqidno：638-685中的任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成。

在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽含有igv结构域或其特异性结合片段。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含seqidno：686-781中任一个所示的氨基酸序列，或表现出与seqidno：686-781中的任一个至少90％、91％％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽由seqidno：686-781中任一个所示的氨基酸序列或表现出与seqidno：686-781中的任一个至少90％、91％％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成。

在任何所提供的实施方案中的一些中，igv结构域或其特异性结合片段是变体icosl多肽的唯一icosl部分。在一些实例中，igc结构域或其特异性结合片段是变体icosl多肽的唯一icosl部分。

在任何所提供的实施方案中的一些中，与icosl参考多肽对于icos或cd28胞外域的结合相比，变体icosl多肽表现出与相同胞外域的结合有所改变。在一些方面，与icosl参考多肽对于icos或cd28的一个或多个胞外域的结合相比，变体icosl多肽表现出增加的与相同的一个或多个胞外域的结合。在一些实例中，结合增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。

在任何此类实施方案中的一些中，icos是人icos。在任何所提供的实施方案中的一些中，cd28是人cd28。

在任何所提供的实施方案中的一些中，与参考icosl多肽对ctla-4的胞外域的结合相比，变体icosl多肽表现出减少的与相同胞外域的结合。在一些实例中，结合减少超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。在任何所提供的实施方案中的一些中，ctla-4是人ctla-4。

在任何所提供的实施方案中的一些中，结合改变(增加或减少)是结合亲和力改变(增加或减少)。在任何此类实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18，19或20个氨基酸修饰，任选为氨基酸取代、插入和/或缺失。在一些情况下，变体icosl多肽表现出与icosl参考多肽至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽是可溶性蛋白。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽缺少跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；和/或当变体icosl多肽从细胞表达时，其不在细胞表面上表达。

在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽还包含跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域包含如seqidno:5的残基257-277所示的氨基酸序列或其功能变体，该功能变体表现出与seqidno:5的残基257-277至少85％序列同一性。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽还包含连接至跨膜结构域的胞质信号传导结构域。在一些情况下，胞质信号传导结构域包含如seqidno:5的残基278-302所示的氨基酸序列或其功能变体，该功能变体表现出与seqidno:5的残基278-302至少85％序列同一性。

在任何所提供的实施方案中的一些中，与icosl参考序列相比，变体icosl多肽被去糖基化或部分去糖基化。

本文提供了一种免疫调节蛋白，其包含任何所提供的变体icosl多肽和半衰期延长部分。在任何所提供的实施方案中的一些中，半衰期延长部分包含多聚化结构域、白蛋白、白蛋白结合多肽、pro/ala/ser(pas)、人绒毛膜促性腺激素β亚基的c末端肽(ctp)、聚乙二醇(peg)、长非结构化亲水氨基酸序列(xten)、羟乙基淀粉(hes)、结合白蛋白的小分子或其组合。在一些情况下，半衰期延长部分是或包含pro/ala/ser(pas)，并且变体icosl多肽被pas基化。在任何所提供的实施方案中的一些中，半衰期延长部分包含seqidno:904中所示的序列。

在任何所提供的实施方案中的一些中，半衰期延长部分是或包含多聚化结构域。在一些情况下，多聚化结构域选自免疫球蛋白的fc区、亮氨酸拉链、异亮氨酸拉链或锌指。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽直接或经由接头间接地连接至多聚化结构域。

在任何所提供的实施方案中的一些中，免疫调节蛋白是多聚体，其包含连接至第一多聚化结构域的第一变体icosl多肽和连接至第二多聚化结构域的第二变体icosl多肽，其中第一和第二多聚化结构域相互作用形成包含第一和第二变体icosl多肽的多聚体。在一些情况下，多聚体是二聚体。

在任何所提供的实施方案中的一些中，第一变体icosl多肽和第二变体icosl多肽是相同的。在任何所提供的实施方案中的一些中，二聚体是同二聚体。在一些情况下，二聚体是异二聚体。

在任何所提供的实施方案中的一些中，多聚化结构域是或包含免疫球蛋白的fc区。在任何所提供的实施方案中的一些中，fc区是免疫球蛋白g1(igg1)或免疫球蛋白g2(igg2)蛋白的。在一些实例中，免疫球蛋白蛋白是人的和/或fc区是人的。在任何所提供的实施方案中的一些中，fc区包含seqidno:227中所示的氨基酸序列或其变体，该变体表现出与seqidno:227至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些方面，fc区包含seqidno:226中所示的氨基酸序列或其变体，该变体表现出与seqidno:226至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在任何所提供的实施方案中的一些中，fc区表现出一种或多种效应子功能。在任何所提供的实施方案中的一些中，与野生型fc区相比，fc区表现出一种或多种降低的效应子功能，任选地其中野生型人fc是人igg1的。

在任何所提供的实施方案中的一些中，一种或多种效应子功能选自抗体依赖性细胞毒性(adcc)、补体依赖性细胞毒性、程序性细胞死亡和细胞吞噬作用。在任何所提供的实施方案中的一些中，fc区是与野生型fc区相比包含一个或多个氨基酸取代的变体fc区。

在任何所提供的实例中的一些中，变体fc区的一个或多个氨基酸取代选自n297g、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k或l234a/l235e/g237a，其中残基是根据kabat的eu索引编号的。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体fc区还包含氨基酸取代c220s，其中残基是根据kabat的eu索引编号的。在一些方面，fc区包含seqidno:476-478中任一个所示的氨基酸序列或表现出与seqidno:476-478中任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列的序列，并且包含氨基酸取代。在任何所提供的实施方案中的一些中，fc区包含k447del，其中残基是根据kabat的eu索引编号的。

在任何所提供的实施方案中的一些中，fc区包含seqidno:632-634中任一个所示的氨基酸序列或表现出与seqidno:632-634中任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列的序列，并且包含氨基酸取代。

在任何所提供的实施方案中的一些中，fc区包含seqidno:474或637中所示的氨基酸序列或表现出与seqidno:474或637至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列的序列，并且包含氨基酸取代。

在任何所提供的实施方案中的一些中，fc区包含seqidno:478或seqidno:634中所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，fc区包含seqidno:477中所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，fc区包含seqidno:633中所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，fc区包含seqidno:474中所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，fc区包含seqidno:637中所示的氨基酸序列。

本文提供了一种免疫调节蛋白，其包含(a)在icosl参考多肽的免疫球蛋白超家族(igsf)结构域中含有一个或多个氨基酸修饰的变体icosl多肽，其中与icosl参考多肽对icos或cd28的一个或多个胞外域的结合相比，变体icosl多肽表现出与相同的一个或多个胞外域的结合有所改变；(b)与野生型人igg1相比含有选自n297g/k447del、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k/k447del或l234a/l235e/g237a/k447del的氨基酸取代的变体fc区，其中残基是依据kabat的eu索引编号的。在一些情况下，免疫调节蛋白是二聚体。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体fc区还包含氨基酸取代c220s，其中残基是根据kabat的eu索引编号的。在一些实例中，fc区包含seqidno：632-634中任一个所示的氨基酸序列或表现出与seqidno：632-634中任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列的序列并且包含氨基酸取代。在任何所提供的实施方案中的一些中，fc区包含seqidno：474或637中所示的氨基酸序列或表现出与seqidno:474或637至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列的序列并且包含氨基酸取代。

在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽直接或经由接头间接地与变体fc区连接。在一些实例中，接头包含1至10个氨基酸。在任何所提供的实施方案中的一些中，接头选自aaa、g4s(seqidno:636)、(g4s)2(seqidno:229)或gsggggs接头(seqidno:635)。在任何所提供的实施方案中的一些中，接头是(g4s)3(seqidno:228)。

在任何提供的实施方案中的一些中，接头是aaa。在任何所提供的实施方案中的一些中，接头是g4s(seqidno:636)。在任何所提供的实施方案中的一些中，接头是(g4s)2(seqidno:229)。在任何所提供的实施方案中的一些中，接头是gsggggs接头(seqidno:635)。

在任何所提供的融合蛋白例如变体icosl-fc融合蛋白的实施方案中的一些中，变体icosl多肽是或包含igv结构域。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含氨基酸修饰n52h/q100r。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽具有seqidno:567中所示的序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含氨基酸修饰n52h/n57y/q100r。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽具有seqidno:565中所示的序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含氨基酸修饰n52l/n57h/q100r。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽具有seqidno:761中所示的序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含氨基酸修饰n52h/n57y/q100p。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽具有seqidno:570中所示的序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含氨基酸修饰n52d。在任何所提供的实施方案中的一些中，多肽具有seqidno:548中所示的序列。

在任何所提供的实施方案的一些中，提供了变体icosl-fc融合蛋白，其具有seqidno:928中所示的氨基酸序列。在任何所提供的实施方案的一些中，提供了变体icosl-fc融合蛋白，其具有与seqidno:928中所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

在特定的实施方案中，提供的免疫调节蛋白，诸如融合蛋白，例如变体icosl-fc融合蛋白，结合cd28和icos。在一些实施方案中，与人野生型icosl-fc融合蛋白(例如含有通过接头(例如seqidno:229所示的)连接至fc区的seqidno:545中所示的icosligv部分)相比，变体icosl-fc融合蛋白表现出增加的与cd28和/或icos的结合亲和力。在此类实例中，fc区是在人igg1fc(例如seqidno:637中所示的)中含有突变l234a、l235e和l235e的惰性或无效应的fc。

本文提供了一种免疫调节蛋白，其包含与包含免疫球蛋白超家族(igsf)结构域的第二多肽连接的变体icosl多肽中的任一个。在一些情况下，与未修饰的或野生型igsf结构域相比，该igsf结构域被亲和力修饰并且表现出与其一个或多个同源结合配偶体的结合有所改变。在任何所提供的实施方案中的一些中，与未修饰的或野生型igsf结构域相比，该igsf结构域表现出增加的与其一个或多个同源结合配偶体的结合。

在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽是第一icosl变体多肽，并且第二多肽的igsf结构域是来自本文提供的第二变体icosl多肽的igsf结构域，其中第一和第二icosl变体相同或不同。

在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽能够与cd28或icos特异性结合，并且第二多肽的igsf结构域能够与除由icosl变体多肽特异性结合的结合配偶体以外的结合配偶体结合。在任何所提供的实施方案中的一些中，igsf结构域来自b7家族的成员。

在任何所提供的实施方案中的一些中，igsf结构域是结合在肿瘤上表达的配体的肿瘤定位部分或是结合在炎性环境的细胞或组织上表达的配体的炎性定位部分。在一些情况下，配体为b7h6。在一些实例中，igsf结构域来自nkp30。

在任何所提供的实施方案中的一些中，第二多肽的igsf结构域是或包含igv结构域。在任何所提供的实施方案中的一些中，第二多肽的igsf结构域是含有l30v/a60v/s64p/s86g的变体nkp30分子。在任何所提供的实施方案中的一些中，第二多肽的igsf结构域具有seqidno:504中所示的序列。

在任何所提供的实施方案中的一些中，igsf结构域是或包含igv结构域。在一些情况下，变体icosl多肽是或包含igv结构域。

在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽是或包含igv结构域。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含氨基酸修饰n52h/q100r。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽具有seqidno:567中所示的序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含氨基酸修饰n52h/n57y/q100r。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽具有seqidno:565中所示的序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含n52l/n57h/q100r的氨基酸修饰。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽具有seqidno:761中所示的序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含氨基酸修饰n52h/n57y/q100p。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽具有seqidno:570中所示的序列。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽包含氨基酸修饰n52d。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述多肽具有seqidno:548所示的序列。

在任何所提供的实施方案中的一些中，免疫调节蛋白包含连接至变体icosl多肽或包含igsf结构域的第二多肽中的一个或两个的多聚化结构域。在一些情况下，多聚化结构域是效应子功能降低的fc结构域或其变体。

在任何所提供的实施方案中的一些中，免疫调节蛋白是二聚体的。在一些情况下，免疫调节蛋白是同二聚体的。在一些方面，免疫调节蛋白是异二聚体的。

本文提供了包含任何所提供的变体icosl多肽或任何所提供的免疫调节蛋白和异源部分的缀合物。在一些情况下，变体icosl多肽直接或经由接头间接连接至异源部分。在任何所提供的实施方案中的一些中，靶向部分是蛋白质、肽、核酸、小分子或纳米颗粒。在一些实例中，靶部分是蛋白质或肽。在任何所提供的实施方案中的一些中，缀合物是融合蛋白。

提供了一种融合蛋白，其包含任何所提供的变体icosl多肽或任何所提供的免疫调节蛋白和异源部分。在一些情况下，该部分是与细胞表面上的分子特异性结合的靶向部分。在一些实例中，靶向部分特异性结合免疫细胞表面上的分子。在任何所提供的实施方案中的一些中，免疫细胞是抗原呈递细胞或淋巴细胞。在某些情况下，靶向部分是与肿瘤表面上的分子结合的肿瘤定位部分。

在任何所提供的实施方案中的一些中，靶向部分结合至分子her1/egfr、her2/erbb2、cd20、cd25(il-2rα受体)、cd33、cd52、cd133、cd206、cea、ceacam1、ceacam3、ceacam5、ceacam6、癌抗原125(ca125)、甲胎蛋白(afp)、lewisy、tag72、癸酸甘油酯-1、间皮素、pdgf受体(pdgfr；诸如pdgf-rα)、pd-1、pd-l1、ctla-4、il-2受体、血管内皮生长因子(vegf)、cd30、epcam、epha2、磷脂酰肌醇聚糖-3、gpa33、黏蛋白类、caix、psma、叶酸结合蛋白、神经节甘脂类(诸如gd2、gd3、gm1和gm2)、vegf受体(vegfr)、vegfr2、vegf-a、整合素αvβ3、整合素α5β1、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap、腱生蛋白、afp、bcr复合物、cd3、cd18、cd44、ctla-4、gp72、hla-dr10β、hla-dr抗原、ige、muc-1、nuc242、pem抗原、金属蛋白酶类、肝配蛋白受体、肝配蛋白配体、hgf受体、cxcr4、cxcr4、铃蟾肽受体、sk-1抗原、bcr-abl、ret、met、trkb、tie2、alk、ros、eml4-alk、ros1、brafv600e、src、c-kit、mtor、tsc1、tsc2、btk、kit、brca、cdk4/6、jak1、jak2、braf、flt-3、mek1、mek2、smo或b7-h6(ncr3lg1)。在一些方面，靶向部分与pd-l1结合。

在任何所提供的实施方案中的一些中，靶向部分是抗体或抗原结合片段。在任何所提供的实施方案中的一些中，抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、扎鲁单抗(zalutumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、ado-曲妥珠单抗emtansine、托西妥单抗(tositumomab，)、利妥昔单抗(rituxan、mabthera)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan，zevalin),达利珠单抗(daclizumab，zenapax)、吉妥珠单抗(gemtuzumab，mylotarg)、阿仑单抗、cea-scanfab片段、oc125单克隆抗体、ab75705、b72.3、贝伐单抗阿法替尼(afatinib)、阿昔替尼(axitinib)、博舒替尼(bosutinib)、卡波替尼(cabozantinib)、色瑞替尼(ceritinib)、克唑替尼、达拉非尼(dabrafenib)、达沙替尼(dasatinib)、dinutuximab(unituxin^tm)、厄洛替尼、依维莫司、依鲁替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、尼洛替尼、奥拉帕尼、奥拉木单抗(olaratumab，lartruvo^tm)、帕博西利布(palbociclib)、帕唑帕尼、帕妥珠单抗雷莫芦单抗瑞戈非尼、鲁索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、替西罗莫司(temsirolimus)、曲美替尼(trametinib)、凡德他尼(vandetanib)、维莫非尼(vemurafenib)、vismodegib、巴利昔单抗(basiliximab)、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、mpdl3280a、pidilizumab(ct-011)、amp-224、msb001078c或medi4736、bms-935559、ly3300054、阿特珠单抗、avelumab或度伐单抗(durvalumab)，或者其抗原结合片段。

在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽直接或经由接头间接地连接至抗体或抗原结合片段的重链和/或轻链的n端。在一些情况下，变体icosl多肽直接或经由接头间接地连接至抗体或抗原结合片段的重链和/或轻链的c末端。

在任何所提供的实施方案中的一些中，缀合物是二价、四价、六价或八价的。在任何所提供的实施方案中的一些中，异源部分是或包含用于检测或纯化变体icosl多肽的标记。

本文提供了一种单价融合蛋白，其包含在icosl参考多肽的免疫球蛋白超家族(igsf)结构域中含有一个或多个氨基酸修饰的变体icosl多肽以及用于检测或纯化变体icosl多肽的标记，其中与icosl参考多肽对icos或cd28的一个或多个胞外域的结合相比，变体icosl多肽表现出与相同的一个或多个胞外域的结合有所改变。在任何所提供的实施方案中的一些中，用于检测或纯化的标记选自多聚组氨酸(his)标签、flag标签、myc标签或荧光蛋白标签。

在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽在与选自以下参照seqidno:32的一个或多个位置相对应的位置处含有一个或多个氨基酸修饰：10、11、13、16、18、20、25、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、138、139、140、142、143、144、146、148、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽与选自以下参照seqidno:32的一个或多个位置相对应的位置处含有一个或多个氨基酸修饰：10、11、13、16、18、20、25、26、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、137、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227。

在一些情况下，一个或多个氨基酸修饰选自：m10v、m10i、v11e、s13g、e16v、s18r、a20v、s25g、f27s、f27c、n30d、y33del、q37r、k42e、t43a、y47h、n52a、n52c、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、n52k、s54a、s54p、n57a、n57d、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57y、n57w、r61s、r61c、y62f、l67p、a71t、g72r、l74q、r75q、d77g、f78l、l80p、n84q、e90a、k92r、f93l、h94e、h94d、l96f、l96i、v97a、l98f、s99g、q100a、q100d、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100p、q100r、q100s、q100t、q100v、l102r、g103e、v107a、v107i、s109g、s109n、v110d、v110n、v110a、e111del、t113e、h115r、h115q、v116a、a117t、n119q、f120i、s121g、v122a、v122m、f120s、s126t、s126r、h129p、s130g,s132f、q133h、e135k、f138l、t139s、c140del、c140d、s142f,i143v、i143t、n144d、y146c、v151a、y152c、y152h、w153r、i154f、n155h、n155q、k156m、d158g、l161p、l161m、l166q、n168q、f172s、l173s、m175t、t190a、t190s、s192g、v193m、n194d、c198r、n201s、l203p、l203f、n207q、l208p、v210a、s212g、d217v、i218t、i218n、e220g、r221g、r221i、i224v、t225a、n227k或其保守氨基酸取代。在一些情况下，一个或多个氨基酸修饰选自m10v、m10i、v11e、s13g、e16v、s18r、a20t、a20v、s25g、r26s、f27c、f27s、n30d、y33del、q37r、t38p、k42e、t43a、y47h、n52a、n52c、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52p、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、s54a、s54f、s54p、n57a、n57d、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57w、n57y、r61c、r61s、y62f、l67p、a71t、g72r、l74q、r75q、d77g、f78l、l80p、n84q、d89g、e90a、k92r、f93l、h94d、h94e、l96f、l96i、v97a、l98f、s99g、q100a、q100d、q100e、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100p、q100r、q100s、q100t、q100v、l102r、g103e、v107a、v107i、s109g、s109n、v110a、v110d、v110n、e111del、t113e、h115q、h115r、v116a、a117t、n119q、f120i、f120s、s121g、v122a、v122m、s126r、s126t、h129p、s130g、s132f、q133h、e135k、t137a、f138l、t139s、c140del、c140d、s142f、i143t、i143v、n144d、y146c、v151a、y152c、y152h、w153r、i154f、n155h、n155q、k156m、d158g、l161m、l161p、q164l、l166q、n168q、f172s、l173s、m175t、t190a、t190s、s192g、v193a、v193m、n194d、c198r、n201s、l203f、l203p、n207q、l208p、v210a、s212g、d217g、d217v、i218n、i218t、e220g、r221g、r221i、r221k、i224v、t225a、t225s、n227k或其保守氨基酸取代。

在任何所提供的实施方案中的一些中，icosl参考多肽含有(i)seqidno:32中所示的氨基酸序列，(ii)与seqidno:32具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)包含igv结构域或igc结构域或其特异性结合片段或二者的(i)或(ii)的一部分。

在任何所提供的实施方案中的一些中，icosl参考多肽包含seqidno:196、545、600-605和623-628中任一个所示的氨基酸序列。在一些方面，icosl参考多肽由seqidno：32、196、545、600-605和623-628中任一个所示的氨基酸序列组成。

提供了编码任何所提供的变体icosl多肽、免疫调节蛋白或融合蛋白的核酸分子。在一些情况下，核酸分子是合成的核酸。在一些实例中，核酸分子是cdna。

提供了包含任何所提供的核酸分子的载体。在一些情况下，载体是表达载体。在任何所提供的实施方案中的一些中，载体是哺乳动物表达载体或病毒载体。

提供了包含任何所提供的载体的细胞。在一些情况下，该细胞是哺乳动物细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中，该细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞或其衍生物。

提供了一种产生包含所述变体icosl多肽中的任一个的免疫调节蛋白的方法，该方法包括在在宿主细胞中表达该蛋白的条件下将任何所提供的核酸分子或载体引入宿主细胞。在一些实例中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些情况下，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞或其衍生物。在任何所提供的实施方案中的一些中，该方法进一步包括从细胞分离或纯化该蛋白。

提供了通过任何所提供的方法产生的蛋白质。

提供了包含蛋白质的组合物，所述蛋白质包含任何所提供的变体icosl多肽或免疫调节蛋白，其中所述组合物中的所述蛋白质或免疫调节蛋白的各个序列的至少95％、96％、97％、98％、99％具有相同的序列长度，任选地，其中所述组合物是包含药学上可接受的载剂的药物组合物。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述蛋白质或免疫调节蛋白是从中国仓鼠卵巢细胞或其衍生物中纯化的。

提供了一种多核苷酸，其包含编码包含所提供的跨膜结构域的变体icosl多肽的核酸和编码重组抗原受体的一条或多条链的一个或多个核酸。在一些情况下，重组抗原受体是嵌合抗原受体(car)或工程化t细胞受体(tcr)。在任何所提供的实施方案中的一些中，编码变体icosl多肽的核酸和编码重组受体的一条或多条链的一个或多个核酸中的每个被编码自切割肽或引起核糖体跳跃的肽的核酸分开。

在一些实例中，多核苷酸包含编码变体icosl多肽的核酸、编码自切割肽或引起核糖体跳跃的肽的核酸、和编码car的核酸。在一些实例中，多核苷酸包含编码变体icosl多肽的核酸、编码第一自切割肽或引起核糖体跳跃的肽的核酸、编码工程化tcrα链或工程化tcrβ链中的一个的核酸、编码第二自我切割肽或引起核糖体跳跃的肽的核酸，以及编码另一个工程化tcrα链或工程化tcrβ链的核酸。在一些方面，编码的第一和第二自切割肽是相同的。在任何所提供的实施方案中的一些中，自切割肽或引起核糖体跳跃的肽是t2a、p2a、e2a或f2a。

提供了包含任何所提供的多核苷酸的载体。在一些情况下，载体是病毒载体。在任何所提供的实施方案中的一些中，病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。

提供了一种工程化细胞，其包含任何所提供的多核苷酸或载体。还提供了一种工程化细胞，其包含任何所提供的变体icosl多肽、免疫调节蛋白或融合蛋白。

提供了一种工程化细胞，其包含任何所提供的核酸分子或载体。在一些情况下，编码变体icosl多肽、免疫调节蛋白或融合蛋白的核酸编码信号肽。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽、免疫调节蛋白或融合蛋白不包含跨膜结构域和/或不在细胞表面上表达。在任何所提供的实施方案中的一些中，变体icosl多肽、免疫调节蛋白或融合蛋白是从工程化细胞中分泌的。在一些方面，工程化细胞包含含有跨膜结构域的变体icosl多肽。在一些方面，变体icosl多肽在细胞表面上表达。

在任何所提供的实施方案中的一些中，细胞是免疫细胞。在一些情况下，免疫细胞是抗原呈递细胞(apc)或淋巴细胞。在一些实例中，工程化细胞是原代细胞。在一些情况下，该细胞是哺乳动物细胞。在一些情况下，该细胞是人类细胞。在任何所提供的实施方案中的一些中，淋巴细胞是t细胞。在一些实例中，工程化细胞是apc，并且apc是人工apc。

在任何所提供的实施方案中的一些中，所述工程化细胞还包含嵌合抗原受体(car)或工程化t细胞受体。

提供了一种感染原，其包含编码所提供的变体icosl多肽或所提供的免疫调节蛋白、所提供的融合蛋白的核酸分子。在一些情况下，编码的变体icosl多肽、免疫调节蛋白或融合蛋白不包含跨膜结构域和/或不在表达它的细胞的表面上表达。在任何所提供的实施方案中的一些中，编码的变体icosl多肽、免疫调节蛋白或融合蛋白当其被表达时从感染原中分泌。在一些情况下，编码的变体icosl多肽包含跨膜结构域。

在任何所提供的实施方案中的一些中，编码的变体icosl多肽在表达它的细胞的表面上表达。在一些情况下，感染原是细菌或病毒。在任何所提供的实施方案中的一些中，病毒是溶瘤病毒。在一些实例中，溶瘤病毒是腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、水泡性口炎病毒(vesticularstomaticvirus)、呼肠孤病毒、新城疫病毒、细小病毒、麻疹病毒、水泡性口炎病毒(vesticularstomatitisvirus)(vsv)、柯萨奇病毒或牛痘病毒。

在任何所提供的实施方案中的一些中，病毒特异性地靶向树突细胞(dc)和/或是树突细胞嗜性的。在一些情况下，该病毒是用修饰的辛德毕斯病毒包膜产物假型化的慢病毒载体。在任何所提供的实施方案中的一些中，感染原还包含编码另外的基因产物的核酸分子，所述另外的基因产物导致靶细胞死亡或可增强或加强免疫应答。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述另外的基因产物选自抗癌剂、抗转移剂、抗血管生成剂、免疫调节分子、免疫检查点抑制剂、抗体、细胞因子、生长因子、抗原、细胞毒性基因产物、促凋亡基因产物、抗凋亡基因产物、细胞基质降解基因、用于组织再生的基因或将人类体细胞重编程为多能性的基因。

提供了一种药物组合物，其包含任何所述变体icosl多肽、免疫调节蛋白、缀合物或融合蛋白或任何所提供的工程化细胞或感染原。在任何所提供的实施方案中的一些中，药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。在任何所提供的实施方案中的一些中，药物组合物是无菌的。

在任何所提供的实施方案中的一些中，提供了一种制品，其在小瓶中包含药物组合物。在一些情况下，小瓶是密封的。

提供了一种试剂盒，其包含任何所提供的组合物和使用说明。还提供了一种试剂盒，其包含任何所提供的制品和使用说明。

提供了一种调节受试者中的免疫应答的方法，该方法包括将药物组合物施用于该受试者。还提供了一种调节受试者中的免疫应答的方法，该方法包括施用工程化细胞。在一些情况下，工程化细胞对受试者而言是自体同源的。在任何所提供的实施方案中的一些中，工程化细胞对受试者而言是同种异体的。

在任何所提供的实施方案中的一些中，调节免疫应答治疗受试者的疾病或病况。在一些方面，免疫应答增加。

在任何所提供的实施方案中的一些中，将包含与肿瘤定位部分连接的变体icosl多肽的免疫调节蛋白或缀合物施用于受试者。在一些情况下，肿瘤定位部分是或包含识别肿瘤抗原的结合分子。在任何所提供的实施方案中的一些中，结合分子包含抗体或其抗原结合片段，或包含野生型igsf结构域或其变体。在任何所提供的实施方案中的一些中，将免疫调节蛋白或缀合物或融合蛋白施用于受试者。在任何所提供的实施方案中的一些中，将作为跨膜免疫调节蛋白的变体icosl多肽施用给受试者。在一些情况下，将包含作为跨膜免疫调节蛋白的变体icosl多肽的工程化细胞施用于受试者。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述疾病或病况是肿瘤或癌症。在一些实例中，所述疾病或病症选自黑素瘤、肺癌、膀胱癌、血液恶性肿瘤、肝癌、脑癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、脾癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌、肌肉骨骼癌、头和颈癌、胃肠道癌、生殖细胞癌或内分泌和神经内分泌癌。在任何所提供的实施方案中的一些中，免疫应答降低。

在任何所提供的实施方案中的一些中，将可溶的变体icosl多肽或免疫调节蛋白施用于受试者。在任何所提供的实施方案中的一些中，可溶性免疫调节蛋白是免疫调节fc融合蛋白。在任何所提供的实施方案中的一些中，将所提供的变体icosl多肽、免疫调节蛋白或融合蛋白施用于受试者。在任何所提供的实施方案中的一些中，将包含可分泌的变体icosl多肽的工程化细胞施用于受试者。在任何所提供的实施方案中的一些中，将所提供的工程化细胞施用于受试者。在任何所提供的实施方案中的一些中，任选在其中所述感染原感染肿瘤细胞或免疫细胞并且所述可分泌的免疫调节蛋白从被感染的细胞中分泌的条件下，将编码变体icosl多肽的感染原施用给所述受试者，所述变体icosl多肽为可分泌的免疫调节蛋白的。在任何所提供的实施方案中的一些中，所述疾病或病况是炎性或自身免疫性疾病或病况。在一些实例中，所述疾病或病况是抗中性粒细胞胞浆抗体(anca)相关的血管炎、血管炎、自身免疫性皮肤病、移植、风湿性疾病、炎性胃肠疾病、炎性眼病、炎性神经病、炎性肺部疾病、炎性内分泌疾病或自身免疫性血液病。在一些情况下，该疾病或病况选自炎性肠病、移植、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、哮喘、类风湿性关节炎或牛皮癣。

附图说明

图1描绘了阻抗结果，其反映了单独使用抗cd19嵌合抗原受体(car)或使用示例性跨膜免疫调节性tip(cd80-tip或icosl-tip)或相应的cd80或icosl野生型跨膜蛋白工程化的细胞在与靶抗原表达细胞共培养之后的细胞毒性杀伤活性。使用acea实时细胞分析仪(rtca)评估阻抗，该acea实时细胞分析仪测量96孔微电子板(e-板)的培养基中的阻抗变化。

图2a描绘了用编码car和tip蛋白二者的病毒有效地转导原代t细胞。将原代人t细胞用抗cd3加抗cd28珠粒激活48小时，然后用编码具有bfp报告基因的抗cd19car的慢病毒以及编码具有gfp报告基因的icosltip的第二慢病毒进行转导。fac图显示了y轴上的bfp表达和x轴上的gfp表达，并示出了落入每个象限的t细胞的百分比。结果显示，培养物包含仅car转导的细胞(左上象限)、仅tip转导的细胞(右下象限)、用两种病毒(右上象限)转导的细胞和未用任一种转导的细胞(左下)。在图2b中，在car-t细胞上表达的tip提供了对car-t细胞的共刺激。在经过或未经过tip共转导的car-t细胞用cell-tracefarred标记，并与cd19+nalm6细胞系一起孵育以使car接合。通过稀释了荧光染料的car表达细胞的百分比来评估增殖。与没有tip的那些细胞或用野生型icosl转导的细胞相比，用突变的tip转导的细胞显示car+t细胞的增殖增加。缺乏car表达的模拟物转导细胞在该测定中未能增殖。

图3a至图3b经由细胞因子释放显示了当与抗cd3共固定化时野生型(wt)或变体icosl的共刺激能力。将10nm抗cd3湿包被至具有40nm(箭头)或10nmwt或变体icosl的96孔平底聚苯乙烯组织培养板的孔中。加入100,000个纯化的cd4⁺和cd8⁺(全)t细胞，72小时后收获上清液，以用于针对细胞因子释放的elisa分析。图3a示出了ifn-γ且图3b示出了由全t细胞分泌的il-17蛋白水平。图表表示由全t细胞共刺激产生的典型ifn-γ和il-17应答。

图4a至图4b经由增殖显示了当与抗cd3共固定化时野生型(wt)或变体icosl的共刺激能力。如前所述，将cfse标记的全t细胞在抗cd3和icosl包被的培养板中孵育72小时。收获细胞，洗涤，用荧光缀合的抗cd4或抗cd8抗体染色，并通过流式细胞术分析。使用未刺激的对照cfse标记的t细胞设定门和细胞计数器电压。通过来自对照的cfse稀释来确定增殖。图4a示出了40nmicosl共刺激后总增殖(箭头)、cd4⁺(实心条)和cd8⁺细胞(阴影条)t细胞的百分比。图4b示出了10nmicosl共刺激后总全t细胞增殖的百分比。图表表示由全t细胞共刺激产生的典型增殖应答。

图5描绘了人混合淋巴细胞反应(mlr)中的icoslvigd候选功能。icosl变体及其突变，连同野生型icosl、阴性对照pdl2-fc和人igg，以及阳性对照基准分子ctla-ig贝拉西普一起在x轴上列出。跨越图中的线表示在阴性对照培养物的上清液中检测到的ifn-γ的基线量。对于每种icosl变体候选物或对照，测试了三种不同浓度，其中箭头表示培养物中蛋白质的最高浓度40nm。与贝拉西普相比，大多数icosl变体候选物在测试的所有三种浓度下显示出优异的拮抗活性，如那些培养物中较低浓度的ifn-γ所反映的。

图6a-6d描绘了在b-t共培养测定中可溶性icoslfc融合蛋白对b和t细胞应答的抑制。图6a描绘了可溶性icoslfc融合蛋白对t细胞驱动的b细胞增殖的抑制。来自单个供体的纯化的cd4+t细胞和b细胞进行cfse标记，并在存在或不存在指定的丝裂原的情况下以1:1的比例与或不与指定的icoslfc融合蛋白进行共孵育。用100ng/ml的葡萄球菌肠毒素b(seb)、1mg/ml的商陆丝裂原(pwm)或两者刺激细胞。icoslfc融合蛋白以40nm的终浓度包含在内，将培养物孵育7天，并进行facs分析。分裂的b细胞的数量由稀释其cfse的培养物中的细胞数确定。除野生型之外的所有icoslfc融合蛋白减少了b细胞增殖。图6b至图6d显示，icoslfc融合蛋白抑制b-t共培养物中的细胞因子t细胞细胞因子产生。在第7天收获来自上述培养物的上清液，并使用legendplexhumanthcytokinepanel(biolegend)分析细胞因子含量。通过包含icoslfc融合蛋白减少il-5(图6b)、il-13(图6c)和il-21(图6d)的t细胞产生。

图7a至图7f描绘了移植物抗宿主病(gvhd)的小鼠模型中的不同终点，其中人pbmc细胞过继转移至免疫缺陷性nsg鼠宿主中。图7a示出了治疗动物的存活曲线。在盐水对照动物中观察到侵袭性疾病过程和随后的死亡，其存活率与在用野生型icosl-fc以及n52h/i143ticosl变体治疗的动物中观察到的相似。变体n52h/n57y/q100p具有与临床基准贝拉西普相当的改善的存活率。图7b示出了在体重减轻方面类似的趋势，其中icosl变体n52h/n57y/q100p显示出与用贝拉西普治疗的动物相似的体重维持，但所有其他组都经历了快速的体重减轻。图7c示出了来自标准化gvhd疾病活动指数(dai)观察的临床评分，再次示出用icosl变体n52h/n57y/q100p治疗的动物的评分较低，其与临床基准贝拉西普相当，而其他动物组经历更高的dai评分。图7d描绘了在第14天测量的来自实验动物的血液中cd4和cd8百分比的流式细胞术测量结果。实验组之间cd8细胞的百分比大致相同，然而，与其他实验组相比，用icosl变体n52h/n57y/q100p和贝拉西普治疗的动物具有较低的cd4细胞百分比。

图7e描绘了来自测试额外的icosl变体分子的相似实验的存活曲线。图7f描绘了来自测试额外的icosl变体分子的相似实验的临床评分。

图8示出了由所示变体堆叠分子vigdc-l传递的局部共刺激活性，其中c表示icosl共刺激结构域，且l表示nkp30定位结构域。在该测定中，在抗cd3的存在下将表达定位表面蛋白b7-h6的靶k562细胞与人t细胞一起培养，并通过培养物上清液中的ifn-γ水平评估t细胞激活。包括单独的抗cd3或不包括堆叠变体fc分子不诱导t细胞激活。类似地，用单独的野生型定位nkp30结构域或单独的野生型共刺激icosl结构域作为fc融合蛋白来培养的细胞不导致t细胞激活。含有野生型形式的共刺激结构域和定位结构域的堆叠结构域诱导了所测最高浓度下的可测量的ifn-γ，然而，定位共刺激堆叠的变体在最高浓度下诱导了超过两倍的ifn-γ水平，并且降低浓度时仍观察到ifn-γ水平。

图9总结了来自迟发型超敏反应(dth)的标准模型的小鼠耳厚度的变化。用卵白蛋白致敏且随后用相同的蛋白质在耳朵中刺激pbs治疗的动物显示出最高水平的测量的耳肿胀。用临床基准阿巴西普治疗的小鼠在耳刺激后耳肿胀略有减轻。与阿巴西普相比，所有五个icosl变体治疗组均显示出相同或改善的耳肿胀减轻。

图10a至图10c描绘了与抗体(v-mab)缀合的变体igsf结构域(vigd)的各种示例性构型。图10a示出了各种构型，其中vigd直接或间接地与抗体的轻链的n-和/或c-末端连接。图10b示出了各种构型，其中vigd直接或间接地与抗体的重链的n-和/或c-末端连接。图10c描绘了当图10a的轻链和图10b的重链在细胞中共表达时所得的v-mab构型。

图11a至图11b显示了v-mab对于同源结合配偶体的特异性。在用dna瞬时转染的expi293细胞上进行结合测定，以用于人her2、cd28、ctla-4或icos的哺乳动物表面表达。将200,000个转染的细胞与100,000pm至100pm亲本抗体(c1)或各种v-mab(c2-9)一起孵育。去除未结合的抗体，用荧光缀合的抗人igg检测结合的抗体，并通过流式细胞术分析细胞的mfi和基于fc对照的阳性百分比。图11a示出了v-mab与her2转染子的结合水平与亲本抗体相似。由于在expi293亲本细胞上的低水平的内源her2表达，对于所有v-mab(但不是wticosl)观察到与模拟物转染细胞的结合。图11b显示，通过v-mab维持或增加亲本igsf结构域(n52h/n57y/q100p)与其同源配偶体的结合(c2、c3、c4、c5、c6、c8、c9)。

图12显示了当与抗cd3共固定化时v-mab共刺激和增殖能力。将10nm抗cd3湿包被至具有30nm至3nm亲本抗体、v-mab或fc对照的96孔平底聚苯乙烯组织培养板的孔中。加入cfse标记的全t细胞，保持72小时。通过elisa测量ifn-γ分泌，并通过cfse稀释的流式细胞术分析测量总t细胞增殖。ifn-γ分泌和igsf结构域(n52h/n57y/q100p)的增殖比wticosl更高。与亲本igsf相比，v-mab显示出增加的细胞因子和增殖共刺激能力。

图13a-图13c描绘了所提供的变体igsf结构域分子的各种形式。图13a描绘了可溶性分子，其包括(1)与fc链融合的变体igsf结构域(vigd)；(2)堆叠分子，其含有第一变体igsf结构域(第一vigd)和第二igsf结构域如第二变体igsf结构域(第二vigd)；(3)肿瘤靶向igsf分子，其含有第一变体igsf结构域(vigd)和靶向肿瘤抗原的igsf结构域如nkp30igsf结构域；以及(4)与抗体(v-mab)连接的变体igsf结构域(vigd)。图13b描绘了含有在细胞表面上表达的变体igsf结构域(vigd)的跨膜免疫调节蛋白(tip)，例如变体icosl。在一个示例性实施方案中，跨膜结合的vigd的同源结合配偶体是共刺激受体(例如cd28)，并且含有vigd(例如，icoslvigd)的tip激动共刺激受体，使得tip在表达共刺激受体的细胞中诱导阳性信号。图13c描绘了分泌的免疫调节蛋白(sip)，其中变体igsf结构域(vigd)(例如变体icosl)由细胞分泌，如第一t细胞(例如cart细胞)。在一个示例性实施方案中，分泌的vigd的同源结合配偶体是活化型受体，例如，cd28，其可以在第一细胞(例如t细胞，诸如cart细胞)和/或第二细胞(例如t细胞；内源性的或工程化的，如cart细胞)上表达。在sip与其同源结合配偶体结合后，经由活化型受体的信号传导被阻断。在所有情况下，vigd可以是单独的v结构域(igv)、v结构域(igv)和c结构域(igc)的组合(包括整个细胞外结构域(ecd))、或igsf超家族成员的ig结构域的任何组合。

图14描绘了与fc融合的变体igsf结构域(vigd)(vigd-fc)的活性的示例性示意图，其中vigd是icosl的igsf结构域的变体。如图所示，icosl的可溶性vigd与其同源结合配偶体相互作用以阻断cd80(b7-1)/cd86(b7-2)或icosl与cd28或icos的相互作用，从而阻断cd28和/或icos共刺激受体的共刺激。

图15描绘了用于将变体igsf结构域(vigd)定位于肿瘤细胞的堆叠分子的示例性示意图。在这种形式中，堆叠分子含有第一变体igsf结构域(第一vigd)和第二igsf结构域(例如第二vigd)，其中该第二igsf结构域(例如第二vigd)是与肿瘤抗原结合的靶向肿瘤的igsf结构域。示例性靶向肿瘤的igsf结构域是与肿瘤抗原b7-h6结合的nkp30的igsf结构域。在该描述中，vigd是icosl的igsf结构域的变体。如图所示，肿瘤靶向的igsf结构域与肿瘤细胞表面的结合将第一vigd定位于肿瘤细胞表面上，其中该第一vigd可以与相邻免疫细胞(例如t细胞)表面上表达的一种或多种其同源结合配偶体(例如cd28或icos)相互作用以刺激共刺激受体。

图16a描绘了含有第一变体igsf结构域(第一vigd)(例如变体icosl)和第二igsf结构域如第二变体igsf结构域(第二vigd)的堆叠分子的各种示例性构型。如图所示，第一vigd和第二igsf结构域直接或间接地单独与fc区的n-或c-末端连接。为了产生同二聚体fc分子，fc区是能够通过细胞中各个fc区的共表达而与匹配的fc区形成同二聚体的fc区。为了产生异二聚体fc分子，各个fc区含有突变(例如ch3结构域中的“隆突到穴中(knob-into-hole)”突变)，使得当各个fc区在细胞中共表达时，与同二聚体相比，异二聚体的形成是有利的。

图16b描绘了含有第一变体igsf结构域(第一vigd)、第二igsf结构域如第二变体igsf结构域(第二vigd)和第三igsf结构域如第三变体igsf结构域(第三vigd)的堆叠分子的各种示例性构型。如所示的，第一vigd、第二igsf和第三igsf结构域独立地直接或间接连接至fc区的n-或c-末端。为了产生同二聚体fc分子，fc区是能够通过各个fc区在细胞中共表达而与匹配的fc区形成同二聚体的fc区。

图17描绘了与抗体(v-mab)缀合的变体igsf结构域(vigd)的活性的示例性示意图，其中抗体(例如抗her2抗体)与肿瘤细胞表面上的抗原结合。在该描述中，vigd是icosl的igsf结构域的变体。如图所示，抗体与肿瘤细胞表面的结合将vigd定位于肿瘤细胞表面上，其中vigd可以与在相邻免疫细胞(例如t细胞)表面上表达的一种或多种其同源结合配偶体相互作用以激动受体信号传导。在所示的示例性实施方案中，变体igsf结构域(vigd)是icosl的igsf结构域的变体。icoslvigd与cd28或icos共刺激受体的结合提供激动剂或共刺激信号。

图18描绘了当10nm抗cd3与40nmfc对照蛋白、野生型icosl-fc、野生型cd80-fc、这两种蛋白质或具有所示突变的变体icoslfc融合蛋白一起孵育时原代人t细胞的nanostring转录特征。由收获的细胞制备来自样品的总rna，并将rna转移至nanostring，并使用cancerimmune芯片定量每个样品中750个基因的转录物。改变的转录物包括其水平在对角线上或对角线下的那些转录物，包括所指的转录物。

图19描绘了在各种免疫调节蛋白的存在下如图18中所述孵育所示时间后的示例性转录物的转录水平。

图20a至图20b显示当与her2表达靶标共培养时vmab介导的t细胞增殖。用k562衍生的人工靶细胞激活cfse标记的全t细胞，所述k562衍生的人工靶细胞在vmab或对照蛋白的存在下展示细胞表面抗cd3单链fv(okt3)和her2。通过在cd4⁺(左图)或cd8⁺(右图)染色的t细胞上的cfse稀释的流式细胞术分析来测量增殖。在图20a中，滴定k562细胞并用t细胞铺板，效应子:靶标(e:t)比例为40至1280:1。以1000pm加入vmab、亲本igsf结构域或wticosl。在图20b中，将k562细胞加入t细胞中，e:t比例为160:1。滴定vmab或对照蛋白并以3000至37pm加入。

图21描绘了在原代人t细胞中进行的用多种包含igsf结构域的跨膜免疫调节蛋白(tip)和示例性的重组e6特异性tcr转导的t细胞的增殖研究。

图22a-22g显示变体icoslfc融合分子的蛋白水解的sec分析，该变体icoslfc融合分子包含在多种参考序列中产生的突变n52h/n57y/q100r/f172s，参考序列例如截短的icoslecdfc融合蛋白、仅icosligv结构域的fc融合蛋白、和/或具有参照seqidno:32中所示的参考icosl细胞外域(ecd)序列的突变n207g/l208g的icosl变体fc融合蛋白。使用expicho-s衍生细胞表达分子。

图23a-23b描绘了使用表达包含ecd的变体icosltip的k652细胞刺激的cd4和cd8人t细胞的增殖，该ecd包含具有对应于n52h/n57y/q100p(seqidno:288)、n52h/n57y/q100r(seqidno:283)和e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r(seqidno:300)的氨基酸突变的亲和力修饰的igsf。

图24a描绘了v-mab与her2和cd28的结合。图24b至图24f描绘了利用使用具有il-2启动子萤光素酶报告基因的jurkat细胞的转染细胞系统进行vmab共刺激t细胞的结果，其表明在her2+k562/okt3细胞的存在下v-mab提供了显著的共刺激信号。

图25a至图25d描绘了堆叠fc融合分子与表达同源结合配偶体b7h6(图25a)、icos(图25b)、cd28(图25c)和ctla-4(图25d)的细胞的结合。

图26a至图26b描绘了示例性经测试的icosl/nkp30堆叠蛋白的生物活性研究。

图27描绘了通过对cd4+或cd8+染色的t细胞的cfse稀释的流式细胞术分析测量的由icosl/nkp30堆叠蛋白诱导的增殖。

图28描绘了测试的icosl/nkp30堆叠蛋白与mpd-1mab的组合的抗肿瘤作用。

图29a-29e描绘了在胶原诱导性关节炎(cia)模型中预防性给药示例性icosligv-fc融合分子的抗炎活性，包括平均总爪得分(图29a)、检测的ciiigg(图29b)、血清细胞因子水平(图29c)、cd44+活化的t细胞或tfh细胞(图29d)、以及引流淋巴结中b细胞的级分(图29e)。

图30a-30d描绘了在胶原诱导性关节炎(cia)模型中延迟给药示例性icosligv-fc融合分子的抗炎活性，包括平均总paw得分(图30a)和血清细胞因子水平(图30c-30d)。

图31a-31d描绘了在实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)模型中延迟给药示例性icosligv-fc融合分子的抗炎活性，包括eae得分(图31a)、腹股沟淋巴结t细胞的流式细胞术分析(图31c)和促炎细胞因子(图31d)。

图32a-32b描绘了用多种剂量(20、100或500μg)的变体icosligv-fc分子治疗的移植物抗宿主疾病(gvhd)小鼠的存活和dai得分。

图33a-33f描绘了在研究终点时在收集的血液中的(图33a)或在总t细胞计数(图33b)中的人细胞/小鼠细胞的移植物抗宿主疾病(gvhd)比率的流式细胞术分析，以及来自用多种剂量(20、100或500μg)的变体icosligv-fc分子治疗的移植物抗宿主疾病(gvhd)小鼠的icos+cd4+或cd8+细胞(图33c-33d)、或cd28+cd4+或cd8+细胞(图33e-33f)的评定。

图34a-34b描绘了来自用多种剂量(20、100或500μg)的变体icosligv-fc分子治疗的移植物抗宿主疾病(gvhd)小鼠的活化或耗竭标志物的表达。

图34c描述了用各种剂量(20、100或500μg)的变体icosligv-fc分子治疗的移植物抗宿主疾病(gvhd)小鼠的t效应细胞(teff)与t调节细胞(treg)的比率。

图35a-35d描绘了来自用多种剂量(20、100或500μg)的变体icosligv-fc分子治疗的移植物抗宿主疾病(gvhd)小鼠的血清促炎细胞因子。图35e描绘了在gvhd模型中与正常小鼠相比变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)的血清暴露。

图36a描绘了dai结果，并且图36b描绘了在cd4+cd45rb高诱导的结肠炎模型中，用示例性变体icosligv-fc治疗对根据体重和粪便得分计算得到的疾病活性指数(dai)的组织学结果。

详述

本文提供了免疫调节蛋白，它是icos配体(icosl)或其特异性结合片段的变体或突变体或它包含icos配体(icosl)或其特异性结合片段的变体或突变体，该变体或突变体显示出与至少一种靶配体同源结合配偶体(也称为反结构蛋白)结合的活性。在一些实施方案中，与参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽相比，变体icosl多肽含有一个或多个氨基酸修饰(例如，氨基酸取代、缺失或添加)。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代、缺失或添加)位于参考(未修饰的)或野生型icosl多肽的免疫球蛋白超家族(igsf)结构域(例如igv)中。在一些实施方案中，变体icosl多肽对至少一种同源结合配偶体(如icos、cd28或ctla-4中的至少一种)显示出改变的例如增加或降低的结合活性或亲和力。在一些实施方案中，免疫调节蛋白是可溶的。在一些实施方案中，免疫调节蛋白是能够在细胞表面上表达的跨膜免疫调节蛋白。在一些实施方案中，本文还提供了一种或多种其他免疫调节蛋白，其是含有本文提供的变体icosl多肽和一种或多种其他部分或多肽的缀合物或融合物。

在一些实施方案中，变体icosl多肽和免疫调节蛋白调节免疫应答，如增加或降低免疫应答。在一些实施方案中，本文提供的变体icosl多肽和免疫调节蛋白可用于治疗与失调的免疫应答相关的疾病或病况。

在一些实施方案中，所提供的变体icosl多肽经由与共刺激信号传导分子的相互作用调节t细胞活化。通常，抗原特异性t-细胞活化需要两种不同的信号。第一信号由t细胞受体(tcr)与抗原呈递细胞(apc)上存在的主要组织相容性复合物(mhc)相关抗原的相互作用提供。第二信号是对tcr参与的共刺激并且是避免t细胞凋亡或无反应性所必需的。

在一些实施方案中，在正常生理条件下，t细胞介导的免疫应答由t细胞受体(tcr)的抗原识别引起，并通过共刺激和抑制信号(例如免疫检查点受体)的平衡来调节。免疫系统依靠免疫检查点受体来预防自身免疫(即自身耐受)并在免疫应答期间例如在对病原体感染的攻击期间保护组织免受过度损伤。然而，在一些情况下，这些免疫调节蛋白可能在包括肿瘤在内的疾病和病况中失调，这是一种逃避免疫系统的机制。

在一些实施方案中，已知的t细胞共刺激受体是cd28，其是配体b7-1(cd80)和b7-2(cd86)的t细胞共刺激受体，两者都存在于apc上。与对于cd28的亲和力相比，这些相同的配体也可以以更大的亲和力与抑制性t细胞受体ctla4(细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4)结合；与ctla-4的结合起到下调免疫应答的作用。icos(诱导型共刺激分子)是另一种t-细胞共刺激受体，它与apc上的icos配体(icosl)结合。在一些情况下，已知cd28和ctla-4在某一个结合位点与icosl相互作用，该结合位点同icosl与t细胞共刺激受体icos的结合重叠(yao等人(2011)immunity,34:729-740)。虽然cd28和icos是相关的cd28家族激活受体并且共用一些细胞内信号传导基序，但cd28与icos之间的共刺激作用不同。例如，cd28在未激活和激活的t细胞上表达，并且其信号传导对于il-2产生和随后的t细胞效应子功能是重要的。直到t细胞激活后，icos通常不在t细胞表面表达，并且通过激活的t细胞上的icos的信号传导支持特化t细胞亚群分化。因此，在一些情况下，cd28和icos的共刺激产生重叠和互补效应。

在一些方面，t细胞表达共刺激分子cd28和icos，cd28和icos分别与抗原呈递细胞(apc)上的cd80/cd86和icosl相互作用。在淋巴器官中，专业的apc(即树突状细胞、巨噬细胞和b细胞)表达cd80、cd86和icosl，并啮合cd28+/icos+t细胞。在一些实施方案中，活化的t细胞然后可以分化成效应细胞，例如cd8+细胞毒性t细胞(ctl)、分泌il-17a/f的cd4+th17细胞或cd4+滤泡辅助细胞(tfh)。表达cd40l的tfh啮合淋巴滤泡中的b细胞，并释放诱导b细胞分化为分泌抗体(ab)的浆细胞的细胞因子(例如il-21)。浆细胞可产生破坏组织的抗体(例如人类中的类风湿因子(rf)和抗瓜氨化抗体(acpa))和小鼠中的抗胶原(cii)抗体，其可形成免疫复合物并沉积在关节和其他组织中。icosl也可以在非专职性apc上表达，从而导致非淋巴样组织中的t细胞活化并进一步破坏组织和关节。

在一些方面，cd4+th1-、th9-和th17-细胞(其通过增加多发性硬化症和实验性自身免疫性脑脊髓炎二者中的cns内的炎症而被认为是对多发性硬化症(ms)的关键贡献者)以及cd4+icos+cxcr5+t辅助性滤泡细胞在细胞复发缓解型的pbmc中有所增加，并且与继发进行性ms中的疾病进展关联。在一些实施方案中，在继发进行性ms中，脑脊髓液细胞中icos基因表达显著增加，并且观察到总单核细胞和表达icosl的单核细胞的百分比增加。icosl还可以在非专职性apc上表达，从而导致非淋巴样组织中的t细胞活化和进一步的组织损伤。

所提供的变体icosl多肽是当被参考icosl多肽的igsf结构域的一个或多个氨基酸修饰修饰时，对cd28和/或icos表现出增强的结合亲和力的多肽。在一些情况下，所提供的变体中icos结合的总体增加小于cd28结合的增加，这是因为野生型icosl已经证实了对icos的结合亲和力明显大于对cd28的结合亲和力。还提供了所提供的变体多肽的各种形式。如本文所示，替代形式可以促进免疫应答的操纵，从而促进治疗应用。例如，本文显示以可溶性形式递送增强的icosl蛋白通过抑制cd28和/或icos信号传导来拮抗t细胞活化。在其他实例中，变体icosl分子系连至表面会通过提供共刺激信号来促进t细胞活化。提供了多种系连策略来定位t细胞共刺激信号的传递，包括但不限于直接包被到塑料上、使用另一种变体igsf结构域以定位到板结合的或细胞表面表达的蛋白靶标上，或将变体icosl融合至肿瘤特异性单克隆抗体。

在一些实施方案中，与其他治疗相比，通过所提供的变体icosl多肽和免疫调节多肽实现的免疫信号传导的调节为炎性和自身免疫性病症以及其他疾病和病况的治疗提供了优势。在一些情况下，干预和改变两种受体的共刺激作用的疗法受到空间定向要求以及免疫突触边界产生的大小限制的束缚。在一些方面，现有的治疗药物(包括抗体药物)可能不能与参与调节这些相互作用的多种靶蛋白同时相互作用。此外，在一些情况下，现有的治疗药物可能仅具有拮抗而非激动免疫应答的能力。另外，单独地靶向这两种受体中的一种或另一种的药物之间的药代动力学差异可能在整个治疗过程中难以适当地维持这种药物组合的所需血液浓度。

在一些实施方案中，所提供的变体icosl多肽或免疫调节蛋白调节(例如增加或减少)由共刺激受体cd28或icos诱导的免疫活性。因此，在一些实施方案中，所提供的多肽通过以下方式克服了这些限制：提供对cd28和icos以及在一些情况下对ctla-4具有改变的(例如增加的或降低的)结合亲和力的变体icosl(诱导型共刺激分子配体)，从而激动或拮抗受体共刺激的互补作用。还提供了制备和使用这些变体icosl的方法。

在一些方面，所提供的分子也可以比其他可溶性治疗性蛋白质药剂更有效。例如，已证明阿巴西普(ctla-4-fc)会干扰t细胞共刺激以减弱自身免疫性疾病环境中的t细胞应答，例如用于治疗类风湿性关节炎、银屑病关节炎和幼年特发性关节炎，而贝拉西普(belatacept)是一种变体ctla-4-fc分子用于移植排斥。但是，这些ctla-4-fc蛋白与cd80和cd86结合并阻止这些共刺激配体啮合并触发仅cd28。在一些情况下，本文提供的变体icosl多肽对cd28和icos均表现出结合亲和力和增强的活性。

此外，根据上下文，以各种构型形成变体多肽以拮抗或激动免疫应答的能力，基于变体icosl对结合配偶体的相同增加的结合和活性，在治疗应用中提供了灵活性。在一些实施方案中，可以针对期望的治疗应用选择特定的形式。例如，如上所述，包含变体icosl多肽的免疫调节多肽以例如以下形式提供：作为fc融合蛋白，以拮抗或阻断其同源结合配偶体例如icos和/或cd28的活性。在一些实施方案中，通过cd28或icos阻断或抑制共刺激信号传导可用于抑制免疫应答，其可用于治疗炎性或自身免疫性病症(例如，多发性硬化或脑部炎症)或器官移植。作为示例，将变体icosl蛋白系连到表面可以递送局部共刺激信号，在一些方面，其可以用于靶向肿瘤组织以将局部共刺激递送至肿瘤浸润的t细胞。大多数原发性肿瘤缺乏共刺激分子如cd80、cd86或icosl的表达，因此缺乏共刺激能够损害t细胞的抗肿瘤应答(yu等人(1998)int.immunol.10:791-797)。通过使用肿瘤定位部分(例如定位至b7h6肿瘤细胞的nkp30或肿瘤特异性抗体)将共刺激结构域定位于肿瘤细胞，可以在不存在肿瘤表达的共刺激蛋白的情况下增强t细胞应答。

本说明书中提及的所有出版物(包括专利，专利申请、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用其全文并入本文，其程度如同具体地和单独地指出每个单独的出版物(包括专利、专利申请、科学文章或数据库)通过引用并入。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐述的定义相反或不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。

这里使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。

i.定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术术语和科学术语或用词旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于引用而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的这些定义不必被解释为代表与本领域通常所理解的意义有实质性差异。

除非在特定情况下另有限制，否则本说明书中使用的术语定义如下。如在本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文清楚地另外指明。除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语、缩略词和缩写具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。除非另有说明，否则化学和生物化学名称的缩写和符号均为iupac-iub命名法。除非另有说明，否则所有数值范围都包括定义该范围的值以及中间的所有整数值。

在免疫球蛋白超家族结构域的上下文中使用的术语“亲和力修饰的”意指具有改变的氨基酸序列(相对于相应的野生型亲本或未修饰的igsf结构域)的哺乳动物免疫球蛋白超家族(igsf)结构域，使得与亲本野生型或未修饰的(即，非亲和力修饰的)igsf对照结构域相比，该哺乳动物免疫球蛋白超家族(igsf)结构域具有对至少一个其同源结合配偶体(或者“反结构”)的增加或降低的结合亲和力或亲合力。在该上下文中包括亲和力修饰的icosligsf结构域。在一些实施方案中，亲和力修饰的igsf结构域可含有参考(例如未修饰的)或野生型igsf结构域中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸差异，如氨基酸取代。结合亲和力或亲合力的增加或降低可使用公知的结合测定法如流式细胞术来测定。larsen等人,americanjournaloftransplantation,vol5:443-453(2005)。还参见，linsley等人,immunity,vol1:793-801(1994)。蛋白质与其一个或多个同源结合配偶体的结合亲和力或亲合力的增加是达到比野生型igsf结构域对照的结合亲和力或亲合力高至少10％的值，并且在一些实施方案中，比野生型igsf结构域对照值高至少20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、500％、1000％、5000％或10000％。蛋白质对其同源结合配偶体中的至少一个的结合亲和力或亲合力的降低是不大于对照的90％但不小于野生型igsf结构域对照值的10％的值，并且在一些实施方案中，不大于野生型igsf结构域对照值的80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％但不小于野生型igsf结构域对照值的10％。通过氨基酸残基的取代、添加或缺失，改变亲和力修饰的蛋白质的一级氨基酸序列。术语“亲和力修饰的igsf结构域”不应解释为对产生亲和力修饰的igsf结构域的任何特定起始组合物或方法施加任何条件。因此，本发明的亲和力修饰的igsf结构域不限于野生型igsf结构域，该野生型igf结构域随后通过任何特定的亲和力修饰过程转化为亲和力修饰的igsf结构域。亲和力修饰的igsf结构域多肽可以例如从野生型哺乳动物igsf结构域序列信息开始产生，随后在计算机模拟中针对与其同源结合配偶体的结合进行建模，最后重组或化学合成以产生亲和力修饰的igsf结构域组合物。但在一个替代例子中，亲和力修饰的igsf结构域可以通过野生型igsf结构域的定点诱变产生。因此，亲和力修饰的igsf结构域表示产物，而不必是由任何给定方法产生的产物。可以使用多种技术，包括重组方法、化学合成或其组合。

本文所用的术语“同种异体的”意指从一种生物体中取出并随后输注或过继转移至相同物种的在遗传上不同的生物体中的细胞或组织。在本发明的一些实施方案中，该物种是鼠或人。

本文所用的术语“自体同源的”意指从后来输注或过继转移的相同生物体中取出的细胞或组织。可以通过例如重组dna方法改变自体同源的细胞或组织，使得其与从生物体取出的天然细胞或天然组织不再在遗传上相同。例如，天然自体同源t细胞可以通过重组dna技术进行遗传工程化，以成为表达跨膜免疫调节蛋白和/或嵌合抗原受体(car)的自体同源工程化细胞，该自体同源工程化细胞在一些情况下涉及将t细胞或til工程化(肿瘤浸润淋巴细胞)。然后将工程化细胞输注到患者中，该患者是从中分离天然t细胞的患者。在一些实施方案中，该生物体是人或鼠。

本文所用的术语“结合亲和力”和“结合亲合力”分别意指蛋白质在特定结合条件下对其反结构的特异性结合亲和力和特异性结合亲合力。在生物化学动力学中，亲合力是指单独非共价结合相互作用(如icosl与其反结构icos和/或cd28之间)的多个亲和力的累积强度。因此，亲合力不同于亲和力，亲和力描述单个相互作用的强度。测定了含有亲和力修饰的icosligsf结构域的变体icosl与其反结构的结合亲和力相对于未修饰的icosl(如含有天然或野生型igsf结构域如igv结构域的未修饰的icosl)的结合亲和力的增加或降低。测定结合亲和力或亲合力的方法是本领域已知的。参见例如larsen等人,americanjournaloftransplantation,第5卷:443-453(2005)。在一些实施方案中，本发明的变体icosl(即含有亲和力修饰的igsf结构域的icosl蛋白)以一定的结合亲和力特异性地结合至通过流式细胞术测量的cd28和/或icos，该结合亲和力在如实施例6中所述的结合测定中产生比野生型icosl对照至少大10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的平均荧光强度(mfi)值。

术语“生物半衰期”是指物质(如包含本发明的变体icosl的免疫调节多肽)丧失其药理学或生理学活性或浓度的一半所花费的时间。生物半衰期可受到物质的消除、排泄、降解(例如，酶促)或在身体的某些器官或组织中的吸收和浓缩的影响。在一些实施方案中，可以通过测定物质的血浆浓度达到其稳态水平的一半所花费的时间(“血浆半衰期”)来评估生物半衰期。可用于衍生化和增加本发明多肽的生物半衰期的缀合物是本领域已知的，并且该缀合物包括但不限于聚乙二醇(peg)、羟乙基淀粉(hes)、xten(延伸的重组肽；参见，wo2013130683、人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)，脂质(酰化)和聚-pro-ala-ser(pas)、聚谷氨酸(谷氨酰胺化)。

本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“car”是指在哺乳动物细胞上表达的人工(即人造)跨膜蛋白，其至少包含胞外域、跨膜和胞内域。任选地，car蛋白包括“间隔区”，其将胞外域与跨膜结构域共价连接。间隔区通常是经由肽键将胞外域与跨膜结构域连接的多肽。car通常在哺乳动物淋巴细胞上表达。在一些实施方案中，car在哺乳动物细胞上表达，如t细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(til)。在t细胞上表达的car在本文中称为“cart细胞”或“car-t”。在一些实施方案中，car-t是t辅助细胞、细胞毒性t细胞、天然杀伤t细胞、记忆t细胞、调节性t细胞或γδt细胞。当在临床上用于例如过继细胞转移时，具有对患者肿瘤的抗原结合特异性的car-t通常被工程化为在从患者获得的天然t细胞上表达。然后将表达car的工程化t细胞输注回患者体内。因此，car-t通常是自体同源car-t，但同种异体car-t也包括在本发明的范围内。car的胞外域包含抗原结合区，例如抗体或其抗原结合片段(例如scfv)，其在生理条件下特异性地结合至靶抗原(例如肿瘤特异性抗原)。特异性结合后，生物化学系列事件(即，信号转导)导致car-t的免疫活性的调节。因此，例如，car-t的抗原结合区与其靶抗原的特异性结合可以导致如细胞毒性、增殖或细胞因子产生的变化所反映的t细胞活性的免疫活性的变化。在一些实施方案中，通过参与天然哺乳动物t细胞中的信号转导的cd3-ζ链(“cd3-z”)实现car-t活化后的信号转导。car-t还可包含多个信号传导结构域，如cd28、41bb或ox40，以进一步调节t细胞的免疫调节应答。cd3-z包含称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)的保守基序，该保守基序参与t细胞受体信号转导。

当关于在体外测定中由两种或更多种变体icosl的存在诱导的细胞因子产生使用时，术语“共同地”或“共同的”意指总体细胞因子表达水平，而与由单个变体icosl诱导的细胞因子产生无关。在一些实施方案中，待测定的细胞因子是如实施例6和实施例7中所述的体外原代t细胞测定中的ifn-γ。

关于多肽，如关于变体icosl的igsf结构域的术语“同源结合配偶体”(与“反结构”可互换使用)，是指引用的多肽在特异性结合条件下特异性结合的至少一种分子(通常是天然哺乳动物蛋白质)。在一些方面，含有亲和力修饰的igsf结构域的变体icosl特异性地结合至相应的天然或野生型icosl的反结构，但以增加或减弱的亲和力特异性地结合。在特异性结合条件下识别并特异性地结合其同源受体的配体种类是该受体的反结构或同源结合配偶体的例子。“同源细胞表面结合配偶体”是在哺乳动物细胞表面上表达的同源结合配偶体。“细胞表面分子种类”是免疫突触(is)的配体的同源结合配偶体，其在细胞(如哺乳动物细胞)上且由细胞表达，从而形成免疫突触。

如本文所用，“缀合物”、“缀合”或其语法变型是指通过本领域已知的任何接合或连接方法将两种或更多种化合物接合或连接在一起，从而导致另一种化合物的形成。它还可以指通过将两种或更多种化合物接合或连接在一起而产生的化合物。例如，直接或间接地与一个或多个化学部分或多肽连接的变体icosl多肽是示例性缀合物。这种缀合物包括融合蛋白、由化学缀合物产生的那些融合蛋白和通过任何其他方法产生的那些融合蛋白。

如本文所用的术语“竞争性结合”意指蛋白质能够特异性地结合至至少两个同源结合配偶体，但一个同源结合配偶体的该特异性结合抑制如阻止或妨碍同时结合第二同源结合配偶体。因此，在一些情况下，蛋白质不可能同时结合两个同源结合配偶体。通常，竞争性结合物含有用于特异性结合的相同或重叠的结合位点，但该结合位点不是所需的。在一些实施方案中，竞争性结合由于第二同源结合配偶体的特异性结合而引起蛋白质与其同源结合配偶体之一的特异性结合的可测量的抑制(部分或完全)。已知多种方法用于量化竞争性结合，如elisa(酶联免疫吸附测定)测定。

本文所用的术语“保守氨基酸取代”意指氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链r基团的另一氨基酸残基取代。具有相似化学性质的侧链的氨基酸基团的例子包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代基团是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。

关于蛋白质位置的术语“对应于”，如以下叙述：核苷酸或氨基酸位置“对应于”公开序列中的核苷酸或氨基酸位置，如序列表中所述，是指基于结构序列比对或使用标准比对算法(如gap算法)在与公开序列比对时鉴定的核苷酸或氨基酸位置。例如，相应的残基可以通过如本文所述的结构比对方法将参考序列与seqidno:32(ecd结构域)所示或seqidno:196或545(igv结构域)所示的序列进行比对来确定。通过比对序列，本领域技术人员可以例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导来鉴定相应的残基。

本文所用的术语“降低”或“减弱”或“抑制”意指统计学上显著的量的降低。降低可以是对照数值(诸如非零对照数值)的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

如本文所用，在降低哺乳动物淋巴细胞的免疫学活性的上下文下，术语“降低”或“减少”是指与对照相比降低淋巴细胞的一种或多种活性，该对照例如未经治疗的对照或其中在相同条件下采用使用未经修饰或非变体对照进行治疗的对照。降低的活性可以指细胞周期抑制、减少的细胞存活、减少的细胞增殖、减少的细胞因子产生或减少的t细胞细胞毒性中的一种或多种，例如减少统计学上显著的量。在一些实施方案中，提到减少的免疫学活性是指与没有治疗的情况相比减少干扰素γ(ifn-γ)的产生，例如减少统计学上显著的量。在一些实施方案中，可以在混合淋巴细胞反应(mlr)测定中评估免疫学活性。进行mlr测定的方法是本领域已知的。wang等,cancerimmunolres.2014sep:2(9):846-56。评估淋巴细胞活性的其他方法是本领域已知的，包括本文所述的任何测定法。在一些实施方案中，增强可以是相较于对照值(诸如未处理的对照值或非零对照值)降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

术语“衍生物”或“衍生的”是指通过将蛋白质直接或间接地与组合物共价连接来修饰蛋白质，以在保持或增强其治疗益处的同时改变生物半衰期、生物利用度、免疫原性、溶解性、毒性、效力、功效等特征。本发明的免疫调节多肽的衍生物在本发明的范围内，并且可以通过例如糖基化、聚乙二醇化、脂化或fc-融合来制备。

如本文所用，结构域(通常为三个或更多个，通常为5或7个或更多个氨基酸的序列，如10至200个氨基酸残基)是指分子如蛋白质或编码核酸的一部分，该部分在结构上和/或功能上与分子的其他部分不同并且是可识别的。例如，结构域包括多肽链的那些部分，该多肽链的那些部分可以在由一个或多个结构基序构成的蛋白质内形成独立折叠的结构和/或通过功能活性(如结合活性)识别。蛋白质可以具有一个或多于一个不同的结构域。例如，可以通过与相关家族成员的一级序列或结构的同源性(如与基序的同源性)来鉴定、定义或区分结构域。在另一个例子中，结构域可以通过其功能进行区分，如与生物分子(如同源结合配偶体)相互作用的能力。结构域可以独立地显示出生物学功能或活性，使得结构域可以独立地执行活性或与另一分子融合来执行活性，例如结合活性。结构域可以是氨基酸的线性序列或氨基酸的非线性序列。许多多肽含有多个结构域。这些结构域是已知的，并且可以由本领域技术人员鉴定。为了本文的示例，提供了定义，但应理解，通过名称识别特定结构域在本领域技术范围内。如果需要，可以使用适当的软件来鉴定结构域。

如本文所用的术语“胞外域”是指位于囊泡膜外的膜蛋白(如跨膜蛋白)的区域。胞外域通常包含特异性地结合至配体或细胞表面受体的结合结构域，如特异性地结合至配体或细胞表面受体的结合结构域。细胞跨膜蛋白的胞外域可替代地称为细胞外结构域。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指本发明的治疗组合物(包括蛋白质组合物或细胞组合物)的量和/或浓度，当单独(即作为单一疗法)或与另外治疗剂组合离体(通过与来自患者的细胞接触)或在体内(通过向患者给药)给药时，该治疗组合物例如通过改善或消除该疾病的症状和/或病因产生统计学上疾病进展的显著降低。有效量可以是缓解、减轻或缓和与疾病或病症相关的至少一种症状或生物反应或效应，防止疾病或病症的进展，或改善患者的身体功能的量。在细胞疗法的情况下，有效量是通过过继细胞疗法向患者给予的有效剂量或细胞数。在一些实施方案中，患者是哺乳动物，例如非人灵长类动物或人类患者。

如本文所用的术语“胞内域”是指在延伸至由细胞表面膜限定的内部空间中的一些膜蛋白(如跨膜蛋白)中发现的区域。在哺乳动物细胞中，胞内域是膜蛋白的细胞质区域。在细胞中，胞内域与细胞内成分相互作用并且可以在信号转导中发挥作用，因此，在一些情况下，该胞内域可以是细胞内信号传导结构域。细胞跨膜蛋白的胞内域可替代地称为细胞质结构域，在一些情况下，其可以是细胞质信号传导结构域。

如本文中在增加哺乳动物淋巴细胞的免疫活性的上下文中使用的术语“增强的”或“增加的”意指与对照(例如未经治疗的对照或其中在相同条件下采用使用未经修饰或非变体对照进行治疗的对照)相比，增加淋巴细胞的一种或多种活性。增加的活性可以是增加细胞存活、细胞增殖、细胞因子产生或t细胞细胞毒性中的一种或多种，如增加统计学上显著的量。在一些实施方案中，提及增加的免疫活性意指增加干扰素γ(ifn-γ)产生，如增加统计学上显著的量。在一些实施方案中，可以在混合淋巴细胞反应(mlr)测定中评估免疫活性。进行mlr测定的方法是本领域已知的。wang等人,cancerimmunolres.2014年9月:2(9):846-56。评估淋巴细胞活性的其他方法是本领域已知的，包括本文所述的任何测定。在一些实施方案中，增强可以是与非零对照值相比至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％或500％的增加。

如本文所用的术语“工程化细胞”是指已通过人为干预(如通过重组dna方法或病毒转导)进行遗传修饰的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞，如淋巴细胞(例如t细胞、b细胞、nk细胞)或抗原呈递细胞(例如树突细胞)。该细胞可以是来自患者的原代细胞或可以是细胞系。在一些实施方案中，本发明的工程化细胞包含本文提供的变体icosl。在一些实施方案中，变体icosl是在工程化细胞上表达的跨膜免疫调节蛋白(下文称为“tip”)。在一些实施方案中，该tip包含细胞外结构域或其部分，其含有与跨膜结构域(例如icosl跨膜结构域)连接的igv结构域以及任选的细胞内信号传导结构域。在一些情况下，tip被格式化为含有异源细胞质信号传导结构域或胞内域的嵌合受体。在一些实施方案中，工程化细胞能够表达和分泌如本文所述的免疫调节蛋白。在提供的工程化细胞中，还有进一步含有工程化t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)的细胞。

如本文所用的术语“工程化t细胞”是指t细胞，如t辅助细胞、细胞毒性t细胞(或者，细胞毒性t淋巴细胞或ctl)、天然杀伤t细胞、调节性t细胞、记忆t细胞或γδt细胞，这些t细胞已经通过人为干预如通过重组dna方法或病毒转导方法进行了遗传修饰。工程化t细胞包含本发明的变体icosl跨膜免疫调节蛋白(tip)或分泌的免疫调节蛋白(sip)，其在t细胞上表达并且被工程化为调节工程化t细胞自身或哺乳动物细胞的免疫活性，该哺乳动物细胞与在t细胞上表达的icosl特异性结合。工程化t细胞可包含本发明的变体icosl分泌的免疫调节蛋白，该分泌的免疫调节蛋白由该t细胞表达和/或分泌，并且被工程化以调节该工程化t细胞自身或哺乳动物细胞的免疫学活性，其中当由该t细胞分泌变体icosl时该哺乳动物细胞与变体icosl特异性结合。

术语“工程化t细胞受体”或“工程化tcr”是指被工程化为与主要组织相容性复合物(mhc)/肽靶抗原以所需的亲和力特异性地结合的t细胞受体(tcr)，其通常用于过继性免疫疗法，该主要组织相容性复合物(mhc)/肽靶抗原被选择、克隆和/或随后引入t细胞群中。与工程化tcr相反，car被工程化为以不依赖于mhc的方式结合靶抗原。

如本文所用的术语“在......上表达”用于指在细胞如哺乳动物细胞的表面上表达的蛋白质。因此，蛋白质被表达为膜蛋白。在一些实施方案中，表达的蛋白质是跨膜蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质与小分子部分如药物或可检测标记缀合。在细胞表面上表达的蛋白质可包括细胞表面蛋白质，如在哺乳动物细胞上表达的细胞表面受体。

术语“半衰期延长部分”是指多肽融合物或化学缀合物的部分，与未与该部分缀合的蛋白质的半衰期相比，该部分延长了在哺乳动物血清中流通的蛋白质的半衰期。在一些实施方案中，半衰期延长大于或大于约1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍或6.0倍。在一些实施方案中，与不具有半衰期延长部分的蛋白质相比，在体内给药后半衰期延长超过6小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时、超过72小时、超过96小时或超过1周。半衰期是指蛋白质丧失其浓度、量或活性的一半所需的时间。例如，可以通过使用elisa测定或活性测定来确定半衰期。示例性的半衰期延长部分包括fc结构域、多聚化结构域、聚乙二醇(peg)、羟乙基淀粉(hes)、xten(延伸的重组肽；参见，wo2013130683)、人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)、脂质(酰化)和聚-pro-ala-ser(pas)和聚谷氨酸(谷氨酰胺化)。

本文所用的术语“免疫突触”(“immunologicalsynapse”或“immunesynapse”)意指表达mhci(主要组织相容性复合物)或mhcii的哺乳动物细胞(如抗原呈递细胞或肿瘤细胞)与哺乳动物淋巴细胞(如效应t细胞或自然杀伤(nk)细胞)之间的界面。

免疫球蛋白分子的fc(可结晶片段)区域或结构域(也称为fc多肽)主要对应于免疫球蛋白重链的恒定区，并且负责各种功能，包括一种或多种抗体的效应子功能。fc结构域含有免疫球蛋白分子的铰链结构域的部分或全部以及ch2和ch3结构域。fc结构域可以形成通过一个或多个二硫键接合的两条多肽链的二聚体。在一些实施方案中，fc是变体fc，其显示出降低(例如降低大于30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的活性以促进效应子功能。在一些实施方案中，除非参考特定的seqidno进行描述，否则提及fc区域中的氨基酸取代是通过eu编号系统。eu编号是已知的，并且按照最新更新的imgtscientificchart(国际immunogeneticshttp://www.imgt.org/imgtscientificchart/numbering/hu_ighgnber.html(创建：2001年5月17日，最后更新：2013年1月10日)和kabat,e.a.等人sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.第5版usdepartmentofhealthandhumanservices,nih公开号91-3242(1991))。

免疫球蛋白fc融合物(“fc-融合物”)，如免疫调节fc融合蛋白，是包含与免疫球蛋白的fc区域可操作地连接的一种或多种多肽(或一种或多种小分子)的分子。fc融合物可包含例如抗体的fc区域(其促进效应子功能和药代动力学)和变体icosl。免疫球蛋白fc区域可以间接或直接地与一种或多种变体icosl或小分子(融合配偶体)连接。各种接头是本领域已知的，并且可任选地用于将fc与融合配偶体连接以产生fc融合物。可以将相同种类的fc融合物二聚化以形成fc融合同二聚体，或使用不同种类形成fc融合异二聚体。在一些实施方案中，fc是哺乳动物fc，如鼠或人fc。

术语“宿主细胞”是指可用于表达由重组表达载体编码的蛋白质的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌，或者它可以是真核生物，例如，单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞或其衍生物如在无血清培养基中生长的veggiecho和相关细胞系或缺乏dhfr的cho菌株dx-b11。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)。

如本文所用的术语“免疫球蛋白”(缩写“ig”)是指哺乳动物免疫球蛋白，其包括五种人类抗体中的任何一种：iga(其包括iga1和iga2子类)、igd、ige、igg(其包括子类igg1、igg2、igg3和igg4)和igm。该术语还包括小于全长的免疫球蛋白，无论是完全或部分合成(例如，重组或化学合成)还是天然产生的，如抗原结合片段(fab)、含有vh和vl的可变片段(fv)、含有连接在一条链中的vh和vl的单链可变片段(scfv)，以及其他抗体v区域片段，如fab′、f(ab)2、f(ab′)2、dsfv双抗体、fc和fd多肽片段。双特异性抗体(同双特异性和异双特异性)包括在该术语的含义内。

本文所用的术语“免疫球蛋白超家族”或“igsf”意指参与细胞的识别、结合或粘附过程的细胞表面和可溶性蛋白质的组。基于与免疫球蛋白(即抗体)共有的结构特征，分子被归类为该超家族的成员；它们都具有称为免疫球蛋白结构域或折叠的结构域。igsf的成员包括免疫系统的细胞表面抗原受体、共受体和共刺激分子、参与将抗原呈递给淋巴细胞的分子、细胞粘附分子、某些细胞因子受体和细胞内肌肉蛋白。它们通常与免疫系统中的作用相关。免疫突触中的蛋白质通常是igsf的成员。igsf也可以基于共有特性如功能被分类为“亚家族”。这些亚家族通常由4至30个igsf成员组成。

本文所用的术语“igsf结构域”或“免疫球蛋白结构域”或“ig结构域”是指igsf蛋白的结构域。ig结构域以免疫球蛋白分子命名。它们含有约70-110个氨基酸，并根据其大小和功能进行分类。ig结构域具有特征性ig-折叠，其具有由两条反平行β链形成的夹心样结构。夹心内侧的疏水性氨基酸与b链和f链中半胱氨酸残基之间形成的高度保守的二硫键之间的相互作用稳定了ig-折叠。ig结构域的一端具有称为互补决定区的区段，其对于抗体对其配体的特异性是重要的。ig类结构域可以归类为(分类)：igv、igc1、igc2或igi。大多数ig结构域是可变的(igv)或恒定的(igc)。具有9个β链的igv结构域通常比具有7个β链的igc结构域长。igsf的一些成员的ig结构域类似于氨基酸序列中的igv结构域，但其大小与igc结构域相似。这些称为igc2结构域，而标准igc结构域称为igc1结构域。t细胞受体(tcr)链在细胞外部分含有两个ig结构域；在n-末端的一个igv结构域和与细胞膜临近的一个igc1结构域。icosl含有两个ig结构域：igv和igc。

本文所用的术语“igsf种类”意指具有相同或基本相同的一级氨基酸序列的igsf成员蛋白质的集合。每个哺乳动物免疫球蛋白超家族(igsf)成员定义了属于该igsf成员的所有igsf种类的独特身份。因此，每个igsf家族成员独特于其他igsf家族成员，因此，特定igsf家族成员的每个种类独特于另一个igsf家族成员的种类。然而，由于翻译后修饰(如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化)的差异，可能发生具有相同igsf种类的分子之间的变异。另外，由于基因多态性导致的单个igsf种类内的微小序列差异构成单个igsf种类内的另一种变异形式，如由于例如蛋白水解裂解导致的野生型截短形式的igsf种类。“细胞表面igsf种类”是在细胞(通常是哺乳动物细胞)的表面上表达的igsf种类。

本文在哺乳动物淋巴细胞如t细胞的上下文中使用的术语“免疫活性”是指一种或多种细胞存活、细胞增殖、细胞因子产生(例如干扰素-γ)或t细胞细胞毒性活性。在一些情况下，免疫活性可意指它们的细胞因子如趋化因子或白细胞介素的表达。用于确定增强或抑制免疫活性的测定包括测量培养上清液中干扰素-γ细胞因子水平的mlr(混合淋巴细胞反应)测定(wang等人,cancerimmunolres.2014年9月:2(9):846-56)、seb(葡萄球菌肠毒素b)t细胞刺激测定(wang等人,cancerimmunolres.2014年9月:2(9):846-56)和抗cd3t细胞刺激测定(li和kurlander,jtranslmed.2010:8:104)。由于t细胞活化与ifn-γ细胞因子的分泌有关，因此可以使用商业elisa试剂盒通过这些体外人t细胞测定来检测培养上清液中的ifn-γ水平(wu等人,immunollett2008年4月15日；117(1):57-62)。免疫应答的诱导导致免疫活性相对于静止淋巴细胞增加。如本文提供的免疫调节蛋白，如含有亲和力修饰的igsf结构域的变体icosl多肽在一些实施方案中可以在原代t细胞测定中相对于野生型igsf成员或igsf结构域对照增加，或者在替代实施方案中减少ifn-γ(干扰素-γ)表达。本领域技术人员将认识到，用于确定ifn-γ表达增加的原代t细胞测定的形式将不同于用于测定ifn-γ表达减少的形式。在测定本发明的免疫调节蛋白或亲和力修饰的igsf结构域在原代t细胞测定中减少ifn-γ表达的能力时，可以如实施例6中所述使用混合淋巴细胞反应(mlr)测定。方便地，本发明的可溶形式的亲和力修饰的igsf结构域可同样如实施例6中所述用于测定其拮抗并因此减少mlr中ifn-γ表达的能力。或者，在测定本发明的免疫调节蛋白或亲和力修饰的igsf结构域在原代t细胞测定中增加ifn-γ表达的能力时，可以使用共固定化测定。在共固定化测定中，在一些实施方案中通过抗cd3抗体提供的t细胞受体信号与共固定化亲和力修饰的igsf结构域(如变体icosl)联合使用，以测定相对于野生型igsf结构域对照增加ifn-γ表达的能力。测定工程化细胞的免疫活性的方法，包括评估变体icosl跨膜免疫调节蛋白的活性的方法，是本领域已知的，并且该活性包括但不限于在抗原刺激后扩增t细胞的能力，在没有再刺激的情况下维持t细胞扩增的能力，以及在适当的动物模型中维持抗癌活性的能力。测定还包括评估细胞毒性的测定，包括标准⁵¹cr释放测定(参见例如milone等人,(2009)moleculartherapy17:1453-1464)，或基于流动的细胞毒性测定，或基于阻抗的细胞毒性测定(peper等人(2014)journalofimmunologicalmethods,405:192-198)。

“免疫调节多肽”或“免疫调节蛋白”是调节免疫活性的多肽或蛋白质分子。“调节”(“modulation”或“modulating”)免疫应答是指增加或降低免疫活性。免疫调节蛋白可以是单个多肽链或具有通过例如链间二硫键彼此共价键合的至少两个多肽链的多聚体(二聚体或更高级多聚体)。因此，单体、二聚体和更高级多聚体多肽在所定义的术语范围内。多聚体多肽可以是同型多聚体(相同多肽链)或异多聚体(非相同多肽链)。本发明的免疫调节蛋白包含变体icosl。

本文所用的术语“增加”意指增加统计学上显著的量。增加可以是比非零对照值大至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％或更大。

icosl的“同种型”(诱导型共刺激分子配体；cd275)是氨基酸序列不同的多种天然存在的icosl多肽之一。同种型可以是由单个基因表达的rna转录物的剪接变体的产物，或高度相似但不同的基因的表达产物，从而产生功能相似的蛋白质，如可以从基因复制中产生。如本文所用，术语icosl的“同种型”还指icosl基因的不同等位基因(例如，icoslg)的产物。

本文所用的术语“淋巴细胞”意指哺乳动物免疫系统中白细胞的三种亚型中的任何一种。它们包括天然杀伤细胞(nk细胞)(其在细胞介导的细胞毒性先天免疫中起作用)、t细胞(用于细胞介导的细胞毒性适应性免疫)和b细胞(用于体液、抗体驱动的适应性免疫)。t细胞包括：t辅助细胞、细胞毒性t细胞、自然杀伤t细胞、记忆t细胞、调节性t细胞或γδt细胞。先天淋巴细胞(ilc)也包括在淋巴细胞的定义中。

术语“哺乳动物”或“患者”具体包括提及以下内容中的至少一种：人、黑猩猩、恒河猴、食蟹猴、狗、猫、小鼠或大鼠。

如本文所用的术语“膜蛋白”意指在生理条件下直接或间接地附接于脂质双层的蛋白质。形成膜的脂质双层可以是生物膜，如真核(例如哺乳动物)细胞膜或人工(即人造)膜，如在脂质体上发现的膜。膜蛋白附接于脂质双层可以通过共价附接，或通过非共价相互作用，如疏水或静电相互作用。膜蛋白可以是完整的膜蛋白或外周膜蛋白。膜蛋白(外周膜蛋白)非共价附接于脂质双层或非共价附接于整合膜蛋白。外周膜蛋白形成与脂质双层的临时附接，使得在哺乳动物生理条件的范围内，外周膜蛋白可以与脂质双层缔合和/或解离。与外周膜蛋白相反，整合膜蛋白形成与膜脂质双层基本永久性附接，使得在哺乳动物生理条件的范围内，整合膜蛋白不从它们与脂质双层的附接中解离。膜蛋白可通过脂质双层的一层形成与膜的附接(单面)，或通过膜的两层附接(多面)。与仅一个脂质双层相互作用的完整膜蛋白是“整合的单面蛋白”。与脂质双层的两层相互作用的完整膜蛋白是“整合的多面蛋白”，其在本文中可替代地称为“跨膜蛋白”。

本文在免疫应答(如哺乳动物免疫应答)的上下文中使用的术语“调节”(“modulating”或“modulate”)是指由于给予包含本发明的变体icosl的免疫调节多肽或由于给予表达免疫调节蛋白(如本发明的变体icosl跨膜免疫调节蛋白)的工程化细胞而发生的现有或潜在的免疫应答的任何改变，如增加或减少。因此，它指的是与在不给予包含变体icosl的免疫调节蛋白或表达这种免疫调节多肽的细胞的情况下发生或存在的免疫应答相比，免疫应答的改变，如增加或减少。这种调节包括免疫细胞免疫活性的程度或范围的任何诱导、激活、抑制或改变。免疫细胞包括b细胞、t细胞、nk(自然杀伤)细胞、nkt细胞、专业抗原呈递细胞(apc)和非专业抗原呈递细胞，以及炎性细胞(中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)。调节包括对现有免疫应答、发展中的免疫应答、潜在免疫施加的任何改变，或对诱导、调节、影响或响应免疫应答的能力施加的任何改变。调节包括作为免疫应答的一部分的免疫细胞中基因、蛋白质和/或其他分子的表达和/或功能的任何改变。免疫应答的调节或免疫活性的调节包括例如以下内容：免疫细胞的消除、缺失或隔离；可调节其他细胞如自身反应性淋巴细胞、抗原呈递细胞或炎性细胞的功能能力的免疫细胞的诱导或生成；在免疫细胞中诱导无反应状态(即无反应性)；增强或抑制免疫细胞的活性或功能，包括但不限于改变由这些细胞表达的蛋白质的模式。例子包括某些类别的分子如细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、激酶、共刺激分子或其他细胞表面受体的改变的产生和/或分泌，或这些调节事件的任何组合。可以例如通过相对于原代t细胞测定中的野生型icosl对照的ifn-γ(干扰素γ)表达的改变来评估调节(参见，zhao和ji,expcellres.2016jan1；340(1)132-138)。例如，可以通过工程化细胞的免疫活性的改变来评估调节，如相对于用野生型icosl跨膜蛋白工程化的细胞，工程化细胞的细胞毒性活性的改变或工程化细胞的细胞因子分泌的改变。

本文所用的术语“分子种类”意指具有相同或基本相同的一级氨基酸序列的蛋白质的集合。每个哺乳动物免疫球蛋白超家族(igsf)成员定义了相同或基本相同的分子种类的集合。因此，例如，人icosl是igsf成员，并且每个人icosl分子是icos的分子种类。由于翻译后修饰(如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化)的差异，可能发生具有相同分子种类的分子之间的变异。另外，由于基因多态性导致的单个分子种类内的微小序列差异构成单个分子种类内的另一种变异形式，如由于例如蛋白水解裂解导致的野生型截短形式的单个分子种类。“细胞表面分子种类”是在哺乳动物细胞表面上表达的分子种类。两种或更多种不同种类的蛋白质据称彼此呈“顺式”或“顺式构型”，其中每种蛋白质仅存在于形成is的两种哺乳动物细胞的一种或仅另一种(但不是两种)。两种不同种类的蛋白质据称彼此呈“反式”或“反式构型”，其中第一种仅存在于形成is的两种哺乳动物细胞之一，第二种仅存在于形成is的两种哺乳动物细胞中的第二种。在形成is的两种哺乳动物细胞上存在的两种不同种类的蛋白质在这些细胞上呈顺式和反式构型。

术语“多聚化结构域”是指促进多肽分子与一种或多种另外的多肽分子稳定相互作用的氨基酸序列，每个多肽分子含有互补的多聚化结构域(例如第一多聚化结构域和第二多聚化结构域)，该多聚化结构域可以是相同或不同的多聚化结构域。互补的多聚化结构域之间的相互作用(例如第一多聚化结构域与第二多聚化结构域之间的相互作用)形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用以产生该多肽分子与另外的多肽分子的多聚物。在一些情况下，多聚化结构域是相同的，并且与自身相互作用以在两个多肽链之间形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。通常，多肽直接或间接地与多聚化结构域接合。示例性的多聚化结构域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区和相容的蛋白质间相互作用结构域。例如，多聚化结构域可以是免疫球蛋白恒定区或结构域，例如来自igg的fc结构域或其部分，包括igg1、igg2、igg3或igg4亚型、iga、ige、igd和igm及其修饰的形式。

术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，是指单链或双链形式的核酸残基(例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物。除非特别限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物且具有与其相似的结合特性，并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢的核酸。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补核苷酸序列以及明确指出的序列(“参考序列”)。具体地，简并密码子取代可以通过生成序列来实现，其中一个或多个选择(或所有)的密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代。术语核酸或多核苷酸包括由基因编码的cdna或mrna。

本文所用的术语“非竞争性结合”是指蛋白质与至少两个同源结合配偶体同时特异性地结合的能力。因此，蛋白质能够同时与至少两个不同的同源结合配偶体结合，但结合相互作用不需要相同的持续时间，使得在一些情况下，蛋白质仅与同源结合配偶体中的一个特异性地结合。在一些实施方案中，结合在特定结合条件下发生。在一些实施方案中，同时结合使得一个同源结合配偶体的结合基本上不抑制与第二同源结合配偶体的同时结合。在一些实施方案中，非竞争性结合意指将第二同源结合配偶体与其在蛋白质上的结合位点结合不会取代第一同源结合配偶体与其在蛋白质上的结合位点的结合。评估非竞争性结合的方法是本领域公知的，如perezdelalastra等人,immunology,1999年4月:96(4):663–670中描述的方法。在一些情况下，在非竞争性相互作用中，第一同源结合配偶体在不与第二同源结合配偶体的相互作用位点重叠的相互作用位点处特异性地结合，使得第二同源结合配偶体的结合不直接干扰第一同源结合配偶体的结合。因此，第二同源结合配偶体的结合对同源结合配偶体的结合的任何影响是通过直接干扰第一同源结合配偶体的结合以外的机制。例如，在酶-底物相互作用的情况下，非竞争性抑制剂与酶的活性位点以外的位点结合。非竞争性结合包括非竞争性结合相互作用，其中第二同源结合配偶体在相互作用位点特异性结合，该相互作用位点不与第一同源结合配偶体的结合重叠，但仅在第一相互作用位点被第一同源结合配偶体占据时与第二相互作用位点结合。

术语“药物组合物”是指适用于哺乳动物受试者(通常是人)的药物用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂(例如，包含变体icosl的免疫调节多肽或表达变体icosl跨膜免疫调节蛋白的工程化细胞)和载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂或稀释剂通常分别是药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的分子链。这些术语不是指产品的特定长度。因此，“肽”和“寡肽”包括在多肽的定义内。该术语包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。该术语还包括分子，其中包括可以合成或使用已知蛋白质工程化技术重组表达的一种或多种氨基酸类似物或非经典或非天然氨基酸。此外，蛋白质可以衍生化。

本文所用的术语“原代t细胞测定”是指用于测量干扰素-γ(“ifn-γ”)表达的体外测定。各种这样的原代t细胞测定是本领域已知的，如实施例7中所述的原代t细胞测定。在优选的实施方案中，使用的测定是抗cd3共固定化测定。在该测定中，通过采用或不采用另外的重组蛋白固定的抗cd3刺激原代t细胞。在通常24-72小时的时间点处收获培养上清液。在另一个实施方案中，使用的测定是mlr。在该测定中，用同种异体apc刺激原代t细胞。在通常24-72小时的时间点收获培养物上清液。通过标准elisa技术测量培养物上清液中的人ifn-γ水平。商业试剂盒可从供应商处获得，并且根据制造商的推荐进行测定。

应用于核酸(如编码本发明的免疫调节蛋白的核酸)的术语“纯化的”通常表示基本上不含通过本领域公知的分析技术测定的其他组分的核酸或多肽(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经过密度梯度离心的介质中形成离散的条带)。例如，在电泳凝胶中基本上产生一个条带的核酸或多肽是“纯化的”。本发明的纯化的核酸或蛋白质纯度为至少约50％纯，通常至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、99％或更高的纯度(例如，重量或摩尔百分比)。

术语“重组”表示已通过人为干预进行人工(即非天然)改变的材料(例如，核酸或多肽)。可以对在其自然环境或状态内的材料进行改变或从其自然环境或状态取出的材料进行改变。例如，“重组核酸”通过例如在克隆、亲和力修饰、dna改组或其他公知的分子生物学过程中重组核酸来制备。“重组dna分子”由通过这种分子生物学技术接合在一起的dna区段组成。如本文所用的术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指使用重组dna分子表达的蛋白质分子。“重组宿主细胞”是含有和/或表达重组核酸或通过基因工程化改变的细胞，如通过向细胞中引入编码重组蛋白(如本文提供的跨膜免疫调节蛋白)的核酸分子。真核生物中的转录控制信号包含“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由dna序列的短阵列组成，这些dna序列与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用。已经从多种真核来源分离了启动子和增强子元件，该真核来源包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞和病毒中的基因(类似的控制元件，即启动子，也见于原核生物中)。特定启动子和增强子的选择取决于用于表达感兴趣的蛋白质的细胞类型。本文所用的术语“可操作组合”、“可操作顺序”和“可操作地连接”是指核酸序列以产生能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子的方式或方向连接核酸序列。

如本文所用的术语“重组表达载体”是指dna分子，其含有所需编码序列和在特定宿主细胞中表达可操作地连接的编码序列所必需的合适核酸序列。在原核生物中表达所必需的核酸序列包括启动子、任选操纵子序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和多腺苷酸化信号。分泌信号肽序列还可以任选地由重组表达载体编码，该重组表达载体与重组蛋白如重组融合蛋白的编码序列可操作地连接，使得表达的融合蛋白可以由重组宿主细胞分泌，以更容易地从细胞中分离融合蛋白(如果需要的话)。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入了其的宿主细胞的基因组中的载体。在该载体中有病毒载体，如慢病毒载体。

术语“选择性”是指与另一种底物如主题蛋白质的不同的同源结合配偶体的特异性结合相比，主题蛋白质或多肽对于一种底物如一种同源结合配偶体的特异性结合的倾向。选择性可以反映为主题蛋白质和第一底物如第一同源结合配偶体(例如kd1)的结合活性(例如结合亲和力)与相同主题蛋白质和第二同源结合配偶体(例如，kd2)的结合活性(例如结合亲和力)的比。

如本文所用的术语“序列同一性”分别指核苷酸或氨基酸水平上的基因或蛋白质之间的序列同一性。“序列同一性”是氨基酸水平上的蛋白质之间的同一性的量度和核苷酸水平上的核酸之间的同一性的量度。当序列比对时，可以通过比较每个序列中给定位置的氨基酸序列来确定蛋白质序列同一性。类似地，当序列比对时，可以通过比较每个序列中给定位置的核苷酸序列来确定核酸序列同一性。用于比较的序列比对的方法是本领域公知的，这样的方法包括gap、bestfit、blast、fasta和tfasta。blast算法计算序列同一性百分比并对两个序列之间的相似性进行统计分析。用于进行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)网站公开获得。

本文所用的关于蛋白质的术语“可溶的”意指蛋白质不是膜蛋白。通常，可溶性蛋白质仅含有igsf家族成员受体的细胞外结构域或其一部分，但不含有跨膜结构域和/或不能在细胞表面上表达，该部分含有一个或多个igsf结构域或其特异性结合片段。在一些情况下，蛋白质的溶解性可以通过直接或间接地经由接头与fc结构域连接或附接来改善，在一些情况下，fc结构域也可以改善蛋白质的稳定性和/或半衰期。在一些方面，可溶性蛋白质是fc融合蛋白。

本文所用的关于多肽或核酸的术语“种类”意指具有相同或基本相同的序列的分子的集合。由于翻译后修饰(如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化)的差异，可能发生具有相同种类的多肽之间的变异。在氨基末端或羧基末端与全长种类相差(或编码相差)不超过1、2或3个氨基酸残基的略微截短的多肽序列被认为是单一种类。这种微观异质性是制造蛋白质的共同特征。

本文所用的关于全长野生型哺乳动物icosl多肽或其igv或igc结构域的术语“特异性结合片段”意指具有igv和/或igc结构域的子序列，并且在体外和/或体内与哺乳动物icos和/或哺乳动物cd28(如人或鼠icos或cd28)特异性结合的多肽。在一些实施方案中，icosligv或icosligc的特异性结合片段为全长野生型序列的序列长度的至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。可以依次改变特异性结合片段以形成本发明的变体icosl。

本文所用的术语“特异性结合”意指蛋白质在特定结合条件下与靶蛋白结合的能力，使得其亲和力或亲合力是相同蛋白质对于足够统计尺寸的一系列随机肽或多肽的平均亲和力或亲合力的5倍，但任选至少10、20、30、40、50、100、250或500倍或甚至至少1000倍。特异性结合蛋白不需要专一地与单个靶分子结合，但由于靶标与非靶标(例如，旁系同源物或直系同源物)之间的结构构象的相似性，可以特异性结合非靶分子。本领域技术人员将认识到，与在不同动物物种中具有相同功能的分子(即直系同源物)特异性结合或与具有与靶分子基本相似的表位的非靶分子(例如，旁系同源物)的特异性结合是可能的，并且不会降低相对于统计学上有效的一系列独特非靶标(例如随机多肽)确定的结合特异性。由于交叉反应性，因此本发明的多肽可以与多于一种的不同种类的靶分子特异性结合。固相elisa免疫测定或biacore测量可用于确定两种蛋白质之间的特异性结合。通常，两种结合蛋白之间的相互作用具有小于1×10^-5m的解离常数(kd)，并且通常低至1×10^-12m。在本公开的某些实施方案中，两种结合蛋白之间的相互作用具有1x10^-6m、1x10^-7m、1x10^-8m、1x10^-9m、1x10^-10m或1x10^-11m的解离常数。

关于表达多肽的哺乳动物细胞的术语“表面表达”(surfaceexpresses)、“表面表达”(surfaceexpression)或“在表面上表达”意指多肽表达为膜蛋白。在一些实施方案中，膜蛋白是跨膜蛋白。

如本文所用，关于合成核酸分子或合成基因或合成肽的“合成的”是指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。

如本文所用的术语“靶向部分”是指共价或非共价附接于或物理上包封包含本发明变体icosl的多肽的组合物。在一些实施方案中，靶向部分对靶分子(诸如在细胞上表达的靶分子)具有特异性结合亲和力。通常，靶分子位于特定组织或细胞类型上。靶向部分包括：抗体、抗原结合片段(fab)、含有vh和vl的可变片段(fv)、含有连接在一条链中的vh和vl的单链可变片段(scfv)，以及其他抗体v区域片段，如fab′、f(ab)2、f(ab′)2、dsfv双抗体、纳米抗体、可溶性受体、受体配体、亲和力成熟受体或配体以及小分子(<500道尔顿)组合物(例如，特异性结合受体组合物)。靶向部分也可以共价或非共价附接于包封本发明多肽的脂质体的脂质膜。

本文所用的术语“跨膜蛋白”是指基本上或完全跨越脂质双层的膜蛋白，如在生物膜如哺乳动物细胞中或在人工构建体如脂质体中发现的那些脂质双层。跨膜蛋白包含跨膜结构域(“跨膜结构域”)，该跨膜蛋白通过跨膜结构域整合至脂质双层中，并且通过该跨膜结构域的整合在生理条件下是热力学稳定的。跨膜结构域通常可以通过其氨基酸序列经由任何数量的可商购生物信息学软件应用基于其相对于与水性环境(例如胞质溶胶、细胞外液)相互作用的蛋白质区域提高的疏水性来预测。跨膜结构域通常是跨越膜的疏水性α螺旋。跨膜蛋白可以一次或多次穿过脂质双层的两层。跨膜蛋白包括本文所述的所提供的跨膜免疫调节蛋白。除跨膜结构域外，本发明的跨膜免疫调节蛋白还包含胞外域，并且在一些实施方案中，还包含胞内域。

本文所用的术语“治疗”(“treating”、“treatment”或“therapy”)意指通过单独给予本发明的治疗组合物(例如含有免疫调节蛋白或工程化细胞)或与本文所述的另一种化合物组合给予来减缓、停止或逆转疾病或病症进展，如通过临床或诊断症状的减少、中止或消除所证明的。“治疗”(“treating”、“treatment”或“therapy”)还意指急性或慢性疾病或病症中症状的严重性降低，或例如在复发或缓解自身免疫疾病病程的情况下复发率的降低，或在自身免疫疾病的炎性方面的情况下炎症的减少。如本文在癌症的上下文中所使用的，术语“治疗”或“抑制”(“inhibit”、“inhibiting”或“inhibition”)癌症是指以下内容中的至少一种：肿瘤生长速率的统计上显著的降低、肿瘤停止生长或肿瘤的大小、质量、代谢活动或体积的减少，如通过标准(例如但不限于实体肿瘤的反应评估标准(recist)，无进展生存期的统计上显著的增加(pfs)或总生存期(os))测量。在本发明的上下文中使用的疾病或病症的“预防”(“preventing”、“prophylaxis”或“prevention”)是指单独给予本发明的免疫调节多肽或工程化细胞或与另一种化合物组合给予，以预防疾病或病症或者疾病或病症的部分或全部症状的发生或发作，或者降低疾病或病症发作的可能性。

如本文所用的术语“肿瘤特异性抗原”或“tsa”是指主要存在于哺乳动物受试者的肿瘤细胞上但通常在哺乳动物受试者的正常细胞上未发现的反结构。肿瘤特异性抗原不必是肿瘤细胞所独有的，但具有肿瘤特异性抗原的特定哺乳动物细胞的百分比足够高或肿瘤表面上肿瘤特异性抗原的水平足够高，以使其可以被抗肿瘤治疗剂如本发明的免疫调节多肽靶向，并且可以预防或治疗哺乳动物免受肿瘤的影响。在一些实施方案中，在来自具有肿瘤的哺乳动物的细胞的随机统计样品中，显示tsa的至少50％的细胞是癌性的。在其他实施方案中，显示tsa的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的细胞是癌性的。

关于变体icosl所用的术语“变体”(也称为“修饰的”或“突变的”)意指icosl，如通过人为干预产生的哺乳动物(例如人或鼠)icosl。变体icosl是相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl具有改变的氨基酸序列的多肽。变体icosl是通过一个或多个修饰(诸如一个或多个氨基酸取代、缺失、添加或其组合)而不同于参考icosl(例如野生型icosl同种型序列)的多肽。为了本文的目的，变体icosl含有至少一个亲和力修饰的结构域，其中一个或多个氨基酸差异发生在igsf结构域(例如igv结构域)中。变体icosl可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸差异，如氨基酸取代。变体icosl多肽通常显示出与相应的参考(例如未修饰的icosl)或野生型(例如与seqidno:5的序列、其成熟序列或其部分，该部分含有其细胞外结构域或igsf结构域)至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在一些实施方案中，变体icosl多肽显示出与相应的参考(例如未修饰的)或野生型icosl，诸如seqidno:32或seqidno:196或545中所示的参考icosl至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。非天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸包括在允许的取代或添加的范围内。变体icosl不限于任何特定的制备方法，并且包括例如从头化学合成、从头重组dna技术或其组合。本发明的变体icosl特异性地结合至哺乳动物物种的cd28、icos和/或ctla-4。在一些实施方案中，与参考(例如未修饰的)或野生型icosl蛋白相比，改变的氨基酸序列导致对icos和/或cd28的结合亲和力或亲合力改变(即，增加或降低)。结合亲和力或亲合力的增加或降低可使用公知的结合测定法如流式细胞术来测定。larsen等人,americanjournaloftransplantation,第5卷:443-453(2005)。还参见，linsley等人,immunity,vol.1(9):793-801(1994)。变体icosl对icos和/或cd28的结合亲和力或亲合力的增加是比参考(例如未修饰的)或野生型icosl的结合亲和力或亲合力大至少5％的值，并且在一些实施方案中，比参考(例如未修饰的)或野生型icosl对照值的结合亲和力或亲合力大至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、100％。icosl对icos和/或cd28的结合亲和力或亲合力的降低是不大于野生型对照值的95％的值，并且在一些实施方案中，不大于野生型icos和/或cd28对照值的80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或不可检测的结合亲和力或亲合力。通过氨基酸残基的取代、添加或缺失，改变变体icosl的一级氨基酸序列。在变体icosl的上下文中的术语“变体”不应解释为对产生变体icosl的任何特定起始组合物或方法施加任何条件。例如，变体icosl可以从参考icosl或野生型哺乳动物icosl序列信息开始产生，随后在计算机模拟中针对与icos和/或cd28的结合进行建模，最后重组或化学合成以产生本发明的变体icosl。但在一个替代例子中，变体icosl可以通过参考(例如未修饰的)或野生型icosl的定点诱变产生。因此，变体icosl表示组合物，并且不必是由任何给定方法产生的产物。可以使用多种技术，包括重组方法、化学合成或其组合。

本文所用的关于生物材料(如核酸分子、蛋白质(例如，icosl)、igsf成员、宿主细胞等)使用的术语“野生型”或“天然的”(“natural”或“native”)是指那些生物材料。

ii.变体icosl多肽

本文提供了对一种或多种icosl同源结合配偶体显示出改变的(增加或降低的)结合活性或亲和力的变体icosl多肽。在一些实施方案中，icosl同源结合配偶体是cd28、icos或ctla-4中的一个或多个。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的icosl多肽或含有免疫球蛋白超家族(igsf)结构域或其特异性结合片段的野生型或未修饰的icosl的一部分，变体icosl多肽含有一个或多个氨基酸修饰，如免疫球蛋白超家族(igsf)结构域(igd)中的一个或多个取代(或者，“突变”或“替代”)、缺失或添加。因此，提供的变体icosl多肽是变体igd(下文称为“vigd”)或包含变体igd，其中该一个或多个氨基酸修饰(例如取代)位于igd中。

在一些实施方案中，igd包含igv结构域或igc(例如igc2)结构域或igv结构域或igc(例如igc2)结构域的特异性结合片段，或其组合。在一些实施方案中，igd可以是单独的igv，igv和igc的组合，包括整个细胞外结构域(ecd)或icosl的ig结构域的任何组合。表2提供了对应于icosl的igv或igc区域的示例性残基。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含igv结构域或igc结构域或其特异性结合片段，其中该至少一个氨基酸修饰(例如，取代)位于igv结构域或igc结构域或其特异性结合片段中。在一些实施方案中，由于改变的结合活性或亲和力，igv结构域或igc结构域是亲和力修饰的igsf结构域。

在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)icosl序列的序列，在又一个igsf结构域中修饰变体。在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)icosl序列是野生型icosl。在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)或野生型icosl具有天然icosl或其直系同源物的序列。在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)或野生型icosl是icosl的细胞外结构域(ecd)或其部分或包含icosl的细胞外结构域(ecd)或其部分，该部分含有一个或多个igsf结构域(参见表2)。在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽的细胞外结构域包含igv结构域和一个或多个igc结构域。然而，变体icosl多肽不需要包含igv结构域和一个或多个igc结构域。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含igv结构域或其特异性结合片段，或基本上由igv结构域或其特异性结合片段组成。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含igc结构域或其特异性结合片段或基本上由igc结构域或其特异性结合片段组成。在一些实施方案中，变体icosl是可溶的并且缺乏跨膜结构域。在一些实施方案中，变体icosl还包含跨膜结构域，并且在一些情况下，还包含细胞质结构域。

在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)或野生型icosl序列是哺乳动物icosl序列。在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)或野生型icosl序列可以是哺乳动物icosl，该哺乳动物包括但不限于人、小鼠、食蟹猴或大鼠。在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)或野生型icosl序列是人的。

在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)或野生型icosl序列具有(i)seqidno:5所示的氨基酸序列或其缺乏信号序列的成熟形式，(ii)显示出与seqidno:5至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列或其成熟形式，或(iii)是(i)或(ii)的一部分，其含有igv结构域或igc结构域或其特异性结合片段。

在一些实施方案中，参考icosl序列是icosl的细胞外结构域或其部分或包含icosl的细胞外结构域或其部分。在一些实施方案中，参考或野生型icosl多肽包含seqidno:32所示的氨基酸序列或其直系同源物。

dtqekevramvgsdvelscacpegsrfdlndvyvywqtsesktvvtyhipqnsslenvdsryrnralmspagmlrgdfslrlfnvtpqdeqkfhclvlsqslgfqevlsvevtlhvaanfsvpvvsaphspsqdeltftctsingyprpnvywinktdnslldqalqndtvflnmrglydvvsvlriartpsvnigccienvllqqnltvgsqtgndigerdkitenpvstgeknaat(seqidno:32)

在一些情况下，参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽可包含(i)seqidno:32所示的氨基酸序列，(ii)与seqidno:32具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列，或(iii)是包含igv结构域或igc结构域的(i)或(ii)的序列的特异性结合片段。

在一些实施方案中，参考icosl多肽包含截短的细胞外结构域，其包含参照seqidno:32中所示的参考icosl细胞外结构域序列的c末端截短。在一些实施方案中，c末端截短为至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少125个氨基酸残基的截短。在一些实施方案中，c末端截短为至少1、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35个氨基酸残基的截短。在一些实施方案中，包含c末端截短的icosl多肽在截短点的c末端以外不包含野生型icosl的连续氨基酸残基。因此，在所提供的icosl参考序列中有短于野生型icosl的完整细胞外结构域(例如seqidno:32所示的)的序列。在一些实施方案中，包含c末端截短的icosl多肽不包含或不融合至细胞外结构域以外的icosl结构域的氨基酸残基。

在一些实施方案中，icosl参考多肽在一个或多个蛋白酶切割位点被改变，例如被突变或缺失。如本文中发现的，野生型icosl多肽包含蛋白酶切割位点，在一些情况下，其在细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞)中表达时导致蛋白质的切割，由此产生多种种类的异质产物，包括具有不同长度或大小的种类。例如，icosl多肽的切割可发生在seqidno:32的残基207和208之间的lqqn/lt蛋白酶切割位点(“/”表示潜在的切割位点)。在一些实施方案中，icosl参考多肽在如seqidno:32的氨基酸204-209所示的蛋白酶切割位点处被改变，或缺少如seqidno:32的氨基酸204-209所示的蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，与野生型或非截短的icosl多肽相比，截短的icosl多肽对蛋白酶切割更具抗性。seqidno:600-606中提供了缺少lqqn/lt蛋白酶切割位点的全部或一部分的示例性截短的icosl多肽ecd截短(指定为截短#2、#3、#4、#5、#6、#7或#8)。

截短#2：

dtqekevramvgsdvelscacpegsrfdlndvyvywqtsesktvvtyhipqnsslenvdsryrnralmspagmlrgdfslrlfnvtpqdeqkfhclvlsqslgfqevlsvevtlhvaanfsvpvvsaphspsqdeltftctsingyprpnvywinktdnslldqalqndtvflnmrglydvvsvlriartpsvnigccienvllqqnl(seqidno:600)

截短#3：

dtqekevramvgsdvelscacpegsrfdlndvyvywqtsesktvvtyhipqnsslenvdsryrnralmspagmlrgdfslrlfnvtpqdeqkfhclvlsqslgfqevlsvevtlhvaanfsvpvvsaphspsqdeltftctsingyprpnvywinktdnslldqalqndtvflnmrglydvvsvlriartpsvnigccienvllqqnltvgsq(seqidno:601)

截短#4：

dtqekevramvgsdvelscacpegsrfdlndvyvywqtsesktvvtyhipqnsslenvdsryrnralmspagmlrgdfslrlfnvtpqdeqkfhclvlsqslgfqevlsvevtlhvaanfsvpvvsaphspsqdeltftctsingyprpnvywinktdnslldqalqndtvflnmrglydvvsvlriartpsvnigccienvllqqn(seqidno:602)

截短#5：

dtqekevramvgsdvelscacpegsrfdlndvyvywqtsesktvvtyhipqnsslenvdsryrnralmspagmlrgdfslrlfnvtpqdeqkfhclvlsqslgfqevlsvevtlhvaanfsvpvvsaphspsqdeltftctsingyprpnvywinktdnslldqalqndtvflnmrglydvvsvlriartpsvnigccienvllqq(seqidno:603)

截短#6：

dtqekevramvgsdvelscacpegsrfdlndvyvywqtsesktvvtyhipqnsslenvdsryrnralmspagmlrgdfslrlfnvtpqdeqkfhclvlsqslgfqevlsvevtlhvaanfsvpvvsaphspsqdeltftctsingyprpnvywinktdnslldqalqndtvflnmrglydvvsvlriartpsvnigccienvll(seqidno:604)

截短#7：

dtqekevramvgsdvelscacpegsrfdlndvyvywqtsesktvvtyhipqnsslenvdsryrnralmspagmlrgdfslrlfnvtpqdeqkfhclvlsqslgfqevlsvevtlhvaanfsvpvvsaphspsqdeltftctsingyprpnvywinktdnslldqalqndtvflnmrglydvvsvlriartpsvnigccien(seqidno:605)

截短#8：

dtqekevramvgsdvelscacpegsrfdlndvyvywqtsesktvvtyhipqnsslenvdsryrnralmspagmlrgdfslrlfnvtpqdeqkfhclvlsqslgfqevlsvevtlhvaanfsvpvvsaphspsqdeltftctsingyprpnvywinktdnslldqalqndtvflnmrglydvvsvlriartpsvnigccienvllqqnlt(seqidno:606)

在一些实施方案中，icosl参考多肽在与参照seqidno:32的氨基酸204-209对应的一个或多个氨基酸中被改变。在一些实施方案中，变体icosl多肽在与参照seqidno:32的编号的位置207和/或208对应的参考icosl或其特异性结合片段中具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有一个或多个选自n207a、n207g、l208g的氨基酸修饰(例如取代)，或保守氨基酸修饰(例如其取代)。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)是n207a/l208g或n207g/l208g。在一些实施方案中，变体icosl多肽的全长参考ecd或截短的参考ecd被修饰以包含一个或多个选自n207a、n207g、l208g的氨基酸修饰(例如取代)或保守氨基酸修饰。具有一个或多个修饰的示例性全长或截短的参考ecd在seqidno:607-628中示出。包含在参考seqidno:32中示出的位置的切割位点n207和/或l208处的突变的示例性参考序列在seqidno:624-628中示出。在一些情况下，所提供的修饰可以减少icosl多肽的蛋白酶切割，诸如可能发生在lqqn/lt蛋白酶切割位点的切割。

在一些实施方案中，可以在参考icoslecd序列中采用以上截短和修饰策略的组合。在一些实施方案中，在截短的参考icosl多肽(例如seqidno:600-606中示出的示例性参考icosl序列)中进行修饰(例如取代)。seqidno:607-628中示出了在潜在的蛋白酶切割位点n207和/或l208处具有修饰的示例性变体icosl多肽序列。在一些实施方案中，与野生型icosl多肽(诸如含有seqidno:32所示的ecd序列的野生型icosl多肽)相比，变体icosl多肽表现出降低的蛋白酶切割。

在一些实施方案中，参考(例如，未修饰的)或野生型icosl多肽包含igv结构域或igc结构域或其特异性结合片段。在一些实施方案中，含有igv结构域的icosl参考多肽包含seqidno:196中所示的氨基酸序列(对应于seqidno:5的氨基酸残基19-129)或其直系同源物。

dtqekevramvgsdvelscacpegsrfdlndvyvywqtsesktvvtyhipqnsslenvdsryrnralmspagmlrgdfslrlfnvtpqdeqkfhclvlsqslgfqevlsve(seqidno:196)

在一些实施方案中，包含igv结构域的参考icosl多肽至少包含参照seqidno:32所示的编号的氨基酸1-112、1-113、1-114、1-115、1-116、1-117、1-118、1-119、1-120、1-121或1-122。在一些实施方案中，含有igv结构域的icosl参考多肽包含seqidno:545所示的氨基酸序列(对应于seqidno:5的氨基酸残基19-140)或其直系同源物。在一些实施方案中，igv结构域是icosl参考多肽的唯一igsf结构域。

dtqekevramvgsdvelscacpegsrfdlndvyvywqtsesktvvtyhipqnsslenvdsryrnralmspagmlrgdfslrlfnvtpqdeqkfhclvlsqslgfqevlsvevtlhvaanfsv(seqidno:545)

在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽的igv结构域可包含(i)seqidno:196或545中所示的氨基酸序列，(ii)与seqidno:196或545具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列，或(iii)seqidno:196或545中所示的氨基酸序列的特异性结合片段或(i)或(ii)的序列的特异性结合片段或。在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)igv结构域能够结合一种或多种icosl同源结合蛋白，诸如cd28、icos或ctla-4中的一种或多种。

在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽的igc结构域包含如seqidno:5的残基141-227示出的氨基酸序列或其直系同源物。例如，参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽的igc结构域可包含(i)seqidno:5的残基141-227所示的氨基酸序列，(ii)与seqidno:5的残基141-227具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列，或(iii)(i)或(ii)。在一些实施方案中，参考igv结构域能够结合一种或多种icosl同源结合蛋白。

在一些实施方案中，参考(未修饰的)或野生型icosl多肽含有icosl的特异性结合片段，如igv结构域或igc结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，特异性结合片段可以结合cd28、icos和/或ctla-4。特异性结合片段可具有至少50个氨基酸的氨基酸长度，如至少60、70、80、90、100或110个氨基酸。在一些实施方案中，igv结构域的特异性结合片段含有氨基酸序列，其为seqidno:5的氨基酸19-129所示的igv结构域长度的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。在一些实施方案中，igc结构域的特异性结合片段包含氨基酸序列，其为seqidno:5的氨基酸141-227所示的igc结构域长度的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。

在一些实施方案中，变体icosl多肽包含ecd结构域、截短的ecd结构域或其部分，该部分包含一个或多个亲和力修饰的igsf结构域。在一些实施方案中，变体icosl多肽可包含igv结构域或igc结构域，其中igsf结构域(igv或igc)或igv结构域的特异性结合片段或igc结构域的特异性结合片段中的一个或多个含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。在一些实施方案中，变体icosl多肽可包含igv结构域和igc结构域，或igv结构域的特异性结合片段和igc结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含全长igv结构域。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含全长igc结构域。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含igv结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含igc结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含全长igv结构域和全长igc结构域。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含全长igv结构域和igc结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含igv结构域的特异性结合片段和全长igc结构域。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含igv结构域的特异性结合片段和igc结构域的特异性结合片段。

在任何这样的实施方案中，变体icosl多肽的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)可位于任何一个或多个icosl多肽结构域中。例如，在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代位于变体icosl多肽的细胞外结构域(ecd)(诸如seqidno:32中所示的)中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代位于igv结构域或igv结构域的特异性结合片段中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)位于igc结构域或igc结构域的特异性结合片段中。

通常，多肽的各种属性中的每一种在下面单独公开(例如，可溶的、可分泌的和膜结合的多肽，icosl对cd28、icos和ctla-4的亲和力，每条多肽链的变异数，连接的多肽链的数量，每种变体icosl的氨基酸改变的数量和性质等)。然而，如本领域技术人员所清楚的，任何特定多肽可包含这些独立属性的组合。应当理解，提及氨基酸，包括提及以seqidno形式阐述用于描述igsf结构域的结构域组织的特定序列，这是出于说明的目的，并不意味着限制所提供的实施方案的范围。应当理解，多肽及其结构域的描述是在理论上基于同源性分析和与相似分子的比对而得到的。因此，确切的基因座可以变化，并且对于每种蛋白质不一定相同。因此，特异性igsf结构域，如特异性igv结构域或igc结构域，可以是更长或更短的几个氨基酸(如一个、两个、三个或四个)。

此外，如下所述的本发明的各种实施方案经常在如上所公开的定义术语的含义内提供。因此，当使用所定义的术语讨论本文所述的各个方面和属性时，以特定定义描述的实施方案将被解释为通过引用并入。因此，标题、描述各个方面和实施方案的顺序以及每个独立属性的单独公开不意味着限制本公开的范围。

a.示例性修饰

本文提供了在参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽中包含的igsf结构域中含有至少一个亲和力修饰的igsf结构域(例如igv或igc)或其特异性结合片段的变体icosl多肽，使得变体icosl多肽显示出与参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽相比，对一种或多种配体icos、cd28或ctla-4的改变(增加或降低)的结合活性或亲和力。在一些实施方案中，变体icosl多肽对cd28、icos和/或ctla-4的结合亲和力不同于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽对照序列的结合亲和力，如通过例如固相elisa免疫测定、流式细胞术或biacore测定所测定的。在一些实施方案中，变体icosl多肽对cd28、icos和/或ctla-4结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28、icos和/或ctla-4的结合亲和力降低。cd28、icos和/或ctla-4可以是哺乳动物蛋白质，如人蛋白质或鼠蛋白质。

每个同源结合配偶体的结合亲和力是独立的；也就是说，在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28、icos和/或ctla-4中的一种、两种或三种的结合亲和力增加，和/或对cd28、icos和ctla-4中的一种、两种或三种的结合亲和力降低。

在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对icos的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对ctla-4的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对icos的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对ctla-4的结合亲和力降低。

在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28和icos的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28的结合亲和力增加，且对icos的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28和icos的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28的结合亲和力降低，且对icos的结合亲和力增加。

在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28和ctla-4的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28的结合亲和力增加，且对ctla-4的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28和ctla-4的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28的结合亲和力降低，且对ctla-4的结合亲和力增加。

在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对icos和ctla-4的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对icos的结合亲和力增加，且对ctla-4的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对icos和ctla-4的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对icos的结合亲和力降低，且对ctla-4的结合亲和力增加。

在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28、icos和ctla-4的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28和icos的结合亲和力增加，且对ctla-4的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28和ctla-4的结合亲和力增加，且对icos的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28和icos的结合亲和力降低，且对ctla-4的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28的结合亲和力降低，且对icos和ctla-4的结合亲和力增加。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28结合亲和力增加，且对icos和ctla-4的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28、ctla-4和icos的结合亲和力降低。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽，变体icosl多肽对cd28的结合亲和力降低，且对icos和ctla-4的结合亲和力增加。

在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽对照，对cd28、icos和/或ctla-4具有增加的或更高的结合亲和力的变体icosl多肽增加至少约5％如至少约10％、15％、20％、25％、35％或50％的对cd28、icos和/或ctla-4的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽的结合亲和力的增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在这样的实例中，参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽具有与变体icosl多肽相同的序列，不同的是它不含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。

在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽对照，对cd28、icos和/或ctla-4具有降低或减小的结合亲和力的变体icosl多肽降低至少5％如至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的对cd28、icosl和/或ctla-4的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽的结合亲和力的降低超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在这样的例子中，参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽具有与变体icosl多肽相同的序列，不同的是它不含有一个或多个氨基酸修饰，例如取代。

在一些实施方案中，任何前述实施方案的对cd28、icos和/或ctla-4的平衡解离常数(kd)可小于1×10^-5m、1×10^-6m、1×10^-7m、1×10^-8m、1×10^-9m、1×10^-10m或1×10^-11m或1x10^-12m。

在一些实施方案中，变体icosl多肽对cd28具有增加的或更高的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽对照，对cd28具有增加的或更高的结合亲和力的变体icosl多肽增加至少约25％如至少约30％、40％、50％或60％的对cd28的结合亲和力。在一些实施方案中，对cd28具有增加的或更高的结合亲和力的变体icosl多肽对cd28的平衡解离常数(kd)小于200pm、300pm、400pm、500pm或600pm。在一些实施方案中，与参考(例如未修饰的)或野生型icosl相比，变体多肽以增加的选择性特异性地结合至icos、cd28或ctla4中一种的胞外域。在一些实施方案中，增加的选择性是针对cd28的。在一些实施方案中，该增加的选择性包括该变体icosl多肽对于选自icos、cd28和ctla4的一种同源结合配偶体相对于另一种同源结合配偶体的结合比例大于该参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽对于该一种同源结合配偶体相对于该另一种同源结合配偶体的结合比例。在一些实施方案中，该比例大至少或至少约1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多倍。

参考(例如未修饰的)或野生型icosl序列不一定必须用作起始组合物以产生本文所述的变体icosl多肽。因此，术语“修饰”，如“取代”的使用并不意味着所提供的实施方案限于制备变体icosl多肽的特定方法。变体icosl多肽可以例如通过从头肽合成来制备，因此不一定需要在改变密码子来为修饰例如取代进行编码的意义上进行修饰，如“取代”。该原理还延伸至氨基酸残基的术语“添加”和“缺失”，其同样不暗示特定的制备方法。设计或产生变体icosl多肽的方法不限于任何特定方法。然而，在一些实施方案中，由参考(例如未修饰的)或野生型icosl遗传物质诱变参考(例如未修饰的)或野生型icosl编码核酸，并针对所希望的特异性结合亲和力和/或ifn-γ表达的诱导或其他功能活性进行筛选。在一些实施方案中，使用可在任何数量的公共可获得的数据库中获得的蛋白质或核酸序列从头合成变体icosl多肽，然后进行筛选。国家生物技术信息中心提供此类信息，并且其网站可通过互联网公开访问，如前所述，uniprotkb数据库也是如此。

除非另有说明，否则如本公开全文所示，一个或多个氨基酸修饰由与seqidno:32所示的参考ecd序列的位置编号对应的氨基酸位置编号指定。如通过参考序列(例如seqidno:196、545、600-628)与seqidno:32的比对来确定icosl多肽(包括其含有igsf结构域(例如igv)的部分)中修饰(例如，氨基酸取代)的相应位置，这在技术人员的水平内。在整个本公开的修饰列表中，氨基酸位置在中间表示，在编号之前列出相应的参考(例如未修饰的或野生型)氨基酸，并且在编号后列出所鉴定的变体氨基酸取代。如果修饰是位置的缺失，则显示“del”，并且如果修饰是在该位置的插入，则显示“ins”。在一些情况下，列出插入，氨基酸位置在中间表示，在编号之前和之后列出对应的参考氨基酸，并且在未修饰的(例如野生型)氨基酸之后列出所鉴定的变体氨基酸插入。

在一些实施方案中，变体icosl多肽在参考(例如未修饰的)或野生型icosl序列中具有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)可以在参考(例如未修饰的)或野生型icosl序列的胞外域(细胞外结构域)中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)位于igv结构域或其特异性结合片段中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)位于igc结构域或其特异性结合片段中。在变体icosl多肽的一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)中的一些位于igv结构域或其特异性结合片段中，并且一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)中的一些位于igc结构域或其特异性结合片段中。

在一些实施方案中，变体icosl多肽具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如，取代)。修饰(例如，取代)可以位于igv结构域或igc结构域中。在一些实施方案中，变体icosl多肽在igv结构域或其特异性结合片段中具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽在igc结构域或其特异性结合片段中具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽与参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽或其特异性结合片段(如与seqidno:32、196或545的氨基酸序列)具有至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

在一些实施方案中，变体icosl多肽在参考icosl或其特异性结合片段中具有对应于参照seqidno:32的编号的位置10、11、13、16、18、20、25、27、30、33、37、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、77、78、75、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。在一些实施方案中，变体icosl多肽在参考icosl或其特异性结合片段中具有对应于参照seqidno:32的编号的位置10、11、13、16、18、20、25、26、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、137、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。

在一些实施方案中，与参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽相比，此类变体icosl多肽显示出对cd28、icos或/或ctla-4中的一种或多种改变的结合亲和力。例如，在一些实施方案中，与参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽相比，变体icosl多肽显示出对cd28、icos和/或ctla-4增加的结合亲和力。在一些实施方案中，与参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽相比，变体icosl多肽显示出对cd28、icos或ctla-4降低的结合亲和力。

在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下项的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)：m10v、m10i、v11e、s13g、e16v、s18r、a20v、s25g、f27s、f27c、n30d、y33del、q37r、k42e、y47h、t43a、n52a、n52c、n52d、n52g、n52h、n52l、n52k、n52m、n52p、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、s54a、s54p、n57a、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57w、n57y、r61s、r61c、y62f、l67p、a71t、g72r、l74q、r75q、d77g、f78l、l80p、n84q、d89g、e90a、k92r、f93l、h94e、h94d、l96f、l96i、v97a、l98f、s99g、q100a、q100d、q100e、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100r、q100p、q100s、q100t、q100v、l102r、g103e、v107a、v107i、s109g、s109n、v110d、v110n、v110a、e111del、t113e、h115r、h115q、v116a、a117t、n119q、f120i、f120s、s121g、v122a、v122m、s126t、s126r、h129p、s130g、s132f、q133h、e135k、f138l、t139s、c140d、c140del、s142f、i143v、i143t、n144d、y146c、v151a、y152c、y152h、w153r、i154f、n155h、n155q、k156m、d158g、l161p、l161m、l166q、n168q、f172s、l173s、m175t、t190s、t190a、s192g、v193m、n194d、c198r、n201s、l203p、l203f、n207q、l208p、v210a、s212g、d217v、i218t、i218n、e220g、r221g、r221i、i224v、t225a、n227k或其保守氨基酸修饰，例如取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下项的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)：m10v、m10i、v11e、s13g、e16v、s18r、a20t、a20v、s25g、r26s、f27c、f27s、n30d、y33del、q37r、t38p、k42e、t43a、y47h、n52a、n52c、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52p、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、s54a、s54f、s54p、n57a、n57d、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57w、n57y、r61c、r61s、y62f、l67p、a71t、g72r、l74q、r75q、d77g、f78l、l80p、n84q、d89g、e90a、k92r、f93l、h94d、h94e、l96f、l96i、v97a、l98f、s99g、q100a、q100d、q100e、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100p、q100r、q100s、q100t、q100v、l102r、g103e、v107a、v107i、s109g、s109n、v110a、v110d、v110n、e111del、t113e、h115q、h115r、v116a、a117t、n119q、f120i、f120s、s121g、v122a、v122m、s126r,s126t、h129p、s130g、s132f、q133h、e135k、t137a、f138l、t139s、c140del、c140d、s142f,i143t、i143v、n144d、y146c、v151a、y152c、y152h、w153r、i154f、n155h、n155q、k156m、d158g、l161m、l161p、q164l、l166q、n168q、f172s、l173s、m175t、t190a、t190s、s192g、v193a、v193m、n194d、c198r、n201s、l203f、l203p、n207q、l208p、v210a、s212g、d217g、d217v、i218n、i218t、e220g、r221g、r221i、r221k、i224v、t225a、t225s、n227k或其保守氨基酸修饰。

保守氨基酸修饰(例如取代)是与取代的氨基酸(而不是参考(例如未修饰的)或野生型氨基酸)属于同一类氨基酸的任何氨基酸。氨基酸的种类是脂肪族(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、羟基或含硫(丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和蛋氨酸)、环状(脯氨酸)、芳香族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)、碱性(组氨酸、赖氨酸和精氨酸)和酸性/酰胺(天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)。

在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下项的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：m10v、m10i、v11e、s13g、e16v、s18r、a20v、s25g、f27s、f27c、n30d、y33del、q37r、k42e、t43a、y47h、n52a、n52c、n52d、n52g、n52h、n52l、n52k、n52m、n52p、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、s54a、s54p、n57a、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57w、n57y,r61s、r61c、y62f、l67p、a71t、g72r、l74q、r75q、d77g、f78l、l80p、n84q、d89g、e90a、k92r、f93l、h94e、h94d、l96f、l96i、v97a、l98f、s99g、q100a、q100d、q100e、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100r、q100p、q100s、q100t、q100v、g103e、l102r、v107a、v107i、s109g、s109n、v110d、v110n、v110a、e111del、t113e、h115r、h115q、v116a、a117t、n119q、f120i、f120s、s121g、v122a、v122m、s126t、s126r、h129p、s130g、s132f、q133h、e135k、f138l、t139s、c140d、c140del、s142f、i143v、i143t、n144d、y146c、v151a、y152c、y152h、w153r、i154f、n155h、n155q、k156m、d158g、l161p、l161m、l166q、n168q、f172s、l173s、m175t、t190a、t190s、s192g、v193m、n194d、c198r、n201s、l203p、l203f、n207q、l208p、v210a、s212g、d217v、i218t、i218n、e220g、r221g、r221i、i224v、t225a或n227k。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下项的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：m10v、m10i、v11e、s13g、e16v、s18r、a20t、a20v、s25g、r26s、f27c、f27s、n30d、y33del、q37r、t38p、k42e、t43a、y47h、n52a、n52c、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52p、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、s54a、s54f、s54p、n57a、n57d、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57w、n57y、r61c、r61s、y62f、l67p、a71t、g72r、l74q、r75q、d77g、f78l、l80p、n84q、d89g、e90a、k92r、f93l、h94d、h94e、l96f、l96i、v97a、l98f、s99g、q100a、q100d、q100e、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100p、q100r、q100s、q100t、q100v、l102r、g103e、v107a、v107i、s109g、s109n、v110a、v110d、v110n、e111del、t113e、h115q、h115r、v116a、a117t、n119q、f120i、f120s、s121g、v122a、v122m、s126r、s126t、h129p、s130g、s132f、q133h、e135k、t137a、f138l、t139s、c140del、c140d、s142f、i143t、i143v、n144d、y146c、v151a、y152c、y152h、w153r、i154f、n155h、n155q、k156m、d158g、l161m、l161p、q164l、l166q、n168q、f172s、l173s、m175t、t190a、t190s、s192g、v193a、v193m、n194d、c198r、n201s、l203f、l203p、n207q、l208p、v210a、s212g、d217g、d217v、i218n、i218t、e220g、r221g、r221i、r221k、i224v、t225a、t225s、n227k或其保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)是n52y/n57y/f138l/l203p、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c140d/t225a、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n52h/s99g、n57y/q100p、n52s/g103e、n52s/s130g/y152c、n52s/y152c、n52s/c198r、n52y/n57y/y152c、n52y/n57y/h129p/c198r、n52h/l161p/c198r、n52s/t113e、n52d/s54p、n52k/l208p、n52s/y152h、n52d/v151a、n52h/i143t、n52s/l80p、f120s/y152h/n201s、n52s/r75q/l203p、n52s/d158g、n52d/q133h、n52s/n57y/h94d/l96f/l98f/q100r、n52s/n57y/h94d/l96f/l98f/q100r/g103e/f120s、n52h/f78l/q100r、n52h/n57y/q100r/v110d、n52h/n57y/r75q/q100r/v110d、n52h/n57y/q100r、n52h/n57y/l74q/q100r/v110d、n52h/q100r、n52h/s121g、a20v/n52h/n57y/q100r/s109g、n52h/n57y/q100p、n52h/n57y/r61s/q100r/v110d/l173s、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y、n52s/f120s、n52s/v97a、n52s/g72r、n52s/a71t/a117t、n52s/e220g、y47h/n52s/v107a/f120s、n52h/n57y/q100r/v110d/s132f/m175t、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r、q37r/n52h/n57y/q100r/v110n/s142f/c198r/d217v/r221g、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/v116a/l161m/f172s/s192g/c198r、f27s/n52h/n57y/v110n、n52s/h94e/l96i/s109n/l166q、s18r/n52s/f93l/i143v/r221g、a20t/n52d/y146c/q164l、v11e/n30d/n52h/n57y/h94e/l96i/l98f/n194d/v210a/i218t、n52s/h94e/l96i/v122m、n52h/n57y/h94e/l96i/f120i/s126t/w153r/i218n、m10v/s18r/n30d/n52s/s126r/t139s/l203f、s25g/n30d/n52s/f120s/n227k、n30d/n52s/l67p/q100k/d217g/r221k/t225s、n52h/n57y/q100r/v110d/a117t/t190s/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/f172s/c198r、s25g/f27c/n52h/n57y/q100r/v110d/e135k/l173s/c198r、n52h/n57y/v110a/c198r/r221i、m10i/s13g/n52h/n57y/d77g/v110a/h129p/i143v/f172s/v193m,c198r、n52h/n57y/r61c/y62f/q100r/v110n/f120s/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/n144d/f172s/c198r、n52s/h94e/l98f/q100r、n52s/e90a、n30d/k42e/n52s、n52s/f120s/i143v/i224v、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/c198r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52s/s54p、t38p/n52s/n57d、n52h/c140del/t225a、n52h/f78l/q100r/c198r、n52h/n57y/r75q/q100p/v110d、n52h/n57y/l74q/v110d/s192g、n52h/s121g/c198r、n52s/f120s/n227k、n52s/a71t/a117t/t190a/c198r、t43a/n52h/n57y/l74q/d89g/v110d/f172s、n52h/n57y/q100r/v110d/s132f/m175t、n52h/n57y/q100r/v107i/v110d/i154f/c198r/r221g、q100r、f138l/l203p、n57y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、q100r/f138l、l203p、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102r/h115r/f172s/c198r、n52h/v122a/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/q100r/h115r/i143t/f172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/e90a/h115r、n30d/k42en52s/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r/r221i、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r、n30d/k42e/n52s/h115r/f172s/n194d、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52s/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100ph115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s、n52h/q100r/f172s/c198r、n52h/q100r/h115q/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52q/n207q、n168q/n207q、n52q/n168q、n84q/n207q、n155q/n207q、n119q/n168q、n119q/n207q、n119q/n155q、n52q/n84q、n52q/n119q、n84q/n119q、n52q/n84q/n168q、n52q/n84q/n207q、n84q/n155q/n168q、n84q/n168q/n207q、n84q/n155h/n207q、n155q/n168q/n207q、n119q/n155q/n168q、n119q/n168q/n207q、n84q/n119q/n207q、n119q/n155h/n207q、n84q/n119q/n155q、n52q/n119q/n155q、n52h/n84q/n119q、n52h/n84q、n52h/n84q/n168q、n52h/n84q/n207q、n52h/n84q/n168q/n207q、n52q/n84q/n155q、n52q/n84q/n168q、n52q/n84q/n155q/n168q、n52q/n84q/n119q/n168q、n84q/n119q/n155q/n168q、n84q/n155q/n168q/n207q、n84q/n119q/n155q/n207q、n52q/n84q/n119q/n207q、n52q/n84q/n119q/n155q、n52q/n84q/n119q/n155q/n207q、n84q/n119q/n155q/n168q/n207q、n52a/n57f/q100s、n52a/n57h/q100s、n52a/n57y/q100a、n52d/n57a/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52h/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57f、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52r/n57y/q100p、n52r/n57y/q100s、n52s/n57a/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100s、n52s/n57y/q100m、n52s/n57y/q100v、n52t/n57h/q100s、n52t/n57h/q100a、n52t/n57y/q100a、n52v/n57l/q100a、n52h/n57y/q100k、n52k/n57y/q100r、n52l/n57h/q100r、n52r/n57f/q100n、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100r、n52r/n57f/q100t、n52r/n57h/q100k、n52r/n57l/q100s、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52r/n57y/q100r、n52c/n57e/q100s、n52g/n57p/q100d、n52g/n57v/q100g、n52g/n57v、n52l/n57v、n52p/n57p、n52p/n57s/q100g、n52s/n57l/q100g、n52t/n57k/q100p、n52v/n57t/q100l或n57q/q100p。

在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰选自：n52y/n57y/f138l/l203p、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c140d/t225a、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n52h/s99g、n57y/q100p、n52s/s130g/y152c、n52s/y152c、n52s/c198r、n52y/n57y/y152c、n52y/n57y/h129p/c198r、n52h/l161p/c198r、n52s/t113e、n52d/s54p、n52k/l208p、n52s/y152h、n52d/v151a、n52h/i143t、n52s/l80p、f120s/y152h/n201s、n52s/r75q/l203p、n52s/d158g、n52d/q133h、n52s/n57y/h94d/l96f/l98f/q100r、n52s/n57y/h94d/l96f/l98f/q100r/g103e/f120s、n52s/g103e、n52h/f78l/q100r、n52h/n57y/q100r/v110d、n52h/n57y/r75q/q100r/v110d、n52h/n57y/q100r、n52h/n57y/l74q/q100r/v110d、n52h/q100r、n52h/s121g、a20v/n52h/n57y/q100r/s109g、n52h/n57y/r61s/q100r/v110d/l173s、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y、n52s/f120s、n52s/v97a、n52s/g72r、n52s/a71t/a117t、n52s/e220g、y47h/n52s/v107a/f120s、n52h/n57y/q100r/v110d/s132f/m175t、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r、q37r/n52h/n57y/q100r/v110n/s142f/c198r/d217v/r221g、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/v116a/l161m/f172s/s192g/c198r、f27s/n52h/n57y/v110n、n52s/h94e/l96i/s109n/l166q、s18r/n52s/f93l/i143v/r221g、a20t/n52d/y146c/q164l、v11e/n30d/n52h/n57y/h94e/l96i/l98f/n194d/v210a/i218t、n52s/h94e/l96i/v122m、n52h/n57y/h94e/l96i/f120i/s126t/w153r/i218n、m10v/s18r/n30d/n52s/s126r/t139s/l203f、s25g/n30d/n52s/f120s/n227k、n30d/n52s/l67p/q100k/d217g/r221k/t225s、n52h/n57y/q100r/v110d/a117t/t190s/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/f172s/c198r、s25g/f27c/n52h/n57y/q100r/v110d/e135k/l173s/c198r、n52h/n57y/v110a/c198r/r221i、m10i/s13g/n52h/n57y/d77g/v110a/h129p/i143v/f172s/v193m,c198r、n52h/n57y/r61c/y62f/q100r/v110n/f120s/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/n144d/f172s/c198r、n52s/h94e/l98f/q100r、n52s/e90a、n30d/k42e/n52s、n52s/f120s/i143v/i224v、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/c198r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/c198r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52s/s54p、t38p/n52s/n57d、n52h/c140del/t225a、n52h/f78l/q100r/c198r、n52h/n57y/r75q/q100p/v110d、n52h/n57y/l74q/v110d/s192g、n52h/s121g/c198r、n52s/f120s/n227k、n52s/a71t/a117t/t190a/c198r、t43a/n52h/n57y/l74q/d89g/v110d/f172s、n52h/n57y/q100r/v110d/s132f/m175t、n52h/n57y/q100r/v107i/v110d/i154f/c198r/r221g、n52q/n207q、n168q/n207q、n52q/n168q、n84q/n207q、n155q/n207q、n119q/n168q、n119q/n207q、n119q/n155q、n52q/n84q、n52q/n119q、n84q/n119q、n52q/n84q/n168q、n52q/n84q/n207q、n84q/n155q/n168q、n84q/n168q/n207q、n84q/n155h/n207q、n155q/n168q/n207q、n119qn155q/n168q、n119q/n168q/n207q、n84q/n119q/n207q、n119q/n155h/n207q、n84q/n119q/n155q、n52q/n119q/n155q、n52h/n84q/n119q、n52h/n84q、n52h/n84q/n168q/n207q、n52q/n84q/n155q/n168q、n52q/n84q/n119q/n168q、n84q/n119q/n155q/n168q、n84q/n155q/n168q/n207q、n84q/n119q/n155q/n207q、n52q/n84q/n119q/n207q、n52q/n84q/n119q/n155q、n52q/n84q/n119q/n155q/n207q、n84q/n119q/n155q/n168q/n207q、f138l/l203p、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、q100r/f138l、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102r/h115r/f172s/c198r、n52h/v122a/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/q100r/h115r/i143t/f172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/e90a/h115r、n30d/k42en52s/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r/r221i、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r、n30d/k42e/n52s/h115r/f172s/n194d、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52s/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s、n52h/q100r/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52a/n57f/q100s、n52a/n57h/q100s、n52a/n57y/q100a、n52d/n57a/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52h/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57f、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52r/n57y/q100p、n52r/n57y/q100s、n52s/n57a/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100s、n52s/n57y/q100m、n52s/n57y/q100v、n52t/n57h/q100s、n52t/n57h/q100a、n52t/n57y/q100a、n52v/n57l/q100a、n52h/n57y/q100k、n52k/n57y/q100r、n52l/n57h/q100r、n52r/n57f/q100n、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100r、n52r/n57f/q100t、n52r/n57h/q100k、n52r/n57l/q100s、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52r/n57y/q100r、n52c/n57e/q100s、n52g/n57p/q100d、n52g/n57v/q100g、n52g/n57v、n52l/n57v、n52p/n57p、n52p/n57s/q100g、n52s/n57l/q100g、n52t/n57k/q100p、n52v/n57t/q100l、n57q/q100p、s54f/v193a或r26s/n52h/n57y/v110d/t137a/c198r。

在一些实施方案中，变体icosl多肽包含表1中列出的任何突变。表1还提供了参照参考(例如未修饰的)或野生型icosl或示例性变体icosl多肽的细胞外结构域(ecd)或igv结构域的seqidno的示例性序列。如所指出的，对应于给定结构域的确切基因座或残基可以变化，如根据用于鉴定或分类结构域的方法变化。同样，在一些情况下，给定结构域(例如igv)的相邻n-和/或c-末端氨基酸也可以包括在变体igsf多肽的序列中，如以确保表达时结构域的适当折叠。因此，应当理解，表1中seqidno的示例不应解释为限制。例如，变体icosl多肽的特定结构域如ecd结构域可以比相应的seqidno所示的氨基酸序列长或短若干个氨基酸，如长或短1-10个氨基酸，如1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。

在一些实施方案中，变体icosl多肽包含表1中列出的任何突变。在一些实例中，在包含seqidno:32所示的氨基酸序列的参考icosl中、在包含seqidno:196或545所示的icosl的igv结构域的参考icosl中、或在seqidno:600-628中的任一个所示的氨基酸序列的被截短和/或被修饰的参考icosl中进行突变。在一些实例中，变体icosl多肽包含表1中列出的细胞外结构域(ecd)序列中的任一个(即seqidno:109-142、239、280-325、364-381、387-424、427-433、435-470、638-685中的任一个)。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含这样的多肽序列，该多肽序列显示出与表1中列出的任何细胞外结构域(ecd)序列(即，seqidno:109-142、239、280-325、364-381、387-424、427-433、435-470、638-685中的任何一个)至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性，如至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性，且含有在参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含表1中列出的任何细胞外结构域(ecd)序列(即，seqidno:109-142、239、280-325、364-381、387-424、427-433、435-470、638-685中的任何一个)的特异性结合片段，且含有参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。

在一些实施方案中，变体icosl多肽包含表1中列出的细胞外结构域(ecd)序列中的任一个(即seqidno:109-142、239、280-325、364-381、387-424、427-433、435-470、638-685、905、908中的任一个)。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含这样的多肽序列，该多肽序列显示出与表1中列出的任何细胞外结构域(ecd)序列(即，seqidno:109-142、239、280-325、364-381、387-424、427-433、435-470、638-685、905、908中的任何一个)至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性，如至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性，且含有在参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含表1中列出的任何细胞外结构域(ecd)序列(即，seqidno:109-142、239、280-325、364-381、387-424、427-433、435-470、638-685、905、908中的任何一个)的特异性结合片段，且含有参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。

在一些实施方案中，变体icosl多肽包含表1中列出的任何igv序列(即，seqidno:197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857中的任何一个)。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含这样的多肽序列，该多肽序列显示出与表1中列出的任何igv序列(即，seqidno:seqidno:197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857中的任何一个)至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性，如至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性，且含有在参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含表1中列出的任何igv序列(即，seqidno:197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857中的任何一个)的特异性结合片段并且含有在参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸取代。

在一些实施方案中，变体icosl多肽包含表1中列出的任何igv序列(即，seqidno:197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857、906-907、909-910中的任何一个)。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含这样的多肽序列，该多肽序列显示出与表1中列出的任何igv序列(即，seqidno:197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857、906-907、909-910中的任何一个)至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性，如至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性，且含有在参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含表1中列出的任何igv序列(即，seqidno:197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857、906-907、909-910中的任何一个)的特异性结合片段，并且含有在参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸取代。

指定为“x”的突变表示指定位置含有q或seqidno:32的相应位置所示的野生型残基。

在一些实施方案中，与参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽(如包含seqidno:32、196或545所示的序列)相比，变体icosl多肽显示出对cd28的胞外域增加的亲和力。在一些实施方案中，与参考(例如未修饰的)或野生型icosl(如包含seqidno:32、196或545所示的序列)相比，icosl多肽显示出对icos的胞外域增加的亲和力。在一些实施方案中，与参考(例如未修饰的)或野生型icosl(如包含seqidno:32、196或545所示的序列)相比，icosl多肽显示出对cd28的胞外域和icos的胞外域增加的亲和力。

在一些实施方案中，变体icosl多肽具有对应于位置52、54或57的一个或多个氨基酸修饰，例如，取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下项的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：n52h、n52d、n52q、n52s、n52y、n52k、s54a、s54p或n57y或其保守氨基酸修饰(例如取代)。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下项的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：n52h、n52d、n52s、n52k或n57y或其保守氨基酸修饰(例如取代)。

在一些实施方案中，除了含有对应于位置52、54或57的位置处的氨基酸修饰(例如取代)，变体icosl多肽还可含有一个或多个其他氨基酸修饰(例如取代)。在一些实施方案中，一个或多个其他氨基酸修饰(例如取代)在对应于10、11、13、16、18、20、25、27、30、37、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227的位置处。在一些实施方案中，一个或多个其他氨基酸(例如取代)在对应于参照seqidno:32的10、11、13、16、18、20、25、26、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、137、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224,225或227的位置处。

在一些实施方案中，变体icosl含有选自以下项的一个或多个其他氨基酸修饰(例如取代)：m10v、m10i、v11e、s13g、e16v、s18r、a20v、s25g、f27s、f27c、n30d、y33del、q37r、k42e、t43a、y47h、n52h、n52d、n52s、n52y、n52k、n52q、s54a、s54p、n57d、n57y、r61s、r61c、y62f、l67p、a71t、g72r、l74q、r75q、d77g、f78l、l80p、n84q、d89g、e90a、k92r、f93l、h94e、h94d、l96f、l96i、v97a、l98f、s99g、q100r、q100k、q100p、l102r、g103e、v107a、v107i、s109g、s109n、v110d、v110n、v110a、e111del、t113e、h115r、h115q、v116a、a117t、n119q、f120i、f120s、s121g、v122a、v122m、s126t、s126r、h129p、s130g、s132f、q133h、e135k、f138l、t139s、c140del、s142f、i143v、i143t、n144d、y146c、v151a、y152c、y152h、w153r、i154f、k156m、d158g、l161p、l161m、l166q、n168q、f172s、l173s、m175t、t190a、t190s、s192g、v193m、n194d、c198r、n201s、l203p、l203f、n207q、l208p、v210a、s212g、d217v、i218t、i218n、e220g、r221g、r221i、i224v、t225a、n227k或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体icosl含有选自以下项的一个或多个其他氨基酸修饰(例如取代)：m10v、m10i、v11e、s13g、e16v、s18r、a20t、a20v、s25g、r26s、f27c、f27s、n30d、y33del、q37r、t38p、k42e、t43a、y47h、n52a、n52c、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52p、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、s54a、s54f、s54p、n57a、n57d、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57w、n57y、r61c、r61s、y62f、l67p、a71t、g72r、l74q、r75q、d77g、f78l、l80p、n84q、d89g、e90a、k92r、f93l、h94d、h94e、l96f、l96i、v97a、l98f、s99g、q100a、q100d、q100e、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100p、q100r、q100s、q100t、q100v、l102r、g103e、v107a、v107i、s109g、s109n、v110a、v110d、v110n、e111del、t113e、h115q、h115r、v116a、a117t、n119q、f120i、f120s、s121g、v122a、v122m、s126r,s126t、h129p、s130g,s132f、q133h、e135k、t137a、f138l、t139s、c140del、c140d、s142f,i143t、i143v、n144d、y146c、v151a、y152c、y152h,w153r、i154f、n155h、n155q、k156m、d158g、l161m、l161p、q164l、l166q、n168q、f172s、l173s、m175t、t190a、t190s、s192g、v193a、v193m、n194d、c198r、n201s、l203f、l203p、n207q、l208p、v210a、s212g、d217g,d217v、i218n、i218t、e220g、r221g、r221i、r221k、i224v、t225a、t225s、n227k或其保守氨基酸取代。

在上述任何一种变体icosl多肽的一些实施方案中，变体icosl多肽还包含对应于seqidno:32的位置140的一个或多个氨基酸缺失。

在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下项的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：n52y/n57y/f138l/l203p、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c140del/t225a、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n57y/q100p、n52s/c198r、n52y/n57y/y152c、n52y/n57y/h129p/c198r、n52h/l161p/c198r、n52s/t113e、n52s/s54p、n52k/l208p、n52s/y152h、n52h/i143t、n52s/r75q/l203p、n52s/d158g、n52d/q133h、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/c198r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52s/s54p、t38p/n52s/n57d、n52h/c140del/t225a、n52h/f78l/q100r/c198r、n52h/n57y/r75q/q100p/v110d、n52h/n57y/l74q/v110d/s192g、n52h/s121g/c198r、n52s/f120s/n227k、n52s/a71t/a117t/t190a/c198r、t43a/n52h/n57y/l74q/d89g/v110d/f172s、n52h/n57y/q100r/v110d/s132f/m175t、n52h/n57y/q100r/v107i/v110d/i154f/c198r/r221g、n52q/n207q、n52q/n168q、n52q/n84q、n52q/n119q、n52q/n84q/n168q、n52q/n84q/n207q、n52q/n119q/n155q、n52h/n84q/n119q,n52h/n84q、n52h/n84q/n168q、n52h/n84q/n207q、n52h/n84q/n168q/n207q、n52q/n84q/n155q、n52q/n84q/n168q、n52q/n84q/n155q/n168q、n52q/n84q/n119q/n168q、n52q/n84q/n119q/n207q、n52q/n84q/n119q/n155q、n52q/n84q/n119q/n155q/n207q、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102r/h115r/f172s/c198r、n52h/v122a/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/q100r/h115r/i143t/f172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/e90a/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r/r221i、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r、n30d/k42e/n52s/h115r/f172s/n194d、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52s/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100ph115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s、n52h/q100r/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r或n52h/n57y/q100r/f172s/c198r。

在一些实施方案中，变体icosl多肽具有在参考icosl或其特异性结合片段中的对应于参照seqidno:32的编号的位置52、57或100的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下项的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：n52a、n52c、n52d、n52g、n52h、n52l、n52k、n52m、n52p、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、n57a、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57w、n57y、q100a、q100d、q100e、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100r、q100p、q100s、q100t或q100v。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)是n52y/n57y/f138l/l203p、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c140d/t225a、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n52h/s99g、n57y/q100p、n52s/s130g/y152c、n52s/y152c、n52s/c198r、n52y/n57y/y152c、n52y/n57y/h129p/c198r、n52h/l161p/c198r、n52s/t113e、n52d/s54p、n52k/l208p、n52s/y152h、n52d/v151a、n52h/i143t、n52s/l80p、n52s/r75q/l203p、n52s/d158g、n52d/q133h、n52s/n57y/h94d/l96f/l98f/q100r、n52s/n57y/h94d/l96f/l98f/q100r/g103e/f120s、n52h/f78l/q100r、n52h/n57y/q100r/v110d、n52h/n57y/r75q/q100r/v110d、n52h/n57y/q100r、n52h/n57y/l74q/q100r/v110d、n52h/q100r、n52h/s121g、a20v/n52h/n57y/q100r/s109g、n52h/n57y/r61s/q100r/v110d/l173s、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y、n52s/f120s、n52s/v97a、n52s/g72r、n52s/a71t/a117t、n52s/e220g、y47h/n52s/v107a/f120s、n52h/n57y/q100r/v110d/s132f/m175t、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r、q37r/n52h/n57y/q100r/v110n/s142f/c198r/d217v/r221g、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/v116a/l161m/f172s/s192g/c198r、f27s/n52h/n57y/v110n、n52s/h94e/l96i/s109n/l166q、s18r/n52s/f93l/i143v/r221g、a20t/n52d/y146c/q164l、v11e/n30d/n52h/n57y/h94e/l96i/l98f/n194d/v210a/i218t、n52s/h94e/l96i/v122m、n52h/n57y/h94e/l96i/f120i/s126t/w153r/i218n、m10v/s18r/n30d/n52s/s126r/t139s/l203f、s25g/n30d/n52s/f120s/n227k、n30d/n52s/l67p/q100k/d217g/r221k/t225s、n52h/n57y/q100r/v110d/a117t/t190s/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/f172s/c198r、s25g/f27c/n52h/n57y/q100r/v110d/e135k/l173s/c198r、n52h/n57y/v110a/c198r/r221i、m10i/s13g/n52h/n57y/d77g/v110a/h129p/i143v/f172s/v193m、c198r、n52h/n57y/r61c/y62f/q100r/v110n/f120s/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/n144d/f172s/c198r、n52s/h94e/l98f/q100r、n52s/e90a、n30d/k42e/n52s、n52s/f120s/i143v/i224v、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/c198r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/c198r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52s/s54p、t38p/n52s/n57d、n52h/c140del/t225a、n52h/f78l/q100r/c198r、n52h/n57y/r75q/q100p/v110d、n52h/n57y/l74q/v110d/s192g、n52h/s121g/c198r、n52s/f120s/n227k、n52s/a71t/a117t/t190a/c198r、t43a/n52h/n57y/l74q/d89g/v110d/f172s、n52h/n57y/q100r/v110d/s132f/m175t、n52d、n52h/n57y/q100r/v107i/v110d/i154f/c198r/r221g、n52q/n207q、n168q/n207q、n52q/n168q、n52q/n84q、n52q/n119q、n52q/n84q/n168q、n52q/n84q/n207q、n52q/n119q/n155q、n52h/n84q/n119q、n52h/n84q、n52h/n84q/n168q/n207q、n52q/n84q/n155q/n168q、n52q/n84q/n119q/n168q、n52q/n84q/n119q/n207q、n52q/n84q/n119q/n155q、n52q/n84q/n119q/n155q/n207q、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、q100r/f138l、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102r/h115r/f172s/c198r、n52h/v122a/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/q100r/h115r/i143t/f172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/e90a/h115r、n30d/k42en52s/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r/r221i、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r、n30d/k42e/n52s/h115r/f172s/n194d、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52s/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100ph115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s、n52h/q100r/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52a/n57f/q100s、n52a/n57h/q100s、n52a/n57y/q100a、n52d/n57a/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52h/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57f、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52r/n57y/q100p、n52r/n57y/q100s、n52s/n57a/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100s、n52s/n57y/q100m、n52s/n57y/q100v、n52t/n57h/q100s、n52t/n57h/q100a、n52t/n57y/q100a、n52v/n57l/q100a、n52h/n57y/q100k、n52k/n57y/q100r、n52l/n57h/q100r、n52r/n57f/q100n、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100r、n52r/n57f/q100t、n52r/n57h/q100k、n52r/n57l/q100s、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52r/n57y/q100r、n52c/n57e/q100s、n52g/n57p/q100d、n52g/n57v/q100g、n52g/n57v、n52l/n57v、n52p/n57p、n52p/n57s/q100g、n52s/n57l/q100g、n52t/n57k/q100p、n52v/n57t/q100l或n57q/q100p。

在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰选自n52y/n57y/f138l/l203p、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c140d/t225a、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n52h/s99g、n57y/q100p、n52s/s130g/y152c、n52s/y152c、n52s/c198r、n52y/n57y/y152c、n52y/n57y/h129p/c198r、n52h/l161p/c198r、n52s/t113e、n52d/s54p、n52k/l208p、n52s/y152h、n52d/v151a、n52h/i143t、n52s/l80p、f120s/y152h/n201s、n52s/r75q/l203p、n52s/d158g、n52d/q133h、n52s/n57y/h94d/l96f/l98f/q100r、n52s/n57y/h94d/l96f/l98f/q100r/g103e/f120s、n52s/g103e、n52h/f78l/q100r、n52h/n57y/q100r/v110d、n52h/n57y/r75q/q100r/v110d、n52h/n57y/q100r、n52h/n57y/l74q/q100r/v110d、n52h/q100r、n52h/s121g、a20v/n52h/n57y/q100r/s109g、n52h/n57y/r61s/q100r/v110d/l173s、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y、n52s/f120s、n52s/v97a、n52s/g72r、n52s/a71t/a117t、n52s/e220g、y47h/n52s/v107a/f120s、n52h/n57y/q100r/v110d/s132f/m175t、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r、q37r/n52h/n57y/q100r/v110n/s142f/c198r/d217v/r221g、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/v116a/l161m/f172s/s192g/c198r、f27s/n52h/n57y/v110n、n52s/h94e/l96i/s109n/l166q、s18r/n52s/f93l/i143v/r221g、a20t/n52d/y146c/q164l、v11e/n30d/n52h/n57y/h94e/l96i/l98f/n194d/v210a/i218t、n52s/h94e/l96i/v122m、n52h/n57y/h94e/l96i/f120i/s126t/w153r/i218n、m10v/s18r/n30d/n52s/s126r/t139s/l203f、s25g/n30d/n52s/f120s/n227k、n30d/n52s/l67p/q100k/d217g/r221k/t225s、n52h/n57y/q100r/v110d/a117t/t190s/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/f172s/c198r、s25g/f27c/n52h/n57y/q100r/v110d/e135k/l173s/c198r、n52h/n57y/v110a/c198r/r221i、m10i/s13g/n52h/n57y/d77g/v110a/h129p/i143v/f172s/v193m,c198r、n52h/n57y/r61c/y62f/q100r/v110n/f120s/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/n144d/f172s/c198r、n52s/h94e/l98f/q100r、n52s/e90a、n30d/k42e/n52s、n52s/f120s/i143v/i224v、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/c198r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/c198r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52s/s54p、t38p/n52s/n57d、n52h/c140del/t225a、n52h/f78l/q100r/c198r、n52h/n57y/r75q/q100p/v110d、n52h/n57y/l74q/v110d/s192g、n52h/s121g/c198r、n52s/f120s/n227k、n52s/a71t/a117t/t190a/c198r、t43a/n52h/n57y/l74q/d89g/v110d/f172s、n52h/n57y/q100r/v110d/s132f/m175t、n52h/n57y/q100r/v107i/v110d/i154f/c198r/r221g、n52q/n207q、n52q/n168q、n52q/n84q、n52q/n119q、n52q/n84q/n168q、n52q/n84q/n207q、n52q/n119q/n155q、n52h/n84q/n119q、n52h/n84q、n52h/n84q/n168q/n207q、n52q/n84q/n155q/n168q、n52q/n84q/n119q/n168q、n52q/n84q/n119q/n207q、n52q/n84q/n119q/n155q、n52q/n84q/n119q/n155q/n207q、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、q100r/f138l、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102r/h115r/f172s/c198r、n52h/v122a/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/q100r/h115r/i143t/f172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/e90a/h115r、n30d/k42en52s/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r/r221i、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r、n30d/k42e/n52s/h115r/f172s/n194d、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52s/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s、n52h/q100r/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52a/n57f/q100s、n52a/n57h/q100s、n52a/n57y/q100a、n52d/n57a/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52h/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57f、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52r/n57y/q100p、n52r/n57y/q100s、n52s/n57a/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100s、n52s/n57y/q100m、n52s/n57y/q100v、n52t/n57h/q100s、n52t/n57h/q100a、n52t/n57y/q100a、n52v/n57l/q100a、n52h/n57y/q100k、n52k/n57y/q100r、n52l/n57h/q100r、n52r/n57f/q100n、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100r、n52r/n57f/q100t、n52r/n57h/q100k、n52r/n57l/q100s、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52r/n57y/q100r、n52c/n57e/q100s、n52g/n57p/q100d、n52g/n57v/q100g、n52g/n57v、n52l/n57v、n52p/n57p、n52p/n57s/q100g、n52s/n57l/q100g、n52t/n57k/q100p、n52v/n57t/q100l、n57q/q100p或r26s/n52h/n57y/v110d/t137a/c198r。

在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自参照seqidno:32的n52a、n52c、n52d、n52g、n52k、n52l、n52m、n52r、n52t、n52v、n57a、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57w、q100a、q100d、q100g、q100l、q100m、q100n、q100r、q100s、q100t或q100v的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰选自n52a/n57f/q100s、n52a/n57h/q100s、n52a/n57y/q100a、n52d/n57a/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52h/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57f、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52r/n57y/q100p、n52r/n57y/q100s、n52s/n57a/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100s、n52s/n57y/q100m、n52s/n57y/q100v、n52t/n57h/q100s、n52t/n57h/q100a、n52t/n57y/q100a、n52v/n57l/q100a、n52h/n57y/q100k、n52k/n57y/q100r、n52l/n57h/q100r、n52r/n57f/q100n、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100r、n52r/n57f/q100t、n52r/n57h/q100k、n52r/n57l/q100s、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52r/n57y/q100r、n52c/n57e/q100s、n52g/n57p/q100d、n52g/n57v/q100g、n52g/n57v、n52l/n57v、n52p/n57p、n52p/n57s/q100g、n52s/n57l/q100g、n52t/n57k/q100p、n52v/n57t/q100l或n57q/q100p。

在一些实施方案中变体icosl多肽具有选自以下项的一个或多个氨基酸修饰(取代)：n52h/n57y/q100r/c198r、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52y/n57y/f138l/l203p、v11e/n30d/n52h/n57y/h94e/l96i/l98f/n194d/v210a/i218t、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r、n52h/q100r、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/v152c/k156m/c198r、n30d/k42e/n52s、n52s/f120s/i143v/i224v、n52s/e90a、n52h/n57y/v110a/c198r/r221i、n52h/n57y/q100p或n52s/n194d。

在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下项的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/q100r或n52h/n57y/q100r/c198r。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下项的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r、n52h/n57y/q100r和n52h/n57y/q100p

在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下项的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：n52h/n57y/f138l/l203p、n52h/n57y/q100p、n52h/k92r、n52h/c140del/t225a、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n57y/q100p、n52y/n57y/h129p/c198r、n52h/l161p/c198r、n52k/l208p或n52h/i143t。

在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰选自f120s/y152h/n201s、e111del、y33del、n168q/n207q、n84q/n207q、n155q/n207q、n119q/n168q、n119q/n207q、n119q/n155q、n84q/n119q、n84q/n155q/n168q、n84q/n168q/n207q、n84q/n155h/n207q、n155q/n168q/n207q、n119qn155q/n168q、n119q/n168q/n207q、n84q/n119q/n207q、n119q/n155h/n207q、n84q/n119q/n155q、n84q/n119q/n155q/n168q、n84q/n155q/n168q/n207q、n84q/n119q/n155q/n207q、n84q/n119q/n155q/n168q/n207q或f138l/l203p。

在一些实施方案中，与参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽(如包括seqidno:32、196或545所示的序列)相比，变体icosl多肽显示出对结合cd28或icos的胞外域之一增加的结合亲和力，并且显示出对结合cd28或icos的胞外域中的另一个降低的结合亲和力。

在一些实施方案中，变体icosl多肽表现出对icos增加的结合亲和力。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代在对应于16、30、42、52、54、57、75、90、92、100、102、110、113、115、120、122、133、138、143、146、152、156、158、172、194、198、203、208、221、224或225的位置处。在一些实施方案中，变体icosl含有选自以下的一个或多个氨基酸取代：c198r、d158g、e16v、e90a、f120s、f138l、f172s、h115r、h115x、i143t、i143v、i224v、k156m、k42e、k92r、l102r、l203p、l208p、n194d、n30d、n52a、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52q、n52r、n52s、n52t、n52y、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57s、n57v、n57w、n57y、q100a、q100d、q100e、q100k、q100m、q100p、q100p、q100r、q100s、q100t、q133h、r221i、r75q、s54a、s54p、t113e、t225a、v110d、v122a、y146c、y152c或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：n52s、n52h、n52d、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n57y、n52s/c198r、n52s/t113e、s54a、n52d/s54p、n52k/l208p、n52h/i143t、n52s/r75q/l203p、n52s/d158g、n52d/q133h、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52s/e90a、n52s/f120s/i143v/i224v、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115x/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、q100r、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、n57y/q100p、q100r/f138l、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102r、h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115rf172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/q100r/h115r/i143tf172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、n52s/e90a/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r/r221i、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r、n30d/k42e/n52s/h115r/f172s/n194d、n30d/k42e/n52s/h115r、n52s/e90a/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r、n52a/n57h/q100s、n52a/n57y/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100m、n52t/n57h/q100s、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100t、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52g/n57p/q100d、n52g/n57v/q100g、n52g/n57v、n52l/n57v、n52s/n57l/q100g或n52t/n57k/q100p。

在一些实施方案中，变体icosl多肽表现出对于icos增加的结合亲和力，并且表现出对cd28降低的结合亲和力。在一些实施方案中，在一些实施方案中，一个或多个其他的氨基酸取代位于对应于52、57、80、100、130、152、161或198的位置。在一些实施方案中，变体icosl含有选自以下项的一个或多个氨基酸取代：n52s、n52h、n52y、n52h、n57y、l80p、q100pq100r、q100k、v110d、s130g、y152c、l161p、l161m、c198r、r221g或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下项的一个或多个氨基酸取代：n57y/q100p、n52s/s130g/y152c、n52s/y152c、n52y/n57y/y152c、n52h/l161p/c198r、n52h/l161p/c198r、n52s/l80p、a20v/n52h/n57y/q100r/s109g、n52h/n57y/r61s/q100r/v110d/l173s、n52h/n57y/q100r/v107i/v110d/s132f/i154f/c198r/r221g、q37r/n52h/n57y/q100r/v110n/s142f/c198r/d217v/r221g、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r、f27s/n52h/n57y/v110n、s18r/n52s/f93l/i143v/r221g、a20t/n52d/y146c/q164l、n52h/n57y/h94e/l96i/f120i/s126t/w153r/i218n、n52h/n57y/q100r/v110d/f172s/c198r、s25g/f27c/n52h/n57y/q100r/v110d/e135k/l173s/c198r、m10i/s13g/n52h/n57y/d77g/v110a/h129p/i143v/f172s/v193m/c198r。

在一些实施方案中，变体icosl多肽显示出对cd28增加的结合亲和力。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代在对应于10、11、13、16、18、20、25、27、30、36、40、41、42、52、54、57、63、70、71、72、74、77、80、81、84、88、89、90、91、92、93、94、96、98、99、100、102、107、109、110、113、114、115、117、118、119、120、121、122、126、127、129、130、132、133、135、138、139、140、143、144、146、152、153、154、155、156、158、161、166、168、169、172、173、178、190、192、193、194、198、199、201、203、207、208、209、212、218、221、224、225或227的位置处。

在一些实施方案中，变体icosl含有选自以下项的一个或多个氨基酸取代：a117t、a20v、a71t、a91g、a91g、ae88d、c140del、c198r、d158g、d77g、d90k、e117g、e135k、e16v、e81a、e88d、e90a、f120i、f120s、f138l、f172s、f27c、f92y、g72r、h115r、h115x、h129p、h94e、i118v、i127t、i143t、i143v、i154f、i218n、i218t、i224v、k156m、k169e、k36g、k42e、k89r、k92r、k93r、l102r、l161p、l166q、l173s、l203f、l203p、l208p、l209p、l40m、l70q、l70r、l74q、l80p、l96i、l98f、m10i、m10v、n115q、n119q、n122s、n144d、n155x、n168q、n168x、n178s、n194d、n207q、n207x、n227k、n25s、n30d、n52a、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、n57a、n57f、n57h、n57l、n57m、n57s、n57v、n57w、n57y、n63s、n84q、q100a、q100e、q100g、q100k、q100m、q100n、q100p、q100r、q100s、q100t、q100v、q133h、r221g、r221i、s109g、s109n、s114t、s121g、s126r、s126t、s130g、s132f、s13g、s18r、s192g、s212g、s25g、s54a、s54p、s99g、t113e、t120s、t130a、t139s、t190a、t199s、t225a、t41i、v107i、v110a、v110d、v11e、v122a、v122m、v193m、v210a、w153r、y146c、y152c、y152h或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体icosl具有选自以下项的一个或多个氨基酸取代：n52s、n52h、n52d、n52y/n57y/f138l/l203p、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c140del/t225a、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n52h/s99g、n57y、n57y/q100p、n52s/s130g/y152c、n52s/y152c、n52s/c198r、n52y/n57y/y152c、n52y/n57y/h129p/c198r、n52h/l161p/c198r、n52s/t113e、s54a、n52d/s54p、n52k/l208p、n52s/y152h、n52h/i143t、n52s/l80p、n52s/d158g、n52d/q133h、l70q/a91g/n144d、l70q/a91g/e117g/i118v/t120s/t130a、l70r/a91g/i118v/t120s/t130a/t199s、l70q/e81a/a91g/i118v/t120s/i127t/t130a、n63s/l70q/a91g/s114t/i118v/t120s/t130a、t41i/a91g、e88d/k89r/d90k/a91g/f92y/k93r/n122s/n178s、e88d/k89r/d90k/a91g/f92y/k93r、ae88d/k89r/d90k/a91g/f92y/k93r、k36g/l40m、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r、n52s/f120s/n227k、n52s/n194d、n52s/f120s、n52s/g72r、n52s/a71t/a117t/t190a/c198r、n52h/n57y/q100r/v107i/v110d/s132f/i154f/c198r/r221g、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r、v11e/n30d/n52h/n57y/h94e/l96i/l98f/n194d/v210a/i218t、n52s/h94e/l96i/v122m、n52h/n57y/h94e/l96i/f120i/s126t/w153r/i218n、m10v/s18r/n30d/n52s/s126r/t139s/l203f、s25g/n30d/n52s/f120s/n227k、n52h/n57y/q100r/v110d/f172s/c198r、s25g/f27c/n52h/n57y/q100r/v110d/e135k/l173s/c198r、n52h/n57y/v110a/c198r/r221i、m10i/s13g/n52h/n57y/d77g/v110a/h129p/i143v/f172s/v193m,c198r、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/n144d/f172s/c198r、n52s/h94e/l98f/q100r、n52s/e90a、n52s/f120s/i143v/i224v、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s、n52h/q100r/h115x/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52s/h94e/l96i/s109n/l166q/、n52h/n57y/q100r/c198r、n52h/n57y/l74q/v110d/s192g、n52h/q100r、n52h/s121g/c198r、a20v/n52h/n57y/q100r/s109g、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、l70q/a91g/i118a/t120s/t130a/k169e、q100r、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、n52h、n57y、n57y/q100p、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102rh115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115rf172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/q100r/h115r/i143tf172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、n30d/k42e/n52s/h115r/c198rr221i、n52s/e90a/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r、n52s/h115r/f172s/c198r、n119q、n207q、n52q/n207x、n168x/n207x、n52q/n168q、n84q/n207q、n119qn155x、n52q/n119q、n52q/n84q/n207q、n119q/n155q/n168q、n52h/n84q/n119q、n52q/n84q/n155x/n168x、n52a/n57f/q100s、n52a/n57h/q100s、n52a/n57y/q100a、n52d/n57a/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52h/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57f、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52r/n57y/q100p、n52r/n57y/q100s、n52s/n57a/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100s、n52s/n57y/q100m、n52s/n57y/q100v、n52t/n57h/q100s、n52t/n57h/q100a、n52t/n57y/q100a、n52v/n57l/q100a、n52h/n57y/q100k、n52k/n57y/q100r、n52l/n57h/q100r、n52r/n57f/q100n、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100r、n52r/n57f/q100t、n52r/n57l/q100s、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52g/n57v、n52l/n57v、n52s/n57l/q100g或n52t/n57k/q100p。

在一些实施方案中，变体icosl多肽显示出对cd28增加的结合亲和力，并且显示出对icos降低的结合亲和力。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代位于对应于52、75或203的位置。在一些实施方案中，变体icosl含有选自n52s、r75q、l203f或l203p的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有氨基酸取代n52s/r75q/l203p。

在一些实施方案中，变体icosl多肽具有在参考icosl或其特异性结合片段中对应于关于seqidno:32的编号的位置16、30、42、52、57、90、100、102、110、115、120、122、138、143、152、156、172、194、198、203、221或224的一个或多个氨基酸修饰，例如取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下项的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：e16v、n30d、k42e、n52h、n52y、n52s、n57y、e90a、q100r、q100p、l102r、v110d、h115r、f120s、v122a、f138l、i143v、i143t、h152c、k156m、f172s、n194d、c198r、l203p、r221i或i224v。在一些实施方案中，变体icosl多肽在参考icosl或其特异性结合片段中具有对应于关于seqidno:32的编号的位置115、172或198的一个或多个氨基酸修饰，例如取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自h115r、f172s或c198r的一个或多个氨基酸修饰，例如取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰例如取代是n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102r/h115r/f172s/c198r、n52h/v122a/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/q100r/h115r/i143t/f172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/e90a/h115r、n30d/k42en52s/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r/r221i、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r、n30d/k42e/n52s/h115r/f172s/n194d、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52s/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100ph115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s、n52h/q100r/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r或n52h/n57y/q100r/f172s/c198r。在一些实施方案中，与参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽相比，变体icosl多肽显示出潜在增强的蛋白质溶解性或增强的蛋白质表达(“溶解性突变”)。

在一些实施方案中，变体icosl多肽包含seqidno:435-470所示的任何细胞外结构域(ecd)序列。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含这样的多肽序列，该多肽序列显示出与seqidno:435-470所示的任何细胞外结构域(ecd)至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性，如至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性，且含有参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸修饰，例如一个或多个取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含seqidno:435-470所示的任何细胞外结构域(ecd)序列的特异性结合片段，且含有参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸修饰，例如一个或多个取代。

在一些实施方案中，变体icosl多肽显示出对cd28增加的结合亲和力，并且显示出对icos增加的结合亲和力。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代在对应于16、30、42、52、54、57、90、92、100、102、110、113、115、120、122、133、138、143、146、152、156、158、172、194、198、203、208、212、224或225的位置处。在一些实施方案中，变体icosl含有选自以下项的一个或多个氨基酸取代：c198r、d158g、e16v、e90a、f120s、f138l、f172s、h115r、i143v、i224v、k156m、k42e、k92r、l102r、l203p、l208p、n194d、n30d、n52a、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52q、n52r、n52s、n52t、n52y、n57f、n57h、n57l、n57m、n57s、n57v、n57w、n57y、q100a、q100e、q100g、q100k、q100m、q100p、q100r、q100s、q133h、s212g、s54a、s54p、t113e、t225a、v110d、v122a、y146c、y152c或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下项的一个或多个氨基酸取代：n52a/n57y/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100m、n52t/n57h/q100s、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100t、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52g/n57v、n52l/n57v、n52s/n57l/q100g、n52t/n57k/q100p、n52s、n52h、n52d、n52y/n57y/f138l/l203p、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n57y、n52s/c198r、n52s/t113e、s54a、n52d/s54p、n52k/l208p、n52h/i143t、n52s/d158g、n52d/q133h、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52s/e90a、n52s/f120s/i143v/i224v、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s、n52h/q100r/h115x/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、q100r、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、n52h、n57y、n57y/q100p、q100r/f138l、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102rh115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115rf172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/q100r/h115r/i143t/f172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、n52s/e90a/h115r、n52s/e90a/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r。

在一些实施方案中，变体icosl多肽在参考icosl或其特异性结合片段中具有对应于关于seqidno:32的编号的位置52、57、100、138、198或203的一个或多个氨基酸修饰，例如取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下项的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：n52h、n52y、n57y、q100r、q100p、f138l、c198r或l203p。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)是q100r、f138l/l203p、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、n52h、n57y、n57y/q100p、q100r/f138l或l203p。

在一些实施方案中，变体icosl多肽包含seqidno:427-433所示的任何细胞外结构域(ecd)序列。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含这样的多肽序列，该多肽序列显示出与seqidno:427-433所示的任何细胞外结构域(ecd)至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性，如至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性，且含有参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸修饰，例如一个或多个取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含seqidno:427-433所示的任何细胞外结构域(ecd)序列的特异性结合片段，且含有参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸修饰，例如一个或多个取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含seqidno:434所示的igv序列。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含这样的多肽序列，该多肽序列显示出与seqidno:434所示的igv序列至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性，如至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性，且含有参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸修饰，例如一个或多个取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含seqidno:434所示的igv序列的特异性结合片段，并且含有参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸取代。

在一些实施方案中，变体icosl多肽在参考icosl或其特异性结合片段中具有对应于关于seqidno:32的编号的位置52、84、91、119、155、168、207的一个或多个氨基酸修饰，例如取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有选自以下各项的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)：a91s、n52h、n52q、n84q、n119q、n155h、n155q、n168q、n207q。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)是n84q、n119q、n168q、n207q、n52q、n52q/n207q、n168q/n207q、n52q/n168q、n84q/n207q、n155q/n207q、n119q/n168q、n119q/n207q、n119q/n155q、n52q/n84q、n52q/n119q、n84q/n119q、n52q/n84q/n168q、n52q/n84q/n207q、n84q/n155q/n168q、n84q/n168q/n207q、n84q/n155h/n207q、n155q/n168q/n207q、n119qn155q/n168q、n119q/n168q/n207q、n84q/n119q/n207q、n119q/n155h/n207q、n84q/n119q/n155q、n52q/n119q/n155q、n52h/n84q/n119q、n52h/n84q、n52h/n84q/n168q、n52h/n84q/n207q、n52h/n84q/n168q/n207q、n52q/n84q/n155q、n52q/n84q/n168q、n52q/n84q/n155q/n168q、n52q/n84q/n119q/n168q、n84q/n119q/n155q/n168q、n84q/n155q/n168q/n207q、n84q/n119q/n155q/n207q、n52q/n84q/n119q/n207q、n52q/n84q/n119q/n155q、n52q/n84q/n119q/n155q/n207q、n84q/n119q/n155q/n168q/n207q或a91s/n119q/n168q/n207q。在一些实施方案中，与参考(例如未修饰的)或野生型icosl多肽相比，变体icosl多肽显示出潜在减少的糖基化。

在一些实施方案中，变体icosl多肽包含seqidno:387-424、427-433、435-470所示的任何细胞外结构域(ecd)序列。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含这样的多肽序列，该多肽序列显示出与seqidno:387-424、427-433、435-470所示的任何细胞外结构域(ecd)至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性，如至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性，且含有参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸修饰，例如一个或多个取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含seqidno:387-424、427-433、435-470所示的任何细胞外结构域(ecd)序列的特异性结合片段，且含有参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸修饰，例如一个或多个取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含seqidno:425-426所示的任何igv序列。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含这样的多肽序列，该多肽序列显示出与seqidno:425-426所示的任何igv序列至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性，如至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性，且含有参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸修饰，例如一个或多个取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含seqidno:425-426所示的任何igv序列的特异性结合片段，并且含有参考(例如未修饰的)或野生型icosl中不存在的一个或多个氨基酸取代。

iii.变体多肽的形式

包含本文提供的变体icosl的免疫调节多肽可以以多种方式被形式化，包括形式化为可溶性蛋白、膜结合蛋白、分泌蛋白、缀合物或融合物，或形式化为用于由工程化细胞或感染原表达，如本文其他地方所述的。在一些方面，包含icosl的一个或多个vigd的免疫调节多肽或包含多个igsf结构域的免疫调节多肽二者都可以以多种方式被形式化。

在一些实施方案中，可以针对期望的治疗应用选择特定的形式。在一些情况下，以一种拮抗或阻断其同源结合配偶体(例如cd28)的活性的形式提供包含变体icosl多肽的免疫调节多肽。在一些实施方案中，cd28的拮抗作用可用于治疗炎症或自身免疫。在一些情况下，以一种激动或刺激其同源结合配偶体(例如cd28)的活性的形式提供包含变体icosl多肽的免疫调节多肽。在一些实施方案中，cd28的激动作用可用于治疗肿瘤学适应症。技术人员可以容易地确定特定形式的活性，例如用于拮抗或激动一种或多种特定同源结合配偶体。在本文中，包括在实施例中，提供了用于评估此类活性的示例性方法。

在一些实施方案中，可将可溶性免疫调节多肽(诸如含有vigd的变体icosl)封装在脂质体内，脂质体本身可缀合至所提供的缀合物(例如，靶向部分)中的任何一种或任何组合。在一些实施方案中，本发明的可溶性或膜结合免疫调节多肽被去糖基化。在更具体的实施方案中，变体icosl序列被去糖基化。在甚至更具体的实施方案中，变体icosl的一个或多个igv和/或igc(例如igc2)结构域被去糖基化。

所提供的形式的非限制性实例在图13a-13c中描述，并在下文中进一步描述。

a.可溶性多肽

在一些方面，提供了包含icosl的vigd的免疫调节多肽。在一些实施方案中，包含变体icosl多肽的免疫调节蛋白是可溶性蛋白。本领域技术人员将理解，细胞表面蛋白通常具有细胞内、跨膜和细胞外结构域(ecd)，并且可以使用细胞外结构域或其免疫活性子序列制备此类蛋白质的可溶形式。因此，在一些实施方案中，含有变体icosl多肽的免疫调节蛋白缺乏跨膜结构域或跨膜结构域的一部分。在一些实施方案中，包含变体icosl的免疫调节蛋白缺乏细胞内(细胞质)结构域或细胞内结构域的一部分。在一些实施方案中，含有变体icosl多肽的免疫调节蛋白仅含有vigd部分，该vigd部分含有ecd结构域或其部分(其含有包含一个或多个氨基酸修饰的igv结构域和/或一个或多个igc(例如igc2)结构域或其特异性结合片段)。

在一些实施方案中，包含变体icosl的免疫调节多肽可包括一个或多个变体icosl多肽。在一些方面，一个或多个另外的igsf结构域，诸如一个或多个另外的vigd，可以与如本文提供的icosl的vigd连接。在一些方面，包含icosl的一个或多个vigd的免疫调节多肽或包含多个igsf结构域的免疫调节多肽二者都可以以多种方式被形式化，例如在第iii节c小节中所述。

在一些实施方案中，包含变体icosl的免疫调节多肽可以包括一个或多个本发明的变体icosl多肽。在一些实施方案中，本发明的多肽将精确地包含1、2、3、4、5个变体icosl序列。在一些实施方案中，变体icosl序列中的至少两个是相同的变体icosl序列。

在一些实施方案中，提供的免疫调节多肽包含icosl的两个或更多个vigd序列。多肽链中的多个变体icosl多肽可以彼此相同(即，相同种类)，或者可以是不相同(即，不同种类)的变体icosl序列。除了单个多肽链的实施方案之外，在一些实施方案中，本发明的两个、三个、四个或更多个多肽可以彼此共价或非共价连接。因此，本文提供了单体的、二聚的和更高级别(例如3、4、5或更多)多聚蛋白。例如，在一些实施方案中，本发明的恰好两个多肽可以彼此共价或非共价连接以形成二聚体。在一些实施方案中，通过链间半胱氨酸二硫键进行连接。包含两种或更多种本发明的多肽的组合物可以是相同种类或基本上相同种类的多肽(例如，同二聚体)或不相同种类的多肽(例如，异二聚体)。如上所述，具有本发明的多个连接的多肽的组合物可以在每个多肽链中具有本发明的一个或多个相同或不同的变体icosl多肽。

在一些方面，一个或多个另外的igsf结构域(诸如一个或多个另外的vigd)可以与如本文提供的icosl的vigd连接(以下称为“堆叠”或“堆叠的”免疫调节蛋白)。在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白的模块化形式为工程化或产生免疫调节蛋白提供了灵活性，所述免疫调节蛋白用于调节多个反结构(counterstructure)(多个同源结合配偶体)的活性。在一些实施方案中，此类“堆叠”分子可以以可溶形式提供，或者在一些情况下，可以作为膜结合或分泌蛋白提供。

在一些实施方案中，免疫调节蛋白可包含与一个或多个其他免疫球蛋白超家族(igsf)结构域直接或间接连接的本文所提供的任何变体icosl多肽(“堆叠的”免疫调节蛋白构建体，也称为“ii型”免疫调节蛋白)。在一些方面，这可以产生独特的多域免疫调节蛋白，其结合两个或更多个，例如三个或更多个同源结合配偶体，从而提供免疫突触的多重靶向调节(multi-targetingmodulation)。

在一些实施方案中，免疫调节蛋白包含变体icosl结构域与野生型igsf家族成员中未发现的另一个igsf家族成员(例如哺乳动物igsf家族成员)的一个或多个其他亲和力修饰和/或非亲和力修饰的igsf结构域序列的组合(“非野生型组合”)和/或排列(“非野生型排列(non-wildtypearrangement)”或“非野生型排列(non-wild-typepermutation)”)。在一些实施方案中，免疫调节蛋白包含2、3、4、5或6个免疫球蛋白超家族(igsf)结构域，其中根据提供的描述，igsf结构域中的至少一个是变体icosligsf结构域(icosl的vigd)。

在一些实施方案中，另外的igsf结构域的序列可以是与参考(例如未修饰的)或野生型igsf结构域相比含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)的修饰的igsf结构域。在一些实施方案中，igsf结构域可以是非亲和力修饰的(例如野生型)或已经被亲和力修饰的。在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)或野生型igsf结构域可以来自小鼠、大鼠、食蟹猴或人来源或其组合。在一些实施方案中，所述另外的igsf结构域可以是表2中列出的igsf家族成员的igsf结构域。在一些实施方案中，所述另外的igsf结构域可以是与表2中列出的igsf家族成员中包含的igsf结构域相比含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)的亲和力修饰的igsf结构域。

在一些实施方案中，另外的igsf结构域是选自以下的家族的igsf家族成员中包含的亲和力修饰的或非亲和力修饰的igsf结构域：信号调节蛋白(sirp)家族、在髓样细胞上表达的触发受体(treml)家族、癌胚抗原相关细胞粘附分子(ceacam)家族、唾液酸结合ig样凝集素(siglec)家族、嗜乳脂蛋白家族、b7家族、cd28家族、含v-set和免疫球蛋白结构域(vsig)的家族、v-set跨膜结构域(vstm)家族、主要组织相容性复合物(mhc)家族、信号淋巴细胞活化分子(slam)家族、白细胞免疫球蛋白样受体(lir)、nectin(nec)家族、nectin样(necl)家族、脊髓灰质炎病毒受体相关(pvr)家族、天然细胞毒性触发受体(ncr)家族、t细胞免疫球蛋白和粘蛋白(tim)家族或杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)家族。在一些实施方案中，另外的igsf结构域独立地来源于选自下组的igsf蛋白，该组由以下各项组成：cd80(b7-1)、cd86(b7-2)、cd274(pd-l1、b7-h1)、pdcd1lg2(pd-l2、cd273)、icoslg(b7rp1、cd275、icosl、b7-h2)、cd276(b7-h3)、vtcn1(b7-h4)、cd28、ctla4、pdcd1(pd-1)、icos、btla(cd272)、cd4、cd8a(cd8-α)、cd8b(cd8-β)、lag3、havcr2(tim-3)、ceacam1、tigit、pvr(cd155)、pvrl2(cd112)、cd226、cd2、cd160、cd200、cd200r1(cd200r)和ncr3(nkp30)。

表2的第一列提供了该特定igsf成员的名称，以及任选一些可能同义词的名称。第二列提供了uniprotkb数据库的蛋白质标识符，uniprotkb数据库是经由互联网在uniprot.org，或者在一些情况下经由genbank登录号可访问的公共可获得的数据库。universalproteinresource(uniprot)是蛋白质序列和注释数据的综合资源。uniprot数据库包括uniprot知识库(uniprotkb)。uniprot是欧洲生物信息研究所(embl-ebi)、sib瑞士生物信息研究所和蛋白质信息资源(pir)之间的合作，并且主要由美国国立卫生研究院(nih)的资助支持。genbank是nih基因序列数据库，是所有公共可获得的dna序列的注释集合(nucleicacidsresearch,2013jan；41(d1):d36-42)。第三列提供了所示igsf结构域所在的区域。该区域被规定为一个范围，其中结构域包含定义该范围的残基。第3列还表明规定的igsf区域的igsf结构域类别。第4列提供了所示另外的结构域所在的区域(信号肽，s；细胞外结构域，e；跨膜结构域，t；细胞质结构域，c)。应当理解，结构域的描述可以根据用于鉴定或分类结构域的方法而变化，并且可以根据不同来源而差异地鉴定。对应于表2中的结构域的残基的描述仅用于举例说明，并且可以是长或短若干个氨基酸(如一个、两个、三个或四个)。第5列表示一些列出的igsf成员，igsf成员的一些同源细胞表面结合配偶体。

在一些实施方案中，除了含有变体icosl多肽之外，所提供的免疫调节蛋白还含有至少1、2、3、4、5或6个另外的免疫球蛋白超家族(igsf)结构域，如表2所示的igsf家族成员的igd结构域。

在一些实施方案中，提供的免疫调节蛋白包含至少一个另外的igsf结构域(例如，第二igsf结构域)。在一些实施方案中，提供的免疫调节蛋白包含至少两个另外的igsf结构域(例如第二和第三igsf结构域)。在一些实施方案中，提供的免疫调节蛋白包含至少三个另外的igsf结构域(例如，第二、第三和第四)。在一些实施方案中，提供的免疫调节蛋白包含至少四个另外的igsf结构域(例如，第二、第三、第四和第五)。在一些实施方案中，提供的免疫调节蛋白包含至少五个另外的igsf结构域(例如，第二、第三、第四、第五和第六)。在一些实施方案中，提供的免疫调节蛋白包含至少六个另外的igsf结构域(例如，第二、第三、第四、第五、第六和第七)。在一些实施方案中，免疫调节蛋白中的每个igsf结构域是不同的。在一些实施方案中，另外的igsf结构域中的至少一个与免疫调节蛋白中的至少一个另外的igsf结构域相同。在一些实施方案中，每个igsf结构域来自或衍生自不同的igsf家族成员。在一些实施方案中，igsf结构域中的至少两个来自或衍生自相同的igsf家族成员。

在一些实施方案中，另外的igsf结构域包含igv结构域或一个或多个igc(例如，igc2)结构域，或igv结构域的特异性结合片段或一个或多个igc(例如igc2)结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，另外的igsf结构域是或包含全长igv结构域。在一些实施方案中，另外的igsf结构域是或包含一个或多个全长igc(例如，igc2)结构域。在一些实施方案中，另外的igsf结构域是或包含igv结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，另外的igsf结构域是或包含一个或多个igc(例如，igc2)结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，免疫调节蛋白包含来自单一(相同)igsf成员的至少两个另外的igsf结构域。例如，在一些方面，免疫调节蛋白包含igsf成员的ecd或其部分，该igsf成员包含全长igv结构域和一个或多个全长igc(例如igc2)结构域或其特异性结合片段。

在一些实施方案中，提供的免疫调节蛋白包含至少一个另外的igsf结构域(例如，第二igsf结构域或在一些情况下还有第三igsf结构域)，其中至少一个另外的(例如第二或第三)igsf结构域是seqidno:1-27和341中任一个所示的氨基酸序列中包含的参考(例如未修饰的)或野生型igsf结构域或其特异性结合片段中所示的igsf结构域。在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)或野生型igsf结构域是igv结构域或igc结构域，诸如igc1或igc2结构域。

在一些实施方案中，所提供的免疫调节蛋白，除了包含变体icosl多肽之外，还包含至少一个另外的igsf结构域(例如，第二igsf结构域，或在一些情况下还包含第三亲和力修饰的igsf结构域等)，其中至少一个另外的igsf结构域是vigd，与参考(例如未修饰的)或野生型igsf结构域中的igsf结构域(诸如表2中列出了igsf家族成员中的igsf结构域)相比，该vigd包含一个或多个氨基酸修饰(例如取代、缺失或突变)。在一些实施方案中，另外的(例如第二或第三)亲和力修饰的igsf结构域包含与在seqidno：1-27和341中任一个所示的氨基酸序列中包含的参考(例如未修饰的)或野生型igsf结构域或其特异性结合片段的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)或野生型igsf结构域是igv结构域或igc结构域(诸如igc1或igc2域)。在一些实施方案中，另外的(例如第二或第三igsf结构域)igsf结构域是亲和力修饰的igv结构域和/或igc结构域。在一些实施方案中，一个或多个另外的igsf结构域是亲和力修饰的igsf结构域，其包含igv结构域和/或一个或多个igc(例如，igc2)结构域或igv结构域的特异性结合片段和/或一个或多个igc(例如igc2)结构域的特异性结合片段，其中所述igv和/或igc结构域包含一个或多个氨基酸修饰(例如，一个或多个取代)。在一些实施方案中，一个或多个另外的亲和力修饰的igsf结构域包含igv结构域，该igv结构域包含一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，一个或多个另外的亲和力修饰的igsf结构域包括存在于相应参考igsf家族成员的ecd或ecd的一部分中的igsf结构域，诸如全长igv结构域和一个或多个全长igc(例如igc2)结构域或其特异性结合片段，其中igv和igc中的一个或二者含有一个或多个氨基酸修饰(例如一个或多个取代)。在一些实施方案中，变体igsf结构域多肽的特定结构域或特定结构域中的每个(例如，另外的(例如第二或第三)igsf结构域)可以比各自seqidno中所示的氨基酸序列长或短的几个氨基酸，例如长或短1-10个氨基酸，例如长或短1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。

在一些实施方案中，提供的免疫调节蛋白包含至少一个另外的(例如，第二igsf结构域，或在一些情况下还包括第三igsf结构域等)或第二igsf结构域，其为与参考(例如未修饰的)或野生型igsf结构域(而非icosl)的igsf结构域(例如igv)相比包含一个或多个氨基酸取代的vigd。

在一些实施方案中，与参考(例如未修饰的)或野生型igsf结构域(如表2中所示的igsf家族成员中的igsf结构域)中的igsf相比，另外的或第二igsf结构域包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，另外的或第二亲和力修饰的igsf结构域包含与seqidno:1-27中任一个所示的氨基酸序列中包含的参考序列(例如未修饰的)或野生型igsf结构域或其特异性结合片段至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在一些实施方案中，参考(例如未修饰的)或野生型igsf结构域是igv结构域或igc结构域，诸如igc1或igc2结构域。在一些实施方案中，另外的或第二igsf结构域是亲和力修饰的igv结构域或igc结构域。表3-5提供了包含一个或多个亲和力修饰的igsf结构域的示例性多肽，该亲和力修饰的igsf结构域可用于本文提供的堆叠构建体中。

在一些实施方案中，一个或多个另外的igsf结构域(例如第二igsf)结构域是结合或识别肿瘤抗原的另一igsf家族成员的igsf结构域(例如igv)。在此类实施方案中，igsf家族成员充当肿瘤定位部分，从而使icosl的vigd与肿瘤微环境中的免疫细胞紧密接近。在一些实施方案中，另外的igsf结构域(例如第二igsf)结构域是结合或识别肿瘤细胞上表达的b7-h6的nkp30的igsf结构域。在一些实施方案中，该至少一个另外的(例如第二)igsf结构域例如nkp30是含有一个或多个氨基酸修饰(例如取代、缺失或添加)的vigd。在一些实施方案中，与参考igsf结构域例如nkp30相比，该一个或多个氨基酸修饰增加对b7-h6的结合亲和力和/或选择性，如增加至少或至少约1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。

存在于“堆叠的”免疫调节蛋白构建体中的这种非亲和力修饰或亲和力修饰的igsf结构域的数目(无论是非野生型组合还是非野生型排列)为至少2、3、4或5，并且在一些实施方案中恰好为2、3、4或5个igsf结构域(由此确定的亲和力修饰的igsf结构域的数目忽略其任何非特异性结合部分的序列和/或其基本上免疫失活部分的序列)。

在本文提供的堆叠免疫调节蛋白的一些实施方案中，igsf结构域的数目为至少2，其中亲和力修饰的igsf结构域的数目和非亲和力修饰的igsf结构域的数目各自独立地为至少：0、1、2、3、4、5或6。因此，亲和力修饰的igsf结构域的数目和非亲和性修饰的igsf结构域的数目(亲和力修饰的igsf结构域：非亲和力修饰的igsf结构域)可以恰好为或为至少：2:0(亲和力修饰的:野生型)、0:2、2:1、1:2、2:2、2:3、3:2、2:4、4:2、1:1、1:3、3:1、1:4、4:1、1:5或5:1。

在堆叠免疫调节蛋白的一些实施方案中，非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域中的至少两个是相同的igsf结构域。

在一些实施方案中，本文提供的堆叠免疫调节蛋白包含来自单个igsf成员但为非野生型排列(或者“置换”)的至少两个亲和力修饰和/或非亲和力修饰的igsf结构域。非野生型排列或置换的一个说明性例子是免疫调节蛋白，其包含相对于在野生型icosl中发现的那些igsf结构域序列的非野生型顺序的亲和力修饰和/或非亲和力修饰的igsf结构域序列，该野生型icosl的igsf结构域序列用作本文提供的变体igsf结构域的来源。因此，在一个例子中，免疫调节蛋白可以包含在跨膜结构域近端的igv和远端的igc，虽然是非亲和力修饰和/或亲和力修饰的形式。在本文提供的免疫调节蛋白中，非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域的非野生型组合和非野生型排列的存在也在所提供的主题范围内。

在堆叠免疫调节蛋白的一些实施方案中，非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域是不相同的(即，不同的)igsf结构域。在特异性结合条件下不相同的亲和力修饰的igsf结构域特异性结合不同的同源结合配偶体，并且无论它们工程化来源的参考(例如未修饰的)或野生型igsf结构域是否相同，该不相同的亲和力修饰的igsf结构域是“不相同的”。因此，例如，免疫调节蛋白中的至少两个不相同的igsf结构域的非野生型组合可以包含至少一个igsf结构域序列(其来源于且仅来源于一个icosl)和至少一个第二igsf结构域序列(其来源于且仅来源于非icosl的另一种igsf家族成员)，其中该免疫调节蛋白的igsf结构域是非亲和力修饰和/或亲和力修饰的形式。然而，在替代实施方案中，两个不相同的igsf结构域来源于相同的igsf结构域序列，但至少一个是亲和力修饰的，使得它们与不同的同源结合配偶体特异性结合。

堆叠免疫调节蛋白多肽链中的多个非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域不需要彼此直接共价连接。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸残基的间隔跨度间接地将非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的igsf结构域彼此共价键合。连接可以是经由n-末端到c-末端残基。

在一些实施方案中，可以经由不位于非亲和力修饰的和/或亲和力修饰的igsf结构域的n-末端或c-末端的氨基酸残基的侧链进行连接。因此，可以经由末端或内部氨基酸残基或其组合进行连接。

在一些实施方案中，该两个或更多个igsf结构域是共价或非共价连接的，其包括icosl的vigd和来自另一个igsf家族成员的一个或多个另外的igsf结构域(例如第二或第三变体igsf结构域)。在一些实施方案中，该两个或更多个igsf结构域直接或间接地如经由接头连接。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸残基的间隔跨度间接地将igsf结构域彼此共价键合。连接可以是经由n-末端到c-末端残基。在一些实施方案中，可以经由不位于一个或多个igsf结构域的n-末端或c-末端的氨基酸残基的侧链进行连接。因此，可以经由末端或内部氨基酸残基或其组合进行连接。

在一些实施方案中，免疫调节蛋白包含至少两个igsf结构域，每个igsf结构域直接或通过接头间接连接。在一些实施方案中，免疫调节蛋白包含至少三个免疫调节蛋白，每个直接或通过接头间接连接。在图16a和16b中示出了多种构型。

在一些实施方案中，一个或多个“肽接头”连接icosl的vigd和一个或多个另外的igsf结构域(例如第二或第三变体igsf结构域)。在一些实施方案中，肽接头长度可以是单个氨基酸残基或更长。在一些实施方案中，肽接头的长度为至少一个氨基酸残基但不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头是柔性接头。在一些实施方案中，接头是(以单字母氨基酸代码的形式)：ggggs(“4gs”；seqidno:636)或4gs接头的多聚体，如2、3、4或5个4gs接头的重复序列。在一些实施方案中，肽接头是分别如seqidno:229和228所示的(ggggs)2或(ggggs)3。在一些实施方案中，接头还可以单独包含一系列丙氨酸残基或者还包含另一个肽接头(如4gs接头或其多聚体)。在一些实施方案中，每个系列中丙氨酸残基的数目是2、3、4、5或6个丙氨酸。在一些实施方案中，接头是刚性接头。例如，接头是α-螺旋接头。在一些实施方案中，接头是(以单字母氨基酸代码的形式)：eaaak或eaaak接头的多聚体，诸如2、3、4或5个eaaak接头的重复，如seqidno:629(1xeaaak)、seqidno:630(3xeaaak)或seqidno:631(5xeaaak)所示。在一些实施方案中，接头可以进一步包括通过克隆和/或从限制位点引入的氨基酸，例如接头可以包括通过使用限制位点bamhi引入的氨基酸gs(以单字母氨基酸代码的形式)。在一些实施方案中，接头(以单字母氨基酸代码的形式)是gsggggs(seqidno:635)。在一些实例中，接头是2xggggs，其后是三个丙氨酸(ggggsggggsaaa；seqidno:230)。

在一些实施方案中，非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域是通过在第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域的n-末端和/或c-末端插入的“野生型肽接头”连接。在一些实施方案中，存在在第一igsf结构域的n-末端插入的前导肽接头和/或在第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域的c-末端插入的第一尾随序列。在一些实施方案中，存在在第二igsf结构域的n-末端插入的第二前导肽接头和/或在第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域的c-末端插入的第二尾随序列。当第一和第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域来源于相同的亲本蛋白质并以相同方向连接时，第一与第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域之间的野生型肽接头不重复。例如，当第一尾随野生型肽接头和第二前导野生型肽接头相同时，ii型免疫调节蛋白不包含第一尾随野生型肽接头或第二前导野生型肽接头。

在一些实施方案中，ii型免疫调节蛋白包含在第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域的n-末端插入的第一前导野生型肽接头，其中该第一前导野生型肽接头包含来自野生型蛋白质中的间插序列的至少5个(如至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个中的任何一个)连续氨基酸，在该野生型蛋白质中第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域来源于亲本igsf结构域与紧接在前的结构域(如信号肽或igsf结构域)之间。在一些实施方案中，第一前导野生型肽接头包含野生型蛋白质中的完整间插序列，在该野生型蛋白质中第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域来源于亲本igsf结构域与紧接在前的结构域(如信号肽或igsf结构域)之间。

在一些实施方案中，ii型免疫调节蛋白还包含在第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域的c-末端插入的第一尾随野生型肽接头，其中该第一尾随野生型肽接头包含来自野生型蛋白质中的间插序列的至少5个(如至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个中的任何一个)连续氨基酸，在该野生型蛋白质中第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域来源于亲本igsf结构域与紧随其后的结构域(如igsf结构域或跨膜结构域)之间。在一些实施方案中，第一尾随野生型肽接头包含野生型蛋白质中的完整间插序列，在该野生型蛋白质中第一非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域来源于亲本igsf结构域与紧随其后的结构域(如igsf结构域或跨膜结构域)之间。

在一些实施方案中，ii型免疫调节蛋白还包含在第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域的n-末端插入的第二前导野生型肽接头，其中该第二前导野生型肽接头包含来自野生型蛋白质中的间插序列的至少5个(如至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多中的任何一个)连续氨基酸，在该野生型蛋白质中第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域来源于亲本igsf结构域与紧接在前的结构域(如信号肽或igsf结构域)之间。在一些实施方案中，第二前导野生型肽接头包含野生型蛋白质中的完整间插序列，在该野生型蛋白质中第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域来源于亲本igsf结构域与紧接在前的结构域(如信号肽或igsf结构域)之间。

在一些实施方案中，ii型免疫调节蛋白还包含在第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域的c-末端插入的第二尾随野生型肽接头，其中该第二尾随野生型肽接头包含来自野生型蛋白质中的间插序列的至少5个(如至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个中的任何一个)连续氨基酸，在该野生型蛋白质中第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域来源于亲本igsf结构域与紧随其后的结构域(如igsf结构域或跨膜结构域)之间。在一些实施方案中，第二尾随野生型肽接头包含野生型蛋白质中的完整间插序列，在该野生型蛋白质中第二非亲和力修饰和/或亲和力修饰的igsf结构域来源于亲本igsf结构域与紧随其后的结构域(如igsf结构域或跨膜结构域)之间。

含有cd80igsf结构域的ii型蛋白的前导序列和尾随序列的示例示于seqidno:231和seqidno:232中。含有icosligsf结构域的ii型蛋白的前导序列和尾随序列的示例示于seqidno:233和234中。含有cd86igsf结构域的ii型蛋白的前导序列和尾随序列的示例示于seqidno:236-238中的任何一个中。用于含有nkp30igsf结构域的ii型蛋白的野生型接头序列的示例示于seqidno:235中。

1.单价

本文提供了单价的包含变体icosl多肽的免疫调节蛋白。在一些实施方案中，单价免疫调节蛋白的变体icosl多肽直接或间接连接至另一部分。在一些实施方案中，另一部分是蛋白质、肽、小分子或核酸。在一些实施方案中，单价免疫调节蛋白是融合蛋白。

在一些实施方案中，该部分是延长半衰期的分子。此类延长半衰期的分子的示例包括但不限于白蛋白、白蛋白结合多肽、pro/ala/ser(pas)、人绒毛膜促性腺激素β亚基的c端肽(ctp)、聚乙二醇(peg)、长非结构化亲水性氨基酸序列(xten)、羟乙基淀粉(hes)、结合白蛋白的小分子，或其组合。

在一些实施方案中，包含变体icosl的免疫调节多肽可包括由氨基酸pro、ala和ser组成的构象失调的多肽序列(参见例如wo2008/155134；seqidno:904)。在一些情况下，氨基酸重复为至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22，23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸残基，其中每个重复包含一个或多个ala、ser和pro残基。因此，本文提供了一种免疫调节蛋白，其是一种pas基化的蛋白，其中变体icosl多肽直接或通过接头间接连接到pro/ala/ser(pas)。在一些实施方案中，可使用一个或多个另外的接头结构。

在一些实施方案中，该部分有利于变体icosl多肽的检测或纯化。在一些情况下，免疫调节多肽包含直接或间接连接至icosl多肽n和/或c末端的标签或融合结构域，例如亲和标签或纯化标签。多种合适的多肽标签和/或融合结构域是已知的，包括但不限于多聚组氨酸(his)标签、flag标签(seqidno:865)、myc标签和荧光蛋白标签(例如，egfp，如seqidno:858、859或896中所示的)。在一些情况下，包含变体icosl的免疫调节多肽包含至少六个组氨酸残基(如seqidno:864所示)。在一些情况下，包含变体icosl的免疫调节多肽还包含部分的各种组合。例如，包含变体icosl的免疫调节多肽还包含一个或多个多聚组氨酸标签和flag标签。

在一些实施方案中，icosl多肽与以单价形式保持的修饰的免疫球蛋白重链恒定区(fc)(如seqidno:472所示)连接。

2.二价

在一些实施方案中，包含变体icosl的免疫调节蛋白是多价的，例如二价的。在一些方面，免疫调节蛋白直接或通过接头间接连接至多聚化结构域。在一些方面，该多聚化结构域使该分子的半衰期增加。

两个或多个变体icosl多肽的相互作用可通过它们直接或间接连接至本身能够相互作用以形成稳定结构的任何部分或其他多肽而被促进。例如，可通过多聚化连接分开编码的变体icosl多肽链，由此通过多聚化结构域介导多肽的多聚化。通常，多聚化结构域提供了第一变体icosl多肽和第二变体icosl多肽之间稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的形成。同型或异型多聚体多肽可以从单独的变体icosl多肽的共表达中产生。第一和第二变体icosl多肽可以相同或不同。

在一些实施方案中，多聚化结构域包括能够形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的任何结构域。多聚化结构域可以经由以下相互作用：免疫球蛋白序列(例如fc结构域；参见例如国际专利公开号wo93/10151和wo2005/063816us；美国公开号2006/0024298；美国专利号5,457,035)；亮氨酸拉链(来自核转化蛋白fos和jun或原癌基因c-myc，或来自氮的一般控制(gcn4))(例如，busch和sassone-corsi(1990)trendsgenetics,6:36-40；gentz等人,(1989)science,243:1695-1699)；疏水区；亲水区；或在同型或异型多聚体的嵌合分子之间形成分子间二硫键的游离巯基。另外，多聚化结构域可包含含有与包含穴的氨基酸序列互补的隆突的氨基酸序列，例如在美国专利号5,731,168；国际专利公开号wo98/50431和wo2005/063816；ridgway等人(1996)proteinengineering,9:617-621中描述的。可以工程化这样的多聚化区域，使得空间相互作用不仅促进稳定的相互作用，而且与由嵌合单体的混合物形成的同二聚体相比，还促进从嵌合单体的混合物中形成异二聚体超过同二聚体。通常，通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽界面的小氨基酸侧链来构建隆突。通过用较小的侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，任选地在第二多肽的界面上产生了与隆突相同或相似大小的补偿腔。示例性的多聚化结构域描述如下。

变体icosl多肽可以在任何地方连接(但通常经由其n-或c-末端)至多聚化结构域的n-或c-末端连接以形成嵌合多肽。连接可以是直接的或经由接头间接的。同样，嵌合多肽可以是融合蛋白，或者可以通过化学连接形成，例如通过共价或非共价相互作用形成。例如，当制备包含多聚化结构域的嵌合多肽时，可以将编码变体icosl多肽的全部或部分的核酸与编码多聚化结构域序列的核酸直接或间接或任选地经由接头结构域可操作地连接。在一些情况下，构建体编码嵌合蛋白，其中变体icosl多肽的c末端连接至多聚化结构域的n末端。在一些情况下，构建体可以编码嵌合蛋白，其中变体icosl多肽的n末端连接至多聚化结构域的n-或c-末端。

多肽多聚体含有两个嵌合蛋白，其是通过直接或间接地将两个相同或不同变体icosl多肽直接或间接连接至多聚化结构域而产生的。在一些实例中，在多聚化结构域是多肽的情况下，将编码变体icosl多肽和多聚化结构域的基因融合体插入合适的表达载体中。所得的嵌合或融合蛋白可以在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达，并使其组装成多聚体，其中多聚化结构域相互作用形成多价多肽。可以使用异双功能接头实现多聚化结构域与变体icosl多肽的化学连接。

所得的嵌合多肽，诸如融合蛋白和由其形成的多聚体，可以通过任何合适的方法来纯化，例如通过蛋白a或蛋白g柱上的亲和层析。在将编码不同多肽的两个核酸分子转化到细胞中时，将形成同二聚体和异二聚体。可以调整表达条件，使得异二聚体形成优于同二聚体形成。

免疫球蛋白结构域

在一些实施方案中，免疫调节蛋白包含与免疫球蛋白的fc区连接的变体icosl多肽(产生“免疫调节fc融合体”，诸如“icosl-fc变体融合体”，也称为icoslvigd-fc融合体)。在一些实施方案中，icosl-fc变体融合体还包含一个或多个另外的igsf结构域，如与icosl的vigd连接的一个或多个另外的vigd。在一些实施方案中，变体icosl多肽或另外的igsf结构域附接在fc的n末端。在一些实施方案中，变体icosl或另外的igsf结构域多肽附接在fc的c末端。在一些实施方案中，两个或更多个icosl或另外的igsf结构域变体多肽(相同或不同)独立地连接在n末端和c末端。

在一些实施方案中，fc是鼠或人fc。在一些实施方案中，fc是哺乳动物或人igg1、igg2、igg3或igg4fc区。在一些实施方案中，fc衍生自igg1，诸如人igg1。在一些实施方案中，fc包含seqidno:226中所示的氨基酸序列或表现出与seqidno:226至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，fc区包含一个或多个修饰以改变(例如减少)其正常功能中的一个或多个。通常，除了作为免疫球蛋白主要功能的抗原结合能力以外，fc区还负责效应子功能，诸如补体依赖性细胞毒性(cdc)和抗体依赖性细胞细胞毒性(adcc)。另外，存在于fc区中的fcrn序列通过与体内fcrn受体缀合来增加体内半衰期，从而起到调节血清中igg水平的作用。在一些实施方案中，可以减少或改变fc的此类功能以与提供的fc融合蛋白一起使用。

在一些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的icosl-fc变体融合体的fc区中，由此产生fc区变体。在一些实施方案中，fc区变体具有降低的效应子功能。存在很多可以改变效应子功能的fc序列变化或突变的实例。例如，wo2000/42072、wo2006/019447、wo2012/125850、wo2015/107026、us2016/0017041和shields等人jbiol.chem.9(2):6591-6604(2001)描述了示例性的fc变体，其具有改善的或削弱的与fcr的结合。这些公开物的内容通过引用具体地并入本文。

在一些实施方案中，所提供的变体icosl-fc融合体包含表现出降低的效应子功能的fc区(也称为惰性fc或无效应子fc)，这使其成为以下应用的合意候选者：其中icosl-fc变体融合体在体内的半衰期很重要，但是某些效应子功能(诸如cdc和adcc)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认cdc和/或adcc活性的降低/消耗。例如，可以进行fc受体(fcr)结合测定以确保icosl-fc变体融合物缺乏fcγr结合(因此可能缺乏adcc活性)，但保留fcrn结合能力。介导adcc的主要细胞(nk细胞)仅表达fcγriii，而单核细胞表达fcγri、fcγrii和fcγriii。ravetch和kinetannu.rev.immunol.9:457-492(1991)中的第464页表3总结了造血细胞上的fcr表达。评估感兴趣的分子的adcc活性的体外测定法的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见，例如，hellstrom,i等人，proc.nat'lacad.sci.usa83:7059-7063(1986))和hellstrom,i等人，proc.nat'lacad.sci.usa82:1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见bruggemann,m.等人,j.exp.med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的acti^tm非放射性细胞毒性测定(celltechnology,inc.mountainview,calif.)；和cytotox96^tm非放射性细胞毒性测定(promega,madison,wis.))。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。替代性地或额外地，可以在体内，诸如在动物模型中，评估感兴趣的分子的adcc活性，如clynes等人，proc.nat'lacad.sci.usa95:652-656(1998)中所公开的那些。也可以进行c1q结合测定以证实icosl-fc变体融合体不能结合c1q并因此缺乏cdc活性。参见，例如，wo2006/029879和wo2005/100402中的c1q和c3c结合elisa。为了评估补体活化，可以进行cdc测定法(参见例如gazzano-santoro等人,j.immunol.methods202:163(1996)；cragg,m.s.等人,blood101:1045-1052(2003)；和cragg,m.s和m.j.glennie,blood103:2738-2743(2004))。还可使用本领域已知的方法进行fcrn结合和体内清除/半衰期的确定(参见，例如，petkova，sb等人，int'l.immunol.18(12):1759-1769(2006))。

具有降低的效应子功能的icosl-fc变体融合体包括具有通过eu编号的fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的icosl-fc变体融合体(美国专利号6,737,056)。此类fc突变体包括在通过eu编号的氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有取代的fc突变体，包括所谓的“dana”fc突变体，其将残基265和297取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。

在一些实施方案中，icosl-fc变体融合体的fc区具有fc区，其中与天然fc区相比，在位置234、235、236、237、238、239、270、297、297、298、325和329(以eu编号表示)处的任何一个或多个氨基酸被不同的氨基酸取代。fc区的这种改变不限于上述改变，并且包括例如诸如去糖基化链(n297a和n297q)、igg1-n297g、igg1-l234a/l235a、igg1-l234a/l235e/g237a、igg1-a325a/a330s/p331s、igg1-c226s/c229s、igg1-c226s/c229s/e233p/l234v/l235a、igg1-e233p/l234v/l235a/g236del/s267k、igg1-l234f/l235e/p331s、igg1-s267e/l328f,igg2-v234a/g237a、igg2-h268q/v309l/a330s/a331s、igg4-l235a/g237a/e318a和igg4-l236e(其描述于currentopinioninbiotechnology(2009)20(6),685-691；)的改变，诸如描述于wo2008/092117中的g236r/l328r、l235g/g236r、n325a/l328r和n325ll328r的改变；在位置233、234、235和237处的氨基酸插入(由eu编号指示)；和在wo2000/042072中描述的位点处的改变。

描述了具有改善的或削弱的与fcr的结合的某些fc变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；wo2004/056312、wo2006/019447和shields等人，j.biol.chem.9(2):6591-6604(2001))。

在一些实施方案中，提供了包含变体fc区的icosl-fc变体融合物，该变体fc区包含一个或多个氨基酸取代，其增加半衰期和/或改善与新生儿fc受体(fcrn)的结合。在us2005/0014934a1(hinton等人)或wo2015107026中描述了具有增加的半衰期和改善的与fcrn结合的抗体。那些抗体包含其中具有改善fc区与fcrn的结合的一个或多个取代的fc区。此类fc变体包括在fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434(通过eu编号)中的一处或多处具有取代的fc变体，例如fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。

在一些实施方案中，icosl-fc变体融合体的fc区包含一个或多个氨基酸取代e356d和m358l(通过eu编号)。在一些实施方案中，icosl-fc变体融合体的fc区包含一个或多个氨基酸取代c220s、c226s和/或c229s(通过eu编号)。在一些实施方案中，icosl变体融合物的fc区包含一个或多个氨基酸取代r292c和v302c。还参见duncan&winter，nature322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和wo94/29351，其关于fc区变体的其他实例。

在一些实施方案中，野生型igglfc可以是seqidno:226中所示的fc，其具有在位置356和358(通过eu编号)处包含残基glu(e)和met(m)的同种异型(例如f异型)。在其他实施方案中，野生型igg1fc包含人g1m1同种异型的氨基酸，如在位置356和358(例如如seqidno:927所示的)处包含asp(d)和leu(l)的残基。因此，在一些情况下，本文提供的fc可包含氨基酸取代e356d和m358l以重构同种异型g1m1(例如α同种异型)的残基。在一些方面，通过一个或多个氨基酸取代修饰野生型fc，以降低效应子活性或使fc对于fc效应子功能呈惰性。示例性无效应子或惰性突变包括本文所述的那些。可以包括在本文提供的构建体的fc中的无效应子突变是通过eu编号的l234a、l235e和g237a。在一些实施方案中，通过去除一个或多个半胱氨酸残基，例如通过在位置220(通过eu编号)处将半胱氨酸残基替换为丝氨酸残基(c220s)，来进一步修饰野生型fc。具有降低的效应子功能的示例性惰性fc区在seqidno:633或477和seqidno:474或637中列出，它们分别基于seqidno:226或seqidno:927中所示的同种异型。在一些实施方案中，在本文提供的构建体中使用的fc区可以进一步缺少c末端赖氨酸残基。

在一些实施方案中，可以在fc区进行改变，其导致削弱的c1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)，例如，如美国专利号6,194,551、wo99/51642和idusogie等人,j.immunol.164:4178-4184(2000)中所描述的。

在一些实施方案中，提供了一种icosl-fc变体融合体，其包含具有一个或多个氨基酸修饰的变体fc区，其中所述变体fc区衍生自igg1，诸如人igg1。在一些实施方案中，变体fc区衍生自seqidno:226中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，fc表现出降低的效应子功能。在一些实施方案中，fc包含至少一个氨基酸取代，其为通过seqidno:226的编号的n82g(对应于通过eu编号的n297g)。在一些实施方案中，fc还包含至少一个氨基酸取代，其为通过seqidno:226的编号的r77c或v87c(对应于通过eu编号的r292c或v302c)。在一些实施方案中，变体fc区还包含通过seqidno:226的编号的c5s氨基酸修饰(对应于通过eu编号的c220s)。例如，在一些实施方案中，变体fc区包含以下氨基酸修饰：通过eu编号的v297g和以下一个或多个氨基酸修饰c220s、r292c或v302c(对应于参照seqidno:226的n82g和以下一个或多个氨基酸修饰c5s、r77c或v87c)，例如fc区包含seqidno:476中所示的序列。在一些实施方案中，变体fc区包含氨基酸修饰c220s、l234a、l235e或g237a中的一个或多个，例如fc区包含seqidno:477中所示的序列。在一些实施方案中，变体fc区包含氨基酸修饰c220s、e233p、l234v、l235a、g236del或s267k中的一个或多个，例如fc区包含seqidno:478中所示的序列。在一些实施方案中，变体fc包含氨基酸修饰c220s、l234a、l235e、g237a、e356d或m358l中的一个或多个，例如fc区包含seqidno:474中所示的序列。

在一些实施方案中，fc区缺少对应于seqidno:56中所示的参考(例如，未修饰的)或野生型fc的位置232的c末端赖氨酸(对应于eu编号的k447del)。在一些实施方案中，因为可在生物合成期间中差异性地去除c末端赖氨酸，所以当蛋白质在细胞中表达时，去除c末端赖氨酸残基会产生更均一的产物。在一些方面，这样的fc区可额外地包括一个或多个另外的修饰，例如，氨基酸取代，诸如所述的任何取代。此类fc区的示例在seqidno:632、633、634或637中示出。

在一些实施方案中，提供了包含变体fc区的icosl-fc变体融合体，其中变体fc包含seqidno:474、476、477、478、507、632、633、634或637中任一个所示的氨基酸序列，或表现出与seqidno:474、476、477、478、507、632、633、634或637中的任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，fc表现出降低的效应子功能。

在一些实施方案中，fc衍生自igg2，诸如人igg2。在一些实施方案中，fc包含seqidno:227中所示的氨基酸序列或表现出与seqidno:227至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，fc包含seqidno:505中所示的氨基酸序列或表现出与seqidno:505至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，igg4fc是：稳定化的fc，其中人igg4的ch3结构域被人igg1的ch3结构域取代，并且其显示出抑制的聚集体形成；抗体，其中人igg4的ch3和ch2结构域分别被人igg1的ch3和ch2取代；或抗体，其中在人igg4的以kabat等人建议的eu索引指示的位置409处的精氨酸被赖氨酸取代，并且其显示出抑制的聚集体形成(参见例如美国专利号8,911,726)。在一些实施方案中，fc是含有s228p突变的igg4，其已显示可防止治疗性抗体与内源性igg4之间通过fab臂交换而重组(参见例如labrijin等人(2009)nat.biotechnol.,27(8)767-71)。在一些实施方案中，fc包含seqidno:506中所示的氨基酸序列或表现出与seqidno:506至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，变体icosl多肽直接连接至fc序列。在一些实施方案中，变体icosl多肽间接连接至fc序列，诸如经由接头。在一些实施方案中，一个或多个“肽接头”连接变体icosl多肽和fc结构域。在一些实施方案中，肽接头长度可以是单个氨基酸残基或更长。在一些实施方案中，肽接头长度为至少一个氨基酸残基，但不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头是三个丙氨酸(aaa)。在一些实施方案中，接头是(以单字母氨基酸代码的形式)：ggggs(“4gs”；seqidno:636)或4gs接头的多聚体，例如2、3、4、5或6个4gs接头的重复，诸如seqidno:229(2xggggs)或seqidno:228(3xggggs)中所示的。在一些实施方案中，接头是刚性接头。例如，接头是α-螺旋接头。在一些实施方案中，接头是(以单字母氨基酸代码的形式)：eaaak或eaaak接头的多聚体，例如2、3、4或5个4gs接头的重复，如seqidno:629(eaaak)或seqidno:630(3xeaaak)或seqidno:631(5xeaaak)中所示的。在一些实施方案中，接头以一个或多个eaaak单元开始，并且可以通过添加a、aa、aaa、aaaa、eaaaa和eaaak序列来延长。在一些实施方案中，接头可以进一步包括通过克隆和/或从限制位点引入的氨基酸，例如接头可包括通过使用限制位点bamhi引入的氨基酸gs(以单字母氨基酸代码的形式)。在一些实施方案中，接头(以单字母氨基酸代码的形式)是gsggggs(seqidno:635)。在一些实例中，接头是2xggggs，其后是三个丙氨酸(ggggsggggsaaa；seqidno:230)。

在一些实施方案中，变体icosl-fc融合蛋白是由连接至fc结构域的两个变体icoslfc多肽形成的二聚体。在一些具体的实施方案中，将相同或基本相同的种类的icosl-fc变体融合多肽(允许3个或更少的n末端或c末端氨基酸序列差异)二聚化以产生同二聚体。在一些实施方案中，二聚体是其中两个变体icoslfc多肽相同的同二聚体。或者，可以将不同种类的icosl-fc变体融合多肽二聚化以产生异二聚体。因此，在一些实施方案中，二聚体是异二聚体，其中两个变体icoslfc多肽是不同的。

在一些实施方案中，提供了变体icosl-fc融合蛋白，其包含直接或间接地连接至fc区的变体icosl多肽，该变体icosl多肽包含在部分ii中描述的参考icosl中的一个或多个氨基酸修饰。在一些情况下，变体icosl多肽的c末端与fc区的n末端连接。在一些实施方案中，icosl-fc融合体的变体icosl在seqidno:545中所示的参考igv结构域的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸修饰。在特定情况下，此类免疫调节蛋白包含变体icosl多肽，该变体icosl多肽包含igv结构域，诸如seqidno:197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857、906-907、909-910中的任一个所示的igv结构域，或与seqidno:197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857、906-907、909-910中任一个具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％并且含有各自seqidno的一个或多个氨基酸修饰的igv结构域。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有表现出对cd28或icos的结合亲和力增加的igsf结构域(例如，igv结构域)，诸如本文所述的任何氨基酸修饰。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有包含一个或多个氨基酸修饰(例如，参考icosl或特异性结合片段中的取代)的igsf结构域(例如igv结构域)，该氨基酸修饰对应于参考seqidno:32的编号的位置52、57或100。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有一个或多个氨基酸修饰，例如选自n52a、n52c、n52d、n52g、n52h、n52l、n52k、n52m、n52p、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、n57a、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57w、n57y、q100a、q100d、q100e、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100r、q100p、q100s、q100t或q100v的取代。这种变体分子的示例包括本文所述的任何一种变体分子。在一些实施方案中，变体icosl多肽含有氨基酸修饰n52h/n57y/q100r(例如其是或包括seqidno:565中所示的igv结构域)。在一些实施方案中，变体icosl多肽含有氨基酸修饰n52d(例如其是或包括seqidno:548中所示的igv结构域)。在一些实施方案中，变体icosl多肽含有氨基酸修饰n52h/q100r(例如其是或包括seqidno:567中所示的igv结构域)。在一些实施方案中，变体icosl多肽含有氨基酸修饰n52l/n57h/q100r(例如其是或包括seqidno:761中所示的igv结构域)。在一些实施方案中，变体icosl多肽含有氨基酸修饰n52hn57y/q100p(例如其是或包括seqidno:570中所示的igv结构域)。

在此类变体icosl-fc融合蛋白的特定实施方案中，fc多肽是人igg1fc区的变体，其表现出降低的效应子功能，诸如所描述的任何人igg1fc区。在一些实施方案中，fc区是人igg1，其包含氨基酸修饰n297g、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k或l234a/l235e/g237a，其中所述残基是根据kabat的eu索引编号的。在一些实施方案中，变体igg1fc区还包含氨基酸取代c220s，其中残基是根据kabat的eu索引编号的。在一些实施方案中，fc区包含k447del，其中残基是根据kabat的eu索引编号的。在一些方面，fc区包含seqidno:474、476、477、478、633或637中任一个所示的氨基酸序列，或表现出与seqidno:474、476、477、477、478、633或637中任一个85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且包含各自seqidno的氨基酸取代的氨基酸序列。变体icosligsf(例如igv)多肽和fc之间的连接可以经由肽接头，例如所描述的任何接头。在一些实施方案中，接头是ggggs(“4gs”；seqidno:636)、seqidno:229(2xggggs)或seqidno:228(3xggggs)。在特定的实例中，变体icosl多肽的c末端与fc区的n末端连接，使得组分的顺序是变体icosl-接头-fc。

在一些实施方案中，提供了变体的icosl-fc融合蛋白，例如变体icosl-接头-fc，其包含seqidno:565所示的变体icosligv结构域、seqidno:636所示的接头和seqidno:637所示的fc多肽。在一些实施方案中，提供了变体icosl-fc融合蛋白，例如变体icosl-接头-fc，其包含seqidno:565所示的变体icosligv结构域、seqidno:636所示的接头和seqidno:474所示的fc多肽。在一些实施方案中，提供了变体icosl-fc融合蛋白，例如变体icosl-接头-fc，其包含seqidno:565所示的变体icosligv结构域、seqidno:636所示的接头和seqidno:477所示的fc多肽。在一些实施方案中，提供了变体icosl-fc融合蛋白，例如变体icosl-接头-fc，其包含seqidno:565所示的变体变体icosligv结构域、seqidno:636所示的接头和seqidno:633所示的fc多肽。

在一些实施方案中，提供了变体icosl-fc融合蛋白，例如变体icosl-接头-fc，其包含seqidno:565所示的变体icosligv结构域、seqidno:229所示的接头和seqidno:637所示的fc多肽。在一些实施方案中，提供了变体icosl-fc融合蛋白，例如变体icosl-接头-fc，其包含seqidno:565所示的变体icosligv结构域、seqidno:229所示的接头和seqidno:474所示的fc多肽。在一些实施方案中，提供了变体icosl-fc融合蛋白，例如变体icosl-接头-fc，其包含seqidno:565所示的变体icosligv结构域、seqidno:229所示的接头和seqidno:477所示的fc多肽。在一些实施方案中，提供了变体icosl-fc融合蛋白，例如变体icosl-接头-fc，其包含seqidno:565所示的变体icosligv结构域、seqidno:229所示的接头和seqidno:633所示的fc多肽。

在一些实施方案中，提供了变体icosl-fc融合蛋白，例如变体icosl-接头-fc，其包含seqidno:565所示的变体icosligv结构域、seqidno:228所示的接头和seqidno:637所示的fc多肽。在一些实施方案中，提供了变体icosl-fc融合蛋白，例如变体icosl-接头-fc，其包含seqidno:565所示的变体icosligv结构域、seqidno:228所示的接头和seqidno:474所示的fc多肽。在一些实施方案中，提供了变体icosl-fc融合蛋白，例如变体icosl-接头-fc，其包含seqidno:565所示的变体icosligv结构域、seqidno:228所示的接头和seqidno:477所示的fc多肽。在一些实施方案中，提供了变体icosl-fc融合蛋白，例如变体icosl-接头-fc，其包含seqidno:565所示的变体icosligv结构域、seqidno:228所示的接头和seqidno:633所示的fc多肽。

在一些实施方案中，提供了变体icosligsffc融合蛋白，其具有seqidno:928所示的氨基酸序列，或表现出与seqidno:928至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体icosligsffc融合蛋白与cd28和icos结合，例如以与参照(野生型)icosl-fc融合蛋白相比增加的结合亲和力结合。在一些实施方案中，与具有野生型人igg1的fc融合体相比，变体icosligsffc融合体表现出降低的fc效应子功能。

在一些实施方案中，提供了多结构域堆叠免疫调节蛋白，其中两个或更多个igsf结构域连接或附接至fc以形成fc融合体，其在细胞中表达后，在一些方面可产生二聚体多结构域堆叠免疫调节蛋白，所述两个或更多个igsf结构域包括icosl的vigd和来自另一个igsf家族成员的一个或多个另外的igsf结构域(例如，第二变体igsf结构域)。因此，还提供了二聚体多结构域免疫调节蛋白。

在一些实施方案中，变体icosl多肽和一个或多个另外的igsf结构域独立地直接或间接地连接至fc区的n末端或c末端。在一些实施方案中，变体icosl多肽与一个或多个另外的igsf结构域中的至少一个直接或间接连接，并且变体icosl中的一个或和一个或多个另外的igsf结构域中的一个还直接或间接连接到fc区的n末端或c末端。在一些实施方案中，fc区的n末端或c末端连接至变体icosl多肽或一个或多个另外的igsf结构域，并且fc区的n末端或c末端中的另一个连接至icosl变体中的另一个或一个或多个另外的igsf结构域中的另一个。在一些实施方案中，与fc的连接经由肽接头，例如通过如上所述的肽接头。在一些实施方案中，变体icosl和第二igsf结构域之间的连接经由肽接头，例如通过如上所述的肽接头。在一些实施方案中，变体icosl和一个或多个另外的igsf结构域之间的连接经由肽接头，例如如上所述的肽接头。在一些实施方案中，icosl的vigd、一个或多个另外的igsf结构域和fc结构域可以如图16a和16b所示的许多构型中的任何一种连接在一起。在一些实施方案中，icosl-fc变体融合体还可包含信号肽，例如包含在seqidno:59或225中所示的氨基酸序列中的示例性信号肽。示例性构型在实施例中描述。

在一些实施方案中，堆叠免疫调节蛋白是由两个免疫调节fc融合多肽形成的二聚体。还提供了编码任何堆叠免疫调节蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，二聚体多结构域堆叠免疫调节蛋白可通过表达或在某些情况下共表达堆叠免疫调节fc区多肽而在细胞中产生，如下文进一步描述的。

在一些实施方案中，二聚体多结构域堆叠免疫调节蛋白对于每个fc亚基是二价的，对于每个亚基是单价的，或者对于一个亚基是二价的而对于另一个亚基是四价的。

在一些实施方案中，二聚体多结构域堆叠免疫调节蛋白是同二聚体多结构域堆叠fc蛋白。在一些实施方案中，二聚体多结构域堆叠免疫调节蛋白包含第一堆叠免疫调节fc融合多肽和第二堆叠免疫调节fc融合多肽，其中第一多肽和第二多肽相同。在一些实施方案中，多肽的fc部分可以是如上所述的任何fc。

在一些实施方案中，多结构域堆叠分子包含含有变体icosl和第二融合igsf结构域的第一fc融合多肽以及含有变体icosl和第二igsf结构域的第二fc多肽。在一些实施方案中，多结构域堆叠分子包含含有变体icosl和第二igsf结构域和第三igsf结构域的第一fc融合多肽，以及含有变体icosl、第二igsf结构域和第三igsf结构域的第二fc融合多肽。在一些实施方案中，第一和/或第二融合多肽的fc部分可以是如上所述的任何fc。在一些实施方案中，第一和第二融合多肽的fc部分或区域是相同的。

在一些实施方案中，提供了一种免疫调节蛋白，其是icosl-nkp30多结构域堆叠体，该堆叠体包含任何变体icosl多肽和nkp30的一个或多个igf结构域，例如野生型或未修饰的nkp30，诸如seqidno:929所示的igv结构域或seqidno:215中所示的ecd或其结合部分或其结合部分。在一些实施方案中，提供了一种免疫调节蛋白，其包含任何变体icosl多肽和变体nkp30的一个或多个igsf结构域，其在seqidno:215或929所示的野生型或未修饰的序列中包含一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如取代)包括l30v、a60v、s64p、s86g中的一个或多个，例如这样的氨基酸修饰中的1、2、3或4个。在一些方面，多结构域堆叠多肽的变体nkp30是或包括变体igv结构域，例如seqidno:504、930、931、932或933中任一个所示的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％并且包含各自seqidno的一个或多个氨基酸修饰的igv结构域。在一些方面，多结构域堆叠多肽的变体nkp30是或包括变体ecd结构域，诸如seqidno：215、216、217、218或219中任一个所示的变体ecd，或与seqidno:215、216、217、218或219中的任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性并且包含各自seqidno的一个或多个氨基酸修饰的ecd结构域。

在icosl-nkp30多结构域堆叠体的任何此类实施方案中，变体icosl多肽可包括包含变体igsf结构域(例如igv或ecd)的部分ii所述的任何变体icosl多肽，例如其包括表1中所示的任何氨基酸修饰。在一些情况下，这种免疫调节蛋白包含变体icosl多肽，该变体icosl多肽包含ecd结构域，诸如seqidno:109-142,239,280-325,364-381,387-424,427-433,435-470,638-685,905,908中任一个所示的ecd结构域，或与seqidno:109-142、239、280-325、364-381、387-424、427-433、435-470、638-685、905、908中任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性并且包含各自seqidno的一个或多个氨基酸修饰的ecd结构域。在特定情况下，此类免疫调节蛋白包含变体icosl多肽，该变体icosl多肽包含igv结构域，诸如seqidno:197-199,201-208、210、212、240、326-340、382-386、425-426、434、546-599、686-857,906-907、909-910中任一个所示的igv结构域，或者与seqidno:197-199、201-208、210、212、240、326-340、382-386,425-426、434、546-599、686-857、906-907、909-910中任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性并包含各自seqidno的一个或多个氨基酸修饰的igv结构域。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有igsf结构域(例如igv结构域)，其表现出对cd28或icos的增加的结合亲和力，例如本文所述的任何igsf结构域。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有igsf结构域(例如igv结构域)，其包含一个或多个对应于参照seqidno:32的编号的位置52、57或100处的氨基酸修饰，例如在参考icosl或特异性结合片段中的取代。在一些实施方案中，变体icosl多肽具有一个或多个氨基酸修饰，例如，选自以下的取代：n52a、n52c、n52d,n52g、n52h、n52l、n52k、n52m,n52p、n52q,n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、n57a、n57e、n57f、n57h,n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57w、n57y、q100a、q100d、q100e、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100r、q100p、q100s、q100t或q100v。这种变体分子的示例包括本文所述的任一种变体分子。在一些实施方案中，变体icosl多肽包含氨基酸修饰n52d(例如其是或包括在seqidno:548中所示的igv结构域)、n52h/q100r(例如其是或包括在seqidno:567中所示的igv结构域)、n52h/n57y/q100r(例如其是或包括seqidno:565中所示的igv结构域)或n52l/n57h/q100r(例如其是或包括seqidno:761中所示的igv结构域)。

在一些实施方案中，将提供的多结构域堆叠免疫调节蛋白，诸如icosl-nkp30多结构域堆叠免疫调节蛋白，与fc多肽融合。在特定的实施方案中，fc多肽是人igg1fc区的变体，其表现出降低的效应子功能，例如所描述的任何。在一些实施方案中，fc区是人igg1，其包含氨基酸修饰n297g、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k或l234a/l235e/g237a，其中所述残基是根据kabat的eu索引编号的。在一些实施方案中，变体igg1fc区还包含氨基酸取代c220s，其中残基是根据kabat的eu索引编号的。在一些实施方案中，fc区包含k447del，其中残基是根据kabat的eu索引编号的。在一些方面，fc区包含seqidno:474、476、477、478、633或637中任一个所示的氨基酸序列的序列，或表现出与seqidno:474、476、477、478、633或637中任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且包含各自seqidno的氨基酸取代的氨基酸序列。

此类构型的示例在图16a-16b中示出，并且在本文中描述。在一些实施方案中，任何提供的icosl-nkp30多结构域堆叠免疫调节多肽可包含两个拷贝的具有以下结构的多肽：变体icosligsf(例如igv，如seqidno:548、565、567或761所示的)–接头1–变体nkp30igsf(例如igv，如seqidno:504所示)–接头2–fc。在一些实施方案中，任何提供的icosl-nkp30多结构域堆叠免疫调节多肽可包含两个拷贝的具有以下结构的多肽：变体icosligsf(例如igv，如seqidno:548、565、567或761所示的)–接头1–变体nkp30igsf(例如igv，如seqidno:504所示的)–接头1-变体nkp30igsf(例如igv，如seqidno:504所示的)–接头2-fc。在一些实施方案中，接头1和接头2是肽接头，如所描述的任何接头。在一些实施方案中，接头1和接头2是相同的。在一些实施方案中，接头1和接头2是不同的。在一些实施方案中，接头1是3xggggs(seqidno:228)。在一些实施方案中，接头2是gsgggs(seqidno:635)。

示例性icosl-nkp30多结构域堆叠具有seqidno:912、914、916、918、920、922、924或926中任一个所示的氨基酸序列，或表现出与seqidno:912、914、916、918、920、922、924或926中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，任何提供的icosl-nkp30多结构域堆叠免疫调节蛋白结合至icos和/或cd28并结合至b7-h6。在一些实施方案中，提供的icosl-nkp30多结构域堆叠免疫调节蛋白提供了能够使肿瘤定位于表达icos和/或cd28的免疫细胞(例如t细胞)附近的结合分子。在一些实施方案中，此类icosl-nkp30多结构域堆叠免疫调节蛋白可用于通过啮合肿瘤微环境中的t细胞上的icos和/或cd28共刺激受体而增加免疫应答。在一些情况下，此类icosl-nkp30多结构域堆叠免疫调节蛋白或其药物组合物可用于治疗肿瘤或癌症。

在一些实施方案中，多结构域堆叠分子是异二聚体，其包含两个不同的fc融合多肽，例如第一和第二fc多肽，其中至少一个是包含至少一个变体icosl多肽的fc融合多肽和/或至少一个是包含第二igsf结构域(例如第二变体igsf结构域)的fc多肽。在一些实施方案中，第一或第二fc融合多肽还包含第三igsf结构域(例如第三变体igsf结构域)。在一些实施方案中，多结构域堆叠分子包含含有变体icosl的第一fc融合多肽和含有第二igsf结构域的第二fc融合多肽，其中在一些情况下，第一或第二fc融合多肽额外地含有第三igsf域。在一些实施方案中，多结构域堆叠分子包含第一fc融合多肽和第二fc融合多肽，所述第一fc融合多肽包含变体icosl、第二igsf结构域以及在一些情况下还包含第三igsf域，所述第二fc融合多肽不与变体icosl多肽或另外的igsf结构域连接。在一些实施方案中，第一和第二融合多肽的fc部分或区域是相同的。在一些实施方案中，第一和第二融合多肽的fc部分或区域是不同的。在一些实施方案中，多结构域堆叠分子包含第一融合fc多肽，其包含1、2、3、4或更多个变体icosl多肽和/或1、2、3、4或更多个另外的igsf结构域，其中第一堆叠fc融合多肽中的igsf结构域的总数大于2、3、4、5、6或更多个。在这样的实施方案的一个实例中，第二堆叠fc融合多肽包含1、2、3、4或更多个变体icosl多肽和/或1、2、3、4或更多个第二igsf结构域，其中第二堆叠fc融合多肽中的igsf结构域的总数大于2、3、4、5、6或更多个。在这样的实施方案的另一个实例中，第二fc融合多肽不与变体icosl多肽或另外的igsf结构域连接。

在一些实施方案中，异二聚体堆叠分子包含第一堆叠免疫调节fc融合多肽和第二堆叠免疫调节fc融合多肽，其中第一和第二多肽是不同的。在一些实施方案中，异二聚体堆叠分子包含第一fc多肽融合体和第二fc多肽融合体，所述第一fc多肽融合体包含fc区和第一变体icosl多肽和/或第二igsf结构域(例如第二变体igsf结构域)，所述第二fc多肽融合物包含fc区和所述第一变体icosl多肽或所述第二igsf结构域中的另一个。在一些实施方案中，异二聚体堆叠分子包含第一fc多肽融合体和第二fc多肽融合体，所述第一fc融合体包含fc区和第一变体icosl多肽和/或第二igsf结构域(例如第二变体igsf结构域)，所述第二fc多肽融合体包含第一变体icosl多肽和第二igsf结构域(例如第二变体igsf结构域)二者但是以与第一fc区不同的方向或构型。在一些实施方案中，第一和/或第二fc融合多肽还包含第三igsf结构域(例如第三变体igsf结构域)。

在一些实施方案中，第一和第二堆叠免疫调节fc融合多肽中的一个或两个的fc结构域包含修饰(例如取代)，使得fc分子的界面被修饰为帮助和/或促进异二聚化。在一些实施方案中，修饰包括将隆突(隆突)引入第一fc多肽中并将腔(穴)引入第二fc多肽中，使得隆突可定位在腔中以促进第一和第二含fc多肽的复合。靶向用于替代和/或修饰以在多肽中产生隆突或腔的氨基酸通常是与第二多肽的界面中的一个或多个氨基酸相互作用或接触的界面氨基酸。

在一些实施方案中，对于其中fc序列是氨基酸序列的n末端部分的构建体，在fc序列之前添加该氨基酸序列。在一些情况下，对于其中fc序列是氨基酸序列hmssvsaq(seqidno:475)的n末端部分的构建体，在紧接该fc序列之前添加该氨基酸序列hmssvsaq(seqidno:475)。在一些实施方案中，异二聚体堆叠分子包含第一fc多肽融合物和第二fc多肽融合物和紧接在第一和第二fc多肽融合体的两个fc区之前的填充序列hmssvsaq(seqidno:475)，所述第一fc多肽融合物含有fc区(隆突)和第一变体icosl多肽和/或第二igsf结构域(例如第二变体igsf结构域)，所述第二fc多肽融合物含有fc区(穴)。

在一些实施方案中，经修饰以含有隆突(穴)氨基酸的第一多肽包括用具有至少一个侧链的氨基酸替代天然或原始氨基酸，该至少一个侧链从第一多肽的界面突出，因此可位于第二多肽的相邻界面中的补偿腔(穴)中。最常见的是，替代氨基酸是具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积的氨基酸。本领域技术人员了解如何测定和/或评估氨基酸残基的性质以鉴定产生隆突的理想的替代氨基酸。在一些实施方案中，用于形成隆突的替代残基是天然存在的氨基酸残基，并且包括例如精氨酸(r)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)或色氨酸(w)。在一些实例中，经鉴定用于替代的原始残基是具有小侧链的氨基酸残基，例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。

在一些实施方案中，经修饰以含有腔(穴)的第二多肽是包括用具有至少一个侧链的氨基酸替代天然或原始氨基酸的多肽，该至少一个侧链从第二多肽的界面凹进，因此能够从第一多肽的界面容纳相应的隆突。最常见的是，替代氨基酸是具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积的氨基酸。本领域技术人员了解如何测定和/或评估氨基酸残基的性质以鉴定对于形成腔而言理想的替代残基。通常，用于形成腔的替代残基是天然存在的氨基酸，并且包括例如丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)和缬氨酸(v)。在一些例子中，经鉴定用于替代的原始氨基酸是具有大侧链的氨基酸，例如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。

例如，人igg1的ch3界面包括位于四个反平行β链上的每个结构域上的十六个残基，该每个结构域从每个表面掩埋2(参见例如，deisenhofer等人(1981)biochemistry,20:2361-2370；miller等人,(1990)jmol.biol.,216,965-973；ridgway等人,(1996)prot.engin.,9:617-621；美国专利号5,731,168)。例如，用于产生隆突或腔而对ch3结构域的修饰描述于例如美国专利号5,731,168；国际专利申请wo98/50431和wo2005/063816；和ridgway等人,(1996)prot.engin.,9:617-621中。在一些例子中，用于产生隆突或腔而对ch3结构域的修饰通常靶向位于两个中心反平行β链上的残基。目的是最小化以下风险，即产生的隆突可通过突出到周围溶剂中而被容纳而不是由配偶体ch3结构域中的补偿腔容纳。

在一些实施方案中，异二聚体分子含有“隆突链”的ch3结构域中的t366w突变，以及“穴链”的ch3结构域中的t366s、l368a、y407v突变。在一些情况下，例如通过将y349c突变引入“隆突”或“穴”链的ch3结构域中，以及将e356c突变或s354c突变引入另一条链的ch3结构域中，还可以使用ch3结构域之间的另外的链间二硫桥(merchant,a.m.,等人,naturebiotech.16(1998)677-681)。在一些实施方案中，异二聚体分子含有两个ch3结构域之一中的s354c、t366w突变，以及两个ch3结构域中的另一个中的y349c、t366s、l368a、y407v突变。在一些实施方案中，异二聚体分子包含两个ch3结构域之一中的e356c、t366w突变，以及两个ch3结构域中的另一个中的y349c、t366s、l368a、y407v突变。在一些实施方案中，异二聚体分子包含两个ch3结构域之一中的y349c、t366w突变以及两个ch3结构域中的另一个中的e356c、t366s、l368a、y407v突变。在一些实施方案中，异二聚体分子包含两个ch3结构域之一中的y349c、t366w突变，以及两个ch3结构域中的另一个中的s354c、t366s、l368a、y407v突变。其他隆突入穴技术的例子是本领域已知的，例如，如ep1870459a1所述。

在一些实施方案中，异二聚体分子的fc区另外可含有一种或多种其他fc突变，如上文所述的任何fc突变。在一些实施方案中，异二聚体分子含有fc区，其具有降低效应子功能的突变。

在一些实施方案中，含有ch3突起(隆突)或腔(穴)修饰的fc变体可以在任何地方与堆叠免疫调节多肽接合，但通常经由其n-或c-末端与第一和/或第二堆叠免疫调节多肽的n-或c-末端接合，例如以形成融合多肽。连接可以是直接的或间接经由接头。通常，通过含有一个或多个ch3突起修饰的fc变体连接的第一堆叠免疫调节多肽与含有一个或多个ch3腔修饰的fc变体连接的第二堆叠免疫调节多肽的共表达来产生隆突和穴分子。

还提供了编码变体icosl-fc融合蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，为了产生fc融合蛋白，将编码变体icosl-fc融合蛋白的核酸分子插入合适的表达载体中。得到的变体icosl-fc融合蛋白可以在用表达转化的宿主细胞中表达，其中通过fc部分之间形成的链间二硫键发生fc结构域之间的组装，以产生二聚(如二价的)变体icosl-fc融合蛋白。

得到的fc融合蛋白可以通过蛋白质a或蛋白质g柱上的亲和色谱容易地纯化。为了产生异二聚体，可能需要另外的纯化步骤。例如，当编码不同变体icosl多肽的两个核酸转化至细胞中时，必须生物化学地实现异二聚体的形成，因为携带fc结构域的变体icosl分子也将表达为二硫键连接的同二聚体。因此，同二聚体可以在有利于破坏链间二硫键但不影响链内二硫键的条件下还原。在一些情况下，将不同的变体icoslfc单体以等摩尔量混合并氧化以形成同二聚体和异二聚体的混合物。通过色谱技术分离该混合物的组分。或者，这种类型的异二聚体的形成可以使用下述隆突到穴中(knob-into-hole)方法通过遗传工程化和表达含有变体icosl多肽的fc融合分子来产生偏差。

b.变体多肽和免疫调节蛋白的缀合物和融合物

在一些实施方案中，本文提供的变体多肽是包含igsf家族(vigd)的ig结构域的变体的免疫调节蛋白，可以直接或间接与一个部分缀合(例如直接或间接融合)以形成缀合物(“igsf缀合物”)，所述部分诸如效应子部分，诸如另一蛋白质。在一些实施方案中，变体icosl免疫调节蛋白以缀合物的形式提供，在该缀合物中包含直接或间接连接至靶向剂或部分(例如连接至特异性结合配体(例如抗原)的抗体或其它结合分子，例如当施用于受试者时用于将vigd靶向或定位到特定环境或细胞)的icosl的vigd，。在一些实施方案中，靶向剂(例如抗体或其他结合分子)与肿瘤抗原结合，由此将含有vigd的变体icosl定位于肿瘤微环境，例如，以调节对肿瘤微环境具有特异性的肿瘤浸润淋巴细胞(til)的活性。在一些实施方案中，附接可以是共价的或非共价的，例如通过生物素-链霉亲和素的非共价相互作用。在一些实施方案中，缀合物是直接或经由接头与另一蛋白或多肽部分连接的变体icosl多肽的融合蛋白。

在一些实施方案中，融合蛋白是icosl-fc变体融合物，其中任何两个或更多个前述变体多肽可以附接至fc。

在一些实施方案中，igsf缀合物，诸如融合蛋白，包含野生型(全长或截短的)或变体icosl多肽的ecd。在一些实施方案中，igsf缀合物，诸如融合蛋白，包含igv结构域或一个或多个igc(例如，igc2)结构域，或igv结构域的特异性结合片段或一个或多个igc(例如，igc2)的特异性结合片段。在一些实施方案中，igsf缀合物，诸如融合蛋白，包含如seqidno:196或545所示的icosl的igv结构域。

在一些实施方案中，该部分可以是靶向部分、小分子药物(小于500道尔顿摩尔质量的非多肽药物)、毒素、细胞抑制剂、细胞毒剂、免疫抑制剂、适用于诊断目的的放射性试剂、用于治疗目的的放射性金属离子、前药活化酶、增加生物半衰期的试剂、或诊断或可检测的试剂。

在一些实施方案中，效应子部分是治疗剂，如癌症治疗剂，其具有细胞毒性、细胞抑制性或以其他方式提供一些治疗益处。在一些实施方案中，效应子部分是靶向部分或试剂，如靶向细胞表面抗原(例如肿瘤细胞表面上的抗原)的试剂。在一些实施方案中，效应子部分是标记，其可以直接或间接地产生可检测信号。在一些实施方案中，效应子部分是毒素。在一些实施方案中，效应子部分是蛋白质、肽、核酸、小分子或纳米颗粒。

在一些实施方案中，1、2、3、4、5或更多个可以相同或不同的效应子部分与变体多肽或蛋白质缀合、连接或融合以形成igsf缀合物。在一些实施方案中，可以使用本领域已知的和下文描述的各种分子生物学或化学缀合和连接方法将此类效应子部分附接于变体多肽或免疫调节蛋白。在一些实施方案中，接头，如肽接头、可裂解接头、不可裂解接头或有助于缀合反应的接头可用于将效应子部分与变体多肽或免疫调节蛋白连接或缀合。

在一些实施方案中，igsf缀合物包含如下组分：(蛋白质或多肽)、(l)q和(效应子部分)m，其中该蛋白质或多肽是能够结合所述的一种或多种同源反结构配体的变体多肽或免疫调节蛋白中的任何一种；l是用于将蛋白质或多肽与该部分连接的接头；m为至少1；q为0或更大；并且所得的igsf缀合物与一种或多种反结构配体结合。在具体实施方案中，m为1至4且q为0至8。在一些实施方案中，接头是肽。在一些实施方案中，效应子部分是蛋白质或多肽。

在一些实施方案中，提供了igsf缀合物，其包含与靶向剂缀合的本文提供的变体多肽或免疫调节蛋白，该靶向剂与细胞表面分子缀合，例如，以用于将变体多肽或免疫调节蛋白靶向递送至特定细胞。在一些实施方案中，靶向剂是一种或多种分子，其具有定位并结合受试者中正常细胞/组织和/或肿瘤细胞/肿瘤上存在的分子的能力。换言之，包含靶向剂的igsf缀合物可以与存在于细胞(如肿瘤细胞)上的配体(直接或间接地)结合。预期使用的本发明的靶向剂包括可以结合靶细胞或分子的组分的抗体、多肽、肽、适体、其他配体或其任何组合。

在一些实施方案中，靶向剂在给予受试者后结合一个或多个肿瘤细胞或可在肿瘤细胞附近(例如肿瘤血管或肿瘤微环境)结合。靶向剂可以与癌细胞表面上的受体或配体结合。在本发明的另一方面，选择对非癌细胞或组织特异的靶向剂。例如，靶向剂可以对于通常存在于特定细胞或组织上的分子具有特异性。此外，在一些实施方案中，相同的分子可以存在于正常细胞和癌细胞上。各种细胞组分和分子是已知的。例如，如果靶向剂对egfr具有特异性，则所得的igsf缀合物可以靶向表达egfr的癌细胞以及表达egfr的正常皮肤表皮细胞。因此，在一些实施方案中，本发明的igsf缀合物可通过两种不同的机制(靶向癌细胞和非癌细胞)起作用。

在本文公开的本发明的各个方面，本发明的igsf缀合物包含靶向剂，其可以结合/靶向细胞组分，如肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原、支原体抗原、真菌抗原、朊病毒抗原、来自寄生虫的抗原。在一些方面，细胞组分、抗原或分子可各自用于表示靶向剂的所需靶标。例如，在各种实施方案中，靶向剂对组分具有特异性或与组分结合，该组分包括但不限于表皮生长因子受体(egfr、erbb-1、her1)、erbb-2(her2/neu)、erbb-3/her3、erbb-4/her4、egfr配体家族；胰岛素样生长因子受体(igfr)家族、igf结合蛋白(igfbp)、igfr配体家族；血小板衍生生长因子受体(pdgfr)家族、pdgfr配体家族；成纤维细胞生长因子受体(fgfr)家族、fgfr配体家族、血管内皮生长因子受体(vegfr)家族、vegf家族；hgf受体家族；trk受体家族；ephrin(eph)受体家族；axl受体家族；白细胞酪氨酸激酶(ltk)受体家族；tie受体家族、血管生成素1,2；受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ror)受体家族，例如ror1；cd171(l1cam)；b7-h6(ncr3lg1)；pd-l1、肿瘤糖基化抗原，例如stn或tn(如muc1的stnag)；lhr(lhcgr)；磷脂酰丝氨酸、盘状结构域受体(ddr)家族；ret受体家族；klg受体家族；ryk受体家族；musk受体家族；转化生长因子-α(tgf-α)受体、tgf-β；细胞因子受体、i类(血细胞生成素家族)和ii类(干扰素/il-10家族)受体、肿瘤坏死因子(tnf)受体超家族(tnfrsf)、死亡受体家族；癌-睾丸(ct)抗原、谱系特异性抗原、分化抗原、α-辅肌动蛋白-4、artcl、断点簇区域-abelson(bcr-abl)融合产物、b-raf、半胱天冬酶-5(casp-5)、半胱天冬酶-8(casp-8)、β-连环蛋白(ctnnb1)、细胞分裂周期27(cdc27)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(cdk4)、cdkn2a、coa-i、dek-can融合蛋白、eftud-2、延伸因子2(elf2)、ets变异基因6/急性髓细胞白血病1基因ets(etc6-aml1)融合蛋白、纤连蛋白(fn)(例如纤连蛋白的额外结构域a(eda))、gpnmb、低密度脂质受体/gdp-l岩藻糖：β-d-半乳糖2-α-l-岩藻糖基转移酶(ldlr/fut)融合蛋白、hla-a2、在hla-a2基因(hla-a*201-r170i)中α2-结构域的α-螺旋的残基170处精氨酸与异亮氨酸交换、hla-a1、热休克蛋白70-2突变(hsp70-2m)、k1aa0205，mart2、黑色素瘤普遍突变1,2,3(mum-1,2,3)、前列腺酸性磷酸酶(pap)、新-pap、肌球蛋白i类、nfyc、ogt、os-9、pml-rarα融合蛋白、prdx5、ptprk、k-ras(kras2)、n-ras(nras)、hras、rbaf600、sirt2、snrpd1、syt-ssx1或-ssx2融合蛋白、磷酸丙糖异构酶、bage、bagk-1、bage-2,3,4,5、gage-1,2,3,4,5,6,7,8、gnt-v(异常n-乙酰葡糖胺基转移酶v、mgat5)、herv-k-mel、kk-lc、km-hn-i、lage、lage-i、ctl识别的黑色素瘤抗原(camel)、mage-a1(mage-i)、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a5、mage-a6、mage-a8、mage-a9、mage-alo、mage-ail、mage-a12、mage-3、mage-bl、mage-b2、mage-b5、mage-b6、mage-cl、mage-c2、粘蛋白1(muc1)、mart-1/melan-a(mlana)、gp100、gp100/pmell7(silv)、酪氨酸酶(tyr)、trp-i、hage、na-88、ny-eso-i、ny-eso-l/lage-2、sage、spl7、ssx-1,2,3,4、trp2-int2、癌胚抗原(cea)、激肽释放酶4、乳房珠蛋白-a、oal、前列腺特异性抗原(psa)、trp-1/gp75、trp-2、脂肪分化相关蛋白(adipophilin)、黑色素瘤2(aim-2)中不存在的诱导蛋白、bing-4、cpsf、细胞周期蛋白d1、上皮细胞粘附分子(ep-cam)、epha3、成纤维细胞生长因子-5(fgf-5)、糖蛋白250(gp250)、egfr(erbb1)、her-2/neu(erbb2)、白细胞介素13受体α2链(il13rα2)、il-6受体、肠道羧基酯酶(ice)、甲胎蛋白(afp)、m-csf、mdm-2、muc1、p53(tp53)、pbf、prame、psma、rage-i、rnf43、ru2as、soxlo、steap1、存活蛋白(birc5)、人端粒酶逆转录酶(htert)、端粒酶、wilms肿瘤基因(wt1)、sycpl、brdt、spanx、xage、adam2、page-5、lipl、ctage-i、csage、mmal、cage、boris、hom-tes-85、af15ql4、hca661、ldhc、morc、sgy-i、spol1、tpxl、ny-sar-35、fthl17、nxf2、tdrdl、tex15、fate、tpte、免疫球蛋白独特型、bence-jones蛋白、雌激素受体(er)、雄激素受体(ar)、cd40，cd30、cd20、cd19、cd33、癌抗原72-4(ca72-4)、癌抗原15-3(ca15-3)、癌抗原27-29(ca27-29)、癌抗原125(ca125)、癌抗原19-9(ca19-9)、β-人绒毛膜促性腺激素、β-2微球蛋白、鳞状细胞癌抗原、神经元特异性烯醇化酶、热休克蛋白gp96、gm2、沙格司亭、ctla-4、707丙氨酸脯氨酸(707-ap)、t细胞识别的腺癌抗原4(art-4)、致癌胚抗原肽-1(cap-i)、钙激活氯通道-2(clca2)、亲环蛋白b(cyp-b)、人印戒肿瘤-2(hst-2)、人乳头瘤病毒(hpv)蛋白(hpv-e6、hpv-e7、主要或次要衣壳抗原及其他)、epstein-barr病毒(ebv)蛋白(ebv潜伏膜蛋白质-lmp1、lmp2；其他)、乙型肝炎或丙型肝炎病毒蛋白以及hiv蛋白。

在一些实施方案中，靶向剂对组分是特异性的或与组分结合，所述组分包括但不限于her1/egfr、her2/erbb2、cd20、cd25(il-2rα受体)、cd33、cd52、cd133、cd206、cea、ceacam1、ceacam3、ceacam5、ceacam6、癌抗原125(ca125)、甲胎蛋白(afp)、lewisy、tag72、癸酸甘油酯-1、间皮素、pdgf受体(pdgfr；诸如pdgf-rα)、pd-1、pd-l1、ctla-4、il-2受体、血管内皮生长因子(vegf)、cd30、epcam、epha2、磷脂酰肌醇聚糖-3、gpa33、黏蛋白类、caix、psma、叶酸结合蛋白、神经节甘脂类(诸如gd2、gd3、gm1和gm2)、vegf受体(vegfr)、vegfr2、vegf-a、整合素αvβ3、整合素α5β1、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap、腱生蛋白、afp、bcr复合物、cd3、cd18、cd44、ctla-4、gp72、hla-dr10β、hla-dr抗原、ige、muc-1、nuc242、pem抗原、金属蛋白酶类、肝配蛋白受体、肝配蛋白配体、hgf受体、cxcr4、cxcr4、铃蟾肽受体、sk-1抗原、bcr-abl、ret、met、trkb、tie2、alk、ros、eml4-alk、ros1、brafv600e、src、c-kit、mtor、tsc1、tsc2、btk、kit、brca、cdk4/6、jak1、jak2、braf、flt-3、mek1、mek2、smo或b7-h6(ncr3lg1)。

在一些实施方案中，igsf缀合物通过其靶向剂将结合肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤微环境的细胞组分，从而经由调节免疫应答(例如，通过激活共刺激分子或抑制免疫细胞激活的负调节分子)、抑制存活信号(例如，生长因子或细胞因子或激素受体拮抗剂)、激活死亡信号和/或免疫介导的细胞毒性(如通过抗体依赖性细胞毒性)促进靶细胞的杀伤。此类igsf缀合物可通过几种机制起作用以预防、减少或消除肿瘤细胞，如促进缀合的效应子部分向肿瘤靶标的递送，如通过受体介导的igsf缀合物的内吞作用进行递送；或这种缀合物可以募集、结合和/或激活免疫细胞(例如nk细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、t细胞、b细胞)。此外，在一些情况下，一种或多种前述途径可以在给予一种或多种本发明的igsf缀合物时起作用。

在一些实施方案中，igsf缀合物通过其靶向剂将定位于(如结合)肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤微环境的细胞组分，从而调节肿瘤附近的免疫应答的细胞。在一些实施方案中，靶向剂促进缀合的igsf(例如vigd)递送至肿瘤靶标，如以与其同源结合配偶体相互作用以改变携带同源结合配偶体的免疫细胞(例如nk细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、t细胞、b细胞)的信号传导。在一些实施方案中，局部递送激动或刺激共刺激受体。

在一些实施方案中，靶向剂是免疫球蛋白。如本文所用，术语“免疫球蛋白”包括天然或人工单价或多价抗体，其包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、fab片段、f(ab')片段，由fab表达文库产生的片段、单链fv(scfv)、抗独特型(抗id)抗体(包括针对例如本发明抗体的抗id抗体)以及任何上述的表位结合片段。如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以具有任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或免疫球蛋白分子的子类。

在一些实施方案中，igsf缀合物通过其抗体靶向部分将结合肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤微环境的细胞组分，从而经由调节免疫应答(例如，通过激活共刺激分子或抑制免疫细胞激活的负调节分子)、抑制存活信号(例如，生长因子或细胞因子或激素受体拮抗剂)、激活死亡信号和/或免疫介导的细胞毒性(如通过抗体依赖性细胞毒性)促进靶细胞的凋亡。此类igsf缀合物可通过几种机制起作用以预防、减少或消除肿瘤细胞，如促进缀合的效应子部分向肿瘤靶标的递送，如通过受体介导的igsf缀合物的内吞作用进行递送；或这种缀合物可以募集、结合和/或激活免疫细胞(例如nk细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、t细胞、b细胞)。

在一些实施方案中，igsf缀合物通过其抗体靶向部分将结合肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤微环境的细胞组分，从而调节免疫应答(例如，通过激活共刺激分子或抑制免疫细胞激活的负调节)。在一些实施方案中，此类缀合物可识别、结合和/或调节(例如抑制或激活)免疫细胞(例如nk细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、t细胞、b细胞)。

本发明的抗体靶向部分包括抗体片段，其包括但不限于fab、fab’和f(ab')2、fd、单链fv(scfv)、单链抗体、二硫键连接的fv(sdfv)和包含vl或vh结构域的片段。结合抗原的抗体片段(包括单链抗体)可以单独包含一个或多个可变区或者一个或多个可变区与以下的全部或部分的组合：铰链区、ch1、ch2和ch3结构域。本发明还包括抗原结合片段，该抗原结合片段还包含一个或多个可变区与铰链区、ch1、ch2和ch3结构域的任何组合。本发明还包括fc片段、抗原-fc融合蛋白和fc靶向部分缀合物或融合产物(fc-肽、fc-适体)。本发明的抗体靶向部分可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。在一个方面，抗体靶向部分是人、鼠(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。此外，此类抗体可以是动物抗体的人源化形式。本发明的抗体靶向部分可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或具有更高的多特异性。

在各种实施方案中，抗体/靶向部分经由fc(抗体中)与fc受体(免疫细胞上)之间的相互作用以及经由本文提供的缀合的变体多肽或免疫调节蛋白来募集、结合和/或激活免疫细胞(例如nk细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞)。在一些实施方案中，抗体/靶向部分识别或结合肿瘤剂，并经由本文提供的缀合变体多肽或免疫调节蛋白定位于肿瘤细胞，以促进肿瘤附近免疫细胞的调节。

可以掺入igsf缀合物中的抗体的例子包括但不限于以下抗体，如西妥昔单抗(imc-c225；)、曲妥珠单抗利妥昔单抗(rituxanb；)、贝伐单抗阿伦单抗帕妥珠单抗帕尼单抗(abx-egf；)、兰尼单抗替伊莫单抗、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)托西莫单抗、碘i131托西莫单抗卡妥索单抗dinutuximab(unituxin^tm)、吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星阿巴西普(ctla4-ig；)、贝拉西普(l104ea29yig；lea29y；lea)、伊匹单抗(mdx-010；mdx-101)、曲美目单抗(替西木单抗；cp-675,206)、prs-010、prs-050、阿柏西普(vegftrap、ave005)、伏洛昔单抗(m200)、f200、morab-009、ss1p(cat-5001)、西妥木单抗(imc-a12)、马妥珠单抗(emd72000)、尼妥珠单抗(h-r3)、扎鲁木单抗(humax-egfr)、耐昔妥珠单抗imc-11f8、mab806/ch806、sym004、mab-425、panorex@(17-1a)(鼠单克隆抗体)；panorex@(17-1a)(嵌合鼠单克隆抗体)；idec-y2b8(鼠，抗cd20mab)；bec2(抗独特型mab，模拟gd表位)(具有bcg)；奥拉雷他单抗(lartruvo^tm)；oncolym(lym-1单克隆抗体)；smartmi95ab、人源化13'ilym-i(oncolym)、ovarex(b43.13、抗独特型小鼠mab)；雷莫芦单抗mdx-210(人源化抗her-2双特异性抗体)；与腺癌上的egp40(17-1a)泛癌抗原结合的3622w94mab；抗vegf、赛尼哌(zenapax)(smart抗tac(il-2受体)；smartmi95ab、人源化ab，人源化)；mdx-210(人源化抗her-2双特异性抗体)；mdx-447(人源化抗egf受体双特异性抗体)；novomab-g2(泛癌特异性ab)；tnt(嵌合mab至组蛋白抗原)；tnt(嵌合mab至组蛋白抗原)；gliomab-h(monoclons-人源化ab)；gni-250mab；emd-72000(嵌合-egf拮抗剂)；lymphocide(人源化ll2抗体)；以及mdx-260双特异性靶标gd-2、anaab、smartid10ab、smartabl364ab或immurait-cea。如前述列表所示，通常制备针对特定靶表位的抗体。

在一些实施方案中，所提供的缀合物(包括融合分子)的抗体或抗原结合片段是西妥昔单抗、帕尼单抗、扎鲁木单抗、尼妥珠单抗、曲妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗emtansine、托西莫单抗利妥昔单抗(rituxan、mabthera)、替伊莫单抗(zevalin)、达利珠单抗(zenapax)、吉妥珠单抗(mylotarg)、阿仑单抗、cea-scanfab片段、oc125单克隆抗体、ab75705、b72.3、贝伐单抗阿法替尼、阿昔替尼、博舒替尼、卡波替尼、西立替尼、克唑替尼、达拉非尼、达沙替尼、dinutuximab(unituxin^tm)、厄洛替尼、依维莫司、依鲁替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、尼洛替尼、奥拉帕尼、奥拉雷他单抗(lartruvo^tm)、帕博西尼帕唑帕尼、帕妥珠单抗雷莫芦单抗、瑞戈非尼、鲁索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、替西罗莫司、曲美替尼、凡德他尼、维莫非尼、vismodegib、巴利昔单抗、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、mpdl3280a、pidilizumab(ct-011)、amp-224、msb001078c或medi4736、bms-935559、ly3300054、阿特珠单抗、avelumab或度伐单抗，或者其抗原结合片段。。

在一些实施方案中，可以将pd-l1抗体或其抗原结合片段并入igsf缀合物中。可并入igsf缀合物中的pd-l1抗体的实例包括但不限于抗体，诸如bms-936559、12a4、ly3300054、阿特珠单抗avelumab度伐单抗参见例如wo2007/005874、wo2017/034916,wo2010/077634、wo2013/079174、wo2011/066389，这些参考文献通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，vigd直接或间接连接至抗pd-l1抗体的轻链和/或重链的n末端或c末端。在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是bms-936559、ly3300054、阿特珠单抗、avelumab或度伐单抗。抗pd-l1抗体阿特珠单抗的示例性轻链和重链分别在seqidno:866和867中示出。包括抗pd-l1抗体阿特珠单抗的示例性igsf缀合物在seqidno:868-895中示出。

在一些实施方案中，抗体靶向部分是全长抗体或其含有fc结构域的抗原结合片段。在一些实施方案中，变体多肽或免疫调节蛋白与抗体靶向部分的fc部分缀合，如通过与抗体的fc部分的n-末端缀合。

在一些实施方案中，vigd直接或间接地与抗体的轻链和/或重链的n-或c-末端连接。在一些实施方案中，连接可以经由肽接头，如以上描述的任何一种肽接头。在一些实施方案中，接头可以进一步包括通过克隆和/或从限制位点引入的氨基酸。在一些实施方案中，接头可在任一末端包含通过限制性位点引入的另外的氨基酸。例如，接头可包括通过使用限制性位点afei引入的另外的氨基酸，诸如sa(以单个字母氨基酸代码的形式)。可以构建各种构型。图10a至图10c描绘了示例性构型。在一些实施方案中，可以通过在细胞中共表达抗体的重链和轻链来产生抗体缀合物。

在本发明的一个方面，靶向剂是适体分子。例如，在一些实施方案中，适体由充当靶向剂的核酸组成。在各种实施方案中，本发明的igsf缀合物包含对肿瘤细胞、肿瘤血管和/或肿瘤微环境上的分子具有特异性的适体。在一些实施方案中，适体本身可以包含生物活性序列以及靶向模块(序列)，其中该生物活性序列可以诱导针对靶细胞的免疫应答。换言之，这种适体分子是两用试剂。在一些实施方案中，本发明的igsf缀合物包括适体与抗体的缀合，其中该适体和该抗体特异性结合肿瘤细胞、肿瘤血管、肿瘤微环境和/或免疫细胞上的单独分子。

术语“适体”包括基于对特定分子的特异性结合特性选择的dna、rna或肽。例如，可以选择一种或多种适体用于结合如本文所公开的肿瘤细胞、肿瘤血管、肿瘤微环境和/或免疫细胞中的特定基因或基因产物，其中通过本领域已知且本领域技术人员熟悉的方法进行选择。

在本发明的一些方面，靶向剂是肽。例如，本文提供的变体多肽或免疫调节蛋白可以与可与癌症或肿瘤细胞的组分结合的肽缀合。因此，本发明的这种igsf缀合物包含肽靶向剂，其与肿瘤细胞的细胞组分、肿瘤血管和/或肿瘤微环境的组分结合。在一些实施方案中，靶向剂肽可以是整合素的拮抗剂或激动剂。包含α和β亚基的整合素包括本领域技术人员公知的许多类型。

在一个实施方案中，靶向剂是vvβ3。整合素vvβ3在多种细胞上表达，并且已显示介导几种生物相关过程，包括破骨细胞粘附于骨基质、血管平滑肌细胞的迁移和血管生成。用于整合素的合适靶向分子包括rgd肽或肽模拟物以及用于其他整合素如v4.βi(vla-4)、v4-p7(参见例如美国专利号6,365,619；chang等人,bioorganic&medicinalchemlett,12:159-163(2002)；lin等人,bioorganic&medicinalchemlett,12:133-136(2002))等的非rgd肽或肽模拟物(参见例如美国专利号5,767,071和5,780,426)。

在一些实施方案中，提供了igsf缀合物，其包含与治疗剂缀合的本文提供的变体多肽或免疫调节蛋白。在一些实施方案中，治疗剂包括例如道诺霉素、多柔比星、甲氨蝶呤和长春地辛(rowland等人,cancerimmunol.immunother.21:183-187,1986)。在一些实施方案中，治疗剂具有细胞内活性。在一些实施方案中，igsf缀合物被内化，并且治疗剂是阻断细胞的蛋白质合成从而导致细胞死亡的细胞毒素。在一些实施方案中，治疗剂是包含具有核糖体失活活性的多肽的细胞毒素，包括例如白树毒素、bouganin、皂草素、蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白a链、异株泻根毒蛋白、白喉毒素、局限曲菌素、假单胞菌外毒素a及其变体。在一些实施方案中，当治疗剂是包含具有核糖体失活活性的多肽的细胞毒素时，igsf缀合物必须在与靶细胞结合后内化，以使蛋白质对细胞具有细胞毒性。

在一些实施方案中，提供了igsf缀合物，其包含与毒素缀合的本文提供的变体多肽或免疫调节蛋白。在一些实施方案中，毒素包括，例如，细菌毒素(如白喉毒素)、植物毒素(如蓖麻毒素)、小分子毒素(如格尔德霉素(mandler等人,j.nat.cancerinst.92(19):1573-1581(2000)；mandler等人,bioorganic&med.chem.letters10:1025-1028(2000)；mandler等人,bioconjugatechem.13:786-791(2002))、美登木素生物碱(ep1391213；liu等人,proc.natl.acad.sci.usa93:8618-8623(1996))和卡里奇霉素(lode等人,cancerres.58:2928(1998)；hinman等人,cancerres.53:3336-3342(1993))。毒素可通过包括微管蛋白结合、dna结合或拓扑异构酶抑制的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制作用。

在一些实施方案中，提供了igsf缀合物，其包含与标记缀合的本文提供的变体多肽或免疫调节蛋白，该标记可间接或直接地产生可检测信号。这些igsf缀合物可用于研究或诊断应用，如用于体内癌症检测。标记优选能够直接或间接地产生可检测信号。例如，标记可以是不透射线的或放射性同位素，如3h、14c、32p、35s、123i、125i、131i；荧光(荧光团)或化学发光(发色团)化合物如异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素；酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；成像剂；或金属离子。在一些实施方案中，标记是用于闪烁照相研究的放射性原子(例如99tc或123i)或用于核磁共振(nmr)成像的自旋标记(也称为磁共振成像，mri)，如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。锆-89可以与各种金属螯合剂复合并与抗体缀合，例如用于pet成像(wo2011/056983)。在一些实施方案中，igsf缀合物可间接地检测。例如，对igsf缀合物具有特异性并含有可检测标记的二级抗体可用于检测igsf缀合物。

可以使用本领域已知的任何方法制备igsf缀合物。参见例如wo2009/067800、wo2011/133886和美国专利申请公开号2014322129，其通过引用其全文并入本文。

igsf缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白可以通过任何方法“附接于”效应子部分，变体多肽或免疫调节蛋白可以通过该任何方法与效应子部分缀合或连接。例如，igsf缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白可以通过化学或重组方法附接于效应子部分。用于制备融合物或缀合物的化学方法是本领域已知的，并且可用于制备igsf缀合物。用于缀合变体多肽或免疫调节蛋白和效应子部分的方法必须能够使变体多肽或免疫调节蛋白与效应子部分连接，而不会干扰变体多肽或免疫调节蛋白与其一个或多个反结构配体结合的能力。

igsf缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白可以间接地与效应子部分连接。例如，igsf缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白可以直接地与含有几种类型之一的效应子部分的脂质体连接。一个或多个效应子部分和/或变体多肽或免疫调节蛋白也可以结合至固体表面。

在一些实施方案中，igsf缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白以及效应子部分均为蛋白质并且可以使用本领域公知的技术缀合。几百种可以缀合两种蛋白质的交联剂是可用的。(参见例如“chemistryofproteinconjugationandcrosslinking,”1991,shanswong,crcpress,annarbor)。通常基于可用的或在变体多肽或免疫调节蛋白和/或效应子部分插入的反应性官能团来选择交联剂。另外，如果没有反应性基团，可以使用可光活化的交联剂。在某些情况下，可能需要在变体多肽或免疫调节蛋白与效应子部分之间包括间隔区。本领域已知的交联剂包括同双功能试剂：戊二醛、二甲基己二亚酰胺化物(dimethyladipimidate)和双(重氮基联苯胺)以及异双功能试剂：m马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺和磺基-m马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺。

在一些实施方案中，igsf缀合物的变体多肽或免疫调节蛋白可以用特定残基工程化，以用于效应子部分的化学附接。用于本领域已知的分子的化学附接的特定残基包括赖氨酸和半胱氨酸。基于在变体多肽或免疫调节蛋白和/或效应子部分插入的反应性官能团来选择交联剂，并且该交联剂可用于效应子部分。

还可以使用重组dna技术制备igsf缀合物。在这种情况下，编码变体多肽或免疫调节蛋白的dna序列与编码效应子部分的dna序列融合，从而产生嵌合dna分子。将嵌合dna序列转染至表达融合蛋白的宿主细胞中。可以从细胞培养物中回收融合蛋白，并使用本领域已知的技术纯化。

将作为标记的效应子部分附接至变体多肽或免疫调节蛋白的例子包括以下文献中所述的方法：hunter,等人,nature144:945(1962)；david,等人,biochemistry13:1014(1974)；pain,等人,j.immunol.meth.40:219(1981)；nygren,j.histochem.和cytochem.30:407(1982)；wensel和meares,radioimmunoimagingandradioimmunotherapy,elsevier,n.y.(1983)；以及colcher等人,“useofmonoclonalantibodiesasradiopharmaceuticalsforthelocalizationofhumancarcinomaxenograftsinathymicmice”,meth.enzymol.,121:802-16(1986)。

放射性标记或其他标记可以以已知方式掺入缀合物中。例如，肽可以是生物合成的，或者可以通过化学氨基酸合成使用合适的氨基酸前体合成，该氨基酸前体包含例如替代氢的氟-19。标记如99tc或123i、186re、188re和111in可以经由肽中的半胱氨酸残基附接。钇-90可以经由赖氨酸残基附接。可使用iodogen方法(fraker等人,biochem.biophys.res.commun.80:49-57(1978))掺入碘-123。“monoclonalantibodiesinimmunoscintigraphy”(chatal,crcpress1989)详细描述了其他方法。

可以使用多种双功能蛋白偶联剂如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(spdp)、琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸盐(smcc)、亚氨基硫杂环戊烷(it)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二甲基二亚胺代己二酸酯hci)、活性酯(如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(如双-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制备变体多肽或免疫调节蛋白和细胞毒性剂的缀合物。例如，可以如vitetta等人,science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-p-异硫氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见例如wo94/11026。接头可以是“可裂解接头”，其促进细胞中细胞毒性药物的释放。例如，可以使用酸不稳定的接头、肽酶敏感接头、光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(chari等人,cancerresearch52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。

本发明的igsf缀合物明确地考虑但不限于用如下交联试剂制备的药物缀合物：bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、磺基-emcs、磺基-gmbs、磺基-kmus、磺基-mbs、磺基-siab、磺基-smcc和磺基-smpb以及svsb(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)，它们可商购获得(例如，来自piercebiotechnology公司，罗克福德，伊利诺伊州，美国)。参见2003-2004应用手册和目录第467-498页。

c.跨膜和可分泌性免疫调节蛋白和工程化细胞

本文提供了表达免疫调节变体icosl多肽的工程化细胞(或者，“工程化细胞”)。在一些实施方案中，变体icosl多肽以膜结合形式在细胞诸如免疫细胞(例如t细胞或抗原呈递细胞)上表达，从而提供跨膜免疫调节蛋白(以下也称为“tip”)。在一些方面，变体icosl多肽以可分泌形式在细胞诸如免疫细胞(例如t细胞或抗原呈递细胞)中表达，由此产生变体icosl多肽的分泌或可溶形式(以下也称为“sip”)，诸如将细胞施用于受试者时。在一些方面，sip可以拮抗其分泌于其中的环境(例如肿瘤微环境)中的同源结合配偶体。

1.跨膜免疫调节蛋白

在一些实施方案中，包含变体icosl的免疫调节多肽可以是膜结合蛋白。如下文更详细描述的，免疫调节多肽可以是包含变体icosl的跨膜免疫调节多肽，在该变体icosl中包含：含有至少一个亲和力修饰的igsf结构域(igv或igc)的胞外域、跨膜结构域和任选细胞质结构域。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白可以在免疫细胞(如哺乳动物细胞)的表面上表达，包括在淋巴细胞(例如t细胞或nk细胞)或抗原呈递细胞的表面上表达。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白在哺乳动物t细胞的表面上表达，包括如下t细胞：t辅助细胞、细胞毒性t细胞(或者，细胞毒性t淋巴细胞或ctl)、自然杀伤t细胞、调节性t细胞、记忆t细胞或γδt细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是抗原呈递细胞(apc)。通常但非唯一地，胞外域(或者，“细胞外结构域”)包含本发明的变体icosl的一个或多个氨基酸变异(例如氨基酸取代)。因此，例如，在一些实施方案中，跨膜蛋白将包含胞外域，该胞外域包含本发明的变体icosl的一个或多个氨基酸取代。

在一些实施方案中，工程化细胞表达作为跨膜免疫调节多肽(tip)的变体icosl多肽，该跨膜免疫调节多肽可以是膜蛋白，如跨膜蛋白。在典型的实施方案中，膜蛋白的胞外域包含本文提供的变体icosl的细胞外结构域或其igsf结构域，其中在该至少一个igsf结构域中含有一个或多个氨基酸取代。本文提供的跨膜免疫调节蛋白还含有与胞外域连接的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域产生用于在细胞上进行细胞表面表达的编码蛋白质。在一些实施方案中，跨膜结构域直接与胞外域连接。在一些实施方案中，跨膜结构域经由一个或多个接头或间隔区间接地与胞外域连接。在一些实施方案中，跨膜结构域主要含有疏水性氨基酸残基，如亮氨酸和缬氨酸。

在一些实施方案中，全长跨膜锚定结构域可用于确保tip将在工程化细胞(如工程化t细胞)的表面上表达。方便地，这可以来自亲和力修饰的特定天然蛋白质(例如icosl或其他天然igsf蛋白质)，并且以与天然igsf蛋白质(例如icosl)类似的方式与第一膜近端结构域的序列简单融合。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白包含相应的参考(例如未修饰的)或野生型igsf成员的跨膜结构域，如包含在seqidno:5所示的氨基酸序列中的跨膜结构域(表2)。在一些实施方案中，膜结合形式包含相应的参考(例如未修饰的)或野生型多肽的跨膜结构域，如对应于seqidno:5的残基257-277。

在一些实施方案中，跨膜结构域是非天然跨膜结构域，该非天然跨膜结构域不是天然icosl的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域来源于来自另一种非icosl家族成员多肽的跨膜结构域，该跨膜结构域是膜结合的或是跨膜蛋白。在一些实施方案中，可以使用来自t细胞上的另一种蛋白质的跨膜锚定结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域来源于cd8。在一些实施方案中，跨膜结构域可还含有cd8的细胞外部分，其用作间隔结构域。示例性cd8衍生的跨膜结构域为seqidno:246或483所示或其含有cd8跨膜结构域的部分。在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的跨膜结构域。

在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白还含有与跨膜结构域连接的胞内域，如细胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞质信号传导结构域诱导细胞信号传导。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白的胞内域包含相应的参考(例如未修饰的)或野生型多肽的细胞质结构域，如seqidno:5所示的氨基酸序列中包含的细胞质结构域(参见表2)。

在一些实施方案中，提供的跨膜免疫调节蛋白(其是变体icosl或包含变体icosl)包含显示出与seqidno:257至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且包含含有至少一个如上所述的亲和力修饰的icosligsf结构域的胞外域和跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白在igsf结构域(例如igv结构域)(包括表1所示的任何一个igsf结构域)中含有任何一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白可还包含所述的细胞质结构域。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白可还含有信号肽。在一些实施方案中，信号肽是野生型igsf成员的天然信号肽，如包含在seqidno:5所示的氨基酸序列中的野生型igsf成员(参见例如表2)。

在一些实施方案中，提供了跨膜免疫调节蛋白，其包含氨基酸取代e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r、n52h/n57y/q100r或n52h/n57y/q100p。在一些实施方案中，所提供的跨膜免疫调节蛋白是如下变体icosl或包含如下变体icosl，该变体icosl包含seqidno:257所示的氨基酸序列，但其中在seqidno:257中的相应位置含有氨基酸取代e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r、n52h/n57y/q100r或n52h/n57y/q100p，或显示出与seqidno:257至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性且含有氨基酸取代e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r、n52h/n57y/q100r或n52h/n57y/q100p的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供了跨膜免疫调节蛋白，其包含seqidno:496或497(各自含有氨基酸取代n52d)、seqidno:498或499(各自含有氨基酸取代n52h/n57y/q100p)、seqidno:500或501(各自含有氨基酸取代e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r)或seqidno:502或503(各自含有氨基酸取代n52h/n57y/q100r)所示的氨基酸序列，或与seqidno:495-503中任一个具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性且含有所示氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，当在工程化细胞中表达时，这种跨膜免疫调节蛋白在细胞表面上表达。

还提供了编码这种跨膜免疫调节蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，编码跨膜免疫调节蛋白的核酸分子包含核苷酸序列，其编码如下氨基酸序列，该氨基酸序列显示出与seqidno:257至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且包含含有至少一个所述的亲和力修饰的igsf结构域的胞外域、跨膜结构域和任选细胞质结构域。在一些实施方案中，核酸分子可还包含编码信号肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，信号肽是相应的野生型igsf成员(参见例如表2)的天然信号肽。

跨膜免疫调节蛋白的示例是icosltip，其包含i)seqidno:383所示的氨基酸序列或ii)如下氨基酸序列，其显示出与seqidno:243至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且包含seqidno:243中所含有的亲和力修饰的结构域或其中的氨基酸取代。还提供了i)seqidno:244所示的核苷酸序列，ii)如下序列，其显示出与seqidno:244至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且编码包含seqidno:243的亲和力修饰的结构域的tip，或iii)具有简并密码子的i)或ii)的序列。

在一些实施方案中，提供了car相关的跨膜免疫调节蛋白，其中跨膜免疫调节蛋白的胞内域包含细胞质信号传导结构域，该细胞质信号传导结构域包含至少一个含itam(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)的信号传导结构域。itam是在许多参与免疫细胞信号转导的蛋白质信号传导结构域中发现的保守基序，包括在参与t细胞受体信号转导的cd3-ζ链(“cd3-z”)中发现的保守基序。在一些实施方案中，胞内域包含cd3-ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，cd3-ζ信号传导结构域包含seqidno:243所示的氨基酸序列或显示出与seqidno:247至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％并且保留t细胞信号传导活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，car相关的跨膜免疫调节蛋白的胞内域可还包含共刺激信号传导结构域，以进一步调节t细胞的免疫调节应答。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域是cd28、icos、41bb或ox40。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域来源于cd28或4-1bb，并且包含seqidno:484-487中任一个所示的氨基酸序列或显示出与seqidno:484-487至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％并且保留t细胞共刺激信号传导活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所提供的car相关的跨膜免疫调节蛋白具有car的特征，以在亲和力修饰的igsf结构域与同源结合配偶体或反结构结合后刺激t细胞信号传导。在一些实施方案中，通过亲和力修饰的igsf结构域与其反结构的特异性结合可以导致如细胞毒性、增殖或细胞因子产生的变化所反映的t细胞活性的免疫活性的变化。

在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白不含能够介导细胞质信号传导的胞内域。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白缺乏野生型或未修饰多肽的信号转导机制，因此本身不诱导细胞信号传导。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白缺乏相应的参考(例如未修饰的)或野生型多肽的细胞内(细胞质)结构域或细胞内结构域的一部分，如seqidno:5所示的氨基酸序列中包含的细胞质信号传导结构域(参见表2)。在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白不含有itim(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)，如在某些抑制性受体(包括igsf家族的抑制性受体(例如pd-1或tigit))中包含的itim。因此，在一些实施方案中，跨膜免疫调节蛋白仅含有胞外域和跨膜结构域，如所述的任何结构域。

2.分泌的免疫调节蛋白和工程化细胞

在一些实施方案中，含有如本文所述的任何一种或多种氨基酸突变的icosl变体免疫调节多肽是可分泌的，如当由细胞表达时。这种变体icosl免疫调节蛋白不包含跨膜结构域。在一些实施方案中，变体icosl免疫调节蛋白不与半衰期延长部分(如fc结构域或多聚化结构域)缀合。在一些实施方案中，变体icosl免疫调节蛋白包含信号肽，例如抗体信号肽或其他有效的信号序列，以获得细胞外的结构域。当免疫调节蛋白包含信号肽并由工程化细胞表达时，信号肽导致工程化细胞分泌免疫调节蛋白。通常，信号肽或信号肽的一部分在分泌时由免疫调节蛋白裂解而来。免疫调节蛋白可以由核酸(其可以是表达载体的一部分)编码。在一些实施方案中，免疫调节蛋白由细胞(如免疫细胞，例如原代免疫细胞)表达和分泌。

因此，在一些实施方案中，提供了还包含信号肽的变体icosl免疫调节蛋白。在一些实施方案中，本文提供了编码变体icosl免疫调节蛋白的核酸分子，该核酸分子可操作地连接至编码信号肽的分泌序列。

信号肽是免疫调节蛋白n-末端的序列，该序列发出由细胞分泌免疫调节蛋白的信号。在一些实施方案中，信号肽的长度为约5至约40个氨基酸(如约5至约7、约7至约10、约10至约15、约15至约20、约20至约25或约25至约30、约30至约35或约35至约40个氨基酸)。

在一些实施方案中，信号肽是来自相应野生型icosl的天然信号肽(参见表6)。在一些实施方案中，信号肽是非天然信号肽。例如，在一些实施方案中，非天然信号肽是来自相应野生型icosl的突变天然信号肽，并且可包括一个或多个(如2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)取代、插入或缺失。在一些实施方案中，非天然信号肽是来自与野生型igsf家族成员相同的igsf家族的家族成员的信号肽或其突变体。在一些实施方案中，非天然信号肽是来自与野生型igsf家族成员不同的igsf家族的igsf家族成员的信号肽或其突变体。在一些实施方案中，信号肽是来自非igsf蛋白家族的信号肽或其突变体，如来自免疫球蛋白的信号肽(如igg重链或igg-κ轻链)、细胞因子(如白细胞介素-2(il-2)或cd33)、血清白蛋白蛋白质(例如hsa或白蛋白)、人天青杀素前蛋白(humanazurocidinpreprotein)信号序列、荧光素酶、胰蛋白酶原(例如胰凝乳蛋白酶原或胰蛋白酶原)或能够使细胞有效分泌蛋白质的其他信号肽。示例性信号肽包括表6中描述的任何信号肽。

在可分泌性变体icosl免疫调节蛋白的一些实施方案中，免疫调节蛋白在表达时包含信号肽，并且信号肽(或其部分)在分泌时由免疫调节蛋白裂解而来。

在一些实施方案中，工程化细胞表达由细胞分泌的变体icosl多肽。在一些实施方案中，这种变体icosl多肽由编码免疫调节蛋白的核酸分子在信号序列对于分泌的可操作控制下编码。在一些实施方案中，编码的免疫调节蛋白在由细胞表达时分泌。在一些实施方案中，由核酸分子编码的免疫调节蛋白不包含跨膜结构域。在一些实施方案中，由核酸分子编码的免疫调节蛋白不包含半衰期延长部分(如fc结构域或多聚化结构域)。在一些实施方案中，由核酸分子编码的免疫调节蛋白包含信号肽。在一些实施方案中，本发明的核酸还包含编码与编码免疫调节蛋白的核酸可操作地连接的分泌或信号肽的核苷酸序列，从而允许免疫调节蛋白的分泌。

3.细胞和工程化细胞

本文提供了表达任何所提供的免疫调节多肽的工程化细胞。在一些实施方案中，工程化细胞在其表面上表达任何所提供的跨膜免疫调节多肽。在一些实施方案中，工程化细胞在适合于分泌蛋白质的条件下表达免疫调节蛋白并且可以或能够由该细胞分泌免疫调节蛋白。在一些实施方案中，免疫调节蛋白在淋巴细胞上或中表达，所述淋巴细胞例如肿瘤浸润淋巴细胞(til)、t细胞或nk细胞或在骨髓细胞上表达。在一些实施方案中，工程化细胞是抗原呈递细胞(apc)。在一些实施方案中，工程化细胞是工程化哺乳动物t细胞或工程化哺乳动物抗原呈递细胞(apc)。在一些实施方案中，工程化t细胞或apc是人或鼠细胞。

在一些实施方案中，工程化t细胞包括但不限于t辅助细胞、细胞毒性t细胞(或者，细胞毒性t淋巴细胞或ctl)、天然杀伤t细胞、调节性t细胞、记忆t细胞或γδt细胞。在一些实施方案中，工程化t细胞是cd4+或cd8+。除了mhc的信号之外，工程化t细胞还需要共刺激信号，其在一些实施方案中由如前所述以膜结合形式表达的变体icosl跨膜免疫调节多肽提供。

在一些实施方案中，工程化apc包括，例如，表达mhcii的apc，如巨噬细胞、b细胞和树突细胞以及包括细胞和非细胞(例如可生物降解的聚合物微粒)aapc的人工apc(aapc)。人工apc(aapc)是apc的合成形式，其可以与apc类似的方式起作用，因为它们将抗原呈递给t细胞并激活它们。抗原呈递由mhc(i类或ii类)进行。在一些实施方案中，在工程化apc如aapc中，加载至mhc上的抗原在一些实施方案中是肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。加载至mhc上的抗原被t细胞的t细胞受体(tcr)识别，在某些情况下，t细胞可以表达icos、cd28或由本文提供的变体icosl多肽识别的其他分子。可用于工程化aapc的材料包括：聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)、氧化铁、脂质体、脂质双层、琼脂糖和聚苯乙烯。

在一些实施方案中，可以将细胞aapc工程化为包含用于过继细胞疗法的tip和tcr激动剂。在一些实施方案中，可以将细胞aapc工程化为含有tip和tcr激动剂，其用于人t细胞的离体扩增，例如在施用之前，例如用于再引入患者中。在一些方面，所述aapc可包括至少一个抗cd3抗体克隆的表达，例如okt3和/或ucht1。在一些方面，可以使aapc失活(例如辐射)。在一些实施方案中，tip可以包括对t细胞上的同源结合配偶体表现出结合亲和力的任何变体igsf结构域。

在一些实施方案中，本文提供的免疫调节蛋白，如跨膜免疫调节蛋白或可分泌性免疫调节蛋白，在表达抗原结合受体的细胞中共表达或工程化至该细胞中，该抗原结合受体例如重组受体，如嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)。在一些实施方案中，工程化细胞如工程化t细胞识别与癌症、炎症和自身免疫病症或病毒感染相关的所需抗原。在具体的实施方案中，抗原结合受体含有特异性结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的抗原结合部分。在一些实施方案中，工程化t细胞是car(嵌合抗原受体)t细胞，其含有特异性地结合至抗原(如肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原)的抗原结合结构域(例如scfv)。在一些实施方案中，抗原结合结构域(例如scfv)对特定抗原例如cd19具有特异性。car的示例是抗cd19car，如含有seqidno:482或seqidno:245所示的抗cd19scfv的car。在一些实施方案中，tip蛋白在工程化t细胞受体细胞或工程化嵌合抗原受体细胞中表达。在此类实施方案中，工程化细胞共表达tip和car或tcr。在一些实施方案中，sip蛋白在工程化t细胞受体细胞或工程化嵌合抗原受体细胞中表达。在此类实施方案中，工程化细胞共表达sip和car或tcr。

嵌合抗原受体(car)是重组受体，其包括抗原结合结构域(胞外域)、跨膜结构域和细胞内信号传导区(胞内域)，该细胞内信号传导区能够在抗原被结合后诱导或介导激活信号至t细胞。在一些实例中，表达car的细胞被工程化以表达细胞外单链可变片段(scfv)，该片段具有对特定肿瘤抗原的特异性，所述特定肿瘤抗原与包含激活结构域以及在某些情况下的共刺激结构域的细胞内信号传导部分连接。共刺激结构域可以源自例如cd28、ox-40、4-1bb/cd137或诱导型t细胞共刺激物(icos)。活化结构域可以衍生自例如cd3(诸如cd3ζ、ε、δ、γ等)。在某些实施方案中，car被设计为具有两个、三个、四个或更多个共刺激结构域。可以将carscfv设计为靶向在与疾病或病状相关的细胞上表达的抗原，例如肿瘤抗原，例如cd19，其是由b细胞系中的细胞表达的跨膜蛋白，b细胞系包括所有正常b细胞和b细胞恶性肿瘤，包括但不限于nhl、cll和非t细胞all。实例car+t细胞疗法和构建体在美国专利公开号2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309和2014/0050708中进行了描述，这些参考文献通过引用以其整体并入本文。

在一些方面，抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段，诸如单链片段(scfv)。在一些实施方案中，抗原在肿瘤或癌细胞上表达。抗原的示例是cd19。car的示例是抗cd19car，诸如包含seqidno:245中所示的抗cd19scfv的car。在一些实施方案中，car还包含间隔区、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域或包含itam信号传导结构域(诸如cd3ζ信号传导结构域)的区域。在一些实施例中，car进一步包括共刺激信号传导结构域。

在一些实施方案中，car还包含间隔区或铰链、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(胞内域)，该细胞内信号传导结构域包含itam信号传导结构域，如cd3ζ信号传导结构域。在一些实施例中，car进一步包括共刺激信号传导结构域。共刺激结构域可以源自例如cd28、ox-40、4-1bb/cd137或诱导型t细胞共刺激物(icos)。在某些实施例中，car被设计为具有两个、三个、四个或更多个共刺激结构域。可以将carscfv设计为靶向在与疾病或病状相关的细胞上表达的抗原，例如肿瘤抗原，例如cd19，其是由b细胞系中的细胞表达的跨膜蛋白，b细胞系包括所有正常b细胞和b细胞恶性肿瘤，包括但不限于nhl、cll和非t细胞all。实例car+t细胞疗法和构建体在美国专利公开号2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309和2014/0050708中进行了描述，这些参考文献通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，间隔区或铰链存在于抗原结合结构域与跨膜结构域之间，如当在细胞上表达时存在于抗原结合结构域与质膜之间。在一些实施方案中，间隔区或铰链来源于igg子类，如igg1和igg4、igd或cd8(参见例如qin等人(2017)j.hematol.oncol.,10:68)。在一些实施方案中，间隔区或铰链来源于igg1。

在一些实施方案中，间隔区和跨膜结构域是来源于cd8的铰链和跨膜结构域，例如具有seqidno:246、483或897所示的示例性序列或显示出与seqidno:246、483或897至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，胞内域包含cd3-ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，cd3-ζ信号传导结构域包含seqidno:243所示的氨基酸序列或显示出与seqidno:247至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性并且保留t细胞信号传导活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，car的胞内域可还包含共刺激信号传导结构域或进一步调节t细胞的免疫调节应答的区域。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域是或包含cd28、icos、41bb或ox40的共刺激区，或衍生自cd28、icos、41bb或ox40的共刺激区。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域来源于cd28或4-1bb，并且包含seqidno:484-487中任一个所示的氨基酸序列或显示出与seqidno:484-487至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性并且保留t细胞共刺激信号传导活性的氨基酸序列。

本文提供了编码icosl多肽和编码一种或多种蛋白质(诸如重组抗原受体(例如，嵌合抗原受体(car)或工程化t细胞受体(tcr))、标志物和一种或多种自切割肽)的多核苷酸、。在一些实施方案中，编码car的构建体还编码通过自切割肽序列与car分离的第二蛋白，诸如标志物，例如可检测的蛋白质。在一些实例中，将编码变体icosl多肽的核酸与一个或多个编码蛋白质的核酸的序列分离，其中所述蛋白质编码重组抗原受体(例如，car或tcr)、标志物、细胞因子或趋化因子。任何核苷酸序列可以在载体诸如病毒载体中。在一些实例中，病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。

在一些实施方案中，自切割肽序列是f2a、t2a、e2a或p2a自切割肽。t2a自切割肽的示例性序列如以下所示：seqidno:250、488、860-862或显示出与seqidno:250、488、860-862中的任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列一致性的氨基酸序列中的任一个。在一些实施方案中，t2a由seqidno:249所示的核苷酸序列或表现出与seqidno:249中的任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的序列编码。p2a自切割肽的示例性序列如以下所示：seqidno:no：863或表现出与seqidno:863至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，编码一种以上p2a自切割肽(诸如p2a1和p2a2)的核酸构建体，其中核苷酸序列p2a1和p2a2各自编码seqidno:863中所示的p2a，核苷酸序列可以不同，以避免序列之间的重组。

在一些实施方案中，标志物是可检测的蛋白质，诸如荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(gfp)或蓝色荧光蛋白(bfp)。荧光蛋白标志物的示例性序列在seqidno:489、858、859、903或显示出与seqidno:489、858、859、903至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列中示出。

在一些实施方案中，car是抗cd19car，其具有seqidno:479、490、491、492、898、899、901或902中任一个所示的氨基酸序列或表现出与seqidno:479、490、491、492、898、899、901或902中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，car由seqidno:248或900示出的核苷酸序列或表现出与seqidno:248或900至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列一致性的核苷酸序列编码。

在另一个实施方案中，工程化t细胞具有tcr，包括重组或工程化tcr。在一些实施方案中，tcr可以是天然tcr。本领域技术人员将认识到，通常天然哺乳动物t细胞受体包含参与抗原特异性识别和结合的α链和β链(或γ链和δ链)。在一些实施方案中，tcr是经修饰的工程化tcr。在一些实施方案中，工程化t细胞的tcr特异性地结合至由apc呈递的肿瘤相关或肿瘤特异性抗原。

在一些实施方案中，免疫调节多肽，如跨膜免疫调节多肽或可分泌性免疫调节多肽，可通过多种策略(如用于重组宿主细胞的那些策略)掺入工程化细胞中，如工程化t细胞或工程化apc。将dna构建体引入原代t细胞中的多种方法是本领域已知的。在一些实施方案中，使用病毒转导或质粒电穿孔。在典型的实施方案中，编码免疫调节蛋白或表达载体的核酸分子包含信号肽，该信号肽将表达的跨膜免疫调节蛋白定位于细胞膜或用于分泌。在一些实施方案中，将编码本发明的跨膜免疫调节蛋白的核酸亚克隆至允许在宿主哺乳动物细胞中表达的病毒载体中，如逆转录病毒载体。可以将表达载体引入哺乳动物宿主细胞中，并且在宿主细胞培养条件下，免疫调节蛋白在表面上表达或分泌。

在一个示例性例子中，可以离体纯化原代t细胞(cd4细胞或cd8细胞或两者)，并用由各种tcr/cd28激动剂组成的激活方案(如抗cd3/抗cd28包被的珠粒)刺激原代t细胞。在激活过程后2或3天，可以通过本领域标准慢病毒或逆转录病毒转导方案或质粒电穿孔策略将含有免疫调节多肽的重组表达载体稳定地引入原代t细胞中。可以通过例如流式细胞术使用与天然亲本分子交叉反应的抗表位标签或抗体以及含有变体icosl的多肽监测细胞的免疫调节多肽表达。表达免疫调节多肽的t细胞可以通过用抗表位标签抗体分选来富集，或者根据应用针对高表达或低表达来富集。

在免疫调节多肽表达后，可以通过多种方法测定工程化t细胞的适当功能。可以验证工程化car或tcr共表达以表明该部分工程化t细胞不受免疫调节蛋白表达的显著影响。一旦验证，标准的体外细胞毒性、增殖或细胞因子测定(例如，ifn-γ表达)可用于评估工程化t细胞的功能。示例性标准终点是培养上清液中肿瘤细胞系的裂解、工程化t细胞的增殖或ifn-γ蛋白表达的百分比。可以选择导致与对照构建体相比统计学上显著增加的肿瘤细胞系裂解、增加的工程化t细胞增殖或增加的ifn-γ表达的工程化构建体。此外，非工程化t细胞，如天然的原代或内源性t细胞也可以掺入相同的体外测定中，以测量在工程化细胞(如工程化t细胞)上表达的免疫调节多肽构建体调节活性的能力，在一些情况下，包括在旁观者天然t-细胞中激活和产生效应子功能的能力。可以监测在内源性t细胞上的激活标志物如cd69、cd44或cd62l的增加的表达，并且增加的增殖和/或细胞因子产生可以表明在工程化t细胞上表达的免疫调节蛋白的所需活性。

在一些实施方案中，类似的测定可用于比较仅含有car或tcr的工程化t细胞与含有car或tcr和tip构建体的t细胞的功能。通常，这些体外测定通过将各种比例的工程化t细胞和含有同源car或tcr抗原的“肿瘤”细胞系共同接种在培养物中来进行。标准终点是培养上清液中肿瘤细胞系的裂解、工程化t细胞的增殖或ifn-γ产生的百分比。可以选择导致与单独的相同tcr或car构建体相比统计学上显著增加的肿瘤细胞系裂解、增加的工程化t细胞增殖或增加的ifn-γ产生的工程化免疫调节蛋白。可以在免疫功能不全的小鼠(如缺乏小鼠t、nk和b细胞的nsg品种)中分析工程化人t细胞。工程化人t细胞(其中car或tcr结合异种移植物上的靶反结构并与tip亲和力修饰的igsf结构域共表达)可以以与异种移植物不同的细胞数量和比例过继转移至体内。例如，可以通过生物发光或通过流式细胞术离体监测含有荧光素酶/gfp载体的cd19+白血病肿瘤细胞系的移植。在一个常见的实施方案中，将异种移植物引入鼠模型中，然后在几天后将工程化t细胞引入。可以测定含有免疫调节蛋白的工程化t细胞相对于仅含有car或tcr的工程化t细胞增加的存活率、肿瘤清除或扩增的工程化t细胞数目。如在体外测定中，内源性、天然(即，非工程化)人t细胞可以共同过继转移以寻求在该群体中成功的表位扩散，从而导致更好的存活率或肿瘤清除。

d.表达变体多肽和免疫调节蛋白的感染原

还提供了含有编码任何变体多肽(如icoslvigd多肽，包括本文所述的可分泌性或跨膜免疫调节蛋白)的核酸的感染原。在一些实施方案中，此类感染原可将编码本文所述的变体免疫调节多肽的核酸(如icoslvigd多肽)递送至受试者的靶细胞，如受试者中的免疫细胞和/或抗原呈递细胞(apc)或肿瘤细胞。还提供了包含在这些感染原中的核酸，和/或用于产生或修饰这些感染原的核酸(如载体和/或质粒)以及含有这种感染原的组合物。在一些实施方案中，变体icosl多肽在感染原(例如病毒或细菌原)中表达，所述感染源在施用至受试者后能够在体内感染细胞，诸如免疫细胞(例如t细胞或抗原呈递细胞)或肿瘤，用于在细胞中传递或表达变体多肽作为tip或sip。

在一些实施方案中，感染原是微生物(microorganism或microbe)。在一些实施方案中，感染原是病毒或细菌。在一些实施方案中，感染原是病毒。在一些实施方案中，感染原是细菌。在一些实施方案中，这种感染原可递送编码任何变体多肽(如icoslvigd多肽，包括本文所述的可分泌性或跨膜免疫调节蛋白)的核酸序列。因此，在一些实施方案中，受试者中被感染原感染或接触的细胞可以在细胞表面上表达或分泌变体免疫调节多肽。在一些实施方案中，感染原还可以将一种或多种其他治疗剂或编码其他治疗剂的核酸递送至细胞和/或受试者体内的环境。在一些实施方案中，可以通过感染原递送的其他治疗剂包括细胞因子或其他免疫调节分子。

在一些实施方案中，感染原例如病毒或细菌含有编码任何变体多肽(如icoslvigd多肽，包括本文所述的可分泌性或跨膜免疫调节蛋白)的核酸序列，并且通过接触和/或感染受试者中的细胞，该细胞表达由感染原中包含的核酸序列编码的变体多肽(如icoslvigd多肽，包括可分泌性或跨膜免疫调节蛋白)。在一些实施方案中，可以将感染原给予受试者。在一些实施方案中，可以将感染原离体引入受试者的细胞。

在一些实施方案中，由感染原感染的细胞表达的变体多肽(如icoslvigd多肽，包括跨膜免疫调节蛋白)是跨膜蛋白并且是表面表达的。在一些实施方案中，由感染原感染的细胞表达的变体多肽(如icoslvigd多肽，包括可分泌性免疫调节蛋白)由细胞表达并分泌。跨膜免疫调节蛋白或分泌的免疫调节蛋白可以是本文所述的任何蛋白质。

在一些实施方案中，受试者中被感染原靶向的细胞包括肿瘤细胞、免疫细胞和/或抗原呈递细胞(apc)。在一些实施方案中，感染原靶向肿瘤微环境(tme)中的细胞。在一些实施方案中，感染原将编码变体多肽的核酸(如icoslvigd多肽，包括可分泌性或跨膜免疫调节蛋白)递送至合适的细胞(例如，apc，如在其细胞表面展示肽/mhc复合物的细胞，如树突细胞)或组织(例如，淋巴组织)，所述合适的细胞或组织调解免疫应答和/或特定细胞介导的免疫应答，例如cd4和/或cd8t细胞应答，该cd8t细胞应答可包括细胞毒性t细胞(ctl)应答。在一些实施方案中，感染原靶向apc，如树突细胞(dc)。在一些实施方案中，通过本文所述的感染原递送的核酸分子包括在特定靶细胞中对于编码变体免疫调节多肽的可操作连接的编码序列的表达而言所必需的适当核酸序列，例如调节元件如启动子。

在一些实施方案中，含有编码免疫调节多肽的核酸序列的感染原也可含有编码一种或多种另外的基因产物(例如细胞因子、前药转化酶、细胞毒素和/或可检测的基因产物)的核酸序列。例如，在一些实施方案中，感染原是溶瘤病毒，并且该病毒可以包括编码另外的治疗性基因产物的核酸序列(参见例如kirn等人,(2009)natrevcancer9:64-71；garcia-aragoncillo等人,(2010)curropinmolther12:403-411；参见美国专利号7,588,767、7,588,771、7,662,398和7,754,221，以及美国专利公开号2007/0202572、2007/0212727、2010/0062016、2009/0098529、2009/0053244、2009/0155287、2009/0117034、2010/0233078、2009/0162288、2010/0196325、2009/0136917和2011/0064650)。在一些实施方案中，另外的基因产物可以是可导致靶细胞(例如，肿瘤细胞)死亡的治疗性基因产物，或是可增强或加强或调节免疫应答的基因产物(例如，细胞因子)。示例性基因产物还包括抗癌剂、抗转移剂、抗血管生成剂、免疫调节分子、免疫检查点抑制剂、抗体、细胞因子、生长因子、抗原、细胞毒性基因产物、促凋亡基因产物、抗凋亡基因产物、细胞基质降解基因、用于组织再生和将人类体细胞重编程为多能性的基因、以及本文描述的或本领域技术人员已知的其他基因。在一些实施方案中，另外的基因产物是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。

1.病毒

在一些实施方案中，感染原是病毒。在一些实施方案中，感染原是溶瘤病毒，或靶向特定细胞例如免疫细胞的病毒。在一些实施方案中，感染原靶向受试者中的肿瘤细胞和/或癌细胞。在一些实施方案中，感染原靶向免疫细胞或抗原呈递细胞(apc)。

在一些实施方案中，感染原是溶瘤病毒。溶瘤病毒是在肿瘤细胞中积累并在肿瘤细胞中复制的病毒。通过在肿瘤细胞中复制，以及任选递送编码本文所述的变体icosl多肽或免疫调节多肽的核酸，肿瘤细胞被溶解，肿瘤收缩并且可以被消除。溶瘤病毒还可具有广泛的宿主和细胞类型范围。例如，溶瘤病毒可以在免疫特权细胞或免疫特权组织(包括肿瘤和/或转移，并且还包括受伤组织和细胞)中积累，从而允许在广泛的细胞类型范围内递送和表达编码本文所述变体免疫调节多肽的核酸。溶瘤病毒也可以以肿瘤细胞特异性方式复制，导致肿瘤细胞溶解和有效的肿瘤消退。

示例性溶瘤病毒包括腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、细小病毒、麻疹病毒、水疱性口炎病毒(vsv)、柯萨奇病毒和牛痘病毒。在一些实施方案中，溶瘤病毒可以特异性定殖于实体瘤，而不感染其他器官，并且可以用作感染原以将编码本文所述变体免疫调节多肽的核酸递送至此类实体瘤。

用于递送编码本文所述的变体icosl多肽或免疫调节多肽的核酸的溶瘤病毒可以是本领域技术人员已知的任何一种溶瘤病毒，并且包括例如水疱性口炎病毒，参见例如美国专利号7,731,974、7,153,510、6,653,103，美国专利公开号2010/0178684、2010/0172877、2010/0113567、2007/0098743、20050260601、20050220818以及欧洲专利号1385466、1606411和1520175；单纯疱疹病毒，参见例如，美国专利号7,897,146、7,731,952、7,550,296、7,537,924、6,723,316、6,428,968，美国专利公开号2014/0154216、2011/0177032、2011/0158948、2010/0092515、2009/0274728、2009/0285860、2009/0215147、2009/0010889、2007/0110720、2006/0039894、2004/0009604、2004/0063094，以及国际专利公开号wo2007/052029、wo1999/038955；逆转录病毒，参见例如美国专利公开号6,689,871、6,635,472、5,851,529、5,716,826、5,716,613和美国专利公开号20110212530；牛痘病毒，参见例如2016/0339066，以及腺相关病毒，参见例如美国专利号8,007,780、7,968,340、7,943,374、7,906,111、7,927,585、7,811,814、7,662,627、7,241,447、7,238,526、7,172,893、7,033,826、7,001,765、6,897,045和6,632,670。

溶瘤病毒还包括经遗传改变以减弱其毒性、改善其安全性、增强其肿瘤特异性的病毒，并且它们还配备有另外的基因，例如细胞毒素、细胞因子、前药转化酶以改善病毒的整体功效(参见例如kirn等人,(2009)natrevcancer9:64-71；garcia-aragoncillo等人,(2010)curropinmolther12:403-411；参见美国专利号7,588,767、7,588,771、7,662,398和7,754,221，以及美国专利公开号2007/0202572、2007/0212727、2010/0062016、2009/0098529、2009/0053244、2009/0155287、2009/0117034、2010/0233078、2009/0162288、2010/0196325、2009/0136917和2011/0064650)。在一些实施方案中，溶瘤病毒可以是已经被修饰以使得它们在癌细胞中选择性地复制的那些溶瘤病毒，因此它们是溶瘤的。例如，溶瘤病毒是腺病毒，其被工程化为具有针对肿瘤治疗的改变的趋性并且也作为基因治疗载体。这样的示例是onyx-015、h101和ad5δcr(hallden和portella(2012)expertopinthertargets,16:945-58)和tnferade(mcloughlin等人(2005)ann.surg.oncol.,12:825-30)，或条件复制型腺病毒

在一些实施方案中，感染原是经修饰的单纯疱疹病毒。在一些实施方案中，感染原是talimogenelaherparepvec(也称为t-vec、imlygic或oncovexgm-csf)的修饰形式，其被修饰为含有编码任何本文所述的变体icosl多肽或免疫调节多肽的核酸。在一些实施方案中，感染原是描述在例如wo2007/052029、wo1999/038955、us2004/0063094、us2014/0154216中的经修饰的单纯疱疹病毒，或其变体。

在一些实施方案中，感染原是靶向被给予病毒的受试者中的特定细胞类型的病毒，例如靶向免疫细胞或抗原呈递细胞(apc)的病毒。树突细胞(dc)是用于启动和控制免疫应答的必需apc。dc可以捕获和加工抗原，从外周迁移到淋巴器官，并以主要组织相容性复合物(mhc)限制的方式将抗原呈递给静息t细胞。在一些实施方案中，感染原是可特异性地靶向dc以递送编码变体icosl多肽或免疫调节多肽的核酸以在dc中表达的病毒。在一些实施方案中，该病毒是慢病毒或其变体或衍生物，如整合缺陷型慢病毒载体。在一些实施方案中，该病毒是慢病毒，其被假型化以有效结合并有效地感染能表达细胞表面标志物树突细胞特异性细胞间粘附分子-3-捕获非整合素(dc-sign)的细胞，如dc。在一些实施方案中，该病毒是用辛德比斯病毒e2糖蛋白假型化的慢病毒或其修饰形式，如wo2013/149167中描述的那些慢病毒。在一些实施方案中，病毒允许将感兴趣的序列(例如，编码任何本文所述的变体icosl多肽或免疫调节多肽的核酸)递送至dc并表达该感兴趣的序列。在一些实施方案中，该病毒包括wo2008/011636、us2011/0064763、tareen等人(2014)mol.ther.,22:575-587中描述的那些病毒或其变体。噬树突细胞载体平台的示例是zvex^tm。

2.细菌

在一些实施方案中，感染原是细菌。例如，在一些实施方案中，细菌可以将编码任何本文所述的变体免疫调节多肽(例如变体icosl多肽或免疫调节多肽)的核酸递送至受试者中的靶细胞，如肿瘤细胞、免疫细胞、抗原呈递细胞和/或吞噬细胞。在一些实施方案中，细菌可以优先靶向受试者体内的特定环境，如肿瘤微环境(tme)，以用于表达和/或分泌变体免疫调节多肽，和/或靶向环境中的靶特异性细胞以用于表达变体免疫调节多肽。

在一些实施方案中，经由细菌介导的质粒dna转移至哺乳动物细胞将核酸递送至细胞(也称为“细胞转染”)。例如，在一些实施方案中，通过整个细菌进入靶细胞来实现遗传物质的递送。在一些实施方案中，自发或诱导的细菌溶解可导致质粒的释放，以用于随后的真核细胞表达。在一些实施方案中，细菌可以将核酸递送至非吞噬哺乳动物细胞(例如，肿瘤细胞)和/或递送至吞噬细胞，例如某些免疫细胞和/或apc。在一些实施方案中，通过细菌递送的核酸可以转移至受试者中的细胞的细胞核中以用于表达。在一些实施方案中，核酸还包括在特定宿主细胞中表达编码变体免疫调节多肽的可操作连接的序列所必需的合适的核酸序列，例如调节元件如启动子或增强子。在一些实施方案中，感染原(其为细菌)可以以rna的形式递送编码免疫调节蛋白的核酸，如预先制备的能翻译的rna，其递送至靶细胞的细胞质以供靶细胞机制进行翻译。

在一些实施方案中，细菌可以复制并溶解靶细胞，例如，肿瘤细胞。在一些实施方案中，细菌可以在靶细胞的细胞质中含有和/或释放核酸序列和/或基因产物，从而杀死靶细胞，例如肿瘤细胞。在一些实施方案中，感染原是可以在受试者的特定环境(例如肿瘤微环境(tme))中特异性复制的细菌。例如，在一些实施方案中，细菌可以在厌氧或缺氧微环境中特异性地复制。在一些实施方案中，存在于特定环境中的条件或因子，例如在tme中由细胞产生的天冬氨酸、丝氨酸、柠檬酸、核糖或半乳糖，可充当化学引诱物以将细菌吸引到环境中。在一些实施方案中，细菌可以在环境中表达和/或分泌本文所述的免疫调节蛋白，例如tme。

在一些实施方案中，感染原是细菌，其为利斯特氏菌属物种、双歧杆菌属物种、埃希氏菌属物种、梭菌属物种、沙门氏菌属物种、志贺氏菌属物种、弧菌属物种或耶尔森氏菌属物种。在一些实施方案中，细菌选自单核细胞增生利斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、产气荚膜梭菌、丁酸梭菌、诺氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌和青春双歧杆菌中的一种或多种。在一些实施方案中，细菌是工程化细菌。在一些实施方案中，细菌是工程化细菌，如以下文献中描述的那些细菌，例如seow和wood(2009)moleculartherapy17(5):767–777；baban等人(2010)bioengineeredbugs1:6,385-394；patyar等人(2010)jbiomedsci17:21；tangney等人(2010)bioengineeredbugs1:4,284-287；vanpijkeren等人(2010)humgenether.21(4):405-416；wo2012/149364；wo2014/198002；us9103831；us9453227；us2014/0186401；us2004/0146488；us2011/0293705；us2015/0359909和ep3020816。可以修饰细菌以递送编码任何本文提供的变体免疫调节多肽、缀合物和/或融合物的核酸序列，和/或以在受试者中表达此类变体免疫调节多肽。

iv.用于产生多肽或细胞的核酸、载体和方法

本文提供了分离的或重组的核酸(统称为“核酸”)，其编码本文提供的变体icosl多肽或免疫调节多肽的各种提供的实施方案中的任一种。在一些实施方案中，本文提供的核酸(包括下文所述的全部核酸)可用于重组生产(例如表达)本文提供的变体icosl多肽或免疫调节多肽。在一些实施方案中，本文提供的核酸(包括下文所述的全部核酸)可用于在细胞(如在工程化细胞中，例如，免疫细胞或感染原细胞)中表达本文提供的变体icosl多肽或免疫调节多肽。本文提供的核酸可以是rna形式或dna形式，并且包括mrna、crna、重组或合成rna和dna，以及cdna。本文提供的核酸通常是dna分子，并且通常是双链dna分子。然而，还提供了包含本发明的任何核苷酸序列的单链dna、单链rna、双链rna和杂合dna/rna核酸或其组合。

本文还提供了重组表达载体和重组宿主细胞，其可用于产生本文提供的变体icosl多肽或免疫调节多肽。

本文还提供了工程化细胞，如工程化免疫细胞，其含有任何提供的核酸分子，或变体icosl多肽或免疫调节多肽中的任何一种，如跨膜免疫调节多肽或可分泌性免疫调节多肽中的任何一种。

本文还提供了感染原，如细菌或病毒细胞，其含有任何提供的核酸分子，或变体icosl多肽或免疫调节多肽中的任何一种，如跨膜免疫调节多肽或可分泌性免疫调节多肽中的任何一种。

在任何上述提供的实施方案中，可以使用重组dna和克隆技术将编码本文提供的变体多肽或免疫调节多肽的核酸引入细胞中。为此，制备编码免疫调节多肽的重组dna分子。制备这种dna分子的方法是本领域公知的。例如，可以使用合适的限制酶从dna切除编码肽的序列。或者，可以使用化学合成技术合成dna分子，如亚磷酰胺法。此外，可以使用这些技术的组合。在一些情况下，可以通过聚合酶链反应(pcr)产生重组或合成核酸。在一些实施方案中，可以产生编码一种或多种变体icosl多肽的dna插入片段，该一种或多种变体icosl多肽含有至少一个亲和力修饰的igsf结构域，并且在一些实施方案中，根据提供的描述含有信号肽、跨膜结构域和/或胞内域。如本领域技术人员已知的，可以将该dna插入片段克隆至合适的转导/转染载体中。还提供了含有核酸分子的表达载体。

在一些实施方案中，表达载体能够在适合于蛋白质表达的条件下在合适的细胞中表达免疫调节蛋白。在一些方面，核酸分子或表达载体包含编码与合适的表达控制序列可操作地连接的免疫调节蛋白的dna分子。在dna分子插入载体之前或之后实现这种有效连接的方法是公知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、加帽信号、多腺苷酸化信号和涉及转录或翻译控制的其他信号。

在一些实施方案中，免疫调节蛋白的表达受启动子或增强子控制以控制或调节表达。启动子与编码变体多肽或免疫调节蛋白的核酸分子部分可操作地连接。在一些实施方案中，启动子是组成型活性启动子(如组织特异性组成型活性启动子或其他组成型启动子)。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子，其可以对诱导剂(如t细胞激活信号)有响应。

在一些实施方案中，组成型启动子与编码变体多肽或免疫调节蛋白的核酸分子可操作地连接。示例性的组成型启动子包括猴空泡病毒40(sv40)启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、泛素c(ubc)启动子和ef-1α(ef1a)启动子。在一些实施方案中，组成型启动子是组织特异性的。例如，在一些实施方案中，启动子允许免疫调节蛋白在特定组织(如免疫细胞、淋巴细胞或t细胞)中组成型表达。示例性组织特异性启动子描述在美国专利号5,998,205中，包括例如胎蛋白、df3、酪氨酸酶、cea、表面活性蛋白和erbb2启动子。

在一些实施方案中，诱导型启动子与编码变体多肽或免疫调节蛋白的核酸分子可操作地连接，使得通过控制合适的转录诱导物的存在或不存在来控制核酸的表达。例如，启动子可以是调节的启动子和转录因子表达系统，如公开的四环素调节的系统或其他可调节的系统(参见例如公开的国际pct申请号wo01/30843)，以允许编码的多肽的调节的表达。示例性可调节启动子系统是例如可从clontech(帕洛阿尔托，加利福尼亚州)获得的tet-on(和tet-off)系统。该启动子系统允许通过四环素或四环素衍生物(如多西环素)控制的转基因的调节的表达。其他可调节的启动子系统是已知的(参见例如公开的美国申请号2002-0168714，标题为“regulationofgeneexpressionusingsingle-chain,monomeric,liganddependentpolypeptideswitches”，其描述了含有配体结合结构域和转录调节结构域(如来自激素受体的那些结构域)的基因开关)。

在一些实施方案中，启动子响应于对t细胞激活信号传导有响应的元件。仅举例来说，在一些实施方案中，工程化t细胞包含编码免疫调节蛋白的表达载体和可操作地连接的启动子以控制免疫调节蛋白的表达。工程化的t细胞可以被激活，例如通过工程化t细胞受体(tcr)或嵌合抗原反应器(car)的信号传导来激活，从而通过响应性启动子引发免疫调节蛋白的表达和分泌。

在一些实施方案中，诱导型启动子与编码免疫调节蛋白的核酸分子可操作地连接，使得免疫调节蛋白响应于活化t细胞的核因子(nfat)或活化b细胞的核因子κ-轻链增强子(nf-κb)而表达。例如，在一些实施方案中，诱导型启动子包含nfat或nf-κb的结合位点。例如，在一些实施方案中，启动子是nfat或nf-κb启动子或其功能变体。因此，在一些实施方案中，核酸使得可以控制免疫调节蛋白的表达，同时还降低或消除免疫调节蛋白的毒性。特别地，包含本发明核酸的工程化免疫细胞仅在该细胞(例如，由该细胞表达的t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car))被抗原特异性刺激和/或该细胞(例如，该细胞的钙信号传导途径)被例如佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(pma)/离子霉素非特异性刺激时才表达和分泌免疫调节蛋白。因此，免疫调节蛋白的表达和在一些情况下免疫调节蛋白的分泌可以控制仅在需要的时间和地点(例如，在存在感染性致病剂、癌症的存在下或在肿瘤部位)发生，这可以减少或避免不希望的免疫调节蛋白相互作用。

在一些实施方案中，编码本文所述免疫调节蛋白的核酸包含编码nfat启动子、nf-κb启动子或其功能变体的合适核苷酸序列。如本文所用的“nfat启动子”意指与最小启动子连接的一种或多种nfat响应元件。“nf-κb启动子”是指与最小启动子连接的一种或多种nf-κb响应元件。在一些实施方案中，基因的最小启动子是最小的人il-2启动子或cmv启动子。nfat响应元件可包括例如nfat1、nfat2、nfat3和/或nfat4响应元件。nfat启动子、nf-κb启动子或其功能变体可包含任何数量的结合基序，例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或多达十二个结合基序。

其上具有dna分子的所得重组表达载体用于转化合适的宿主。可以使用本领域公知的方法进行该转化。在一些实施方案中，本文提供的核酸还包含编码与编码免疫调节多肽的核酸可操作地连接的分泌或信号肽的核苷酸序列，使得从培养基、宿主细胞或宿主细胞周质中回收所得的可溶性免疫调节多肽。在其他实施方案中，选择合适的表达控制信号以允许免疫调节多肽的膜表达。此外，可商购试剂盒以及签约制造公司也可用于制备本文提供的工程化细胞或重组宿主细胞。

在一些实施方案中，其上具有dna分子的所得表达载体用于转化(如转导)合适的细胞。可以使用本领域公知的方法进行引入。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些方法，包括经由病毒(例如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔。在一些实施方案中，表达载体是病毒载体。在一些实施方案中，通过慢病毒或逆转录病毒转导方法将核酸转移至细胞中。

任何大量公共可获得的和公知的哺乳动物宿主细胞(包括哺乳动物t细胞或apc)都可用于制备多肽或工程化细胞。细胞的选择取决于本领域公认的许多因素。这些因素包括，例如，与所选表达载体的相容性、由dna分子编码的肽的毒性、转化速率、肽的回收容易性、表达特征、生物安全性和成本。要平衡这些因素，必须认识到并非所有细胞对特定dna序列的表达具有相同效果。

在一些实施方案中，宿主细胞可以是多种真核细胞(如酵母细胞)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(cho)或hek293细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是悬浮细胞，并且在培养的悬浮液中，例如在培养的悬浮液cho细胞(例如cho-s细胞)中，工程化或产生多肽。在一些实例中，细胞系是dhfr缺陷型(dhfr-)cho细胞系，诸如dg44和duxb11。在一些实施方案中，细胞是谷氨酰胺合酶(gs)缺陷型，例如cho-s细胞、chok1sv细胞和chozn((r))gs-/-细胞。在一些实施方案中，cho细胞，诸如悬浮cho细胞，可以是cho-s-2h2细胞、cho-s克隆14细胞或expicho-s细胞。

在一些实施方案中，从cho细胞表达所提供的icosl多肽导致产生的蛋白质的组成更加均一。在一些实施方案中，与包含完整ecd参考序列和/或包含蛋白酶切割位点(例如，lqqn/lt)的icosl多肽相比，当从cho细胞表达蛋白质时，提供的icosl多肽产生更均一的产物。在一些实施方案中，所产生的包含本文产生的icosl变体多肽的蛋白质的组成的至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％具有相同的氨基酸长度或尺寸相同。评估尺寸均一性的技术包括高效液相色谱(hplc)、尺寸排阻色谱、sdspage或测序。

在一些实施方案中，宿主细胞也可以是原核细胞，如大肠杆菌。在多肽表达条件下培养转化的重组宿主，然后纯化以获得可溶性蛋白质。可以在常规发酵条件下培养重组宿主细胞，使得表达所需的多肽。这种发酵条件是本领域公知的。最后，可以通过本领域公知的许多方法中的任何一种从重组细胞培养物中回收和纯化本文提供的多肽，该方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法和亲和色谱法。根据需要，可以使用蛋白质重折叠步骤来完成成熟蛋白质的构型。最后，高效液相色谱法(hplc)可用于最终的纯化步骤。

在一些实施方案中，细胞是免疫细胞，如与制备工程化细胞有关的上述任何免疫细胞。在一些实施方案中，这种工程化细胞是原代细胞。在一些实施方案中，工程化细胞对于受试者是自体同源的。在一些实施方案中，工程化细胞与受试者是同种异体的。在一些实施方案中，工程化细胞从受试者获得，如通过白细胞分离术，并离体转化以表达免疫调节多肽，例如跨膜免疫调节多肽或可分泌性免疫调节多肽。

还提供了编码本文所述的感染原中包含的任何变体免疫调节多肽的核酸。在一些实施方案中，感染原将核酸递送至受试者中的细胞，和/或允许编码的变体多肽在细胞中表达。还提供了用于生成、产生或修饰此类感染原的核酸。例如，在一些实施方案中，提供了载体和/或质粒，其含有编码变体免疫调节多肽的核酸，以用于产生感染原，递送至受试者中的细胞和/或在受试者的细胞中表达变体免疫调节多肽。

在一些实施方案中，提供的核酸是重组病毒或细菌载体，其含有编码变体免疫调节多肽的核酸序列。在一些实施方案中，重组载体可用于产生感染原，其含有编码变体免疫调节多肽和/或有待递送至受试者中的靶细胞以供靶细胞表达的核酸序列。在一些实施方案中，重组载体是表达载体。在一些实施方案中，重组载体包括生成和/或产生感染原和在靶细胞中表达所必需的合适序列。

在一些实施方案中，重组载体是质粒或粘粒。如本文所述，含有编码变体免疫调节多肽的核酸序列的质粒或粘粒很容易使用本领域公知的标准技术构建。为了生成感染原，载体或基因组可以以质粒形式构建，其随后可以转染至包装或生产细胞系或宿主细菌中。可以使用本领域已知的任何重组技术生成重组载体。在一些实施方案中，载体可包括原核复制起点和/或基因，该基因的表达赋予可检测的或可选择的标志物，如用于阻碍在原核系统中繁殖和/或选择的药物。

在一些实施方案中，重组载体是病毒载体。示例性重组病毒载体包括慢病毒载体基因组、痘病毒载体基因组、牛痘病毒载体基因组、腺病毒载体基因组、腺病毒相关病毒载体基因组、疱疹病毒载体基因组和α病毒载体基因组。病毒载体可以是活的、减毒的、有复制条件的或复制缺陷的、非致病的(有缺陷的)、可复制的病毒载体和/或经修饰以表达异源基因产物，例如本文提供的变体免疫调节多肽。用于生成病毒的载体还可以被修饰以改变病毒的衰减，其包括增加或减少转录或翻译负荷的任何方法。

可以使用的示例性病毒载体包括经修饰的牛痘病毒载体(参见例如guerra等人,j.virol.80:985-98(2006)；tartaglia等人,aidsresearchandhumanretroviruses8:1445-47(1992)；gheradi等人,j.gen.virol.86:2925-36(2005)；mayr等人,infection3:6-14(1975)；hu等人,j.virol.75:10300-308(2001)；美国专利号5,698,530、6,998,252、5,443,964、7,247,615和7,368,116)；腺病毒载体或腺病毒相关病毒载体(参见例如molin等人,j.virol.72:8358-61(1998)；narumi等人,amj.respir.cellmol.biol.19:936-41(1998)；mercier等人,proc.natl.acad.sci.usa101:6188-93(2004)；美国专利号6,143,290；6,596,535；6,855,317；6,936,257；7,125,717；7,378,087；7,550,296)；逆转录病毒载体，包括基于鼠白血病病毒(mulv)、臂猿白血病病毒(galv)、亲嗜性逆转录病毒、猴免疫缺陷病毒(siv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)和组合的那些病毒(参见例如buchscher等人,j.virol.66:2731-39(1992)；johann等人,j.virol.66:1635-40(1992)；sommerfelt等人,virology176:58-59(1990)；wilson等人,j.virol.63:2374-78(1989)；miller等人,j.virol.65:2220-24(1991)；miller等人,mol.cellbiol.10:4239(1990)；kolberg,nihres.4:431992；cornetta等人,hum.genether.2:215(1991))；慢病毒载体，包括基于人类免疫缺陷病毒(hiv-1)、hiv-2、猫免疫缺陷病毒(fiv)、马传染性贫血病毒、猴免疫缺陷病毒(siv)和maedi/visna病毒的那些病毒(参见例如pfeifer等人,annu.rev.genomicshum.genet.2:177-211(2001)；zufferey等人,j.virol.72:9873,1998；miyoshi等人,j.virol.72:8150,1998；philpott和thrasher,humangenetherapy18:483,2007；engelman等人,j.virol.69:2729,1995；nightingale等人,mol.therapy,13:1121,2006；brown等人,j.virol.73:9011(1999)；wo2009/076524；wo2012/141984；wo2016/011083；mcwilliams等人,j.virol.77:11150,2003；powell等人,j.virol.70:5288,1996)或其任何变体，和/或可用于生成任何上述病毒的载体。在一些实施方案中，重组载体可以包括调节序列，如启动子或增强子序列，该调节序列可以调节病毒基因组(如在rna病毒的情况下)在包装细胞系中的表达(参见例如美国专利号5,385,839和5,168,062)。

在一些实施方案中，重组载体是表达载体，例如，当递送至靶细胞(例如受试者中的细胞，例如肿瘤细胞、免疫细胞和/或apc)中时允许编码的基因产物进行表达的表达载体。在一些实施方案中，感染原中包含的重组表达载体能够在适合于蛋白质表达的条件下在受试者的靶细胞中表达免疫调节蛋白。

在一些方面，核酸或表达载体包含编码与合适的表达控制序列可操作地连接的免疫调节蛋白的核酸序列。在编码免疫调节蛋白的核酸序列插入载体中之前或之后实现这种可操作连接的方法是公知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、加帽信号、多腺苷酸化信号和涉及转录或翻译控制的其他信号。启动子可以与编码免疫调节蛋白的核酸序列的部分可操作地连接。在一些实施方案中，启动子是靶细胞中的组成型活性启动子(如组织特异性组成型活性启动子或其他组成型启动子)。例如，重组表达载体还可以包括淋巴组织特异性转录调节元件(tre)，如b淋巴细胞、t淋巴细胞或树突细胞特异性tre。淋巴组织特异性tre是本领域已知的(参见例如thompson等人,mol.cell.biol.12:1043-53(1992)；todd等人,j.exp.med.177:1663-74(1993)；penix等人,j.exp.med.178:1483-96(1993))。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子，其可以对诱导剂(如t细胞激活信号)有响应。在一些实施方案中，递送至受试者中的靶细胞的核酸，例如肿瘤细胞、免疫细胞和/或apc，可以与上述任何调节元件可操作地连接。

在一些实施方案中，载体是细菌载体，例如，细菌质粒或粘粒。在一些实施方案中，经由细菌介导的质粒dna转移至哺乳动物细胞(也称为“细胞转染”)将细菌载体递送至靶细胞，例如肿瘤细胞、免疫细胞和/或apc。在一些实施方案中，递送的细菌载体还含有用于在靶细胞中表达的合适的表达控制序列，例如启动子序列和/或增强子序列或上述任何调节或控制序列。在一些实施方案中，细菌载体含有合适的表达控制序列，以用于在感染原例如细菌中表达和/或分泌编码的变体多肽。

在一些实施方案中，本文提供的多肽也可以通过合成方法制备。固相合成是制备单独肽的优选技术，因为它是制备小肽的最划算的方法。例如，公知的固相合成技术包括保护基团、接头和固相支持体的使用以及特定的保护和去保护反应条件、接头裂解条件、清除剂的使用以及固相肽合成的其他方面。然后可将肽组装成本文提供的多肽。

v.评估变体icosl多肽和免疫调节蛋白的活性免疫调节的方法

在一些实施方案中，本文提供的变体icosl多肽(例如全长和/或特异性结合片段或缀合物、堆叠构建体或其融合物)显示出调节t细胞活化的免疫调节活性。在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl对照，icosl多肽在原代t细胞测定中调节ifn-γ表达。在一些情况下，相对于对照，ifn-γ表达的调节可以增加或降低ifn-γ表达。用于确定特异性结合和ifn-γ表达的测定是本领域公知的，并且包括测量培养上清液中干扰素-γ细胞因子水平的mlr(混合淋巴细胞反应)测定(wang等人,cancerimmunolres.2014sep:2(9):846-56)、seb(葡萄球菌肠毒素b)t细胞刺激测定(wang等人,cancerimmunolres.2014sep:2(9):846-56)和抗cd3t细胞刺激测定(li和kurlander,jtranslmed.2010:8:104)。

在一些实施方案中，相对于野生型icosl对照，变体icosl多肽在一些实施方案中可以增加或在替代实施方案中降低原代t细胞测定中的ifn-γ(干扰素-γ)表达。在所提供的含有可溶性变体icosl序列的多肽的一些实施方案中，该多肽可以在原代t细胞测定中相对于野生型icosl对照增加ifn-γ表达，并且在替代实施方案中降低ifn-γ表达。在所提供的含有多个变体icosl序列的多肽的一些实施方案中，该多肽可以在原代t细胞测定中相对于野生型icosl对照增加ifn-γ表达，并且在替代实施方案中降低ifn-γ表达。

本领域技术人员将认识到，用于确定ifn-γ表达增加的原代t细胞测定的形式可不同于用于测定ifn-γ表达减少的形式。在测定变体icosl在原代t细胞测定中减少ifn-γ表达的能力时，可以如实施例6中所述使用混合淋巴细胞反应(mlr)测定。在一些情况下，可同样如实施例6中所述使用可溶形式的变体icosl来确定变体icosl拮抗并因此降低mlr中ifn-γ表达的能力。

或者，在原代t细胞测定中测定变体icosl增加ifn-γ表达的能力时，可以如实施例6中所述使用共固定化测定。在共固定化测定中，在一些实施方案中由抗cd3抗体提供的tcr信号与共固定化的变体icosl结合使用，以确定相对于icosl对照增加ifn-γ表达的能力。在一些情况下，可同样如实施例6中所述使用可溶形式的变体icosl来确定变体icosl激动并因此增加mlr中ifn-γ表达的能力，所述可溶性icosl经多聚化以一定程度提供多价结合。

在一些实施方案中，在测定变体icosl调节ifn-γ表达的增加或减少的能力时，可以使用t细胞报告子(reporter)测定法。在一些实施方案中，t细胞是jurkatt细胞系或衍生自jurkatt细胞系。在报告子测定中，还产生报告子细胞系(例如jurkat报告细胞)以过表达抑制性受体，该受体是变体igsf结构域多肽的同源结合配偶体。在一些实施方案中，报告子t细胞还包含报告子构建体，该报告子构建体包含可操作地连接至报告子的对t细胞活化有响应的诱导型启动子。在一些实施方案中，报告子是荧光或发光报告子。在一些实施方案中，报告子是萤光素酶。在一些实施方案中，启动子对cd3信号传导有响应。在一些实施方案中，启动子是nfat启动子。在一些实施方案中，启动子对共刺激信号传导例如cd28共刺激信号传导有响应。在一些实施方案中，启动子是il-2启动子。

在报告子测定的方面，如通过与表达抑制性受体(例如icosl)的野生型配体的抗原呈递细胞(apc)共同孵育来刺激报告子细胞系。在一些实施例中，apc是人工apc。人工apc是技术人员众所周知的。在一些实施方案中，人工apc衍生自一种或多种哺乳动物细胞系，诸如k562、cho或293细胞。

在一些实施方案中，在变体igsf结构域分子或免疫调节蛋白(例如变体icosl多肽或免疫调节蛋白)的存在下，将jurkat报告子细胞与过表达抑制性配体的人工apc共同孵育。在一些实施方案中，如通过确定细胞的发光或荧光来监测报告子表达。在一些实施方案中，其抑制性受体与配体之间的正常相互作用导致报告子信号的抑制或减少，如与对照相比，所述对照例如通过对照t细胞与其中不存在抑制性受体与配体相互作用的apc(例如，不过表达icosl的apc)共同孵育的报告子表达。在一些实施方案中，本文提供的变体icosl多肽或免疫调节蛋白拮抗所述相互作用，例如，当以可溶形式作为变体icosl-fc提供时或当以可分泌的免疫调节蛋白形式从apc表达时，由此导致与不存在变体icosl多肽或免疫调节蛋白的情况相比报告子信号的增加。在一些情况下，本文提供的变体icosl多肽或免疫调节蛋白的某些形式可提供激动剂活性，由此与不存在变体icosl多肽或免疫调节蛋白的情况相比降低报告子表达。

合适的对照的使用是本领域技术人员已知的，然而，在前述实施方案中，对照通常涉及使用参考icosl，如来自相同哺乳动物物种的野生型天然icosl同种型(由其衍生或形成变体icosl)。不管对icos和cd28中的一种或两种的结合亲和力是增加还是减少，在一些实施方案中，变体icosl将在原代t细胞测定中相对于野生型icosl对照增加ifn-γ表达，并且在替代实施方案中减少ifn-γ表达。

在一些实施方案中，相对于参考(例如未修饰的)或野生型icosl对照，变体icosl使ifn-γ表达(即蛋白质表达)增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在其他实施方案中，相对于野生型或未修饰的icosl对照，变体icosl使ifn-γ表达(即蛋白质表达)减少至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些实施方案中，野生型icosl对照是鼠icosl，如通常针对变体icosl来使用，该变体icosl的序列与野生型鼠icosl序列的序列相比有所改变。在一些实施方案中，野生型icosl对照是人icosl，如通常针对变体icosl来使用，该变体icosl的序列与野生型人icosl序列的序列(如包含seqidno:32或seqidno:196或545的氨基酸序列的icosl序列)相比有所改变。

vi.药物制剂

本文提供了含有本文所述的任何变体icosl多肽、免疫调节蛋白、缀合物、工程化细胞或感染原的组合物。药物组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂。例如，药物组合物可含有一种或多种赋形剂，以用于改变、维持或保持例如组合物的ph、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透。在一些方面，技术人员理解含有细胞的药物组合物可以不同于含有蛋白质的药物组合物。

在一些实施方案中，药物组合物是固体，如粉末、胶囊或片剂。例如，可以冻干药物组合物的组分。在一些实施方案中，在给予之前将固体药物组合物重构或溶解在液体中。

在一些实施方案中，药物组合物是液体，例如溶解在水溶液(如生理盐水或林格氏溶液)中的变体icosl多肽。在一些实施方案中，药物组合物的ph为约4.0至约8.5(如约4.0至约5.0、约4.5至约5.5、约5.0至约6.0、约5.5至约6.5、约6.0至约7.0、约6.5至约7.5、约7.0至约8.0或约7.5至约8.5)。

在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的赋形剂，例如填充剂、粘合剂、包衣、防腐剂、润滑剂、调味剂、甜味剂、着色剂、溶剂、缓冲剂、螯合剂或稳定剂。药学上可接受的填充剂的例子包括纤维素、磷酸氢钙、碳酸钙、微晶纤维素、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇、麦芽酚、预胶化淀粉、玉米淀粉或马铃薯淀粉。药学上可接受的粘合剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、乳糖、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、明胶、蔗糖、聚乙二醇、甲基纤维素或纤维素。药学上可接受的包衣的例子包括羟丙基甲基纤维素(hpmc)、虫胶、玉米蛋白玉米醇溶蛋白或明胶。药学上可接受的崩解剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素或羟基乙酸淀粉钠。药学上可接受的润滑剂的例子包括聚乙二醇、硬脂酸镁或硬脂酸。药学上可接受的防腐剂的例子包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸或山梨酸。药学上可接受的甜味剂的例子包括蔗糖、糖精、阿斯巴甜或山梨糖醇。药学上可接受的缓冲剂的例子包括碳酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、乙酸盐、磷酸盐或酒石酸盐。

在一些实施方案中，药物组合物还包含用于控制或持续释放产物的试剂，如可注射的微球、生物可侵蚀的颗粒、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠粒或脂质体。

在一些实施方案中，药物组合物是无菌的。可以通过无菌过滤膜进行过滤或辐射来完成灭菌。在冻干组合物的情况下，可以在冻干和重构之前或之后使用该方法进行灭菌。用于肠胃外给药的组合物可以以冻干形式或溶液形式储存。此外，通常肠胃外组合物通常置于具有无菌进入口的容器中，例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。

在一些实施方案中，提供了含有跨膜免疫调节蛋白的药物组合物，包括表达这种跨膜免疫调节蛋白的工程化细胞。在一些实施方案中，药物组合物和制剂包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。此类组合物可包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。优选配制本发明的组合物用于静脉内给药。

在一些实施方案中，药物组合物包含含有编码免疫调节变体多肽的核酸序列的感染原。在一些实施方案中，药物组合物含有一定剂量的感染原，该剂量适合于给予适合治疗的受试者。在一些实施方案中，药物组合物含有感染原，该感染原是单剂量或多剂量的病毒，其为或为约1×10⁵至约1×10¹²噬斑形成单位(pfu)、1×10⁶至1×10¹⁰pfu，或1×10⁷至1×10¹⁰pfu，每个范围均包括端点，如至少或至少约或约1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹pfu或约1×10¹⁰pfu。在一些实施方案中，药物组合物可含有约10⁵至约10¹⁰pfu/ml的病毒浓度，例如，5×10⁶至5×10⁹或1×10⁷至1×10⁹pfu/ml，如至少或至少约或约10⁶pfu/ml、10⁷pfu/ml、10⁸pfu/ml或10⁹pfu/ml。在一些实施方案中，药物组合物含有感染原，该感染原是单剂量或多剂量的细菌，其为或为约1×10³至约1×10⁹菌落形成单位(cfu)、1×10⁴至1×10⁹cfu或1×10⁵至1×10⁷cfu，每个范围均包括端点，如至少或至少约或约1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸或1×10⁹cfu。在一些实施方案中，药物组合物可含有浓度为或为约10³至约10⁸cfu/ml的细菌，例如，5×10⁵至5×10⁷或1×10⁶至1×10⁷cfu/ml，如至少或至少约或约10⁵cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁷cfu/ml或10⁸cfu/ml。

例如，这种制剂可以是适合于静脉内输注的形式。药学上可接受的载体可以是药学上可接受的材料、组合物或媒介物，其涉及将感兴趣的细胞从身体的一个组织、器官或部分携带或运送至身体的另一个组织、器官或部位。例如，载体可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料或它们的一些组合。载体的每种组分必须是“药学上可接受的”，因为它必须与制剂的其他成分相容。它也必须适合于与任何可能遇到的身体的组织、器官或部位接触，这意味着它不得带有毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或胜过其治疗益处的任何其他并发症的风险。

在一些实施方案中，将药物组合物给予受试者。通常，根据标准药学实践，根据受试者的体型和状况确定药物组合物的剂量和给药途径。例如，最初可以在细胞培养测定中或在动物模型如小鼠、大鼠、兔、狗、猪或猴中估算治疗有效剂量。动物模型也可用于确定合适的浓度范围和给药途径。然后，这些信息可用于确定人体给药的有用剂量和途径。确切的剂量将根据与需要治疗的受试者相关的因素来确定。调整剂量和给药以提供足够水平的活性化合物或以维持所需效果。可以考虑的因素包括疾病状态的严重程度、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、给药的时间和频率、一种或多种药物组合、反应敏感性以及对治疗的反应。

长效药物组合物可以根据特定制剂的半衰期和清除率每3至4天、每周或每两周给予一次。给药频率将取决于所用制剂中分子的药代动力学参数。通常，给予组合物直至达到实现所需效果的剂量。因此，组合物可以以单剂量的方式给予，或随时间以多剂量(以相同或不同的浓度/剂量)的方式给予，或以连续输注的方式给予。常规地对合适的剂量做出进一步改进。通过使用适当的剂量反应数据可以确定合适的剂量。可以监测许多针对治疗效果的生物标志物或生理学标志物，包括t细胞活化或增殖、细胞因子合成或产生(例如，tnf-α、ifn-γ、il-2的产生)、诱导各种活化标志物(例如，cd25、il-2受体)、炎症、关节肿胀或压痛、c反应蛋白的血清水平、抗胶原抗体产生和/或一种或多种t细胞依赖性抗体应答。

在一些实施方案中，药物组合物通过任何途径给予受试者，包括口服、透皮、吸入、静脉内、动脉内、肌肉内、直接施用于伤口部位、施用于手术部位、腹膜内、通过栓剂、皮下、皮内、经皮、通过雾化、胸膜内、心室内、关节内、眼内或脊柱内。

在一些实施方案中，药物组合物的剂量是单剂量或重复剂量。在一些实施方案中，向受试者给予剂量为每天一次、每天两次、每天三次或每天四次或每天更多次。在一些实施方案中，在一周内给予约1或更多(如约2或更多、约3或更多、约4或更多、约5或更多、约6或更多或约7或更多)个剂量。在一些实施方案中，在数天、数周、数月或数年的过程中给予多剂量。在一些实施方案中，治疗过程为约1或更多个剂量(例如约2或更多个剂量、约3或更多个剂量、约4或更多个剂量、约5或更多个剂量、约7或更多个剂量、约10或更多个剂量、约15或更多个剂量、约25或更多个剂量、约40或更多个剂量、约50或更多个剂量或约100或更多个剂量)。

在一些实施方案中，所给予的药物组合物的剂量为每kg受试者体重约1μg蛋白质或更多(如每kg受试者体重约2μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约5μg蛋白质)或更多、每kg受试者体重约10μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约25μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约50μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约100μg蛋白质或更高、每kg受试者体重约250μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约500μg蛋白质或更多、每kg受试者体重约1mg蛋白质或更多、每kg受试者体重约2mg蛋白质或更多或每kg受试者体重约5mg蛋白质或更多)。

在一些实施方案中，给予治疗量的细胞组合物。通常，医生可以考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定待给予的本发明组合物的精确量。通常，可以说包含如本文所述的工程化细胞(例如，t细胞)的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重(如10⁵至10⁶个细胞/kg体重，包括在这些范围内的所有整数值)的剂量给予。工程化细胞组合物，如t细胞组合物，也可以按这些剂量多次给予。可以通过使用在免疫疗法中通常已知的输注技术来给予细胞(参见例如rosenberg等人,neweng.j.ofmed.319:1676,1988)。通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。

已知多种方法用于确定给予本发明的治疗组合物通过如下方式是否可充分调节免疫活性：消除、隔离或灭活介导或能够介导不希望的免疫应答的免疫细胞；诱导、产生或开启介导或能够介导保护性免疫应答的免疫细胞；改变免疫细胞的物理或功能特性；或这些效果的组合。免疫活性调节的测量的例子包括但不限于检查免疫细胞群的存在或不存在(使用流式细胞术、免疫组织化学、组织学、电子显微镜、聚合酶链反应(pcr))；测量免疫细胞的功能能力，包括响应于信号进行增殖或分裂的能力或抵抗增殖或分裂(如使用t细胞增殖测定和基于用抗cd3抗体、抗t细胞受体抗体、抗cd28抗体、钙离子载体、载有肽或蛋白质抗原的pma(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)抗原呈递细胞刺激后刺激后3h-胸苷掺入的肽扫描分析；b细胞增殖测定)；测量杀死或溶解其他细胞的能力(如细胞毒性t细胞测定)；测量细胞因子、趋化因子、细胞表面分子、抗体和细胞的其他产物(例如，通过流式细胞术、酶联免疫吸附测定、western印迹分析、蛋白质微阵列分析、免疫沉淀分析)；测量免疫细胞或免疫细胞内信号传导途径的活化的生化标志物(例如western印迹和免疫沉淀分析酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化、多肽切割以及蛋白质复合物的形成或解离；蛋白质阵列分析；dna转录、使用dna阵列或消减杂交的分析)；通过细胞凋亡、坏死或其他机制测量细胞死亡(例如，膜联蛋白v染色、tunel测定、用于测量dna梯度的凝胶电泳、组织学；荧光半胱天冬酶测定、半胱天冬酶底物的western印迹分析)；测量由免疫细胞产生的基因、蛋白质和其他分子(例如，northern印迹分析、聚合酶链反应、dna微阵列、蛋白质微阵列、2维凝胶电泳、western印迹分析、酶联免疫吸附测定、流式细胞术)；以及测量临床症状或结果，如改善自身免疫、神经退行性疾病和其他涉及自身蛋白质或自身多肽的疾病(临床评分、使用其他疗法的要求、功能状态、影像学研究)，例如，在多发性硬化的情况下通过测量复发率或者疾病严重程度(使用普通技术人员已知的临床评分)，在i型糖尿病的情况下测量血糖，或在类风湿性关节炎的情况下测量关节炎症。

vii.制品和试剂盒

本文还提供了在合适包装中的包含本文所述药物组合物的制品。用于本文所述组合物的合适包装是本领域已知的，并且包括例如小瓶(如密封小瓶)、器皿、安瓿、瓶子、罐子、软包装(例如，密封的聚酯薄膜(mylar)或塑料袋)等。可进一步将这些制品灭菌和/或密封。

还提供了包含本文所述的药物组合物(或制品)的试剂盒，其可还包含关于使用该组合物(如本文所述的用途)的方法的说明书。本文所述的试剂盒还可包含商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器以及具有针对执行本文所述任何方法的说明书的包装插页。

viii.治疗应用

本文所述的药物组合物(包括包含本文所述的变体icosl多肽、免疫调节蛋白、缀合物、工程化细胞和感染原的药物组合物)可用于多种治疗应用，如疾病的治疗。例如，在一些实施方案中，药物组合物用于治疗哺乳动物的炎性或自身免疫性疾病、癌症、器官移植、病毒感染和/或细菌感染。药物组合物可以调节(例如增加或减少)免疫应答以治疗疾病。在一些实施方案中，所提供的方法适用于本文所述的变体icosl多肽、免疫调节蛋白、缀合物、工程化细胞和感染原的治疗性给予。鉴于所提供的公开内容，技术人员能够根据所需的免疫应答的调节类型(例如增加或减少)选择用于指示的形式。

此类方法和用途包括治疗方法和用途，例如，涉及将分子或工程化细胞或包含它们的组合物施用于患有疾病、病况或病症的受试者。在一些情况下，如所描述的，该疾病或病症是自身免疫或炎性疾病或病症。在一些情况下，例如所描述的，该疾病或病症是肿瘤或癌症。在一些实施方案中，以有效量施用分子或工程化细胞以实现疾病或病症的治疗。用途包括含有变体icosl多肽的分子、免疫调节蛋白、缀合物、工程化细胞和感染原在此类方法和治疗中以及在药物制备中的用途，以进行此类治疗方法。在一些实施方案中，通过将变体icosl多肽、免疫调节蛋白、缀合物、工程化细胞和感染原或包含它们的组合物施用于患有或怀疑患有该疾病或病况的受试者来执行该方法。在一些实施方案中，该方法从而治疗受试者的疾病或病况或病症。

在一些实施方案中，所提供的方法适用于本文所述的变体icosl多肽、免疫调节蛋白、缀合物、工程化细胞和感染原的治疗性给予。鉴于所提供的公开内容，技术人员能够根据所需的免疫应答的调节类型(例如增加或减少)选择用于指示的形式。

在一些实施方案中，给予能刺激免疫应答的本文提供的药物组合物，其可用于例如治疗癌症、病毒感染或细菌感染。在一些实施方案中，药物组合物含有某种形式的变体icosl多肽，其显示出其同源结合配偶体cd28或icos的激动剂活性和/或经由cd28或icos刺激或启动共刺激信号传导。用于与此类治疗性应用结合使用的icosl多肽的示例性形式包括，例如，免疫调节蛋白或变体icosl多肽的“堆叠”以及与肿瘤抗原结合的igsf结构域或其变体(例如nkp30或亲和力修饰的变体)(也称为“肿瘤定位igsf结构域”)、含有与肿瘤靶向部分(也称为肿瘤定位部分)连接的变体icosl多肽的缀合物、表达跨膜免疫调节蛋白的工程化细胞或包含编码跨膜免疫调节蛋白的核酸分子的感染原，如用于在感染细胞(例如肿瘤细胞或apc，例如树突细胞)中表达跨膜免疫调节蛋白。

本文所述的包含工程化细胞的药物组合物和方法可用于过继细胞转移应用。在一些实施方案中，包含工程化细胞的细胞组合物可以在相关方法中使用，例如用于调节免疫疗法方法中的免疫活性以治疗例如哺乳动物癌症，或者在其他实施方案中，治疗自身免疫病症。所采用的方法通常包括在允许亲和力修饰的igsf结构域的特异性结合和调节哺乳动物细胞的免疫活性的条件下使本发明的tip与哺乳动物细胞接触的方法。在一些实施方案中，免疫细胞(如肿瘤浸润淋巴细胞(til)、t细胞(包括cd8+或cd4+细胞)或apc)被工程化以表达为膜蛋白和/或如本文所述的可溶性变体icosl多肽、免疫调节蛋白或缀合物。然后，在允许亲和力修饰的igsf结构域与哺乳动物细胞上的反结构特异性结合使得可以在哺乳动物细胞中调节免疫活性的条件下，工程化细胞可以接触其中需要调节免疫活性的哺乳动物细胞，如apc、第二淋巴细胞或肿瘤细胞。细胞可以在体内或离体进行接触。

在一些实施方案中，工程化细胞是自体同源细胞。在其他实施方案中，细胞是同种异体的。在一些实施方案中，细胞是自体同源的工程化细胞，其重新输注至它所分离的哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，细胞是输注至哺乳动物中的同种异体工程化细胞。在一些实施方案中，从患者的血液或肿瘤收获细胞，工程化以表达多肽(如本文所述的变体icosl多肽、免疫调节蛋白或缀合物)，在体外培养体系中扩增(例如，通过刺激细胞)，并重新输注至患者中以介导肿瘤破坏。在一些实施方案中，该方法通过过继性细胞转移进行，其中将表达tip的细胞(例如，t细胞)输注回患者中。在一些实施方案中，本发明的治疗性组合物和方法用于治疗哺乳动物患者的癌症，如淋巴瘤、淋巴性白血病、骨髓性白血病、宫颈癌、神经母细胞瘤或多发性骨髓瘤。

在一些实施方案中，药物组合物可用于抑制哺乳动物癌细胞(如人癌细胞)的生长。治疗癌症的方法可包括向患有癌症的受试者给予有效量的本文所述的任何药物组合物。可给予有效量的药物组合物以抑制、中止或逆转癌症的进展。

可通过本文所述的药物组合物和治疗方法治疗的癌症包括但不限于黑色素瘤、膀胱癌、血液恶性肿瘤(白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、肝癌、脑癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌(腺癌)、结直肠癌、肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、脾癌、胸腺癌或血细胞癌(即白血病)、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌、肌肉骨骼癌、头颈癌、胃肠癌、生殖细胞癌或内分泌和神经内分泌癌。在一些实施方案中，癌症是尤因氏肉瘤。在一些实施方案中，癌症选自黑色素瘤、肺癌、膀胱癌和血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤、淋巴性白血病、骨髓性白血病、宫颈癌、神经母细胞瘤或多发性骨髓瘤。

可以在体内或离体处理人癌细胞。在人类患者的离体治疗中，在体外治疗含有癌细胞的组织或流体，然后将组织或流体重新引入患者体内。在一些实施方案中，通过将治疗组合物给予患者在人类患者中体内治疗癌症。

在一些实施方案中，药物组合物作为单一疗法(即，作为单一药剂)或作为组合疗法(即，与一种或多种另外的抗癌剂组合，如化学治疗药物、癌症疫苗或免疫检查点抑制剂)给予。在一些实施方案中，药物组合物还可以与放射疗法一起给予。

在一些实施方案中，药物组合物作为单一疗法(即，作为单一药剂)或作为组合疗法(即，与一种或多种另外的抗癌药剂，如化疗药物、癌症疫苗或免疫检查点抑制剂组合)给予。在一些实施方案中，药物组合物也可与放射疗法一起给予。在一些方面，免疫检查点抑制剂阻断pd-1与pd-l1和/或pd-l2的相互作用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂是特异性结合pd-1、pd-l1或pd-l2的抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，免疫检查点抑制剂是抗pd-1抗体，如纳武单抗或派姆单抗或其抗原结合片段。在一些情况下，免疫检查点抑制剂阻断ctla-4或为ctla-4的拮抗剂，例如是抗ctla-4抗体或其抗原结合片段。在本公开内容的一些方面，免疫检查点抑制剂为tremelimumab或伊匹单抗。

在一些实施方案中，药物组合物抑制免疫应答，其可用于治疗炎性或自身免疫性疾病或器官移植。在一些实施方案中，药物组合物含有某种形式的变体icosl多肽，其显示出其同源结合配偶体cd28或icos的拮抗剂活性和/或经由cd28或icos阻断或抑制共刺激信号传导。用于与此类治疗性应用结合使用的icosl多肽的示例性形式包括，例如，可溶的变体icosl多肽(例如变体icosl-fc融合蛋白)、变体icosl多肽的免疫调节蛋白或“堆叠”和另一种igsf结构域(包括作为fc融合物的可溶形式)、表达可分泌性免疫调节蛋白的工程化细胞或包含编码可分泌免疫调节蛋白的核酸分子的感染原，例如以用于在感染细胞(例如肿瘤细胞或apc，例如树突细胞)中表达和分泌可分泌性免疫调节蛋白。

在一些实施方案中，该炎性或自身免疫病症是抗中性粒细胞胞浆抗体(anca)相关的血管炎、血管炎、自身免疫性皮肤病、移植、风湿性疾病、炎性胃肠疾病、炎性眼病、炎性神经疾病、炎性肺病、炎性内分泌疾病或自身免疫性血液病。

在一些实施方案中，可通过本文所述的药物组合物治疗的炎性和自身免疫病症是艾迪生病、过敏、斑秃、阿尔茨海默症、抗中性粒细胞胞浆抗体(anca)相关性血管炎、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征(休斯综合征)、哮喘、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、无精子症、白塞病、伯杰病、大疱性类天疱疮、心肌病、心血管疾病、口炎性腹泻/乳糜泻、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(cfids)、慢性特发性多发性神经炎、慢性炎性脱髓鞘、多发性神经病变(cidp)、慢性复发性多发性神经病(格林-巴利综合征)、churg-strauss综合征(css)、瘢痕性类天疱疮、冷凝激素病(cad)、copd(慢性阻塞性肺病)、crest综合征、克罗恩病、皮炎、疱疹、皮肌炎、糖尿病、盘状狼疮、湿疹、获得性大疱性表皮松解症、原发性混合型冷球蛋白血症、埃文综合征、眼球突出、纤维肌痛、goodpasture综合征、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(itp)、iga肾病、免疫增殖性疾病或病症、炎性肠病(ibd)、间质性肺病、幼年型关节炎、幼年特发性关节炎(jia)、川崎病、lambert-eaton肌无力综合征、扁平苔藓、狼疮性肾炎、淋巴细胞性垂体炎、ménière病、米勒鱼综合征/急性播散性脑脊髓神经病变、混合性结缔组织病、多发性硬化(ms)、肌肉风湿病、肌痛性脑脊髓炎(me)、重症肌无力、眼部炎症、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征(whitaker综合征)、风湿性多肌痛、多发性肌炎、原发性丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化/自身免疫性胆管病、银屑病、银屑病关节炎、雷诺现象、瑞特综合征/反应性关节炎、再狭窄、风湿热、风湿性疾病、结节病、施密特综合征、硬皮病、综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮(sle)、系统性硬皮病、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、甲状腺炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、间质性肠病或韦格纳肉芽肿病。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性病症选自间质性肠病、移植、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、哮喘、类风湿性关节炎和银屑病。

在一些实施方案中，炎性或自身免疫性疾病是慢性自身免疫性疾病。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性疾病是干燥综合征(sjogren’ssyndrome，pss)或系统性红斑狼疮(sle)。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性疾病是炎性肠病(ibd)。在一些实例中，炎性或自身免疫性疾病是克罗恩氏病。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性疾病是ibd相关疾病或病症，例如间质性肺病(ild)。在一些实施方案中，炎性或自身免疫性疾病是银屑病性关节炎或类风湿性关节炎。在一些实施方案中，给予药物组合物以调节自身免疫病况。例如，抑制免疫应答在用于抑制接受者对供体的组织、细胞或器官移植的排斥的方法中是有益的。因此，在一些实施方案中，本文所述的药物组合物用于限制或预防移植物相关或移植相关的疾病或病症，如移植物抗宿主病(gvhd)。在一些实施方案中，药物组合物用于抑制移植(transplant或graft)的骨髓、器官、皮肤、肌肉、神经元、胰岛或实质细胞的自身免疫排斥。

在一些实施方案中，本文提供的药物组合物，如本文提供的变体icosligsf(例如igv)fc融合蛋白，用于治疗银屑病性关节炎(psa)。在一些情况下，psa影响一个或多个关节，诸如手指、脚趾、手臂或腿部，包括肘部、腕部、手和脚或骶髂关节。在一些情况下，psa是轻度的和/或影响四个或更少的关节。在一些情况下，psa是中度的和/或影响四个或更多个关节。在一些情况下，患有psa的受试者可能在脊柱或颈部中或一个以上的关节中出现疼痛、僵硬或发炎。

在一些实施方案中，本文提供的药物组合物，诸如本文提供的变体icosligsf(例如igv)fc融合蛋白，用于治疗类风湿关节炎(ra)。在一些些情况下，ra影响关节、关节内层和/或身体的非关节结构(例如皮肤、眼、肺、心脏、肾脏、唾液腺、神经组织、骨髓或血管)。在一些实施方案中，ra或ra症状是慢性的。

在一些实施方案中，本文提供的药物组合物，诸如本文提供的变体icosligsf(例如igv)fc融合蛋白，用于治疗gvhd。在一些情况下，gvhd是急性gvhd(agvhd)。在一些情况下，同种异体造血干细胞移植(hsct)和/或供体免疫细胞针对宿主组织的反应后会发生agvhd。在一些情况下，agvhd出现在皮肤、肝脏或胃肠道中。

在一些实施方案中，本文提供的药物组合物，诸如本文提供的变体icosligsf(例如igv)fc融合蛋白，用于治疗与器官移植相关的自身免疫病。在一些情况下，治疗与器官移植相关的自身免疫疾病可延长宿主和移植器官的存活。在一些实施方案中，治疗与器官移植相关的自身免疫疾病包括预防或抑制或防止作为器官移植接受者的受试者的移植排斥。

在一些实施方案中，本文提供的药物组合物，例如本文提供的变体icosligsf(例如igv)fc融合蛋白，用于治疗炎性肠病(ibd)。在一些实施方案中，本文提供的药物组合物，诸如本文提供的变体icosligsf(例如igv)fc融合蛋白，用于治疗克罗恩氏病。在一些实施方案中，克罗恩氏病可包括来自克罗恩氏结肠炎、克罗恩氏肠炎、克罗恩氏回肠炎或克罗恩氏小肠结肠炎的亚型。

在一些实施方案中，本文提供的药物组合物，诸如本文提供的变体icosligsf(例如igv)fc融合蛋白，用于治疗系统性红斑狼疮(sle)。在一些实施方案中，本文提供的药物组合物，诸如本文提供的变体icosligsf(例如igv)fc融合蛋白，用于治疗干燥综合征。

ix.示例性实施方案

提供的实施方案为：

1.一种变体icos配体(icosl)多肽，其在icosl参考多肽的免疫球蛋白超家族(igsf)结构域中包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述icosl参考多肽是截短的细胞外结构域，其包含连续的氨基酸序列和参照seqidno:32所示的icosl细胞外结构域序列的至少25个氨基酸的c末端截短，所述连续的氨基酸包含参照seqidno:32所示的icosl细胞外结构域序列的氨基酸1-112。

2.根据实施方案1所述的变体icosl多肽，其中与所述icosl参考多肽对icos或cd28的一个或多个胞外域的结合相比，所述变体icosl多肽表现出改变的与相同的一个或多个胞外域的结合。

3.根据实施方案1或实施方案2所述的变体icosl多肽，其中与所述icosl参考多肽对icos或cd28的一个或多个胞外域的结合相比，所述变体icosl多肽表现出与相同的一个或多个胞外域的结合增加。

4.根据实施方案1-3中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述c末端截短为至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100个、至少125个氨基酸残基。

5.根据实施方案1-4中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述icosl参考多肽在如seqidno:32的氨基酸204-209所示的蛋白酶切割位点中有所改变或缺少如seqidno:32的氨基酸204-209所示的蛋白酶切割位点。

6.根据实施方案1-5中任一项所示的变体icosl多肽，其中所述icosl参考多肽包含seqidno:545中所示的氨基酸序列。

7.根据实施方案1-4中任一项所示的变体icosl多肽，其中所述icosl参考多肽由seqidno:545中所示的氨基酸序列组成。

8.一种变体icosl配体(icosl)多肽，其在icosl参考多肽中包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述icosl参考多肽由seqidno:545中所示的氨基酸序列组成。

9.一种变体icos配体(icosl)多肽，其在icosl参考多肽的免疫球蛋白超家族(igsf)结构域中包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述icosl参考多肽在与参照seqidno:32的氨基酸204-209对应的一个或多个氨基酸中有所改变。

10.根据实施方案8或实施方案9所述的变体icosl多肽，其中与所述icosl参考多肽对其一个或多个结合配偶体的结合相比，所述变体icosl多肽表现出改变的与该一个或多个结合配偶体中的一个或多个的结合。

11.根据实施方案8或实施方案9所述的变体icosl多肽，其中与所述icosl参考多肽对其一个或多个结合配偶体的结合相比，所述变体icosl多肽表现出增加的与该一个或多个结合配偶体中的一个或多个的结合，。

12.根据实施方案9-11中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述改变包括与参照seqidno:32的氨基酸204-109对应的一个或多个连续氨基酸的缺失。

13.根据实施方案1-6和9-12中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述icosl参考多肽包含seqidno:600-605中任一个所示的氨基酸序列。

14.根据实施方案1-6和9-12中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述icosl参考多肽由seqidno:600-605中任一个所示的氨基酸序列组成。

15.根据实施方案1-6和9-14中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述改变包含在与seqidno:32所示的位置对应的位置207和208中的一或两处的至少一个氨基酸取代。

16.根据实施方案15所述的变体icosl多肽，其中所述至少一个氨基酸取代是n207a、n207g或l208g或其保守氨基酸取代。

17.根据实施方案9-16中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述参考icosl多肽包含seqidno:623-628中任一个所示的氨基酸序列。

18.根据实施方案9-17中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述参考icosl多肽由seqidno:623-628中任一个所示的氨基酸序列组成。

19.根据实施方案5-7和9-18中任一项所述的变体icosl多肽，其中任选地与所述变体icosl多肽的全长细胞外结构域当从细胞表达时相比，所述变体icosl多肽当从相同细胞表达时表现出减少的蛋白水解切割。

20.根据实施方案19所述的变体icosl多肽，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

21.根据实施方案19或实施方案20所述的变体icosl多肽，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞系或其衍生物。

22.根据实施方案1-21中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代、插入或缺失。

23.根据实施方案1-22中任一项所述的变体，其中所述一个或多个氨基酸修饰在与选自以下的一个或多个位置对应的位置处：参照seqidno:32的10、11、13、16、18、20、25、26、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、137、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227。

24.根据实施方案1-23中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自m10v、m10i、v11e、s13g、e16v、s18r、a20t、a20v、s25g、r26s、f27c、f27s、n30d、y33del、q37r、t38p、k42e、t43a、y47h、n52a、n52c、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52p、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、s54a、s54f、s54p、n57a、n57d、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57w、n57y、r61c、r61s、y62f、l67p、a71t、g72r、l74q、r75q、d77g、f78l、l80p、n84q、d89g、e90a、k92r、f93l、h94d、h94e、l96f、l96i、v97a、l98f、s99g、q100a、q100d、q100e、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100p、q100r、q100s、q100t、q100v、l102r、g103e、v107a、v107i、s109g、s109n、v110a、v110d、v110n、e111del、t113e、h115q、h115r、v116a、a117t、n119q、f120i、f120s、s121g、v122a、v122m、s126r,s126t、h129p、s130g,s132f、q133h、e135k、t137a、f138l、t139s、c140del、c140d、s142f,i143t、i143v、n144d、y146c、v151a、y152c、y152h,w153r、i154f、n155h、n155q、k156m、d158g、l161m、l161p、q164l、l166q、n168q、f172s、l173s、m175t、t190a、t190s、s192g、v193a、v193m、n194d、c198r、n201s、l203f、l203p、n207q、l208p、v210a、s212g、d217g,d217v、i218n、i218t、e220g、r221g、r221i、r221k、i224v、t225a、t225s、n227k或其保守氨基酸取代。

25.根据实施方案1-24中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰位于与位置52、57或100对应的位置处。

26.根据实施方案1-25中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自n52a、n52c、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、n52k、s54a、s54p、n57a、n57d、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57y、n57w、q100a、q100d、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100p、q100r、q100s、q100t或q100v。

27.根据实施方案1-26中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自n52y/n57y/f138l/l203p、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c140d/t225a、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n52h/s99g、n57y/q100p、n52s/s130g/y152c、n52s/y152c、n52s/c198r、n52y/n57y/y152c、n52y/n57y/h129p/c198r、n52h/l161p/c198r、n52s/t113e、n52d/s54p、n52k/l208p、n52s/y152h、n52d/v151a、n52h/i143t、n52s/l80p、n52s/r75q/l203p、n52s/d158g、n52d/q133h、n52s/n57y/h94d/l96f/l98f/q100r、n52s/n57y/h94d/l96f/l98f/q100r/g103e/f120s、n52s/g103e、n52h/f78l/q100r、n52h/n57y/q100r/v110d、n52h/n57y/r75q/q100r/v110d、n52h/n57y/q100r、n52h/n57y/l74q/q100r/v110d、n52h/q100r、n52h/s121g、a20v/n52h/n57y/q100r/s109g、n52h/n57y/r61s/q100r/v110d/l173s、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y、n52s/f120s、n52s/v97a、n52s/g72r、n52s/a71t/a117t、n52s/e220g、y47h/n52s/v107a/f120s、n52h/n57y/q100r/v110d/s132f/m175t、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r、q37r/n52h/n57y/q100r/v110n/s142f/c198r/d217v/r221g、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/v116a/l161m/f172s/s192g/c198r、f27s/n52h/n57y/v110n、n52s/h94e/l96i/s109n/l166q、s18r/n52s/f93l/i143v/r221g、a20t/n52d/y146c/q164l、v11e/n30d/n52h/n57y/h94e/l96i/l98f/n194d/v210a/i218t、n52s/h94e/l96i/v122m、n52h/n57y/h94e/l96i/f120i/s126t/w153r/i218n、m10v/s18r/n30d/n52s/s126r/t139s/l203f、s25g/n30d/n52s/f120s/n227k、n30d/n52s/l67p/q100k/d217g/r221k/t225s、n52h/n57y/q100r/v110d/a117t/t190s/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/f172s/c198r、s25g/f27c/n52h/n57y/q100r/v110d/e135k/l173s/c198r、n52h/n57y/v110a/c198r/r221i、m10i/s13g/n52h/n57y/d77g/v110a/h129p/i143v/f172s/v193m,c198r、n52h/n57y/r61c/y62f/q100r/v110n/f120s/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/n144d/f172s/c198r、n52s/h94e/l98f/q100r、n52s/e90a、n30d/k42e/n52s、n52s/f120s/i143v/i224v、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/c198r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/c198r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52s/s54p、t38p/n52s/n57d、n52h/c140del/t225a、n52h/f78l/q100r/c198r、n52h/n57y/r75q/q100p/v110d、n52h/n57y/l74q/v110d/s192g、n52h/s121g/c198r、n52s/f120s/n227k、n52s/a71t/a117t/t190a/c198r、t43a/n52h/n57y/l74q/d89g/v110d/f172s、n52h/n57y/q100r/v110d/s132f/m175t、n52d、n52h/n57y/q100r/v107i/v110d/i154f/c198r/r221g、n52q/n207q、n168q/n207q、n52q/n168q、n52q/n84q、n52q/n119q、n52q/n84q/n168q、n52q/n84q/n207q、n52q/n119q/n155q、n52h/n84q/n119q、n52h/n84q、n52h/n84q/n168q/n207q、n52q/n84q/n155q/n168q、n52q/n84q/n119q/n168q、n52q/n84q/n119q/n207q、n52q/n84q/n119q/n155q、n52q/n84q/n119q/n155q/n207q、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、q100r/f138l、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102r/h115r/f172s/c198r、n52h/v122a/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/q100r/h115r/i143t/f172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/e90a/h115r、n30d/k42en52s/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r/r221i、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r、n30d/k42e/n52s/h115r/f172s/n194d、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52s/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100ph115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s、n52h/q100r/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52a/n57f/q100s、n52a/n57h/q100s、n52a/n57y/q100a、n52d/n57a/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52h/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57f、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52r/n57y/q100p、n52r/n57y/q100s、n52s/n57a/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100s、n52s/n57y/q100m、n52s/n57y/q100v、n52t/n57h/q100s、n52t/n57h/q100a、n52t/n57y/q100a、n52v/n57l/q100a、n52h/n57y/q100k、n52k/n57y/q100r、n52l/n57h/q100r、n52r/n57f/q100n、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100r、n52r/n57f/q100t、n52r/n57h/q100k、n52r/n57l/q100s、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52r/n57y/q100r、n52c/n57e/q100s、n52g/n57p/q100d、n52g/n57v/q100g、n52g/n57v、n52l/n57v、n52p/n57p、n52p/n57s/q100g、n52s/n57l/q100g、n52t/n57k/q100p、n52v/n57t/q100l、n57q/q100p或r26s/n52h/n57y/v110d/t137a/c198r。

28.根据实施方案1-24中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自f120s/y152h/n201s、e111del、y33del、n168q/n207q、n84q/n207q、n155q/n207q、n119q/n168q、n119q/n207q、n119q/n155q、n84q/n119q、n84q/n155q/n168q、n84q/n168q/n207q、n84q/n155h/n207q、n155q/n168q/n207q、n119qn155q/n168q、n119q/n168q/n207q、n84q/n119q/n207q、n119q/n155h/n207q、n84q/n119q/n155q、n84q/n119q/n155q/n168q、n84q/n155q/n168q/n207q、n84q/n119q/n155q/n207q、n84q/n119q/n155q/n168q/n207q或f138l/l203p。

29.根据实施方案1-28中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自c198r、d158g、e16v、e90a、f120s、f138l、f172s、h115r、h115x、i143t、i143v、i224v、k156m、k42e、k92r、l102r、l203p、l208p、n194d、n30d、n52a、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52q、n52r、n52s、n52t、n52y、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57s、n57v、n57w、n57y、q100a、q100d、q100e、q100k、q100m、q100p、q100p、q100r、q100s、q100t、q133h、r221i、r75q、s54a、s54p、t113e、t225a、v110d、v122a、y146c或y152c；或

a117t、a20v、a71t、a91g、a91g、ae88d、c140del、c198r、d158g、d77g、d90k、e117g、e135k、e16v、e81a、e88d、e90a、f120i、f120s、f138l、f172s、f27c、f92y、g72r、h115r、h115x、h129p、h94e、i118v、i127t、i143t、i143v、i154f、i218n、i218t、i224v、k156m、k169e、k36g、k42e、k89r、k92r、k93r、l102r、l161p、l166q、l173s、l203f、l203p、l208p、l209p、l40m、l70q、l70r、l74q、l80p、l96i、l98f、m10i、m10v、n115q、n119q、n122s、n144d、n155x、n168q、n168x、n178s、n194d、n207q、n207x、n227k、n25s、n30d、n52a、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、n57a、n57f、n57h、n57l、n57m、n57s、n57v、n57w、n57y、n63s、n84q、q100a、q100e、q100g、q100k、q100m、q100n、q100p、q100r、q100s、q100t、q100v、q133h、r221g、r221i、s109g、s109n、s114t、s121g、s126r、s126t、s130g、s132f、s13g、s18r、s192g、s212g、s25g、s54a、s54p、s99g、t113e、t120s、t130a、t139s、t190a、t199s、t225a、t41i、v107i、v110a、v110d、v11e、v122a、v122m、v193m、v210a、w153r、y146c、y152c或y152h.

30.根据实施方案1-29中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自n52s、n52h、n52d、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n57y、n52s/c198r、n52s/t113e、s54a、n52d/s54p、n52k/l208p、n52h/i143t、n52s/r75q/l203p、n52s/d158g、n52d/q133h、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52s/e90a、n52s/f120s/i143v/i224v、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115x/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、q100r、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、n57y/q100p、q100r/f138l、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102r、h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115rf172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/q100r/h115r/i143tf172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、n52s/e90a/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r/r221i、n30d/k42e/n52s/h115r/c198r、n30d/k42e/n52s/h115r/f172s/n194d、n30d/k42e/n52s/h115r、n52s/e90a/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r、n52a/n57h/q100s、n52a/n57y/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100m、n52t/n57h/q100s、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100t、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52g/n57p/q100d、n52g/n57v/q100g、n52g/n57v、n52l/n57v、n52s/n57l/q100g或n52t/n57k/q100p；或

n52s、n52h、n52d、n52y/n57y/f138l/l203p、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c140del/t225a、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n52h/s99g、n57y、n57y/q100p、n52s/s130g/y152c、n52s/y152c、n52s/c198r、n52y/n57y/y152c、n52y/n57y/h129p/c198r、n52h/l161p/c198r、n52s/t113e、s54a、n52d/s54p、n52k/l208p、n52s/y152h、n52h/i143t、n52s/l80p、n52s/d158g、n52d/q133h、l70q/a91g/n144d、l70q/a91g/e117g/i118v/t120s/t130a、l70r/a91g/i118v/t120s/t130a/t199s、l70q/e81a/a91g/i118v/t120s/i127t/t130a、n63s/l70q/a91g/s114t/i118v/t120s/t130a、t41i/a91g、e88d/k89r/d90k/a91g/f92y/k93r/n122s/n178s、e88d/k89r/d90k/a91g/f92y/k93r、ae88d/k89r/d90k/a91g/f92y/k93r、k36g/l40m、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r、n52s/f120s/n227k、n52s/n194d、n52s/f120s、n52s/g72r、n52s/a71t/a117t/t190a/c198r、n52h/n57y/q100r/v107i/v110d/s132f/i154f/c198r/r221g、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r、v11e/n30d/n52h/n57y/h94e/l96i/l98f/n194d/v210a/i218t、n52s/h94e/l96i/v122m、n52h/n57y/h94e/l96i/f120i/s126t/w153r/i218n、m10v/s18r/n30d/n52s/s126r/t139s/l203f、s25g/n30d/n52s/f120s/n227k、n52h/n57y/q100r/v110d/f172s/c198r、s25g/f27c/n52h/n57y/q100r/v110d/e135k/l173s/c198r、n52h/n57y/v110a/c198r/r221i、m10i/s13g/n52h/n57y/d77g/v110a/h129p/i143v/f172s/v193m,c198r、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/n144d/f172s/c198r、n52s/h94e/l98f/q100r、n52s/e90a、n52s/f120s/i143v/i224v、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s、n52h/q100r/h115x/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52s/h94e/l96i/s109n/l166q/、n52h/n57y/q100r/c198r、n52h/n57y/l74q/v110d/s192g、n52h/q100r、n52h/s121g/c198r、a20v/n52h/n57y/q100r/s109g、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、l70q/a91g/i118a/t120s/t130a/k169e、q100r、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、n52h、n57y、n57y/q100p、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102rh115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115rf172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/q100r/h115r/i143tf172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、n30d/k42e/n52s/h115r/c198rr221i、n52s/e90a/h115r、n30d/k42e/n52s/h115r、n52s/h115r/f172s/c198r、n119q、n207q、n52q/n207x、n168x/n207x、n52q/n168q、n84q/n207q、n119qn155x、n52q/n119q、n52q/n84q/n207q、n119q/n155q/n168q、n52h/n84q/n119q、n52q/n84q/n155x/n168x、n52a/n57f/q100s、n52a/n57h/q100s、n52a/n57y/q100a、n52d/n57a/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52h/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57f、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52r/n57y/q100p、n52r/n57y/q100s、n52s/n57a/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100s、n52s/n57y/q100m、n52s/n57y/q100v、n52t/n57h/q100s、n52t/n57h/q100a、n52t/n57y/q100a、n52v/n57l/q100a、n52h/n57y/q100k、n52k/n57y/q100r、n52l/n57h/q100r、n52r/n57f/q100n、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100r、n52r/n57f/q100t、n52r/n57l/q100s、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52g/n57v、n52l/n57v、n52s/n57l/q100g或n52t/n57k/q100p。

31.根据实施方案1-30中任一项所述的变体icosl多肽，其中与所述参考icosl多肽对icos或cd28的胞外域的结合相比，所述变体icosl多肽表现出增加的与相同的胞外域的结合。

32.根据实施方案1-31中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自c198r、d158g、e16v、e90a、f120s、f138l、f172s、h115r、i143v、i224v、k156m、k42e、k92r、l102r、l203p、l208p、n194d、n30d、n52a、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52q、n52r、n52s、n52t、n52y、n57f、n57h、n57l、n57m、n57s、n57v、n57w、n57y、q100a、q100e、q100g、q100k、q100m、q100p、q100r、q100s、q133h、s212g、s54a、s54p、t113e、v110d、v122a、y146c、y152c或t225a。

33.根据实施方案1-33中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自n52a/n57y/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100m、n52t/n57h/q100s、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100t、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52g/n57v、n52l/n57v、n52s/n57l/q100g、n52t/n57k/q100p、n52s、n52h、n52d、n52y/n57y/f138l/l203p、n52h/n57y/q100p、n52s/y146c/y152c、n52h/c198r、n52h/c198r/t225a、n52h/k92r、n57y、n52s/c198r、n52s/t113e、s54a、n52d/s54p、n52k/l208p、n52h/i143t、n52s/d158g、n52d/q133h、n52h/n57y/q100r/v110d/c198r/s212g、n52h/n57y/q100r/v122a、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r、n52s/n194d、n52h/n57y/q100r/l102r/v110d/h115r/c198r、n52s/e90a、n52s/f120s/i143v/i224v、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52y/n57y/q100p/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/f172s/c198r、n52s/h115r/f120s/i143v/c198r、n52h/n57y/q100p/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/f172s/c198r、n52h/n57y/q100p/h115r、n52h/n57y/q100p/h115r/c198r、n52h/q100r/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s、n52h/q100r/h115x/f172s/c198r、n52h/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、q100r、n52y/f138l/l203p、n57y/q100r/c198r、n57y/f138l/l203p、n52h、n57y、n57y/q100p、q100r/f138l、n52h/n57y/q100r/h115r、n52h/n57y/q100r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/i224v、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/q100r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/i143v/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/l102rh115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115rf172s/n194d、n52h/n57y/h115r/f172s/c198r、n52h/n57y/q100r/h115r/c198r、n52h/n57y/h115r、n52h/q100r/h115r/i143t/f172s、n52h/n57y/q100p/h115r/f172s、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/c198r、n52s/e90a/h115r、n52s/e90a/h115r或n30d/k42e/n52s/h115r。

34.根据实施方案1-33中任一项所述的变体icosl多肽，其中与所述参考icosl多肽对icos和cd28的胞外域的结合相比，所述变体icosl多肽表现出增加的与相同的胞外域的结合。

35.根据实施方案1-34中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述变体icosl多肽包含seqidno:546-599、734-781、783、786、788、792、796、798、800、802、804、806、808、811、813、815、817、818、820、822、824、826、827、829、831、833、834、836、838、840-843、845、847、848、850-853、855、857、907、910中任一个所示的氨基酸序列或表现出与seqidno:546-599、734-781、783、786、788、792、796、798、800、802、804、806、808、811、813、815、817、818、820、822、824、826、827、829、831、833、834、836、838、840-843、845、847、848、850-853、855、857、907、910中的任一个至少90％、91％％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

36.根据实施方案1-34中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述变体icosl多肽由seqidno:546-599、734-781、783、786、788、792、796、798、800、802、804、806、808、811、813、815、817、818、820、822、824、826、827、829、831、833、834、836、838、840-843、845、847、848、850-853、855、857、907、910中任一个所示的氨基酸序列组成或由表现出与seqidno:546-599、734-781、783、786、788、792、796、798、800、802、804、806、808、811、813、815、817、818、820、822、824、826、827、829、831、833、834、836、838、840-843、845、847、848、850-853、855、857、907或910中的任一个至少90％、91％％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成。

37.一种变体icos配体(icosl)多肽，其包含igv结构域或其特异性结合片段、igc结构域或其特异性结合片段或二者，其中所述变体icosl多肽在icosl参考多肽或其特异性结合片段中包含一个或多个氨基酸修饰，所述一个或多个氨基酸修饰选自参照seqidno:32的n52a、n52c、n52d、n52g、n52k、n52l、n52m、n52r、n52t、n52v、n57a、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57w、q100a、q100d、q100g、q100l、q100m、q100n、q100r、q100s、q100t或q100v。

38.根据实施方案37所述的变体icosl多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自n52a/n57f/q100s、n52a,/n57h/q100s、n52a/n57y/q100a、n52d/n57a/q100a、n52d/q100s、n52g/q100a、n52h/q100a、n52m/n57h/q100s、n52m/n57w/q100p、n52q/n57f、n52q/n57s/q100a、n52r/n57l/q100a、n52r/n57y/q100p、n52r/n57y/q100s、n52s/n57a/q100a、n52s/n57h/q100e、n52s/n57l/q100s、n52s/n57m/q100s、n52s/n57y/q100s、n52s/n57y/q100m、n52s/n57y/q100v、n52t/n57h/q100s、n52t/n57h/q100a、n52t/n57y/q100a、n52v/n57l/q100a、n52h/n57y/q100k、n52k/n57y/q100r、n52l/n57h/q100r、n52r/n57f/q100n、n52r/n57f/q100p、n52r/n57f/q100r、n52r/n57f/q100t、n52r/n57h/q100k、n52r/n57l/q100s、n52r/n57w/q100k、n52r/n57w、n52r/n57y/q100r、n52c/n57e/q100s、n52g/n57p/q100d、n52g/n57v/q100g、n52g/n57v、n52l/n57v、n52p/n57p、n52p/n57s/q100g、n52s/n57l/q100g、n52t/n57k/q100p、n52v/n57t/q100l或n57q/q100p。

39.根据实施方案37或实施方案38所述的变体icosl多肽，其中所述icosl参考多肽是哺乳动物icosl或其特异性结合片段。

40.根据实施方案37-39中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述icosl参考多肽是人icosl或其特异性结合片段。

41.根据实施方案37-40中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述icosl参考多肽包含(i)seqidno:32中所示的氨基酸序列；(ii)与seqidno:32具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(iii)包含igv结构域或igc结构域或其特异性结合片段或二者的(i)或(ii)的一部分。

42.根据实施方案37-41中任一项所述的变体icosl多肽，其中：

igv结构域或igc结构域的特异性结合片段的长度为至少50、60、70、80、90、100、110或更多个氨基酸；或

igv结构域的特异性结合片段包含的长度为如seqidno:5的氨基酸19-129所示的igv结构域的长度的至少80％和/或igc结构域的特异性结合片段包含的长度为如seqidno:5的氨基酸141-227所示的igc结构域的长度的至少80％。

43.根据实施方案37-42中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述变体icosl多肽包含igv结构域或其特异性片段和igc结构域或其特异性片段。

44.根据实施方案37-43中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述变体icosl多肽包含seqidno:638-685、905、908中任一个所示的氨基酸序列，或表现出与seqidno:638-685、905、908中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

45.根据实施方案37-43中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述变体icosl多肽由seqidno:638-685、905、908中任一个所示的氨基酸序列组成，或由表现出与seqidno:638-685、905、908中的任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成。

46.根据实施方案37-43中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述变体icosl多肽包含igv结构域或其特异性结合片段。

47.根据实施方案37-43和46中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述变体icosl多肽包含seqidno:686-781、907、910中任一个所示的氨基酸序列，或表现出与seqidno:686-781、907、910中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

48.根据实施方案37-43和46中任一项的变体icosl多肽，其中所述变体icosl多肽由seqidno:686-781、907、910中任一个所示的氨基酸序列组成，或由表现出与seqidno:686-781、907、910中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成。

49.根据实施方案37-43和46-48中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述igv结构域或其特异性结合片段是所述变体icosl多肽的仅icosl部分。

50.根据实施方案37-42中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述igc结构域或其特异性结合片段是所述变体icosl多肽的仅icosl部分。

51.根据实施方案37-50中任一项所述的变体icosl多肽，其中与所述icosl参考多肽对icos或cd28的胞外域的结合相比，所述变体icosl多肽表现出改变的与相同的胞外域的结合。

52.根据实施方案37-51中任一项所述的变体icosl多肽，其中与所述icosl参考多肽对icos或cd28的一个或多个胞外域的结合相比，所述变体icosl多肽表现出增加的与相同的一个或多个胞外域的结合。

53.根据实施方案1-52中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述结合增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。

54.根据实施方案1-53中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述icos是人icos。

55.根据实施方案1-54中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述cd28是人cd28。

56.根据实施方案1-55中任一项所述的变体icosl多肽，其中与所述参考icosl多肽对ctla-4的胞外域的结合相比，该变体icosl多肽表现出降低的与相同的胞外域的结合。

57.根据实施方案56所述的变体icosl多肽，其中结合减少超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。

58.根据实施方案1-57中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述ctla-4是人ctla-4。

59.根据实施方案1-58中任一项所述的变体icosl多肽，其中改变的(增加的或减少的)结合是改变的(增加的或减少的)结合亲和力。

60.根据实施方案1-59中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述变体icosl多肽包含最多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，任选地为氨基酸取代、插入和/或缺失。

61.根据实施方案1-60中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述变体icosl多肽表现出与icosl参考多肽至少或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

62.根据实施方案1-61中任一项所述的变体icosl多肽，其是可溶性蛋白。

63.根据实施方案1-62中任一项所述的变体icosl多肽，其中：

变体icosl多肽缺少跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；和/或

当从细胞表达时，变体icosl多肽不在所述细胞的表面上表达。

64.根据实施方案1-61中任一项所述的变体icosl多肽，其中所述变体icosl多肽进一步包含跨膜结构域。

65.根据实施方案64所述的变体icosl多肽，其中所述跨膜结构域包含如seqidno:5的残基257-277所示的氨基酸序列或其功能变体，所述功能变体表现出与seqidno:5的残基257-277至少85％序列同一性。

66.根据实施方案64或实施方案65所述的变体icosl多肽，其还包含连接至跨膜结构域的细胞质信号传导结构域。

67.根据实施方案66所述的变体icosl多肽，其中所述胞质信号传导结构域包含如seqidno:5的残基278-302所示的氨基酸序列或其功能变体，该功能变体表现出与seqidno:5的残基278-302至少85％序列同一性。

68.根据实施方案1-67中任一项所述的变体icosl多肽，其与所述icosl参考序列相比被去糖基化或部分去糖基化。

69.一种免疫调节蛋白，其包含实施方案1-68中任一项所述的变体icosl多肽和半衰期延长部分。

70.根据实施方案69所述的免疫调节蛋白，其中所述半衰期延长部分包含多聚化结构域、白蛋白、白蛋白结合多肽、pro/ala/ser(pas)、人绒毛膜促性腺激素β亚基的c端肽(ctp)、聚乙二醇(peg)、长非结构化亲水氨基酸序列(xten)、羟乙基淀粉(hes)、结合白蛋白的小分子，或其组合。

71.根据实施方案69或实施方案70所述的免疫调节蛋白，其中所述半衰期延长部分是或包含pro/ala/ser(pas)，并且所述变体icosl多肽被pas基化。

72.根据实施方案71所述的免疫调节蛋白，其中所述半衰期延长部分包含seqidno:904中所示的序列。

73.根据实施方案69或实施方案70所述的免疫调节蛋白，其中所述半衰期延长部分是或包含多聚化结构域。

74.根据实施方案73所述的免疫调节蛋白，其中所述多聚化结构域选自免疫球蛋白的fc区、亮氨酸拉链、异亮氨酸拉链或锌指。

75.根据实施方案73或实施方案74所述的免疫调节蛋白，其中所述变体icosl多肽直接或经由接头间接连接至多聚化结构域。

76.根据实施方案73-75中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白是包含连接至第一多聚化结构域的第一变体icosl多肽和连接至第二多聚化结构域的第二变体icosl多肽的多聚体，其中所述第一和第二多聚化结构域相互作用以形成包含所述第一和第二变体icosl多肽的多聚体。

77.根据实施方案76所述的免疫调节蛋白，其中所述多聚体是二聚体。

78.根据实施方案76或实施方案77所述的免疫调节蛋白，其中所述第一变体icosl多肽和所述第二变体icosl多肽是相同的。

79.根据实施方案77或实施方案78所述的免疫调节蛋白，其中所述二聚体是同二聚体。

80.根据实施方案77所述的免疫调节蛋白，其中所述二聚体是异二聚体。

81.根据实施方案73-80中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述多聚化结构域是或包含免疫球蛋白的fc区。

82.根据实施方案81所述的免疫调节蛋白，其中该fc区是免疫球蛋白g1(igg1)或免疫球蛋白g2(igg2)蛋白的fc区。

83.根据实施方案81或实施方案82所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫球蛋白蛋白是人的和/或所述fc区是人的。

84.根据实施方案81-83中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述fc区包含seqidno:227中所示的氨基酸序列或表现出与seqidno:227至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的其变体。

85.根据实施方案81-84中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述fc区包含seqidno:226中所示的氨基酸序列或表现出与seqidno:226至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的其变体。

86.根据实施方案81-85中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述fc区表现出一种或多种效应子功能。

87.根据实施方案81-86中任一项所述的免疫调节蛋白，其中与野生型fc区相比，所述fc区展示一种或多种降低的效应子功能，任选地，其中野生型人fc是人igg1。

88.根据实施方案86或实施方案87所述的免疫调节蛋白，其中所述一种或多种效应子功能选自抗体依赖性细胞毒性(adcc)、补体依赖性细胞毒性、程序性细胞死亡和细胞吞噬作用。

89.根据实施方案87或实施方案88所述的免疫调节蛋白，其中与野生型fc区相比，所述fc区是包含一个或多个氨基酸取代的变体fc区。

90.根据实施方案89所述的免疫调节蛋白，其中所述变体fc区的一个或多个氨基酸取代选自n297g、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k或l234a/l235e/g237a，其中所述残基是根据kabat的eu索引编号的。

91.根据实施方案90所述的免疫调节蛋白，其中所述变体fc区还包含氨基酸取代c220s，其中所述残基是根据kabat的eu索引编号的。

92.根据实施方案87-91中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述fc区包含seqidno:476-478中任一个所示的氨基酸序列的序列或表现出与seqidno：476-478中的任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且包含所述氨基酸取代的氨基酸序列。

93.根据实施方案87-92中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述fc区包含k447del，其中所述残基是根据kabat的eu索引编号的。

94.根据实施方案87-92和93中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述fc区包含seqidno:632-634中任一个所示的氨基酸序列的序列或表现出与seqidno：632-634中的任一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且包含所述氨基酸取代的氨基酸序列。

95.一种免疫调节蛋白，其包含：

(a)变体icosl多肽，其在icosl参考多肽的免疫球蛋白超家族(igsf)结构域中包含一个或多个氨基酸修饰，其中与所述icosl参考多肽对icos或cd28的一个或多个胞外域的结合相比，所述变体icosl多肽表现出改变的与相同的一个或多个胞外域的结合；和

(b)变体fc区，其与野生型人igg1相比，包含选自n297g/k447del、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k/k447del或l234a/l235e/g237a/k447del的氨基酸取代，其中所述残基是根据kabat的eu索引编号的。

96.根据实施方案95所述的免疫调节蛋白，其为二聚体。

97.根据实施方案95或实施方案96所述的免疫调节蛋白，其中所述变体fc区进一步包含氨基酸取代c220s，其中所述残基是根据kabat的eu索引编号的。

98.根据实施方案95-97中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述fc区包含seqidno:632-634中任一个所示的氨基酸序列的序列或或表现出与seqidno：632-634中的任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且包含所述氨基酸取代的氨基酸序列。

99.根据实施方案95-98中任一项所述的免疫调节蛋白，其中变体icosl多肽直接或经由接头间接地与所述变体fc区连接。

100.根据实施方案75和实施方案99所述的免疫调节蛋白，其中所述接头包含1至10个氨基酸。

101.根据实施方案100所述的免疫调节蛋白，其中所述接头选自aaa、g4s(seqidno:636)、(g4s)2(seqidno:229)或gsggggs接头(seqidno:635)。

102.一种免疫调节蛋白，其包含与包含免疫球蛋白超家族(igsf)结构域的第二多肽连接的实施方案1-68中任一项所述的变体icosl多肽。

103.根据实施方案102所述的免疫调节蛋白，其中与未修饰的或野生型igsf结构域相比，所述igsf结构域被亲和力修饰并且表现出与未修饰的或野生型igsf结构域相比改变的与其一个或多个同源结合配偶体中的一个或多个的结合。

104.根据实施方案103所述的免疫调节多肽，其中与未修饰的或野生型igsf结构域相比，所述igsf结构域表现出增加的与其一个或多个同源结合配偶体中的一个或多个的结合。

105.根据实施方案102-104中任一项所述的免疫调节多肽，其中所述变体icosl多肽是第一icosl变体多肽，并且所述第二多肽的igsf结构域是来自实施方案1-68中任一项所述的第二变体icosl多肽的igsf结构域，其中所述第一和第二icosl变体相同或不同。

106.根据实施方案102-105中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述变体icosl多肽能够特异性结合cd28或icos，并且所述第二多肽的igsf结构域能够与除被所述icosl变体多肽特异性结合的结合配偶体以外的结合配偶体结合。

107.根据实施方案106所述的免疫调节多肽，其中所述igsf结构域来自b7家族的成员。

108.根据实施方案102-104和106中任一项所述的免疫调节多肽，其中所述igsf结构域是与肿瘤上表达的配体结合的肿瘤定位部分，或者是与炎性环境的细胞或组织上表达的配体结合的炎性定位部分。

109.根据实施方案108所述的免疫调节多肽，其中所述配体是b7h6。

110.根据实施方案108或实施方案109所述的免疫调节多肽，其中所述igsf结构域来自nkp30。

111.根据实施方案102-110中任一项所述的免疫调节多肽，其中所述igsf结构域是或包含igv结构域。

112.根据实施方案102-111中任一项所述的免疫调节多肽，其中变体icosl多肽是或包含igv结构域。

113.根据实施方案102-112中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述免疫调节蛋白包含连接至变体icosl多肽或包含igsf结构域的第二多肽中的一者或二者的多聚化结构域。

114.根据实施方案113所述的免疫调节蛋白，其中所述多聚化结构域是效应子功能降低的fc结构域或其变体。

115.根据实施方案102-114中任一项所述的免疫调节蛋白，其是二聚体。

116.根据实施方案115所述的免疫调节蛋白，其是同二聚体。

117.根据实施方案116所述的免疫调节蛋白，其是异二聚体。

118.一种缀合物，其包含实施方案1-68中任一项所述的变体icosl多肽或实施方案69-117中任一项所述的免疫调节蛋白以及异源部分。

119.根据实施方案118所述的缀合物，其中所述变体icosl多肽直接或经由接头间接地连接至所述异源部分。

120.根据实施方案118或实施方案119中任一项所述的缀合物，其中所述靶向部分是蛋白质、肽、核酸、小分子或纳米颗粒。

121.根据实施方案118-120中任一项所述的缀合物，其中所述靶向部分是蛋白质或肽。

122.根据实施方案121所述的缀合物，其中所述缀合物是融合蛋白。

123.一种融合蛋白，其包含实施方案1-68中任一项所述的变体icosl多肽或实施方案69-117中任一项所述的免疫调节蛋白和异源部分。

124.根据实施方案118-123中任一项所述的缀合物或融合蛋白，其中所述部分是与细胞表面上的分子特异性结合的靶向部分。

125.根据实施方案124所述的缀合物或融合蛋白，其中所述靶向部分特异性结合至免疫细胞表面上的分子。

126.根据实施方案125所述的缀合物或融合蛋白，其中所述免疫细胞是抗原呈递细胞或淋巴细胞。

127.根据实施方案124所述的缀合物或融合蛋白，其中所述靶向部分是与肿瘤表面上的分子结合的肿瘤定位部分。

128.根据实施方案124-127中任一项所述的缀合物或融合蛋白，其中所述靶向部分结合分子her1/egfr、her2/erbb2、cd20、cd25(il-2rα受体)、cd33、cd52、cd133、cd206、cea、ceacam1、ceacam3、ceacam5、ceacam6、癌抗原125(ca125)、甲胎蛋白(afp)、lewisy、tag72、癸酸甘油酯-1、间皮素、pdgf受体(pdgfr；诸如pdgf-rα)、pd-1、pd-l1、ctla-4、il-2受体、血管内皮生长因子(vegf)、cd30、epcam、epha2、磷脂酰肌醇聚糖-3、gpa33、黏蛋白类、caix、psma、叶酸结合蛋白、神经节甘脂类(诸如gd2、gd3、gm1和gm2)、vegf受体(vegfr)、vegfr2、vegf-a、整合素αvβ3、整合素α5β1、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap、腱生蛋白、afp、bcr复合物、cd3、cd18、cd44、ctla-4、gp72、hla-dr10β、hla-dr抗原、ige、muc-1、nuc242、pem抗原、金属蛋白酶类、肝配蛋白受体、肝配蛋白配体、hgf受体、cxcr4、cxcr4、铃蟾肽受体、sk-1抗原、bcr-abl、ret、met、trkb、tie2、alk、ros、eml4-alk、ros1、brafv600e、src、c-kit、mtor、tsc1、tsc2、btk、kit、brca、cdk4/6、jak1、jak2、braf、flt-3、mek1、mek2、smo或b7-h6(ncr3lg1)。

129.根据实施方案124-128中任一项所述的缀合物或融合蛋白，其中所述靶向部分结合pd-l1。

130.根据实施方案124-129中任一项所述的缀合物或融合蛋白，其中所述靶向部分是抗体或抗原结合片段。

131.根据实施方案130所述的缀合物或融合蛋白，其中所述抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、扎鲁单抗、尼莫妥珠单抗、曲妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗emtansine、托西妥单抗利妥昔单抗(rituxan、mabthera)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan，zevalin)、达利珠单抗(zenapax)、吉姆单抗(mylotarg)、阿仑单抗、cea-scanfab片段、oc125单克隆抗体、ab75705、b72.3、贝伐单抗阿法替尼、阿昔替尼、博舒替尼、卡波替尼、西立替尼、克唑替尼、达布拉非尼、达沙替尼、dinutuximab、厄洛替尼、依维莫司、依鲁替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、尼洛替尼、奥拉帕尼、奥拉雷他单抗、帕博西利布、帕唑帕尼、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、瑞戈非尼、鲁索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、替西罗莫司、曲美替尼、凡德他尼、维莫非尼、vismodegib、巴利昔单抗、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、mpdl3280a、pidilizumab(ct-011)、amp-224、msb001078c或medi4736、bms-935559、ly3300054、阿特珠单抗、avelumab或度伐单抗，或者其抗原结合片段。

132.根据实施方案130或实施方案131所述的缀合物或融合蛋白，其中所述变体icosl多肽直接或经由接头间接地连接至所述抗体或抗原结合片段的重链和/或轻链的n末端。

133.根据实施方案130或实施方案131所述的缀合物或融合蛋白，其中所述变体icosl多肽直接或经由接头间接地连接至所述抗体或抗原结合片段的重链和/或轻链的c末端。

134.根据实施方案118-133中任一项所述的缀合物或融合蛋白，其中所述缀合物是二价、四价、六价或八价的。

135.根据实施方案118-123中任一项所述的缀合物或融合蛋白，其中所述异源部分是或包含用于检测或纯化所述变体icosl多肽的标记。

136.一种单价融合蛋白，其包含：

(a)变体icosl多肽，其在icosl参考多肽的免疫球蛋白超家族(igsf)结构域中包含一个或多个氨基酸修饰，其中与所述icosl参考多肽对icos或cd28的一个或多个胞外域的结合相比，所述变体icosl多肽表现出改变的与相同的一个或多个胞外域的结合；和

(b)用于检测或纯化所述变体icosl多肽的标记。

137.根据实施方案135或实施方案136所述的缀合物或融合蛋白，其中所述用于检测或纯化的标记选自聚组氨酸(his)标签、flag标签、myc标签或荧光蛋白标签。

138.根据实施方案95-101中任一项所述的免疫调节蛋白或实施方案136或实施方案137中的融合蛋白，其中所述变体icosl多肽在与选自以下的一个或多个位置对应的位置处包含一个或多个氨基酸修饰：参照seqidno:32的10、11、13、16、18、20、25、26、27、30、33、37、38、42、43、47、52、54、57、61、62、67、71、72、74、75、77、78、80、84、89、90、92、93、94、96、97、98、99、100、102、103、107、109、110、111、113、115、116、117、119、120、121、122、126、129、130、132、133、135、137、138、139、140、142、143、144、146、151、152、153、154、155、156、158、161、164、166、168、172、173、175、190、192、193、194、198、201、203、207、208、210、212、217、218、220、221、224、225或227。

138.根据实施方案138所述的免疫调节蛋白或融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自m10v、m10i、v11e、s13g、e16v、s18r、a20t、a20v、s25g、r26s、f27c、f27s、n30d、y33del、q37r、t38p、k42e、t43a、y47h、n52a、n52c、n52d、n52g、n52h、n52k、n52l、n52m、n52p、n52q、n52r、n52s、n52t、n52v、n52y、s54a、s54f、s54p、n57a、n57d、n57e、n57f、n57h、n57k、n57l、n57m、n57p、n57q、n57s、n57t、n57v、n57w、n57y、r61c、r61s、y62f、l67p、a71t、g72r、l74q、r75q、d77g、f78l、l80p、n84q、d89g、e90a、k92r、f93l、h94d、h94e、l96f、l96i、v97a、l98f、s99g、q100a、q100d、q100e、q100g、q100k、q100l、q100m、q100n、q100p、q100r、q100s、q100t、q100v、l102r、g103e、v107a、v107i、s109g、s109n、v110a、v110d、v110n、e111del、t113e、h115q、h115r、v116a、a117t、n119q、f120i、f120s、s121g、v122a、v122m、s126r,s126t、h129p、s130g、s132f、q133h、e135k、t137a、f138l、t139s、c140del、c140d、s142f、i143t、i143v、n144d、y146c、v151a、y152c、y152h、w153r、i154f、n155h、n155q、k156m、d158g、l161m、l161p、q164l、l166q、n168q、f172s、l173s、m175t、t190a、t190s、s192g、v193a、v193m、n194d、c198r、n201s、l203f、l203p、n207q、l208p、v210a、s212g、d217g、d217v、i218n、i218t、e220g、r221g、r221i、r221k、i224v、t225a、t225s、n227k或其保守氨基酸取代。

140.根据实施方案138或实施方案139所述的免疫调节蛋白或融合蛋白，其中所述icosl参考多肽包含(i)seqidno:32所示的氨基酸序列，(ii)与seqidno:32具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；(iii)包含igv结构域或igc结构域或其特异性结合片段或二者的(i)或(ii)的一部分、。

141.根据实施方案138-140中任一项所述的免疫调节蛋白或融合蛋白，其中所述icosl参考多肽包含seqidno:196、545、600-605和623-628中任一个所示的氨基酸序列。

142.根据实施方案138-141中任一项所述的免疫调节蛋白或融合蛋白，其中所述icosl参考多肽由seqidno:32、196、545、600-605和623-628中任一个所示的氨基酸序列组成。

143.一种或多种核酸分子，其编码实施方案1-68中任一项所述的变体icosl多肽、实施方案69-117和118-142中任一项所述的免疫调节蛋白或实施方案123-142中任一项所述的融合蛋白。

144.根据实施方案143所述的一个或多个核酸分子，其是合成核酸。

145.根据实施方案143或实施方案144所述的一个或多个核酸分子，其是cdna。

146.一种载体，其包含实施方案143-145中任一项所述的一个或多个核酸分子。

147.根据实施方式146所述的载体，其是表达载体。

148.根据实施方案146或实施方案147所述的载体，其中所述载体是哺乳动物表达载体或病毒载体。

149.一种细胞，其包含实施方案146-148中任一项所述的载体。

150.根据实施方案149所述的细胞，其是哺乳动物细胞。

151.根据实施方案149或实施方案150所述的细胞，其是中国仓鼠卵巢(cho)细胞或其衍生物。

152.一种产生包含变体icosl多肽的免疫调节蛋白的方法，其包括将实施方案143-154中任一项所述的核酸分子或实施方案146-148中任一项所述的载体引入宿主细胞中，所述引入在所述细胞中表达所述蛋白质的条件下进行。

153.根据实施方案152所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

154.根据实施方案153所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞或其衍生物。

155.根据实施方案152-154中任一项所述的方法，其进一步包括从所述细胞分离或纯化所述蛋白质。

156.根据通过实施方案152-155中任一项所述的方法产生的蛋白质。

157.一种组合物，其包含包含实施方案1-68中任一项所述的变体icosl多肽的蛋白质或实施方案69-117中任一项所述的免疫调节蛋白，其中所述组合物中蛋白质或免疫调节蛋白的单个序列中的至少95％、96％、97％、98％、99％具有相同的序列长度，任选地其中所述组合物是包含药学上可接受的载剂的药物组合物。

158.根据实施方案157所述的组合物，其中所述蛋白质或免疫调节蛋白是从中国仓鼠卵巢细胞或其衍生物中纯化的。

159.一种多核苷酸，其包含编码实施方案64-68中任一项所述的包含跨膜结构域的变体icosl多肽的核酸和编码重组抗原受体的一个或多个链的一个或多个核酸。

160.根据实施方案159所述的多核苷酸，其中所述重组抗原受体是嵌合抗原受体(car)或工程化t细胞受体(tcr)。

161.根据实施方案159或实施方案160所述的多核苷酸，其中所述编码变体icosl多肽的核酸和编码重组受体的一个或多个链的一个或多个核酸中的每一个被编码自切割肽或引起核糖体跳跃的肽的核酸分开。

162.根据实施方案161所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码变体icosl多肽的核酸、编码自切割肽或引起核糖体跳跃的肽的核酸和编码car的核酸。

163.根据实施方案161所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码变体icosl多肽的核酸、编码第一自切割肽或引起核糖体跳跃的肽的核酸、编码工程化tcrα链或工程化tcrβ链中的一个的核酸、编码第二自裂解肽或引起核糖体跳跃的肽的核酸以及编码工程化tcrα链或工程化tcrβ链中另一个的核酸。

164.根据实施方案163所述的多核苷酸，其中编码的第一和第二自切割肽是相同的。

165.根据实施方案160-163中任一项所述的多核苷酸，其中所述自切割肽或引起核糖体跳跃的肽是t2a、p2a、e2a或f2a。

166.一种载体，其包含实施方案159-165中任一项所述的多核苷酸。

167.根据实施方案166所述的载体，其中所述载体是病毒载体。

168.根据实施方案167所述的载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。

169.一种工程化细胞，其包含实施方案159-165中任一项所述的多核苷酸或实施方案166-168中任一项所述的载体。

170.一种工程化细胞，其包含实施方案1-68中任一项所述的变体icosl多肽、实施方案69-117中任一项所述的免疫调节蛋白或实施方案123-142中任一项所述的融合蛋白。

171.一种工程化细胞，其包含实施方案143-145中任一项所述的核酸分子或实施方案146-148中任一项所述的载体。

172.根据实施方案169-171中任一项所述的工程化细胞，其中所述编码变体icosl多肽、免疫调节蛋白或融合蛋白的核酸编码信号肽。

173.根据实施方案169-172中任一项所述的工程化细胞，其中所述变体icosl多肽、免疫调节蛋白或融合蛋白不包含跨膜结构域和/或不在细胞表面上表达。

174.根据实施方案169-173中任一项所述的工程化细胞，其中所述变体icosl多肽、免疫调节蛋白或融合蛋白是从所述工程化细胞分泌的。

175.根据实施方案169-171中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含实施方案64-68中任一项所述的包含跨膜结构域的变体icosl多肽。

176.根据实施方案169-171和175中任一项所述的工程化细胞，其中变体icosl多肽在细胞表面上表达。

177.根据实施方案169-176中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是免疫细胞。

178.根据实施方案177所述的工程化细胞，其中所述免疫细胞是抗原呈递细胞(apc)或淋巴细胞。

179.根据实施方案169-178中任一项所述的工程化细胞，其是原代细胞。

180.根据实施方案169-179中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

181.根据实施方案169-180中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是人细胞。

182.根据实施方案169-181中任一项所述的工程化细胞，其中所述淋巴细胞是t细胞。

183.根据实施方案178所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是apc，并且所述apc是人工apc。

184.根据实施方案169-183中任一项所述的工程化细胞，其还包含嵌合抗原受体(car)或工程化t细胞受体。

185.一种药物组合物，其包含实施方案1-68中任一项所述的变体icosl多肽、实施方案69-117中任一项所述的免疫调节蛋白、实施方案118-142中任一项所述的缀合物或融合蛋白、或实施方案169-184中任一项所述的工程化细胞、或实施方案216-227中任一项所述的感染原。

186.根据实施方案185所述的药物组合物，其包含药学上可接受的赋形剂。

187.根据实施方案185或186所述的药物组合物，其中所述药物组合物是无菌的。

188.一种制品，其在小瓶中包含实施方案185-187中任一项所述的药物组合物。

189.根据实施方案188所述的制品，其中所述小瓶是密封的。

190.一种试剂盒，其包含实施方案157-158和185-187中任一项所述的组合物，以及使用说明书。

191.一种试剂盒，其包含根据实施方案189和190所述的制品，以及使用说明书。

192.一种调节受试者中免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用实施方案157-158和185-187中任一项所述的药物组合物。

193.一种调节受试者中免疫应答的方法，其包括施用实施方案169-184中任一项所述的工程化细胞。

194.根据实施方案193所述的方法，其中所述工程化细胞对所述受试者是自体同源的。

195.根据实施方案193所述的方法，其中所述工程化细胞对所述受试者是同种异体的。

196.根据实施方案193-195中任一项所述的方法，其中调节免疫应答治疗受试者的疾病或病况。

197.根据实施方案193-196中任一项所述的方法，其中所述免疫应答增加。

198.根据实施方案192、196和197中任一项所述的方法，其中将包含与肿瘤定位部分连接的变体icosl多肽的免疫调节蛋白或缀合物施用于所述受试者。

199.根据实施方案198所述的方法，其中所述肿瘤定位部分是或包含识别肿瘤抗原的结合分子。

200.根据实施方案199所述的方法，其中所述结合分子包含抗体或其抗原结合片段或包含野生型igsf结构域或其变体。

201.根据实施方案192和196-200中任一项所述的方法，其中将实施方案102-117中任一项所述的免疫调节蛋白或实施方案118-142中任一项所述的缀合物或融合蛋白施用于所述受试者。

202.根据实施方案193-197中任一项所述的方法，其中将作为跨膜免疫调节蛋白的变体icosl多肽施用于所述受试者。

203.根据实施方案193-197和202中任一项所述的方法，其中将包含作为实施方案64-68中任一项所述的跨膜免疫调节蛋白的变体icosl多肽的工程化细胞施用于所述受试者。

204.根据实施方案192-203所述的方法，其中所述疾病或病况是肿瘤或癌症。

205.根据实施方案192-204中任一项所述的方法，其中所述疾病或病况选自黑素瘤、肺癌、膀胱癌、血液恶性肿瘤、肝癌、脑癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、脾癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌、肌肉骨骼癌、头颈癌、胃肠道癌、生殖细胞癌或内分泌和神经内分泌癌。

206.根据实施方案192-196中任一项所述的方法，其中所述免疫应答被降低。

207.根据实施方案192-196和206中任一项所述的方法，其中将可溶的变体icosl多肽或免疫调节蛋白施用于所述受试者。

208.根据实施方案207所述的方法，其中所述可溶性免疫调节蛋白是免疫调节fc融合蛋白。

209.根据实施方案192-196和206-208中任一项所述的方法，其中将实施方案1-63和68中任一项所述的变体icosl多肽、实施方案70-101中任一项所述的免疫调节蛋白或实施方案136和137所述的融合蛋白施用于所述受试者。

210.根据实施方案192-196和206-208中任一项所述的方法，其中将包含可分泌的变体icosl多肽的工程化细胞施用给受试者。

211.根据实施方案192-196、206-208和210中任一项所述的方法，其中将实施方案169-174和177-184中任一项所述的工程化细胞施用给所述受试者。

212.根据实施方案192-196、206-208和210中任一项所述的方法，其中将编码变体icosl多肽的感染原施用于所述受试者，所述变体icosl多肽为可分泌的免疫调节蛋白的，可选地在所述感染原感染肿瘤细胞或免疫细胞并且可分泌的免疫调节蛋白从感染的细胞分泌的条件下。

213.根据实施方案192-196和206-212中任一项所述的方法，其中所述疾病或病况是炎性或自身免疫性疾病或病况。

214.根据实施方案192-196和206-213中任一项所述的方法，其中所述疾病或病况是抗中性粒细胞胞浆抗体(anca)相关的血管炎、血管炎、自身免疫性皮肤病、移植、风湿性疾病、炎性胃肠道疾病、炎性眼病、炎性神经病、炎性肺部疾病、炎性内分泌疾病或自身免疫性血液病。

215.根据实施方案213或实施方案214所述的方法，其中所述疾病或病况选自炎性肠病、移植、克罗恩病、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、哮喘、类风湿性关节炎或牛皮癣。

216.一种感染原，其包含编码实施方案1-68中任一项所述的变体icosl多肽、或实施方案69-117中任一项所述的免疫调节蛋白、或实施方案123-142中任一项所述的融合蛋白的核酸分子。

217.根据实施方案216所述的感染原，其中所述编码的变体icosl多肽、免疫调节蛋白或融合蛋白不包含跨膜结构域和/或不在表达它的细胞的表面上表达。

218.根据实施方案216或实施方案217所述的感染原，其中所述编码的变体icosl多肽、免疫调节蛋白或融合蛋白当被表达时，是从所述感染原分泌的。

219.根据实施方案218所述的感染原，其中所述编码的变体icosl多肽包含跨膜结构域。

220.根据实施方案216、实施方案217或实施方案219所述的感染原，其中所述编码的变体icosl多肽在表达它的细胞的表面上表达。

221.根据实施方案216-220中任一项所述的感染原，其中所述感染原是细菌或病毒。

222.根据实施方案221所述的感染原，其中所述病毒是溶瘤病毒。

223.根据实施方案222所述的感染原，其中溶瘤病毒是腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、水泡性口炎病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、细小病毒、麻疹病毒、水泡性口炎病毒(vsv)、柯萨奇病毒或牛痘病毒。

224.根据实施方胺222所述的感染原，其中所述病毒特异性地靶向树突细胞(dc)和/或是树突细胞嗜性的。

225.根据实施方案224所述的感染原，其中所述病毒是用修饰的辛德毕斯病毒包膜产物假型化的慢病毒载体。

226.根据实施方案216-225中任一项所述的感染原，其还包含编码另外的基因产物的核酸分子，所述另外的基因产物导致靶细胞死亡或可以增强或加强免疫应答。

227.根据实施方案226所述的感染原，其中所述另外的基因产物选自抗癌剂、抗转移剂、抗血管生成剂、免疫调节分子、免疫检查点抑制剂、抗体、细胞因子、生长因子、抗原、细胞毒性基因产物、促凋亡基因产物、抗凋亡基因产物、细胞基质降解基因、用于组织再生的基因或将人类体细胞重编程为多能性的基因。

ix.实施例

包括以下实施例仅用于说明目的，并不意图限制本发明的范围。

实施例1

实施例1生成igsf结构域的突变dna构建体

实施例1描述了人icosligsf结构域的突变dna构建体的生成，以用于在酵母表面上翻译和表达为酵母展示文库。

a.简并文库

产生编码icosl的ecd结构域的变体的突变dna构建体。基于含有ecd结构域的seqidno:32中所示的野生型人icosl序列生成构建体，seqidno:32如下：

dtqekevramvgsdvelscacpegsrfdlndvyvywqtsesktvvtyhipqnsslenvdsryrnralmspagmlrgdfslrlfnvtpqdeqkfhclvlsqslgfqevlsvevtlhvaanfsvpvvsaphspsqdeltftctsingyprpnvywinktdnslldqalqndtvflnmrglydvvsvlriartpsvnigccienvllqqnltvgsqtgndigerdkitenpvstgeknaat

对于靶向对采用简并密码子的完全或部分随机化特异性的残基的文库，编码seqidno:32的dna作为一组长度多达80碱基对(bp)的重叠寡核苷酸购自integrateddnatechnologies(coralville，ia)。为了生成ecd的多种变体的文库，寡核苷酸在所需的氨基酸位置含有所需的简并密码子，诸如编码多种氨基酸取代的特定混合碱基组。使用url:rosettadesign.med.unc.edu/swiftlib/处的算法生成简并密码子。

通常，从感兴趣的靶标-配体对的同源模型(icosl)中选择突变和简并密码子的位置，以鉴定配体接触残基(诸如与配体相互作用的靶标侧链残基)以及位于蛋白质相互作用界面的残基。使用url:spdbv.vital-it.ch)处可获得的结构查看器进行该分析。

文库设计的下一步是人、小鼠、大鼠和猴icosl序列的比对以鉴定保守残基。基于该分析，保守的靶残基与简并密码子一起突变，该简并密码子仅指定保守氨基酸变化以及野生型残基。未保存的残基更积极地突变，但也包括野生型残基。也编码野生型残基的简并密码子展开以避免靶蛋白的过度诱变。出于同样的原因，一次只有多达20个位置被靶向进行诱变。这些残基是接触残基和非接触界面残基的组合。

将寡核苷酸溶解在无菌水中，以等摩尔比混合，加热至95℃持续5分钟并缓慢冷却至室温进行退火。然后使用分别退火至ecd的起始和结束的ecd特异性寡核苷酸引物生成pcr产物。与修饰形式的pbyds03克隆载体(越过并包含bamh1和kpn1克隆位点)(lifetechnologies，美国)重叠40-50bp的ecd特异性寡核苷酸随后用于扩增来自先前步骤的100ng的pcr产物，以生成总计5μg的dna。两种pcr均使用onetaq2xpcr主混合物(newenglandbiolabs，美国)通过聚合酶链反应(pcr)进行。使用pcr纯化试剂盒(qiagen，德国)纯化第二pcr产物，并重悬于无菌去离子水中。

为了准备文库插入，用bamhi和kpni限制酶(newenglandbiolabs，美国)消化载体pbyds03的修饰的酵母展示形式，并且将大载体片段进行凝胶纯化并溶解在无菌去离子水中。对于每次电穿孔通过将12μg文库dna与4μg线性化载体在总体积50μl的去离子的和无菌水中混合，生成用于下一步骤的电穿孔就绪dna。生成靶向文库的另一种方法是用含有简并密码子的寡核苷酸进行靶ecd的定点诱变(multisite试剂盒，agilent，美国)。该方法用于生成仅靶向靶蛋白的特定序列段以进行诱变的子文库。在这些情况下，在继续选择步骤之前混合子文库。通常，文库大小在10e7至10e8克隆的范围内，而子文库仅在10e4至10e5的范围内。针对icosl生成大型文库和子文库。

b.随机文库

还构建了随机文库以鉴定含有ecd结构域的seqidno:32中所示的icosl的ecd的变体。将编码野生型ecd的dna克隆在修饰的酵母展示载体pbyds03的bamhi与kpni限制性位点之间。然后用genemorphii试剂盒(agilent，美国)诱变dna，以生成每个文库变体平均三至五个氨基酸变化。然后通过两步pcr扩增诱变的dna，并如上文针对靶向文库所述进行进一步加工。

实施例2

将dna文库引入酵母中

实施例2描述了将icosldna文库引入酵母中。

为了将简并和随机文库dna引入酵母中，制备酵母菌株bj5464(atcc.org；atcc号208288)的电穿孔感受态细胞，并在genepulserii(biorad，美国)上用来自基本上如上所述的步骤的电穿孔就绪dna进行电穿孔(colby,d.w.等人2004methodsenzymology388,348-358)。唯一不同的是转化的细胞在非诱导的最小选择性scd-leu培养基中生长，以适应由修饰的质粒pbyds03携带的leu2选择性标志物。1l的scd-leu培养基由14.7克柠檬酸钠、4.29克一水合柠檬酸、20克右旋糖、6.7克酵母基础氮源和1.6克不含亮氨酸的酵母合成液体培养基补充剂组成。在使用前使用0.22μm真空过滤器装置过滤灭菌培养基。

通过在scd-leu琼脂板上接种新鲜回收的细胞的连续稀释液，然后由接种(每个培养板生成至少50个菌落)的单菌落数量外推文库大小来确定文库大小。一般地，文库大小的范围为基于该稀释测定的10e8至10e9个转化子。在scd-leu中将剩余的电穿孔培养物培养至饱和，将来自该培养物的细胞再次传代培养(例如1/100)至新鲜的scd-leu中，以使未转化细胞的比例最小化。为了保持文库多样性，使用接种物进行该传代培养步骤，该接种物含有比计算的文库大小多至少10倍的细胞。将来自第二饱和培养物的细胞重悬于含有无菌25％(重量/体积)甘油的新鲜培养基中至密度为10e10/ml，并在-80℃下冷冻储存(冷冻文库原液)。

通过在scd-leu琼脂板上接种新鲜回收的细胞的稀释液，然后由接种(每个培养板生成至少50个菌落)的单菌落数量外推文库大小来确定文库大小。

为了从含有两个或更多个不同文库克隆的细胞中分离质粒，从过夜scd-leu培养物中取出相当于10倍文库大小的若干细胞，并1/100传代培养至新鲜的scd-leu培养基中并生长过夜。将来自该过夜培养物的细胞重悬浮于无菌25％(重量/体积)甘油中至密度为10e10/ml，并在-80℃下冷冻储存(冷冻文库原液)。

实施例3

酵母选择

实施例3描述了表达亲和力修饰的icosl变体的酵母的选择。

将等于至少10倍文库大小的若干细胞从单个文库原液中解冻，悬浮于非诱导scd-leu培养基中至0.1×10e6细胞/ml，并生长过夜。第二天，将等于10倍文库大小的若干细胞以2000rpm离心2分钟，并重悬于诱导scdg-leu培养基中至0.5×10e6细胞/ml。1升scdg-leu诱导培养基由5.4克na2hpo4、8.56克nah2po4·h20、20克半乳糖、2.0克葡萄糖、6.7克difco酵母氮源和1.6克不含亮氨酸的酵母合成缺失培养基补充剂组成，在溶解于水中并通过0.22μm膜过滤装置灭菌。培养物在20℃下生长两天，以诱导酵母细胞表面上的文库蛋白质的表达。

用磁珠处理细胞以减少非结合物并针对具有与其外源重组反结构蛋白结合的能力的所有icosl变体进行富集。然后使用外源反结构蛋白染色进行两至三轮流式细胞术分选，以富集显示改善的结合物的酵母细胞部分。通过流式细胞术的磁珠富集和选择基本上如miller,k.d.currentprotocols在cytometry4.7.1-4.7.30,2008年7月中所述。

对于icosl文库，靶配体蛋白来源于r&dsystems(美国)，如下：人rcd28.fc(即重组cd28-fc融合蛋白)、rctla4.fc和ricos.fc。磁性链霉亲和素珠粒获自美国的新英格兰生物实验室。对于反结构蛋白的生物素化，使用生物素化试剂盒(目录号21955，lifetechnologies，美国)。对于双色流式细胞分选，使用bectondickinsonfacsariaii分选仪。用alexafluor488(lifetechnologies，美国)标记的抗血凝素抗体监测icosl展示水平。用pe缀合的人ig特异性山羊fab(jacksonimmunoresearch，美国)检测配体结合fc融合蛋白rcd28.fc、rctla4.fc或ricos.fc。使用前向散射(fsc)/侧向散射(ssc)参数屏蔽双重酵母，并且分选门基于在fl4中检测到的更高配体结合，其在fl1中具有更有限的标签表达结合。

测定来自流式细胞术分类的酵母输出的更高特异性结合亲和力。对分选的输出酵母进行扩增并重新诱导以表达它们编码的特定igsf亲和力修饰的结构域变体。然后可以通过流式细胞术将该群体与亲本、野生型酵母菌株或任何其他选择的输出(如珠粒输出酵母群)进行比较。

对于icosl，针对各个ricos.fc、rcd28.fc和rctla4.fc的结合通过对具有抗ha(血凝素)标签表达和抗人fc二级的每个群体进行双重染色来将第二类输出(f2)与亲本icosl酵母进行比较，以检测配体结合。

在选择icosl酵母变体用于与icos结合的情况下，当用5.6nmricos.fc染色时，f2分类输出给出平均荧光强度(mfi)值997，而当用相同浓度的ricos.fc染色时，测得亲本icosl菌株mfi为397。这表示该f2选择的克隆库中平均结合的大约三倍的改善，并且预测来自该库的单个克隆将在单独测试时具有更好的改善的mfi/亲和力。

在选择icosl酵母变体用于与cd28结合的情况下，当用100nmrcd28.fc染色时，f2分类输出给出mfi值640，而当用相同浓度的rcd28.fc染色时，测得亲本icosl菌株mfi为29(改善22倍)。在选择icosl酵母变体用于与ctla4结合的情况下，当用100nmrctla4.fc染色时，f2分类输出给出mfi值949，而当用相同浓度的rctla4.fc染色时，测得亲本icosl菌株mfi为29(改善32倍)。

重要的是，当用fl1上的抗ha标签抗体测量时，上述所有f2输出的mfi没有增加，并且有时与野生型菌株相比下降，这表明增加的结合不是增加所选变体在酵母表面上的表达以及仅选择具有高配体结合的中低表达子的经验证的门控策略的函数。

将选择的变体icoslecd结构域进一步格式化为融合蛋白，并如下所述测试结合和功能活性。

实施例4

重新格式化作为fc融合物和各种免疫调节蛋白类型的选择输出

实施例4描述了选择实施例3中鉴定的输出作为免疫调节蛋白的重新格式化，该免疫调节蛋白含有与fc分子融合的icosl的亲和力修饰的(变体)细胞外结构域(ecd)(变体ecd-fc融合分子)。

来自最终流式细胞术icosl种类的输出细胞在scd-leu培养基中生长至终末密度。使用酵母质粒dna分离试剂盒(zymoresearch，美国)分离来自每个输出的质粒dna。对于fc融合物，使用具有适合于克隆至所选fc融合载体中的添加的限制位点的pcr引物，由质粒dna制剂(即用于突变体靶ecd的编码dna的制剂)中批量扩增。在限制性消化后，将pcr产物连接至合适的fc融合载体中，然后按供应商的指示化学转化至菌株大肠杆菌xl1(agilent，美国)或neb5α(新英格兰生物实验室，美国)中。fc融合载体的示例是pfuse-higg1-fc2(invivogen，美国)。

将转化反应的稀释液接种在含有100μg/ml羧苄青霉素(teknova，美国)的lb琼脂上以生成单菌落。然后使来自每次转化的多达96个菌落在96孔板中生长至饱和，在37℃下lb肉汤(teknova目录号l8112)中过夜，并且将来自每个孔的小等分试样提交用于ecd插入片段的dna测序，以便识别所有克隆中的一个或多个突变。使用由服务提供者(genewiz；southplainfield，新泽西)提供的方案进行用于dna测序的样品制备。在移取用于dna测序的样品后，然后将甘油加入剩余的培养物中，使最终甘油含量为25％，并将培养板在-20℃下储存以备将来用作主培养板(见下文)。或者，通过使用一次性96孔复制器(vwr，美国)从生长的液体培养物影印培养至固体琼脂培养板上来生成用于dna测序的样品。将这些培养板孵育过夜以生成生长斑，并将培养板提交给genewiz遵循他们的说明书进行dna测序。在一些情况下，进行重测序以验证突变。

分析genewiz生成的dna测序数据后，从主培养板回收感兴趣的克隆，并在含有100μg/ml羧苄青霉素(teknova，美国)的5ml液体lb肉汤中单独生长至饱和，随后使用2ml的各培养物利用标准试剂盒如pureyield试剂盒(promega，美国)制备每种克隆的约10μg小量制备质粒dna。感兴趣的克隆的鉴定通常涉及以下步骤。首先，从genewiz网站下载dna序列数据文件。然后手动组织管理所有序列，使它们从ecd编码区的起点开始。然后使用url:www.ebi.ac.uk/tools/st/emboss_transeq/处可获得的合适程序批量翻译组织管理的序列。然后使用url:multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html处可获得的合适程序比对翻译的序列。或者，处理genewiz序列以使用ugene软件(http://ugene.net)生成比对。

然后使用以下标准鉴定感兴趣的克隆：1.)相同的克隆在比对中发生至少两次，和2.)突变在比对中发生至少两次，并且优选在不同的克隆中发生。满足这些标准中的至少一个的克隆是最可能由于改善的结合而通过分选过程富集的克隆。

为了生成重组免疫调节蛋白(即含有具有至少一个亲和力修饰的结构域的icosl的ecd的fc融合蛋白)，生成编码核酸分子以编码如下设计的蛋白质：信号肽，接着是变体(突变体)icoslecd，接着是三个丙氨酸的接头(aaa)，接着是含有关于seqidno:226所示的野生型人igg1fc的突变n82g(对应于根据eu编号的n297g)的人igg1fc。各自关于seqidno:226所示的野生型人igg1fc，该示例性fc还含有稳定性半胱氨酸突变r77c和v87c，并在通过eu编号的位置220(c220s)(对应于参考seqidno:226中所示的野生型人igg1fc的位置5(c5s))处半胱氨酸残基取代为丝氨酸残基(分别对应于根据eu编号的r292c、v302c和c220s)。在一些情况下，缺失促成aaa接头序列的noti克隆位点以生成icoslecd和fc的起点的直接融合物。由于构建体不包括可与半胱氨酸形成共价键的任何抗体轻链，因此与seqidno:226所示的野生型或未修饰的fc相比，人igg1fc还含有在位置5半胱氨酸残基替代为丝氨酸残基(c5s)。

实施例5

fc融合物的表达和纯化

实施例5描述了如以上实施例所描述的含有变体ecdicosl的fc-融合蛋白的高通量表达和纯化。

用expi293表达系统(invitrogen，美国)从悬浮液适应的人胚肾(hek)293细胞产生重组变体fc融合蛋白。将来自前一步骤的4μg每种质粒dna加入200μlopti-mem(invitrogen，美国)中，同时将10.8μlexpifectamine分别加入另外的200μlopti-mem中。5分钟后，将200μl质粒dna与200μlexpanfectamine混合，并进一步孵育另外20分钟，然后将该混合物加入细胞中。将一千万个expi293细胞分配至体积为3.4mlexpi293培养基(invitrogen，美国)中的无菌10ml的深锥形底24孔生长板(thomsoninstrument公司，美国)的不同孔中。将培养板在120rpm下在设定为95％湿度和8％co2的哺乳动物细胞培养箱中摇动5天。孵育5天后，使细胞沉淀并保留培养物上清液。

使用高通量96孔蛋白a纯化试剂盒，利用制造商的方案(目录号45202，lifetechnologies，美国)从上清液中纯化蛋白质。使用zeba96孔旋转脱盐板(目录号89807，lifetechnologies，美国)利用制造商的方案将得到的洗脱级分缓冲液交换至pbs中。使用nanodrop仪器(thermofisherscientific，美国)测量的280nm吸光度定量纯化的蛋白质，并通过在变性和还原条件下在nupage预制聚丙烯酰胺凝胶(lifetechnologies，美国)上加载5μg蛋白质以及随后的凝胶电泳来评估蛋白质纯度。使用标准考马斯染色在凝胶中将蛋白质可视化。

实施例6

评估含亲和力成熟的igsf结构域的分子的结合和活性

a.与细胞表达的反结构结合

该实施例描述了来自以上实施例的纯化蛋白的fc融合物结合研究，以评价icosl结构域变体免疫调节蛋白对同源结合配偶体的特异性和亲和力。

为了产生表达同源结合配偶体的细胞，在pcdna3.1表达载体(lifetechnologies)中设计了人cd28和icos各自的全长哺乳动物表面表达构建体，并且该全长哺乳动物表面表达构建体来源于美国genscript。使用上述瞬时转染系统(lifetechnologies，美国)生成以表达全长哺乳动物表面配体的经转染的hek293细胞上进行结合研究。作为对照，还评价了与模拟(未转染的)细胞的结合。确定实验所需的细胞数，并使用制造商建议的方案进行适当的30ml规模的转染。对于cd28、icos或模拟物各30ml转染，将7500万个expi293f细胞与30μg表达构建体dna和1.5ml稀释的expifectamine293试剂一起孵育48小时，此时收获细胞用于染色。

为了通过流式细胞术染色，将适当瞬时转染或阴性对照(模拟)的200,000个细胞铺板在96孔圆底板中。将细胞离心并重悬于染色缓冲液(pbs(磷酸盐缓冲盐水)、1％bsa(牛血清白蛋白)和0.1％叠氮化钠)中20分钟以阻断非特异性结合。然后，根据50μl中每种候选cd80变体fc、icosl变体fc或堆叠的igsf变体fc融合蛋白的实验，将细胞再次离心并重悬于含有100nm至1nm变体免疫调节蛋白的染色缓冲液中。在冰上进行初级染色45分钟，然后在染色缓冲液中洗涤细胞两次。将pe缀合的抗人fc(jacksonimmunoresearch，美国)在50μl染色缓冲液中1:150稀释，并加入细胞中并在冰上再孵育30分钟。将二级抗体洗涤两次，将细胞固定在4％甲醛/pbs中，并在facscan流式细胞仪(bectondickinson，美国)或hypercyt流式细胞仪(intellicyte，美国)上分析样品。

使用cellquestpro软件(bectondickinson，美国)或hypercyt流式细胞仪(intellicyte，美国)计算每种转染子和阴性亲本系的平均荧光强度(mfi)。

b.生物活性表征

该实施例还描述了人原代t细胞体外测定中的fc融合变体蛋白生物活性表征。

1.混合淋巴细胞反应(mlr)

在人混合淋巴细胞反应(mlr)中测试可溶性ricosl.fc生物活性。通过将从pbmc(bentechbio，美国)分离的单核细胞用在离体15培养基(lonza，瑞士)中的500u/mlril-4(r&dsystems，美国)和250u/mlrgm-csf(r&dsystems，美国)在体外培养7天来生成人原代树突细胞(dc)。将10,000个成熟的dc和100,000个纯化的同种异体cd4+t细胞(bentechbio，美国)与icosl变体fc融合蛋白和对照在96孔圆底板中在200μl终体积的离体15培养基中共培养。在第5天，使用人ifn-γduosetelisa试剂盒(r&dsystems，美国)分析培养物上清液中的ifn-γ分泌。通过vmaxelisa酶标仪(moleculardevices，美国)测量光密度，并针对包含在ifn-γ双组装试剂盒(r&dsystems，美国)中的滴定的rifn-γ标准物进行定量。第二mlr方案由如下步骤组成：通过将从pbmc(bentechbio，美国)分离的单核细胞用在ex-vivo15培养基(lonza，瑞士)中的50ng/mlril-4(r&dsystems，美国)和80ng/mlrgm-csf(r&dsystems，美国)在体外培养7天来生成人原代树突细胞(dc)。在第3天和第5天，去除一半培养基并用含有50ng/mlril-4和80ng/mlrgm-csf的新鲜培养基替代。为了完全诱导dc成熟，在第6天将脂多糖(lps)(invivogencorp.，美国)以100ng/ml加入dc培养物中，并将细胞再孵育24小时。将约10,000个成熟的dc和100,000个纯化的同种异体cd3+t细胞(bentechbio，美国)与icosl变体fc融合蛋白和对照在96孔圆底板中在200μl终体积的ex-vivo15培养基中共培养。在第4天至第5天，使用人ifn-γduosetelisa试剂盒(r&dsystems，美国)分析培养物上清液中的ifn-γ分泌。在biotekcytation多模式微板阅读器(biotekcorp.，美国)上测量光密度，并针对包含在ifn-γ双组装试剂盒(r&dsystems，美国)中的滴定的rifn-γ标准物进行定量。

2.抗cd3共固定化测定

在抗cd3共固定化测定中测定icosl融合变体的共刺激生物活性。将1nm或10nm小鼠抗人cd3(okt3，biolegends，美国)在含有1nm至80nmricosl.fc变体蛋白的pbs中稀释。将该混合物加入组织培养物处理的平底96孔板(科宁，美国)中过夜，以促进刺激蛋白附着至培养板的孔。第二天，将未结合的蛋白质从培养板上洗掉，并将100,000个纯化的人pant细胞(bentechbio，美国)或人t细胞克隆bc3(astartebiologics，美国)加入每个孔中至最终体积为200μl的ex-vivo15培养基(lonza，瑞士)。在一些情况下，用0.25um羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse，thermofisherscientific，美国)标记人全t细胞。将细胞培养3天，然后收获培养物上清液，并如上所提及用duosetelisa试剂盒(r&dsystems，美国)测量人ifn-γ水平。细胞增殖由进入分裂的输入细胞的百分比来确定，如在用荧光缀合的抗cd4、抗cd8抗体(bd，美国)染色的细胞上的cfse稀释或通过总t细胞经由lsrii(bd，美国)上的流式细胞术分析测得。

c.结果

针对示例性测试变体的结合和活性研究的结果示于表7，其显示在针对相应同源结构icos和cd28的亲和力成熟的筛选中选择的icosl的ecd中的示例性igsf结构域氨基酸取代(替代)。在上述表中，示例性氨基酸取代由对应于相应参考(例如未修饰的)ecd序列的氨基酸位置编号指定，如下所示。例如，表7中的参考(例如未修饰的)ecd序列(wticosl)是seqidno:32所示的(例如未修饰的)icoslecd序列。氨基酸位置在中间表示，在编号之前列出相应的参考(例如未修饰的或野生型)氨基酸，并且在编号后列出所鉴定的变体氨基酸取代。第2列示出了每种变体ecd-fc融合分子的变体ecd的seqidno标识符。

还显示了通过平均荧光强度(mfi)值测量的对于每个变体fc-融合分子与转染以表达同源配体的细胞的结合的结合活性，以及与不含一个或多个氨基酸取代的相应参考(例如未修饰的)ecd-fc融合分子与相同细胞表达的反结构配体的结合相比mfi的比率。还基于i)采用与抗cd-3共固定化的所示变体ecd-fc融合分子或ii)采用mlr测定中所示的变体ecd-fc融合分子生成的培养物上清液中ifn-γ的计算水平(pg/ml)示出了变体fc融合分子调节t细胞活性的功能活性。所述表还描绘了在两种功能测定中每种变体ecd-fc产生的ifn-γ与相应的参考(例如未修饰的或野生型)ecd-fc的比率。

如图所示，该选择导致鉴定了许多icosligsf结构域变体，该icosligsf结构域变体经亲和力修饰以显示出对至少一种，并且在一些情况下多于一种同源反结构配体的增加的结合。此外，结果显示变体分子的亲和力修饰也显示出对于增加和/或降低(根据分子的形式)免疫活性的改善的活性。例如，与不含一个或多个氨基酸替代物的参考(例如未修饰的或野生型)ecd-fc分子相比，配体的共固定化可能提供与细胞的多价相互作用以聚集或增加亲合力以有利于激动剂活性以及增加t细胞活化。然而，当分子作为溶液中的二价fc分子提供时，与不含一个或多个氨基酸替代物的参考(例如未修饰的或野生型)ecd-fv分子相比，相同的igsf结构域变体显示出降低t细胞活化的拮抗剂活性。

*：使用346pg/mlifn-γ计算的对于wticosl的亲本比率

基本上如上所述重复结合测定，不同之处在于还针对表达全长人ctla4的细胞评估结合。还基本上如上所述在抗cd3共固定化测定中进一步评估icosl变体fc融合蛋白。结果证实了许多icosligsf结构域变体的鉴定，所述icosligsf结构域变体对至少一种，在一些情况下多于一种的同源配体显示出增加的结合亲和力。此外，结果显示变体分子的亲和力修饰在共固定化测定中也显示出改善的活性。

实施例7

另外的亲和力修饰的igsf结构域

该实施例描述了另外的亲和力修饰的cd80(b7-1)、cd86(b7-2)和nkp30免疫调节蛋白的设计、创建和筛选，其是在免疫激活和抑制中均显示出双重作用的免疫突触(is)的其他组分。这些实施例表明igsf结构域的亲和力修饰产生可以用于增加和减少免疫活性的蛋白质。该项工作还描述了与变体亲和力修饰的icosl成对(即，堆叠的)融合以形成ii型免疫调节蛋白以实现免疫调节活性的那些结构域的各种组合。

基本上如实施例1中所述生成用于翻译和表达为酵母展示文库的人cd80、cd86和nkp30igsf结构域的突变dna构建体。对于靶向靶蛋白的特定残基以用简并密码子完全或部分随机化的文库，人cd80(seqidno:28)和nkp30(seqidno:54)的细胞外结构域(ecd)的编码dna序列购自integrateddnatechnologies(coralville，ia)的一组长度多达80碱基对(bp)的重叠寡核苷酸。或者，基本上如实施例1中所述，通过定点靶向诱变使残基突变。或者，基本上如实施例1中所述构建随机文库以鉴定cd80的ecd变体(seqidno:28)、cd86(seqidno:29)和nkp30(seqidno:54)。

基本上如实施例2中所述将靶向和随机文库dna引入酵母中以生成酵母文库。该文库用于选择基本上如实施例3中所述的表达cd80、cd86和nkp30的亲和力修饰变体的酵母。处理细胞以减少非结合物并针对具有基本上如实施例3所述结合其外源重组反结构蛋白的能力的cd80、cd86或nkp30变体进行富集。例如，分别针对cd28、ctl-4和pd-l1中的每一种选择展示靶向或随机cd80文库的酵母。然后使用外源反结构蛋白染色进行两至三轮流式细胞术分选，以富集显示改善的结合物的酵母细胞部分。通过流式细胞术的磁珠富集和选择基本上如keithd.miller,1noahb.pefaur,2和cheryll.baird1currentprotocols在cytometry4.7.1-4.7.30,2008年7月中所述。

对于cd80、cd86和nkp30文库，靶配体蛋白来源于r&dsystems(美国)，如下：人rcd28.fc(即重组cd28-fc融合蛋白)、rpdl1.fc、rctla4.fc和rb7h6.fc。基本上如实施例3中所述进行双色流式细胞术。测定来自流式细胞术分类的酵母输出的更高特异性结合亲和力。对分选的输出酵母进行扩增并重新诱导以表达它们编码的特定igsf亲和力修饰的结构域变体。然后可以通过流式细胞术将该群体与亲本、野生型酵母菌株或任何其他选择的输出(如珠粒输出酵母群)进行比较。

在选择nkp30酵母变体与b7-h6结合的情况下，当用16.6nmrb7h6.fc染色时，f2分类输出给出mfi值533，而当用相同浓度的rb7h6.fc染色时，测得亲本nkp30菌株mfi为90(改善6倍)。

在鉴定的nkp30变体中，有包含关于对应于seqidno:54所示位置的nkp30细胞外结构域中的位置的突变l30v/a60v/s64p/s86g。在鉴定的cd86变体中，有包含关于对应于seqidno:29所示位置的cd86细胞外结构域中的位置的突变q35h/h90l/q102h的变体。在鉴定的cd80变体中，有表8所示的变体以及在下面进一步描述的变体。

与icosl一样，当用fl1上的抗ha标签抗体测量时，上述所有f2输出的mfi没有增加，并且有时与野生型菌株相比下降，这表明增加的结合不是增加所选变体在酵母表面上的表达以及仅选择具有高配体结合的中低表达子的经验证的门控策略的函数。

示例性选择输出被重新格式化为免疫调节蛋白，其基本上如实施例4中所述含有与fc分子融合的cd80的亲和力修饰(变体)细胞外结构域(ecd)(变体ecd-fc融合分子)，并且基本上如实施例5中所述表达和纯化fc-融合蛋白。

然后基本上如实施例6中所述评估示例cd80fc融合变体与细胞表达的反结构的结合。为了产生表达同源结合配偶体的细胞，基本上如实施例6中所述产生人cd28、ctla4和pd-l1各自的全长哺乳动物表面表达构建体。基本上如实施例6中所述进行结合研究和流式细胞术。此外，fc融合变体蛋白的生物活性通过基本上如实施例6中所述的混合淋巴细胞反应(mlr)或抗cd3共固定化测定来表征。

表8和表9中示出了示例性测试变体的结合和活性研究的结果。特别地，表8显示在针对相应同源结构cd28的亲和力成熟的筛选中选择的cd80的ecd中的示例性igsf结构域氨基酸取代(替代)。表9显示在针对相应同源结构pd-l1的亲和力成熟的筛选中选择的cd80的ecd中的示例性igsf结构域氨基酸取代(替代)。如上所述，对于每个表，示例性氨基酸取代由对应于相应参考(例如未修饰的)ecd序列的氨基酸位置编号指定，如下所示。例如，表8和表9中的参考(例如未修饰的)ecd序列是seqidno:28所示的未修饰的cd80ecd序列。氨基酸位置在中间表示，在编号之前列出相应的参考(例如未修饰的或野生型)氨基酸，并且在编号后列出所鉴定的变体氨基酸取代。第2列示出了每种变体ecd-fc融合分子的变体ecd的seqidno标识符。

还显示了通过平均荧光强度(mfi)值测量的对于每个变体fc-融合分子与工程化以表达同源反结构配体的细胞的结合的结合活性，以及与不含一个或多个氨基酸取代的相应参考(例如未修饰的)ecd-fc融合分子与相同细胞表达的反结构配体的结合相比mfi的比率。还基于i)采用与抗cd-3共固定化的所示变体ecd-fc融合分子或ii)采用mlr测定中所示的变体ecd-fc融合分子生成的培养物上清液中ifn-γ的计算水平(pg/ml)示出了变体fc融合分子调节t细胞活性的功能活性。该表还描绘了在两种功能测定中每种变体ecd-fc产生的ifn-γ与相应的参考(例如未修饰的)ecd-fc的比率。

如图所示，该选择导致鉴定了许多cd80igsf结构域变体，该cd80igsf结构域变体经亲和力修饰以显示出对至少一种，并且在一些情况下多于一种同源反结构配体的增加的结合。此外，结果显示变体分子的亲和力修饰也显示出对于增加和降低(根据分子的形式)免疫活性的改善的活性。例如，与不含一个或多个氨基酸替代物的参考(例如未修饰的或野生型)ecd-fc分子相比，配体的共固定化可能提供与细胞的多价相互作用以聚集或增加亲合力以有利于激动剂活性以及增加t细胞活化。然而，当分子作为溶液中的二价fc分子提供时，与不含一个或多个氨基酸替代物的参考(例如未修饰的或野生型)ecd-fc分子相比，相同的igsf结构域变体显示出降低t细胞活化的拮抗剂活性。

实施例8

含不同亲和力修饰结构域的堆叠的分子的生成和评估

该实施例描述了作为堆叠构建体生成的其他免疫调节蛋白，其含有来自鉴定的变体icosl多肽的至少两个不同的亲和力修饰的结构域和一个或多个连接在一起并与fc融合的另外的变体cd80、cd86、icosl和nkp30分子。

对于一种或多种反结构配体进行亲和力修饰的上述选择的变体分子用于生成含有两个或更多个亲和力修饰的igsf结构域的“堆叠”分子(即ii型免疫调节蛋白)。获得呈基因块的堆叠构建体(integrateddnatechnologies，coralville，ia)，该基因块编码某种形式的堆叠，该形式通过使用gibson组装试剂盒(newenglandbiolabs，美国)的标准gibson组装使其与fc融合。

生成所有堆叠的编码核酸分子以编码如下设计的蛋白质：信号肽，接着是感兴趣的第一变体igv，接着是15个氨基酸的接头，其由三个ggggs(g4s)基序(seqidno:228)组成，接着是感兴趣的第二igv，接着是两个ggggs接头(seqidno:229)，接着是三个丙氨酸(aaa)，接着是如上所述的人igg1fc。为了最大化每个堆叠中igv结构域的正确折叠的机会，第一igv之前是通常在该igv和信号肽之间的野生型蛋白质中出现的所有残基(前导序列)。类似地，第一igv之后是通常将其在野生型蛋白质中与下一个ig结构域(通常是igc结构域)连接的所有残基，或者如果没有这样的第二igv结构域，则是将其与跨膜结构域连接的残基(尾随序列)。将相同的设计原理应用于第二igv结构域，不同的是当两个igv结构域来源于相同的亲本蛋白质(例如与另一个icosligv堆叠的icosligv)时，两者之间的接头不重复。

表10示出了示例性堆叠的构建体的设计。表10中所示的示例性堆叠分子含有所示的ig结构域(例如igv结构域)，另外含有如上所述的拖尾序列。在该表中，以下组分以如下顺序存在：信号肽(sp；seqidno:225)、ig结构域1(例如ig1)、尾随序列1(ts1)、接头1(lr1；seqidno:228)、ig结构域2(ig2)、尾随序列2(ts2)、接头2(lr2；seqidno:230)和fc结构域(含有c5s/r77c/n82g/v87c氨基酸取代的seqidno:226)。在一些情况下，前导序列1(ls1)存在于信号肽与igv1之间，并且在一些情况下，前导序列2(ls2)存在于接头与igv2之间。

基本上如实施例5中所述产生变体igv堆叠的fc融合分子的高通量表达和纯化，该融合分子包含含有至少一个亲和力修饰的igv结构域的来自cd80、cd86、icosl或nkp30的变体igv结构域的各种组合。通过抗cd3共固定化测定，变体igv堆叠的fc融合分子与相应反结构的结合和功能活性也基本上如实施例6中所述进行评估。例如，在如上所述的类似的固定化抗cd3测定中测定堆叠的igsffc融合蛋白的共刺激生物活性。在这种情况下，将4nm的抗cd3(okt3，biolegend，美国)与4nm至120nm的人rb7-h6.fc(r&dsystems，美国)或人rpd-l1.fc(r&dsystems，美国)在组织培养物处理的96孔板(科宁，美国)上共固定化过夜。第二天用pbs洗去未结合的蛋白质，并在100μl离体15培养基(lonza，瑞士)中向每个孔中加入100,000个纯化的pant细胞。随后以100μl的体积加入浓度范围为8nm至40nm的堆叠的igsf结构域，总体积为200μl。将细胞培养3天，然后收获培养物上清液，并如上所提及用duosetelisa试剂盒(r&dsystems，美国)测量人ifn-γ水平。

结果示于表11至表13中。具体地，表11示出了含有nkp30igv结构域和icosligv结构域的变体igv堆叠的fc融合分子的结合和功能活性结果。表12和表13示出了含有变体icosligv结构域和cd80igv或cd86igv结构域的变体igv堆叠的fc融合分子的结合和功能活性结果。

对于表11至表13中的每一个，第1列表示从氨基末端(n末端)结构域开始的堆叠的亲和力修饰的或野生型(wt)结构域，以及位于c末端人igg1fc结构域之前的中间wt或亲和力修饰的结构域的结构组织和方向。第2列示出了各个“堆叠”分子中包含的每个igv结构域序列的seqidno标识符。第3列示出了结合配偶体，根据该结合配偶体选择来自第1列所示的亲和力修饰的堆叠的结构域。

还显示了通过平均荧光强度(mfi)值测量的对于每个堆叠分子与被转染以表达各种反结构配体的细胞的结合的结合活性以及与包含不含一个或多个氨基酸取代的参考(例如未修饰的)igv结构域的相应堆叠分子与相同细胞表达的反结构配体的结合相比的mfi的比率。还基于采用溶液中所示的变体堆叠分子以及与实施例6中所述的抗cd3共固定化的合适配体生成的培养物上清液中ifn-γ的计算水平(pg/ml)，示出了变体堆叠分子调节t细胞活性的功能活性。该表还描述了在共固定化测定中与相应的参考(例如未修饰的)堆叠分子相比，每种变体堆叠分子产生的ifn-γ的比率。

如图所示，结果显示，可以生成含有至少一个变体igsf结构域的堆叠分子，与含有各个参考(例如野生型或未修饰的)igv结构域的相应堆叠分子相比，该含有至少一个变体igsf结构域的堆叠分子显示出对至少一个同源反结构配体的增加结合的亲和力修饰活性。在一些情况下，来自分子中的一个或两个变体igsf结构域的组合的堆叠分子显示出对多于一个同源反结构配体的增加的结合。结果还表明，在一些情况下，堆叠的分子中的igv结构域的顺序可以改变结合活性的改善程度。在一些情况下，当在靶向共固定化测定中评估时，功能性t细胞活性也发生改变。

实施例9

表达跨膜免疫调节蛋白的工程化细胞的生成和评估

生成工程化t细胞，其中包含含有如上所述的变体cd80或icosl亲和力修饰的igsf结构域的细胞外结构域(ecd)的跨膜免疫调节蛋白(tip)与嵌合抗原受体(car)共表达。tip还含有相应的野生型cd80或icosl跨膜蛋白序列的跨膜结构域和胞质结构域。将工程化细胞的免疫调节活性与仅表达car的细胞或共表达相应野生型cd80或icosl跨膜蛋白与car的细胞进行比较。

示例性cd80-tip是具有亲和力修饰的igsf结构域以及对应于seqidno:1的残基243-288的跨膜和胞质结构域的变体cd80，该亲和力修饰的igsf结构域含有对应于关于seqidno:28所示的cd80细胞外结构域中的位置的i67t/l70q/a91g/t120s的igv和igc结构域中的氨基酸突变。示例性cd80-tip的氨基酸序列如seqidno:241所示，并由seqidno:242所示的核苷酸序列编码。相应的野生型cd80跨膜蛋白具有seqidno:1的氨基酸残基35-288所示的氨基酸序列，并由seqidno:251所示的氨基酸序列编码。

示例性icosl-tip是具有亲和力修饰的igsf结构域以及对应于seqidno:5的残基257-302的跨膜和胞质结构域的变体icosl，该亲和力修饰的igs结构域含有对应于关于seqidno:32所示的icosl细胞外结构域中的位置的n52h/i143t的igv结构域中的氨基酸突变。示例性icosl-tip的氨基酸序列如seqidno:243所示，并由seqidno:244所示的核苷酸序列编码。相应的野生型icosl跨膜蛋白具有seqidno:5的氨基酸残基19-302所示的氨基酸序列，其由seqidno:252所示的氨基酸序列编码。

含有亲和力修饰的结构域的tip或含有相应的非亲和力修饰的igsf结构域的野生型跨膜蛋白在t细胞中与含有cd3ζ细胞内信号传导结构域的第一代嵌合抗原受体(car)共表达。第一代car包括对cd19具有特异性的scfv(seqidno:245)、来源于cd8的铰链和跨膜结构域(seqidno:246)和来源于cd3ζ的细胞内信号传导结构域(如seqidno:47所示)。编码cd19scfv-cd3ζcar的核苷酸序列如seqidno:248所示，cd19scfv-cd3ζcar的氨基酸序列如seqidno:479所示。

生成了仅编码car或者还编码通过自裂解t2a序列(seqidno:250，并且由seqidno:249所示核苷酸序列编码)而与car分离的示例性tip或野生型跨膜蛋白质之一的核酸分子。示例性构建体含有表14所示的核酸序列。作为对照，还生成了编码另外含有cd28共刺激结构域的第二代car的核酸构建体(cd19scfv-cd28-cd3ζ)。

将核酸分子单独克隆至慢病毒载体中，该载体用于转导从获自三种不同健康供体的人pbmc样品中分离的t细胞。在用载体和慢病毒包装构建体共转染hek293细胞后产生含有核酸序列的慢病毒颗粒。通过超速离心从培养基中收集慢病毒颗粒，并通过qrt-pcr滴定。使用密度沉降从三个正常献血者分离人外周血单核细胞(pbmc)。将pbmc与抗cd3和抗cd28抗体以及il-2一起培养过夜，然后用慢病毒制剂以5:1的感染复数进行转导。编码对照第2代car的慢病毒载体仅用于转导来自一个供体的细胞。

培养两周(14天)后，使用acea实时细胞分析仪(rtca)将细胞与靶抗原表达细胞共培养后分析细胞的细胞毒性，该分析仪测量96孔微电子培养板(e培养板)的培养基中的阻抗变化，并在实时图中显示细胞数量和形态的变化。将表达cd19的hela靶细胞(hela-cd19)接种至96孔e培养板中，并使用rtca系统监测每个单层的阻抗24小时。将工程化t细胞以10:1的效应物:靶标比例加入孔中，并对孔再监测48小时。结果显示并记录为来源于测量的电阻抗的变化的细胞指数(ci)值，然后通过将所有时间点的所有孔的ci读数除以同一时间(基准时间)的各个孔的ci值进行比例转换以获得表示基准时间处百分比值的标准化细胞指数值(参见zhang等人“introductiontothedataanalysisoftherochesystemwithrtcapackage.”bioconductor.2016年5月3日,bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/rtca/inst/doc/aboutrtca.pdf.2016年9月9日存取)。在该测定中，单层阻抗的降低反映了转导细胞对靶细胞的杀伤。

结果显示，与未转导的t细胞相比，在表达第1代car的细胞中观察到阻抗降低，但表达第1代car的细胞的阻抗降低程度小于表达第2代car的细胞的阻抗降低程度。表达第1代car的细胞中的阻抗降低通常持续至测定的前8小时，而此后仅第2代car表达细胞继续降低阻抗。

如图1所示，与仅表达第1代car的细胞相比，在一个供体中，与第1代car共表达tip或相应的野生型跨膜蛋白的每个细胞显示出更大的阻抗降低，这表明其细胞毒活性更大。此外，结果显示，相对于共表达含有非亲和力修饰的igsf结构域的相应野生型cd80或icosl跨膜蛋白的car表达细胞，共表达cd80-tip或icosl-tip的car表达细胞中的细胞毒活性更高。这些tip工程化细胞的观察结果显示，共表达cd80-tip或icosl-tip与car的细胞中的细胞毒活性显示出可调节抗原特异性t细胞(如car-表达t细胞)的细胞毒性免疫应答的增加的活性。

在另外两个供体中，与表达相应野生型cd80跨膜蛋白的细胞相比，表达cd80-tip的细胞不会导致更大的阻抗降低。在一个供体中，没有足够的细胞用野生型跨膜蛋白构建体转导，尽管在该供体中，与测试的其他构建体相比，icos-ltip产生最佳的细胞毒性。在另一个供体中，与表达相应野生型icos-l跨膜蛋白的细胞相比，表达icos-l-tip的细胞不会导致更大的阻抗降低。在测试细胞中，共表达cd80-tip、icosl-tip或相应的野生型跨膜蛋白与car的所有细胞显示出比仅表达第一代car的细胞更高的细胞毒活性。供体之间观察到的结果差异可能与供体之间t细胞的差异、细胞表面上各种工程化蛋白的表达水平的差异、该示例性测定中用于评估细胞中的杀伤的特定条件细胞(例如评估第14天转导的细胞，评估单一效应子:靶细胞比例)或其他因素有关。

实施例10

评估icosligsf结构域变体的结合和活性

基本上如上所述通过酵母选择方法鉴定另外的ecdicosl变体，并如实施例5中所述用于产生ecd-fc融合蛋白。进行结合研究以基本上如实施例6中所述评估icosl结构域变体免疫调节蛋白对同源结合配偶体的特异性和亲和力。

a.结合和功能表征

基本上如实施例6中所述，对与细胞表达的全长同源结合配偶体cd28、icos和ctla-4的结合进行评估。ecdicosl变体的生物活性也基本上如实施例6中所述在抗cd3共固定化测定或人混合淋巴细胞反应(mlr)中评估，不同之处在于对于共固定化测定，通过10nm培养板结合的抗cd3和40nmicoslfc变体蛋白的混合物培养人t细胞来确定共刺激活性。

表15描绘了另外的icosligsf结构域变体与细胞表达的反结构的结合和在抗cd3共固定化测定或mlr测定中的生物活性的示例性结果。表15所述的示例性氨基酸取代如下由对应于seqidno:32所示的相应参考(例如未修饰的)icoslecd序列的氨基酸位置编号指定。氨基酸位置在中间表示，在编号之前列出相应的未修饰的(例如野生型)氨基酸，并且在编号后列出所鉴定的变体氨基酸取代。第2列示出了每种变体ecd-fc融合分子的变体ecd的seqidno标识符。

表15中的结果描绘了通过平均荧光强度(mfi)值测量的对于每个变体fc-融合分子与工程化以表达同源抗体结构配体的细胞的结合的结合活性，以及与不含一个或多个氨基酸取代的相应参考(例如未修饰的)ecd-fc融合分子与相同细胞表达的反结构配体的结合相比mfi的比率。还基于i)采用与抗cd-3共固定化的所示变体ecd-fc融合分子或ii)采用mlr测定中所示的变体ecd-fc融合分子生成的培养物上清液中ifn-γ的计算水平(pg/ml)示出了变体fc融合分子调节t细胞活性的功能活性。该表还描绘了在两种功能测定中每种变体ecd-fc产生的ifn-γ与相应的未修饰的(亲本)ecd-fc的比率。

结果显示亲和力修饰的icosligsf结构域变体对至少一种同源反结构配体的改变的(包括增加的)结合亲和力和/或改善的免疫活性。具体地，与实施例6中鉴定的初始命中物类似，该选择导致鉴定了许多另外icosligsf结构域变体，该另外的icosligsf结构域变体经亲和力修饰以显示出对至少一种，并且在一些情况下多于一种同源反结构配体的增加的结合。此外，结果显示变体分子的亲和力修饰也显示出如实施例6所述对于增加和/或降低(根据分子的形式)免疫活性的改善的活性。

b.抗cd3共刺激测定中的细胞因子产生

进一步评估了上述示例性变体ecdicoslfc融合分子在上述抗cd3共刺激(共固定化)生物活性测定中对细胞因子il-17的刺激。将10nm培养板结合的抗cd3和40nmicoslfc变体蛋白的混合物与人t细胞一起培养。收集上清液并通过elisa测定il-17水平。测量了用所示变体ecd-fc融合分子和用抗cd3共固定化的相应未修饰(亲本)ecd-fc生成的培养物上清液中il-17的量(pg/ml)。为了比较，该表中还示出了在与表15中所示对于示例性变体的相同测定中产生ifn-γ的结果。

结果示于表16中，该表描述了测定的上清液中的il-17(pg/ml)以及每种变体ecd-fc与相应的未修饰(野生型)的ecd-fc所产生的il-17的比(增加倍数)。示出了ifn-γ的类似结果。还示出了细胞产生的总il-17或ifn-γ细胞因子％。结果表明，在共刺激测定中变体分子的亲和力修饰显示出改变的功能性t细胞活性以增加il-17以及ifn-γ。

实施例11

表达跨膜免疫调节蛋白的另外的工程化t细胞的生成和增殖评估

该实施例描述了另外的工程化t细胞的生成，其中含有具有icosl亲和力修饰的igsf结构域的细胞外结构域(ecd)的跨膜免疫调节蛋白(tip)与嵌合抗原受体(car)共表达。具体地，生成tip以包含示例性变体icosl的ecd，该示例性变体icosl含有关于seqidno:32所示的icosl细胞外结构域中的位置的氨基酸突变n52d、n52h/n57y/q100p、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r或n52h/n57y/q100r。tip还含有对应于seqidno:5的残基257-302的相应野生型icosl跨膜蛋白序列的跨膜结构域和细胞质结构域。具有和不具有其信号肽的tip的序列如下：n52d(seqidno:496和497)；n52h/n57y/q100p(seqidno:498和499)；e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r(seqidno:500和501)和n52h/n57y/q100r(seqidno:502和503)。为了比较，全长跨膜野生型icosl(seqidno:5的氨基酸残基19-302)也在细胞中表达。具有和不具有其信号肽的野生型tip的序列示于seqidno:494和495中。编码tip的核酸还包括编码通过自裂解t2a序列与tip分离的绿色荧光蛋白(gfp)的序列。

含有亲和力修饰的结构域的tip或含有相应的非亲和力修饰的igsf结构域的野生型跨膜蛋白在t细胞中与嵌合抗原受体(car)共表达。编码car的核苷酸序列依次编码：cd8信号序列(seqidno:481)、抗cd19scfv(seqidno:482)、来源于cd8的铰链/跨膜区域(seqidno:483)、来源于4-1bb的共刺激信号传导结构域(seqidno:484)和cd3ζ信号传导结构域(seqidno:247)。得到的抗cd19car具有seqidno:490所示的氨基酸序列。编码car的核酸还包括编码通过自裂解t2a序列(seqidno:488所示)与car分离的蓝色荧光蛋白(bfp；seqidno:489)的序列。

分别生成病毒载体构建体，其中仅编码car的核酸分子或编码示例性tip或野生型icosl中的一种的核酸分子被克隆至所述病毒载体构建体中。将编码car的病毒载体和编码tip或野生型icosl的病毒载体共转导至t细胞中。对于转导，以1:1的珠粒:细胞比例用抗cd3和抗cd28珠粒(dynal)激活原代t细胞，并在100iu/mlil-2的存在下在37℃下孵育2天。然后收获t细胞，并在8μg/ml聚凝胺的存在下用400μlcar病毒上清液和400μltip病毒上清液转导。将细胞在30℃下以1000g旋转30分钟。然后转移细胞并在37℃下孵育过夜。孵育后，收集细胞并去除病毒上清液。用完全培养基和50iu/ml的il-2重悬细胞。扩增细胞，每两天补充一次il-2和培养基，共6天。使用磁体从细胞去除珠粒并计数，然后在增殖测定中进行评估。示例性转导的t细胞中tip和car的示例性表达谱示于图2a中。

为了评估cart细胞和car-tipt细胞响应于抗原的增殖，用细胞追踪远红染料标记细胞。从1.5:1的靶标:t细胞比例开始并通过8点稀释以1:2稀释度来滴定cd19表达型nalm6靶细胞。将标记的cart细胞或car-tipt细胞加入nalm6细胞中，将培养物孵育4天，然后通过流式细胞术分析细胞。收集上清液并在细胞因子释放测定中进一步评估。

如图2b所示，car+原代t细胞以剂量依赖性方式增殖为cd19+nalm6细胞。与仅表达car的t细胞相比，共表达car和野生型icosl或示例性icosltip之一的t细胞显示出增强的增殖。含有n52h/n57y/q100p、e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r或n52h/n57y/q100r变体icoslecd的car和tip的共表达显示出比共表达car和野生型icosl的t细胞更强的增殖，这表明在原代t细胞上表达的tip提供了改善的共刺激信号以增强t细胞增殖。

实施例12

icosligsf结构域变体的纯化和评估

对于实施例6和实施例10中描述的示例性候选物命中物采用纯化策略。用表达构建体瞬时转染来源于293细胞系(expi293)的人细胞，并在细胞中表达ecdicoslfc融合分子。然后通过亲和力色谱法(mabselectsure)从具有蛋白a的上清液纯化fc融合蛋白。然后在该初始纯化步骤之后进行制备型尺寸排阻色谱(sec)步骤以进一步纯化蛋白质(superdex20016x60)。保留来自两个纯化步骤的样品并通过分析型sec进行比较。在蛋白a纯化后测定蛋白质的浓度。还通过高效液相色谱(hplc)上的分析型sec来分析所得纯化蛋白质以评估纯度。

测定纯化样品中的主峰百分比，并与在初始蛋白a步骤(主峰prota池％)中纯化的蛋白质以及用蛋白a纯化的蛋白质进行比较，然后进行制备型sec(主峰sec池％，t＝d0)。如表17所示，另外的sec步骤显著提高了纯化蛋白质的蛋白质纯度。为了进一步评估蛋白质的稳定性，将通过制备型sec纯化的蛋白质在室温下放置24小时，然后通过hplc评估主峰％(主峰sec池％，t＝d24)并与d0样品比较。测定d0与d24的主峰％的变化(▲主峰sec池％)。如表17中所示，此时大多数测试的示例性变体ecdicoslfc融合分子显示出主峰％的少许变化，这表明发生了蛋白质变体的最小聚集。

实施例13

纯化的icosligsf结构域变体命中物的共刺激生物活性的评估

基本上如实施例6中所述通过mlr评估如实施例12中所述纯化的示例性ecdicoslfc融合分子的生物活性。在10nm抗cd3的存在下，将10nm或40nmicoslfc变体蛋白的混合物过夜结合至96孔板。洗涤培养板并加入100,000个cfse标记的全t细胞，持续96小时。收集上清液，并通过elisa测量ifn-γ和il-17水平。

通过用示例性测试变体(10nm和40nmicoslfc)与抗cd3共刺激诱导的细胞因子分泌的结果示于图3a和图3b中，该图示出了icosl的ecd中的示例性igsf结构域氨基酸取代(替代)。图3a和图3b中的条形图分别描绘了通过elisa得到的在上清液中分泌的ifn-γ和il-17的量(pg/ml)。用水平线表示与用wticosl与抗cd3共刺激诱导的水平相比，用测试变体与抗cd3共刺激诱导的细胞因子释放水平。结果表明，变体分子的亲和力修饰显示出调节功能性t细胞活性(包括在共刺激测定中显著增加ifn-γ和il-17分泌)的活性。对于一些变体观察到增加的免疫活性。

实施例14

纯化的icosligsf结构域变体命中物的增殖的评估

评估如实施例12中所述纯化的示例性变体ecdicoslfc融合分子共刺激抗cd3诱导的t细胞增殖的能力。用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)标记原代t细胞。在10nm抗cd3的存在下将10nm或40nm变体ecdicoslfc或野生型ecdicosl蛋白的混合物过夜结合至96孔板，然后加入标记的t细胞并孵育3天。作为对照，还在结合的抗cd3和igg或单独igg存在的情况下评估增殖。对细胞进行cd4或cd8表面标志物染色，并通过流式细胞术评估cfse稀释度来测定总t细胞、cd4+t细胞或cd8+t细胞的增殖。

对于在40nm和10nmicosl下测试的示例性变体的结果分别示于图4a和图4b。如图4a所示，几乎所有测试的变体ecdicoslfc融合分子诱导了高于wt对照的增殖。如图4b所示，增殖的差异在10nm下更明显，某些变体即使在该较低浓度下也提供最大增殖。

实施例15

纯化的icosligsf结构域变体命中物的结合和活性的评估

使用基本上如实施例6或实施例10中所述的方法评估如实施例12中所述纯化的示例性变体ecdicoslfc融合分子的结合和功能活性。

a.流式细胞术结合测定

将来源于293细胞系(expi293)的人细胞用cd28、ctla-4、icos转染或用模拟物转染。然后将细胞与从100,000pm滴定至46pm的ecdicoslfc融合分子或野生型ecdicosl-fc一起孵育，并如实施例6中所述使用pe缀合的抗人fc观察结合。通过流式细胞术评估结合，并使用cellquestpro软件(bectondickinson，美国)测定平均荧光强度(mfi)和对于信号呈阳性的细胞百分比(％)。测定产生半数最大mfi应答(mfiec50)或阳性细胞％(％(+)ec50)的icosl-fc浓度。

表18示出了结果。表18所述的icosl氨基酸取代如下由对应于seqidno:32所示的相应参考(例如未修饰的)icoslecd序列的氨基酸位置编号指定。对于一些值(例如wt与cd28的结合)，不可能获得ec50，因此为了数据格式化目的，任意地选择1000000pm。类似于以上实施例10中所述的先前结合测定所获得的结果，观察到变体icoslecd-fc融合分子对至少一种同源反结构配体的结合亲和力改变。

b.fortebio结合测定

使用fortebio结合测定法进一步评估受体与icosl结构域变体免疫调节蛋白之间的蛋白质间相互作用。将icos、cd28和ctla-4受体分别加载至抗人捕获传感器(fortebiooctetahc)上，并将野生型未修饰的icoslecd-fc融合分子、野生型pd-l2ed-fc融合分子或变体icoslfc-融合分子结合至4点滴定的受体。每次滴定全局地适合于计算每种蛋白质的缔合(kon)和解离(kdis)。测定用变体icoslecd-fc融合分子测试的每种受体的抗人捕获传感器的加载响应。计算解离常数(kd)并与野生型比较以确定倍数提高值(提高倍数)。

表19示出了与icos的结合结果，表20示出了与cd28的结合结果，表21示出了与ctla-4的结合结果。表19至表21所述的示例性氨基酸取代如下由对应于seqidno:32所示的相应参考未修饰icoslecd序列的氨基酸位置编号指定。

c.共固定化测定

在基本上如实施例6所述的抗cd3共固定化测定中测定icosl融合变体的共刺激生物活性。将约0.37nm、1.3nm或10nm小鼠抗人cd3(okt3，biolegends，美国)和10nm或40nm变体icoslecdfc或野生型icoslecd-fc稀释于pbs中。将该混合物加入组织培养物处理的平底96孔板以促进刺激蛋白附着至培养板的孔。第二天，将未结合的蛋白质从培养板上洗掉，并向每个孔中加入100,000个纯化的人全t细胞。将细胞培养3天，然后收获培养物上清液，并用elisa试剂盒测量人ifn-γ水平。

表22示出了在抗cd3共固定化测定中各种条件下由细胞产生的ifn-γ(pg/ml)的量。在该表中，示例性变体ecdicosl-fc融合物的氨基酸取代由对应于seqidno:32所示的未修饰icoslecd序列的氨基酸位置编号指定，并且示出了对于每种变体icoslecd-fc融合分子的变体ecd的相应seqidno标识符。示出了在功能测定中在每种变体icoslecd-fc的存在下产生的ifn-γ与在相应的未修饰(野生型)ecd-fc的存在下产生的ifn-γ的比(倍数↑wt)。如所示，与野生型icosl相比，变体icosl-ecd-fc分子的共刺激信号传导显著更高。

d.混合淋巴细胞反应用于评估生物反应性抑制

在基本上如实施例6中所述的混合淋巴细胞反应(mlr)中测定融合变体对t细胞活性的调节。将人单核细胞在il-4和gm-csf的存在下孵育6天，并在最后24小时用另外的lps成熟为树突细胞。每孔铺板1x10⁴个树突细胞和1x10⁵个人cfse标记的t细胞，并在pbs中稀释的三种不同浓度(40nm、13.3nm或4.4nm)的野生型或重组变体icoslecd-fc分子的存在下孵育4天。相同浓度的人igg、pd-l2-fc或贝拉西普(含有l104e和a29y突变的ctla4-fc)用作对照。收获上清液并通过elisa表征ifn-γ应答。

图5描绘了在各种条件下的ifn-γ产生。由水平线表示在野生型icosl的存在下由细胞产生的ifn-γ的水平。在阴性对照蛋白pd-l2-fc的存在下未观察到对ifn-γ产生的抑制。相反，大多数测试的icosl变体在mlr中显示出一定程度的对ifn-γ产生的抑制。某些变体显示出对ifn-γ的显著抑制，即使在测试的4.4nm的最低浓度下，培养物中产生的ifn-γ也为非常低至不可检测。在4.4nm变体ecdicosl-fc的变体的存在下mlr抑制百分比示于表23中。在该表中，负值表示测定中的炎症效应。

e.通过流式细胞术评估增殖和细胞内细胞因子标志物

来自如上所述的mlr研究的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)标记的全t细胞已经在野生型或重组变体icoslecd-fc分子的存在下孵育4天，将该全t细胞在高尔基抑制剂(golgi/block/plug)的存在下通过用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(pma)/离子霉素再刺激6小时进一步测试细胞因子水平。还再刺激来自mlr研究的已与人igg、抗cd28、抗icosl、pd-l2-fc或贝拉西普(含有l104e和a29y突变的ctla4-fc)一起孵育的t细胞。将t细胞针对cd4或cd8表面标志物进行染色、固定、透性化处理以及针对如表24和表25所示的各种细胞因子进行细胞内染色。

对于特定细胞内细胞因子呈阳性的cd4+和cd8+t细胞的百分比(％)分别示于表24中。结果表明，许多变体icoslecd-fc分子能够抑制一种或多种细胞因子，在一些情况下，包括大多数细胞因子。计算总得分和平均得分以评估测试的各个分子对该测定中检查的参数的总和效应。还评估了增殖，并且通过cfse稀释测定的已分裂细胞百分比也示于表24和表25中。在提供的结果中，结果表明某些变体显示出与贝拉西普相当或比贝拉西普更好的活性，特别是来自cd8+细胞的变体。

实施例16

评估b-t细胞共培养中的细胞因子产生

从相同供体纯化b细胞和cd4+t细胞且用csfe标记，并以1:1细胞比例铺板于96孔板中，每孔5×10⁴个细胞。加入变体icoslecd-fc融合分子或贝拉西普，终浓度为每孔40nm。细胞未受刺激，或将细胞与100ng/ml的葡萄球菌肠毒素b(seb)、1μg/ml的商陆丝裂原(pwm)或两者一起在37℃下在200μl/孔的最终体积中孵育7天。

收获细胞并针对以下b和t细胞系标志物(igm、igd、cd38、cd138、cd27、cd19、cd4、cd3)进行表面染色。通过流式细胞术评估增殖，并使用legendplex人th细胞因子检测试剂盒(biolegend，美国)分析培养物上清液的il-5、il-13或il-21细胞因子。

如图6a所示，与无蛋白质对照相比，当在变体icoslecdfc融合分子的存在下孵育时，b/t细胞共培养物中分裂型b细胞的数量减少。测试的示例性变体的拮抗作用程度类似于ctla-4-ig贝拉西普(l104e，a29y)。同样地，如图6b至图6d所示，与无蛋白质对照以及含有野生型icosl对照的培养物相比，变体icoslecdfc融合分子在体外抑制原代人b细胞/t细胞共培养物中的细胞因子产生。在一些情况下，与贝拉西普相比，示例性测试的变体icoslecdfc融合分子在阻断细胞因子产生方面更有效。

实施例17

评估移植物抗宿主病(gvhd)模型中的存活和疾病活动

评估示例性icosl变体ecd-fc蛋白在移植物抗宿主病(gvhd)模型中的活性。照射(100rad)雌性nsg小鼠(每组n＝10)并在第-1天皮下给予10mg丙种球蛋白。在第0天，小鼠接受1000万个人外周血单核细胞(pbmc)并腹膜内注射给予100μgwt-icoslecdfc、变体icoslecdfc分子n52h/i143t(seqidno:135所示的ecd)、变体icoslecdfc分子n52h/n57y/q100p(seqidno:113所示的ecd)、75μg贝拉西普(ctla-4-igl104e/a29y；美国专利申请公开号us20160271218)或盐水作为对照。在第15天，通过流式细胞术对移植的人cd45+细胞进行表型分析。在第35天终止研究后，评估存活率、体重减轻和疾病活动的终点测量结果。

图7a示出了用盐水、wticosl-ecdfc、变体icoslecd-fc分子或贝拉西普处理的gvhd小鼠的存活率。观察了与给予盐水或wticsolecd-fc的小鼠相比，给予变体icoslecd-fcn52h/n57y/q100p(seqidno:113所示的ecd)的小鼠的存活率的显著差异(根据mantel-cox和gehan-breslow-wilcoxon检验，p<0.0001)。图7b示出了在研究过程中用盐水、wticoslecd-fc、变体icoslecd-fc分子或贝拉西普处理的小鼠的体重减轻之间的类似差异。

在研究期间每周测定三次疾病活动指数(dai)，并评价小鼠的体重减轻、姿势、活动、毛发外观和皮肤的评分。研究过程中的疾病等级示于图7c中。接受icoslfc变体n52h/n57y/q100p(seqidno:113所示的ecd)或贝拉西普的处理组显示出显著改善的dai得分。还通过流式细胞术评估研究第14天外周血中人t细胞的百分比。对处理组的测量结果求平均值，且误差条表示平均值的标准误差(sem)。图7d示出了血液中活cd3+/cd4+或cd3+/cd8+细胞的百分比。接受具有n52h/n57y/q100p的变体icoslecdfc(seqidno:113所示的ecd)或贝拉西普的处理组显示出与盐水处理组相比显著不同的cd4+t细胞水平(根据未配对t检验，分别为p＝0.008和0.006)。该研究表明了变体icoslfc变体蛋白在体内建模期间对人原代t细胞和gvhd的治疗效果。

进行了使用额外的变体icoslecd-fc融合分子的类似研究，包括变体icoslecd-fcn52h/n57y/q100r/c198r(seqidno:365所示的ecd)、n52h/n57y/q100r/f172s(seqidno:291所示的ecd)、以及n52h/n57y/q100p(seqidno:288所示的ecd)。还测试了n52h/q100r(seqidno:285所示的ecd)，其在如上所示的体外mlr研究中具有降低的活性。如上所示处理了nsg小鼠(n＝9只/组)。在该研究中，icosl-fc或贝拉西普的给药(dosing)从第0天直至第37天持续每周3次，并且在第49天终止存活小鼠。为了确定各组之间存活比例的统计学差异，使用mantel-cox(log-rank)检验分析数据。所得的存活曲线在图7e中示出。贝拉西普和icosl-fc变体n52h/n57y/q100r/c198r(seqidno:365所示的ecd)、n52h/n57y/q100r/f172s(seqidno:291所示的ecd)和n52h/n57y/q100p(seqidno:288所示的ecd)与盐水和wticosl-fc相比，显著延长存活(p＜0.001)。在实验的时间过程中绘制平均dai得分，最后一次观察(即在终止日收集的平均得分)接至在最后计划的研究日(第49天)之前终止的那些组的图表上。组之间随时间推移的数据(即dai得分)的显著差异是使用针对‘治疗’效果的双向重复测量anova确定的。所得的dai得分在图7f中示出。贝拉西普和icosl-fc变体n52h/n57y/q100r/c198r(seqidno:365所示的ecd)、n52h/n57y/q100r/f172s(seqidno:291所示的ecd)和n52h/n57y/q100p(seqidno:288所示的ecd)与盐水和wticosl-fc相比显著降低了dai得分(p<0.001)，并且对贝拉西普和具有n52h/n57y/q100r/c198r的icosl-fc变体之间的dai得分进行双向anova(p＝0.035)。

与贝拉西普的治疗相比，变体icosl-fc的活性在某些情况下得到了改善。icosl-fc变体的施用可以以与贝拉西普相当的水平或优于贝拉西普的水平保护其免受gvhd的影响，如通过提高的存活和减弱的疾病发展所证明的。该模型中的活性与体外活性相关，因为wticosl-fc和具有突变n52h/q100r(seqidno:285所示的ecd)的变体icosl-fc在该模型中不那么有效。

实施例18

通过堆叠分子评估激活

基本上如实施例8中所述产生并评估含有作为定位结构域(指定为“l”)的nkp30igv结构域和作为共刺激结构域(指定为“c”)的icosligv结构域的堆叠变体igvfc融合蛋白。具体地，在该实验中测试的构建体包括：(1)具有变体igvfc融合蛋白(vigdcl)的堆叠构建体，该变体igvfc融合蛋白含有由共有nkp30变体的ig(seqidno:143)与icosl变体n52h/n57y/q100p的igv结构域(seqidno:113所示的ecd和seqidno:201所示的igv)构成的nkp30；(2)具有nkp30野生型结构域ig结构域(seqidno:214)和野生型icosl(wtc-l)的v结构域(seqidno:196)的堆叠构建体；(3)具有野生型icosligv结构域(wtc结构域；seqidno:196)的构建体，和(3)具有野生型nkp30结构域(wtl结构域；seqidno:214)的构建体。

将cd32+k562细胞工程化为在细胞表面上稳定表达b7-h6。然后用丝裂霉素处理细胞，并在无10nm抗cd3和100、33、11或3.7nm的堆叠变体或对照结构域的存在下铺板全t细胞。将细胞培养3天，然后收获培养物上清液，并使用elisa测量人ifn-γ水平。

如图8a所示，变体和野生型共刺激定位结构域堆叠均能够定位至工程化k562细胞，并向全t细胞递送共刺激信号以诱导ifn-γ分泌。具有变体igvfc融合蛋白(vigdc-l)的堆叠构建体在所有测试浓度下显示出增加的功能活性结果，而各个结构域组分在没有互相组合时没有效果。

实施例19

评估体内迟发型超敏反应

在小鼠迟发型超敏反应(dth)模型中评估变体icoslecd-fc融合分子的体内抗炎活性。在卵白蛋白(ova)致敏的小鼠中引发迟发型超敏免疫反应，并评估刺激后的应答。测试的变体icoslecd-fc融合分子含有具有以下氨基酸取代的变体ecd：n52h/n57y/q100p(seqidno:113所示的ecd)、n52h/q100r(seqidno:285所示的ecd)或n52h/n57y/q100r/f172s(seqidno:291所示的ecd)。在有或没有g4s(ggggs；seqidno:636)接头的情况下将变体与含有根据eu编号的突变c220s/l234a/l235e/g237a的fc骨架(指定为fc#1，如seqidno:477所示)或含有根据eu编号的突变c220s/e233p/l234v/l235a/g236del/s267k的fc骨架(指定为fc#2，如seqidno:478所示)融合。表26示出了测试构建体：

为了致敏，在第0天，给8周龄雌性balb/c小鼠在尾根部皮下注射在sigma佐剂(100μl；目录号s6322-1vl)中乳化的100μgova。在第1天和第4天，通过腹膜内注射向小鼠给予变体icoslecd-fc融合蛋白、75μgctla-4fc(阿巴西普)或pbs作为阴性对照。在第7天，在ova刺激前两至三小时，通过腹膜内注射向小鼠进一步给予pbs作为对照、75μgctla-4fc(来自orencia的阿巴西普)或指定的变体icosl多肽。将阿巴西普和变体icosl-fc融合分子以摩尔当量给药。

对于ova激发，在治疗处理后2-3小时，在气体异氟烷麻醉下在左耳耳廓中皮内注射10μl体积的pbs中的10μgova。在ova激发之前测量基线耳厚度。

在第8天，使用mitutoyo卡尺在异氟烷麻醉下测量耳厚度，并测定ova激发前后耳厚度的变化。如图9所示，与pbs对照相比，用所示变体icoslecd-fc融合分子处理的小鼠显示出显著更小的ova诱导的耳肿胀(通过单向anova，<0.0001)。对于用阿巴西普处理的小鼠与用任何测试的所示变体icoslecd-fc融合分子处理的小鼠相比，耳厚度没有显著差异，或者变体icosl处理之间没有显著差异。这些结果表明变体icosl分子可以降低体内免疫应答。

实施例20

含变体icosligsf结构域的分子的结合和活性的产生和评估

如下所述，产生含另外的变体icosligsf(例如ecd)结构域的分子。在如下每个表中，该表示出了变体icosl的ecd中的氨基酸取代，其由对应于seqidno:32所示的相应参考(例如，未修饰的)icosl胞外域(ecd)序列中的氨基酸位置的氨基酸位置编号指定。在一些情况下，变体icoslecd-fc的aaa接头序列的除去由“δaaa”表示。第2列示出了变体ecd-fc融合分子中包含的每个变体ecd结构域的seqidno标识符。

a.另外的变体的产生

1.溶解性变体

来自含有以下突变的突变体集合，该突变包括e16v、n30d、k42e、n52h、n52y、n52s、n57y、e90a、q100r、q100p、l102r、v110d、h115r、f120s、v122a、f138l、i143v、i143t、h152c、k156m、f172s、n194d、c198r、l203p、r221i、i224v，突变h115r、f172s和c198r被鉴定为可能潜在地增强蛋白质溶解性或增强蛋白质表达的突变(“溶解性突变”)。通过定点诱变将这三种突变(h115r、f172s和c198r)随机引入同一组克隆中，以产生含有这些溶解性突变中的一种或多种的衍生物集合。因为定点诱变反应是在合并的诱变寡核苷酸与合并的亲本克隆反应的单一反应中进行的，所以一些克隆还含有来自其他亲本克隆的一些突变。如表27a中所总结，产生的变体含有以各种组合形式的3至10个不同的氨基酸突变。

2.回复变体(backvariant)

在实施例6中描述的所选变体中鉴定的包括n52h、n52y、n57y、q100r、q100p、f138l、c198r、l203p的特定示例性突变根据seqidno:32所示的位置进一步组合在参考(例如野生型)icosl的ecd中，以产生另外的组合变体。如表27b所示，产生的变体含有以各种组合形式的1至3个不同的氨基酸突变。

3.糖基化变体

选自n52h、n52q、n84q、n119q、n155h、n155q、n168q、n207q的示例性糖基化突变根据seqidno:32所示的位置以各种排列组合在参考(例如，野生型)icosl的ecd中，以产生另外的组合变体。如表27c所示，产生的变体含有以各种组合形式的1至5个不同的氨基酸突变。用“x”指示的突变在指定位置表示n或q。

b.与细胞表达的反结构结合

如实施例4中所述，将另外的变体格式化为fc融合蛋白。在结合研究中评估变体fc融合分子以评估icosl结构域变体免疫调节蛋白对同源结合配偶体的特异性和亲和力。如实施例6中所述，用同源结合配偶体、人cd28、icos和ctla4转染的expi293细胞用于结合研究。确定每种转染子的mfi，并与相应的未修饰的(亲本)ecd-fc进行比较。

示例性变体icoslecd-fc融合分子的结合结果示于表28a至表28c中。如表28a至表28c所示，用特定突变的各种组合产生的icosligsf(例如ecd)结构域变体显示出对至少一种，并且在一些情况下对多于一种同源反结构配体增加的结合。

c.用抗cd3共固定化测定进行生物活性表征

如实施例6中所述，还在抗cd3共固定化测定中评估所产生的变体fc融合分子的共刺激生物活性。表28a至表28c描绘了在测定中每种变体ecd-fc产生的ifn-γ与相应的未修饰的(野生型)icoslecd-fc产生的ifn-γ的比率。用“x”指示的突变表示q或对应于seqidno:32的所示位置在指定位置的野生型残基。如图所示，产生的变体fc融合分子显示出改善的活性以增加免疫活性。

实施例21

采用her2靶向抗体产生和评估融合分子

该实施例描述了与肿瘤靶向剂缀合以形成缀合物(“vigd缀合物”)的变体icoslecd-fc融合分子的产生和评估。

icoslvigd的仅v结构域(n52h/n57y/q100p；seqidno:201所示)与her2靶向抗体的轻链(图10a)和重链(图10b)的氨基和羧基末端采用介于中间的gggsgggs接头融合。vigd缀合物的示例性构型示于图10c。

为了评估her2结合，将her2dna或模拟物expi293转染子用浓度为100pm至100nm的滴定量的含有变体icosl缀合物(vigdn52h/n57y/q100p缀合物)的her2靶向抗体染色。还测试了对照蛋白，其包括野生型icoslecd-fc融合物、野生型pd-l2igv-fc融合物和具有n52h/n57y/q100p处突变的变体icoslecd-fc融合分子。如实施例6中所述，测定每种转染子的平均荧光强度(mfi)或阳性细胞百分比。与在expi293细胞中观察到的her2表达的内源性水平相比，如图11a至图11b中所示产生的所有igsf缀合物保持与her2的结合。类似地，vigd缀合物还显示与icosl的同源结合配偶体(包括cd28、ctla-4和icos)结合。

还如实施例6中所述在体外测定中表征了人原代t细胞的蛋白质生物活性和增殖。在10nm抗cd3的存在下，将vigd缀合物以30-0.1nm结合至96孔板过夜。洗涤平板并向培养板中加入100,000个cfse标记的全t细胞并孵育72小时。通过elisa测定上清液中的ifnγ水平。如图12所示，与亲本野生型icoslecd-fc融合分子缀合物相比，具有所示构型的vigd缀合物显示出更多的ifnγ分泌和增殖。

实施例22

原代人t细胞的nanostring转录特征

用10nm抗cd3与40nmfc对照蛋白、野生型icosl-fc、野生型cd80-fc、这两种蛋白或具有突变的变体icoslfc融合蛋白包被组织培养板。然后将纯化的人t细胞铺板在蛋白质包被的培养板上并在37℃下孵育。在24、48和72小时收获来自上述每个处理组的培养物，并由每个细胞样品制备总rna。将rna转移至nanostring，并使用cancerimmune芯片定量每个样品中750个基因的转录物。使用nanostring的专有软件对转录值进行归一化，从而比较处理组之间和不同时间点的转录水平。如图18和图19所示，与野生型cd80ecd-fc、野生型icoslecd-fc或两者的组合相比，测试的变体icoslecd-fc多肽显示出改变的炎症活性。

实施例23

采用her2靶向抗体产生和评估融合分子

还表征了与vmab和her2表达型靶细胞共培养的人t细胞的增殖。用k562衍生的人工靶细胞刺激cfse标记的全t细胞72小时，所述k562衍生的人工靶细胞在vmab或对照蛋白的存在下展示细胞表面抗cd3单链fv(okt3)和her2。通过在cd4⁺或cd8⁺染色的t细胞上的cfse稀释的流式细胞术分析来测量增殖。通过改变靶细胞数或所用vmab的浓度测定vmab。在第一次测定中，将k562靶细胞从2500至78个细胞/孔进行滴定并加入100,000个t细胞中，以使效应子:靶标(e:t)范围为40-1280:1。以1000pm加入vmab、亲本igsf结构域或wticosl。在第二次测定中，将k562靶细胞以625个细胞/孔加入100,000个t细胞中，以使效应子:靶标比例为160:1。滴定vmab或对照蛋白并以3000至37pm加入。如图20a和图20b所示，该测定的两种构型表明，与亲本抗体、亲本igsf结构域或wticosl相比，含有vigd缀合物的vmab提供了更好的增殖。另外，vigd缀合物在低e:t比例(1280:1)或低蛋白质浓度(37pm)下介导增殖。

实施例24

表达跨膜免疫调节蛋白和t细胞受体的工程化细胞的生成和评估

该实施例描述了多种含有变体icosligsf结构域的跨膜免疫调节蛋白(tip)与示例性重组e6特异性t细胞受体(tcr)在人t细胞中的表达和t细胞增殖的评估。

在第0天，用抗cd3/抗cd28激活珠(thermofisherscientific，美国)激活人hla-a2+t细胞，并在第1天用特异于hpve6的tcr(在wo2015/009606中描述)和包含变体icosligsf结构域的各种跨膜免疫调节蛋白(tip)进行转导。示例性的icosl-tip具有亲和力修饰的igsf结构域，其包含与参照seqidno:32所示的icosl细胞外结构域中的位置的e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r或n52h/n57y/q100r对应的氨基酸突变。icosltip还包括与seqidno:5的残基257-302对应的的跨膜和胞质结构域。为了比较，也用hpve6tcr或者wtcd80-tip(如seqidno:1的氨基酸35-288所示，并由seqidno:251中所示的核苷酸序列编码)或wticosl-tip(如seqidno:5的氨基酸19-302所示，并由seqidno:252中所示的核苷酸序列编码)共转导t细胞。为了进行转导，用病毒载体构建体转导细胞，在病毒载体构建体中插入了编码tip以及tcrα和tcrβ链序列的多核苷酸，每个序列都被编码p2a核糖体跳跃序列(seqidno:863)的序列彼此分开，用于在工程化细胞中共表达tip和含有tcrα和tcrβ链的tcr。具体而言，核酸构建体具有以下结构：icosl-p2a1-tcrβ-p2a2-tcrα，其中核苷酸序列p2a1和p2a2各自编码seqidno:863所示的p2a，但核苷酸序列有所不同以避免序列之间的重组。

作为对照，模拟转导t细胞或仅用示例性的e6tcr转导t细胞。

在第3天去除t细胞活化珠，并将细胞因子il-2、il-7和il-15加入培养物中。转导后第6天，通过流式细胞术评估tip和tcr的细胞表面表达，其中35-65％的工程化细胞对tcr和tip呈双阳性。在hpve6肽的存在下扩增表达tcr的细胞，得到>90％对tcr/tip呈双阳性的细胞群，如在第14天所评估的。在第14天，将工程化细胞与hpv感染的细胞一起孵育，该hpv感染的细胞为鳞状细胞癌细胞系upci:scc152（crl-3240^tm；hpv+,hla-a2+)、表皮样癌caski细胞（号crl-1550^tm；hpv+,hla-a2+)或鳞状细胞癌siha细胞(htb-35^tm；hpv+,hla-a2-)。在与靶细胞共培养开始后的第3天评估工程化细胞的增殖。如图21所示，在两种hpv+细胞系中观察到用e6tcr工程化改造的t细胞的增殖增加，但在hpv-siha系中未明显观察到。共表达变体icosltips的工程化细胞响应于hla-a2+hpv+靶标scc152和caski细胞系而增殖增加。

实施例25

fc融合免疫调节蛋白的生成和评估

除了使用多种接头和fc分子外，基本上如实施例4中所述，将包含变体icosligsf(例如ecd)结构域的分子形式化为fc融合蛋白。为了生成免疫调节蛋白(其是包含具有至少一个亲和力修饰的结构域的icosl的ecd的fc融合蛋白(例如，变体icoslecd-fc))，生成编码核酸分子以编码如下设计的蛋白：直接或经由接头间接连接至惰性人igg1fc的变体(突变体)ecd。具体而言，产生的免疫调节蛋白不包含接头(无)，或者包含aaa或g4s(seqidno:636)接头。惰性人igg1fc包含如下突变(通过eu编号)：c220s/r292c/n297g/v302c(seqidno:476)、c220s/e233p/l234v/l235a/g236del/s267k(seqidno:478)、c220s/l234a/l235e/g237a(seqidno:477)或其同种异型。之所以包括替代c220s，是因为所得的蛋白质不包含可用半胱氨酸形成共价键的抗体轻链。基本上如实施例5所述，在293细胞中产生重组变体fc融合蛋白并用蛋白a进行纯化。

在结合研究中评估变体icoslfc融合免疫调节蛋白，以评估对于同源结合配偶体的结合。如实施例6中所述，用同源结合配偶体，人cd28、icos和ctla4，转染的expi293细胞用作结合研究中的靶细胞。测定变体icoslfc融合免疫调节蛋白与表达每种结合配偶体的靶细胞结合的mfi，并且将其与相应的未修饰的(野生型)icoslecd-fc与相同靶细胞的结合进行比较。还使用基本上如实施例6中所述的混合淋巴细胞反应(mlr)来测定变体icoslfc融合免疫调节蛋白对t细胞活性的调节。

包含多种接头和fc区的示例性变体icoslecd-fc融合免疫调节蛋白的结合的结果示于表29中。该表指示变体icosl的ecd中的氨基酸取代，其由与seqidno:32所示的各自参考(例如未修饰的)icosl胞外域(ecd)序列中的氨基酸位置对应的氨基酸位置编号指示。第1列还列出了变体icoslfc融合物中包含的每个变体ecd结构域的seqidno标识符。第2列表示在fc融合蛋白中使用的接头和该接头的seqidno标识符。第3列列出了fc中的由eu编号的突变以及变体icoslfc融合蛋白中包含的fc的seqidno标识符。

如表29所示，在测试的变体icoslfc融合蛋白中观察到与同源结合配偶体结合的相似结果。这些结果表明，具有不同fc分子或不同接头的fc融合物的形式不影响icosligsf结构域变体与其同源结合配偶体的结合。另外，当在mlr反应中以溶液中的二价fc分子形式提供时，与不包含氨基酸取代的参考(例如未修饰的或野生型)ecd-fc分子相比，所有的fc融合形式表现出拮抗活性以降低t细胞活化。在一些情况下，在上清液中未检测到可检测的ifn-γ，这与共刺激性配体同源结合配偶体与其配体的相互作用以诱导ifn-γ分泌被完全阻断相一致。

实施例26

cho细胞中变体icosl分子的表达

作为如实施例5中所述在expi293细胞中表达变体icoslfc融合蛋白的替代方法，使用悬浮的中国仓鼠卵巢细胞(expicho-s)细胞产生各种icosl分子。使用编码示例性变体icosligsf(例如ecd)fc融合蛋白的dna构建体来转染细胞，该fc融合蛋白包含通过gsggggs接头(seqidno:635)与包含seqidno:477中所示的通过eu编号的突变c220s/l234a/l235e/g237a的惰性fc或seqidno:637中所示的其同种异型连接的变体(突变体)ecdn52h/n57y/q100r/f172s(seqidno:291)。

expicho-s细胞和用于使用expicho^tm表达系统进行转染的试剂购自thermofisherscientific(cat#a29133)。按照制造商推荐的方案对细胞进行解冻和扩增。至少2次传代后，将在转染前24小时使细胞分裂并使其扩增至高密度。然后将细胞稀释至用于转染的细胞数量，用expifectamine^tmcho试剂形成dna复合物，然后添加到细胞中。dna复合物添加后一天，将expicho^tm进料和expifectamine^tmcho增强剂添加到培养物中，然后将其置于32摄氏度的培养箱中。监测细胞活力和细胞质量，并在活力降至80％以下时收获培养物。然后将培养物低速离心以去除细胞沉淀，并将澄清的上清液进行0.2μm无菌过滤。如实施例5所述纯化蛋白质。

a.蛋白质分析

在sds-page上运行纯化的变体icoslfc融合蛋白，并通过蛋白染色进行分析。在由cho细胞而非293细胞产生的细胞中观察到多个条带，这与在cho细胞中表达时发生icosl的蛋白水解剪裁的观察结果一致。表30a描述了通过sds-page观察到的基于氨基酸序列计算的完整、单剪裁和双剪裁蛋白质的分子量和潜在碳水化合物的分子量。观察到在expicho-s衍生细胞中表达的icoslfc融合蛋白的蛋白水解，这通过两种具有较低分子量(单剪裁和双裁剪)的还原/非还原的剪裁的种类的存在来表明。基于观察到的条带大小和质谱分析，这些结果与对应于序列lqqn/lt的icoslecd中的潜在的切割位点一致(“/”表示潜在的切割位点)，从而导致在ecd的茎区域之前发生切割并去除fc融合蛋白的一条或两条链中的序列的fc部分。当在cho细胞中产生时，观察到的蛋白酶切割可导致异质蛋白产物。同样，对于表达为跨膜免疫调节蛋白的形式，在某些细胞中发生的蛋白酶切割可导致可溶性蛋白从细胞中释放出来，从而减少工程化细胞上的细胞表面表达形式的变体蛋白。

实施例27

含有icosligsf结构域的分子的耐蛋白水解变体的生成

为了使变体icosl多肽在细胞如cho细胞中表达后对蛋白水解具有抗性，产生了多种其他形式的变体icosl多肽。产生了以下icoslecd的额外修饰的参考序列：(1)缺少lqqn/lt蛋白酶切割位点的所有或一部分(指定为trunc#4、#5、#6、#7或#8)的各种ecd截短；(2)icosl变体参考序列，其在参考seqidno:32所示的位置的切割位点n207和/或l208处具有突变；或包含igv结构域作为分子的唯一igsf结构域(以seqidno:545示出，对应于seqidno:32的氨基酸1-122)的仅有igv的icosl。在一些情况下，在icoslecd参考序列中采用了以上策略的组合。下表30b列出了各种产生的参考序列。

将示例性突变n52h/n57y/q100r/f172s(参照seqidno:32中列出的编号)引入至各种参考序列中。因为seqidno:545中所示的参考icosligv不包含对应于f172s的位置，所以变体icosligv不包含突变f172s。将产生的变体icosl多肽格式化为fc融合蛋白，其包含经由(g4s)2接头(seqidno:229)连接至seqidno:633所示的包含通过eu编号的突变c220s/l234a/l235e/g237a/k447del的惰性fc或seqidno:637所示的其同种异型的所产生的参考icosligsf结构域。

a.蛋白水解评估

将编码上述变体icoslfc融合分子的dna构建体转染到中国仓鼠卵巢细胞(expicho-s)中。然后如实施例5中所述通过亲和层析使用蛋白a从上清液中纯化icoslfc融合蛋白。纯化的蛋白通过分析性sec进行分析。

通过sec，完整的蛋白质显示为单个峰，而剪裁的蛋白质显示为多个峰，包括较低分子量的种类。与实施例26中描述的sds-page结果一致，当变体icoslecdfc融合蛋白在expicho-s衍生的细胞中表达时，观察到通过sec评估的蛋白水解，如图22a中所示的多个峰所表示。如图22b-22g所示，通过使用修饰的参考icosl多肽生成的变体icoslfc融合蛋白的sec分析观察到单峰，其中推定的ecd蛋白酶切割位点被去除或突变，这表明发生了减少的蛋白切割。然而，在一个纯化批次中，由使用seqidno:604所示的参考icosl多肽生成的变体icoslfc融合蛋白(截短#5)的sec分析观察到了较低分子量的种类，尽管不清楚这些批次中存在这些种类的原因。如图22g所示，通过使用单独的icosligv参考序列生成的变体icoslfc融合蛋白的sec分析也未观察到较低分子量种类的生成，因此也未观察到蛋白水解。

b.结合和活性

比较了在cho细胞中转染编码上述各种参考序列的变体icoslfc-融合免疫调节蛋白的dna构建体后产生和纯化的蛋白的结合和活性。在一些情况下，后来发现如下文所评估的纯化克隆含有除上述突变之外的额外突变，并且不认为这些突变会影响测试蛋白质的免疫调节活性。

基本上如上所述，使用混合淋巴细胞反应(mlr)评估所得的纯化的变体icoslfc融合免疫调节蛋白与同源结合配偶体的结合以及对t细胞活性的调节。表30c显示了icosl参考序列中的氨基酸取代，其由与seqidno:32所示的各个参考(例如，未修饰的)icosl细胞外结构域(ecd)序列中的氨基酸位置对应的氨基酸位置编号表示，并且显示了每个icosl参考序列的seqidno标识符。如图所示，对于所有测试形式，结合和mlr拮抗剂活性基本相似。

c.在293(expi293)或cho细胞中表达的蛋白质的结合和活性

在293(expi293)或cho细胞中表达后，评估基于上述icosl参考序列生成的变体icoslfc融合蛋白的结合和活性。另外，编码表30d所示的示例性icosl参考序列中的示例性igsf结构域icosl变体n52h/n57y/q100r/c198r或n52h/q100r的dna构建体还与seqidno:477所示的包含通过eu编号的突变c220s/l234a/l235e/g237a的惰性fc连接，并在用dna构建体转染293或cho细胞后产生和纯化。另外，生成了示例性变体免疫调节蛋白作为单体，其中用编码变体icoslecd参考序列中的变体但未与fc序列融合的dna构建体转染细胞。

基本上如上所述，使用混合淋巴细胞反应(mlr)评估所得的纯化的变体icoslfc融合蛋白或变体icosl单体与同源结合配偶体的结合以及对t细胞活性的调节。表30d显示了变体icosl参考序列中的氨基酸取代，其由与seqidno:32所示的各个参考(例如，未修饰的)icosl胞外域(ecd)序列中的氨基酸位置对应的氨基酸位置编号表示，并且显示了每个参考icosl序列的seqidno标识符。第3列表示用于产生icosl蛋白的细胞类型(expicho-s或expi293)。如图30d所示，结果指示，无论变体icosl免疫调节蛋白在cho还是在293细胞中产生，都具有基本相似的结合和活性。

实施例28

icosligsf结构域变体的nnk变体文库的生成以及结合和活性评估

生成了在参照seqidno:32所示的位置的位置52、57和100处具有突变的另外的含变体icosligsf结构域的分子。这些变体是从nnk文库中生成的，其中k＝t或g，使得编码密码子编码所有潜在的氨基酸，但阻止了两个终止残基taa和tga的编码。基本上如实施例2所述将nnk文库dna引入酵母中以生成酵母文库。基本上如实施例3所述，使用该文库来选择表达亲和力修饰的icosl变体的酵母。

基本上如实施例4所述，除了包含经由gsggggs接头(seqidno:635)连接至seqidno:633所示的含有通过eu编号的突变c220s/l234a/l235e/g237a/k447del的惰性fc或seqidno:637所示的其同种异型的所产生的icosligsf结构域，将所选择的包含变体icosligsf结构域的分子进一步格式化为fc融合蛋白。

在结合研究中对变体icoslfc融合免疫调节蛋白进行评估，以评估对同源结合配偶体的结合。在如实施例6中所述的结合研究中将用同源结合配偶体(人cd28、icos和ctla4)转染的expi293细胞用作靶细胞。测定100nm变体icoslfc融合免疫调节蛋白与表达每种结合配偶体的靶细胞结合的mfi，并且与针对相同靶细胞的相应参考(例如，未修饰的或野生型)icosligv-fc的结合进行比较。还在如实施例6中所述的抗cd3(10mm)共固定化测定中评估了所生成的icosl变体fc融合分子的共刺激生物活性。还基本上如实施例6中所述通过使用1nmicosl-fc的混合淋巴细胞反应(mlr)来测定变体icoslfc融合免疫调节蛋白对t细胞活性的调节。确定从一式三份孔中的ifn-γ分泌。

表31显示了示例性变体icosligv-fc融合分子的基于共刺激生物活性或mlr测定的活性的结合和功能活性的结果。下表指示了变体icosl中的氨基酸取代，其由与seqidno:32所示的各个参考(例如，未修饰的)icosl胞外域(ecd)序列中的氨基酸位置对应的氨基酸位置编号指示。第2栏示出了变体igv-fc融合分子中包含的每个变体igv结构域的seqidno标识符。如同所示，使用在位置52、57和100处的特定突变的多种组合所生成的icosligsf(例如igv)结构域变体表现出对至少一种并且在一些情况下多于一种的同源结合配偶体的结合改变。该表的最后两列还描述了在mlr测定中基于培养物上清液中的ifn-γ的计算水平(pg/ml)的变体fc融合分子调节t细胞活性的功能活性，该培养物上清液是使用以下产生的：i)与抗cd3共固定化的指示的变体igv-fc融合可溶分子或ii)指示的变体igv-fc融合分子。该表还描述了在两种功能测定中每种变体ecd-fc产生的ifn-γ与相应参考(例如，未修饰的或野生型)ecd-fc相比的比率。变体fc融合蛋白还表现出改变的免疫学活性。一些变体分子的共刺激信号传导与野生型icosl相比显著更大。某些变体表现出对ifn-γ的实质性抑制，在mlr测定法中培养物中产生的可检测的ifn-γ非常低甚至没有。

实施例29

表达跨膜免疫调节蛋白(tip)的k562细胞的评估

k562细胞被工程化以表达跨膜免疫调节蛋白(tip)，其包含vigdicosl结构域的ecd，其与seqidno:5所示的wt人icosl的天然跨膜结构域和胞内结构域融合。示例性的变体icosl-tip具有亲和力修饰的igsf结构域，该结构域包含与参照seqidno:32所示的icosl细胞外结构域中的位置的n52h/n57y/q100p(seqidno:288)、n52h/n57y/q100r(seqidno:283)或e16v/n52h/n57y/q100r/v110d/h115r/y152c/k156m/c198r(seqidno:300)对应的氨基酸突变。

用cfse标记k562细胞(atcc)，以在共培养测定中更好地将它们与t细胞区分开。纯化的原代人t细胞用celltracefarred(二者均来自thermo-fisher)标记，并与抗cd3抗体共同铺板在96孔圆底组织培养板中。为了为t细胞提供tcr信号，以可溶形式包含一定浓度范围内的抗cd3抗体，该浓度允许k562通过细胞表达的fc受体cd32呈递这种刺激性抗体。将细胞孵育72小时，并监测cd4+(图23a)和cd8+(图23b)的增殖，并报告为分裂细胞百分比相对于抗cd3浓度。每个点代表三次重复的平均值，误差线表示标准偏差。

当与可溶性抗cd3抗体以剂量依赖性方式共同孵育时，野生型k562细胞刺激t细胞增殖，而在没有抗cd3的情况下k562细胞则不刺激t细胞增殖。如图23a和23b所示，wticosltip在表面上的表达增强了应答，但是当k562细胞表达变体icosltip时效果更大，这指示这些在细胞表面上表达的分子为t细胞提供了出众的共刺激。

实施例30

具有her2靶向抗体的融合分子的结合和共刺激功能的评估。

如图24a-24f所示的各种构型所示，将包含突变n52h/n57y/q100r的示例性变体icoslecd融合至示例性抗her2抗体(曲妥珠单抗)的重链或轻链的n或c末端。编码图24a-24f中所示的每个构建体的vmabsdna被转染到hek-293细胞中，并通过蛋白a和尺寸排阻色谱法纯化分泌的蛋白。接下来评估所得的v-mab蛋白的适当结合特性的保留。用her2、cd28或icos表达载体瞬时转染hek-293细胞，然后将每种转染子与单独的v-mab蛋白和用于检测结合的试剂的第二抗体孵育。如图24a所示，尽管结合的程度稍微降低，但是所有v-mab都保留了her2结合。此外，v-mab与cd28转染的细胞的结合很大程度上是完整的，尽管少数形式显示出结合的稍微降低(图24a)。该数据指示，与抗体重链和/或轻链融合以形成融合蛋白的icosl变体大大保留了反结构和抗体结合活性。

为了测试vmab是否能够驱动t细胞的靶特异性共刺激，使用了包括用于测量共刺激的t细胞报告子的转染细胞系统。具有il-2启动子萤光素酶报告基因的jurkat细胞用于评估共刺激功能。为了刺激细胞，k562细胞经工程化用作人工抗原呈递细胞。具体地，在用或不用指导her2表达的单独的慢病毒转导的情况下，用编码单链fv形式的抗cd3抗体okt3的慢病毒转导k562细胞。将有或没有表面her2表达的展示细胞表面抗cd3单链fv(okt3)的k562细胞以2x10⁴个细胞/孔接种在jurkat测定缓冲液(rpmi1640+5％fbs)中。将靶细胞与从20,000pm至6pm滴定的v-mab或对照蛋白在室温下孵育20分钟。以1x10⁵个细胞/孔的量加入表达il-2-萤光素酶报告基因的jurkat效应细胞(promega)，使最终体积/孔达到100μl。将靶细胞和jurkat细胞在37℃下孵育5小时。从培养箱中移出板，并适应至室温持续15分钟。向每个孔中加入100μl细胞裂解物和萤光素酶底物溶液(bioglo萤光素酶试剂，promega)，并将板在定轨振荡器上孵育10分钟。使用cytation3成像读取器(biotekinstruments)，以1秒每孔的积分时间(integrationtime)测量发光。确定每个测试样品的相对发光值(rlu)并报告。

如图24b所示，天然曲妥珠单抗的包含对萤光素酶诱导没有影响。类似地，变体icosl-fc蛋白n52h/n57y/q100r(未与曲妥珠单抗融合)的包含也不影响应答(图24b)。然而，在存在her2+k562/okt3细胞的情况下，多个v-mab的包含提供了显著的共刺激信号，该信号比缺少her2表达的k562/okt3情况下的共刺激信号强得多(图24c-24f)。在一些情况下，在缺少her2的k562/okt3细胞中诱导了信号，但这最可能是由于v-mab的fc结构域，该fc结构域允许cd32介导的v-mab呈递。结果指示，将变体icosl多肽与抗体融合可用于递送局部t细胞共刺激信号。

实施例31

包含icosl和nkp30亲和力修饰的结构域的堆叠分子的生成

该实施例描述了作为多结构域堆叠构建体生成的免疫调节蛋白，该构建体包含来自上述经鉴定的变体icosl多肽的和来自经鉴定的变体nkp30多肽的亲和力修饰的igv结构域。具体地，将示例性变体icosligv(如seqidno:548所示的n52d；如seqidno:567所示的n52h/q100r；如seqidno:565所示的n52h/n57y/q100r；如seqidno:761所示的n52l/n57h/q100r)和示例性变体nkp30igv分子l30v/a60v/s64p/s86g(seqidno:504)连接在一起并以多种构型融合至惰性fc(包含人igg1fc(例如seqidno:637所示的)中的突变l234a、l235e和l235e)。生成包含相同fc亚基的同二聚体构建体，其中变体icosligv和变体nkp30igv经由gsgggs(seqidno:635)和/或3xggggs(seqidno:228)肽接头不同地与fc区的n末端或c末端连接。其他接头和fc区也适合于生成堆叠分子。示例性的生成的堆叠物在下文示出。

编码免疫调节蛋白的核酸分子还包含编码示例性信号肽mgstailalllavlqgvsa(seqidno:225所示)的残基。使用制造商的商用expifectamine试剂和培养基，在来自invitrogen的expi293hek293细胞中瞬时表达了编码感兴趣的fc融合蛋白的表达构建体。收获上清液，使用akta蛋白质纯化系统捕获蛋白质并从蛋白a柱洗脱。

设计编码核酸分子产生同二聚体堆叠物，该堆叠物的多种序列构型按顺序在表32中示出。

实施例32

包含icosl和nkp30结构域的堆叠分子的与细胞表达的反结构的结合和生物活性的评估

该实施例描述了结合研究，以显示在实施例31中生成的示例性icosl/nkp30堆叠免疫调节蛋白对同源结合配偶体的特异性和亲和力。还评估了实施例31中生成的示例性icosl/nkp30堆叠免疫调节蛋白在人原代t细胞体外测定中的生物活性表征。

a.与细胞表达的反结构的结合

在具有对icosl结构域变体免疫调节蛋白或nkp30-fc特异的同源结合配偶体的稳定或瞬时细胞表面表达的细胞上进行了icosl/nkp30堆叠结合研究。

为了评估与变体icosl结构域与结合配偶体的结合，使用已经被慢病毒转导的中国仓鼠卵巢细胞(cho)用于表面表达全长人cd28、ctla-4或icos。

为了产生表达nkp30的同源结合配偶体的细胞，将含有人b7-h6的全长哺乳动物表面表达构建体克隆到pcdna3.1表达载体(lifetechnologies)中。使用expi293f瞬时转染系统(lifetechnologies美国)进行结合研究。简而言之，对于30ml转染，将大约7千5百万个expi293f细胞与30μg表达构建体dna和1.5ml稀释的expifectamine293试剂孵育48小时，在该时间点收集细胞进行染色。

为了进行流式细胞术分析，将200,000个给定的稳定细胞系、瞬时转染或合适的阴性对照接种在96孔圆底板中。将细胞离心下降并悬浮于染色缓冲液(pbs(磷酸盐缓冲盐水)、1％bsa(牛血清白蛋白)和0.1％叠氮化钠)中20分钟以阻断非特异性结合。然后，将细胞再次离心，并悬浮在含有100nm至32pm的icosl/nkp30堆叠或对照蛋白的50μl染色缓冲液中。在染色缓冲液中洗涤细胞两次之前，进行初次染色45分钟。用50μl染色缓冲液中以1：150稀释的pe缀合的抗人igg(jacksonimmunoresearch，美国)检测结合的蛋白，并孵育30分钟。最终孵育后，将细胞洗涤两次以除去未结合的缀合抗体，将其固定在2％甲醛/pbs中，并在lsrii(bectondickinson，美国)流式细胞仪上进行分析。使用flowjo版本10软件(flowjollc，美国)计算每个样品的平均荧光强度(mfi)。

对所有icosl-nkp30fc融合蛋白或对照评估通过mfi测量的结合活性。如图25a-25d所示，示例性的堆叠蛋白以高亲和力结合icosl和nkp30二者的同源蛋白。

b.评估亲和力成熟的包含igsf结构域的分子的生物活性

在与用于诱导人原代t细胞中细胞因子产生的b7-h6+细胞的共培养物中测试了可溶性icosl/nkp30堆叠蛋白的生物活性。用慢病毒转导内源性表达b7-h6的k562细胞，以表达细胞表面抗人cd3单链fv(okt3)，产生k562/otk3靶标。在200μl最终体积的ex-vivo15培养基中将人原代t细胞与从100nm至49pm滴定的icosl/nkp30堆叠蛋白或对照蛋白以2.5或10:1的效应细胞:靶标(e：t)比率共培养。在第3-5天，终止测定，并使用il-2和tnf-αelisamax试剂盒(biolegend美国)测试培养上清液。在biotekcytation多模式微孔板读取器(biotekcorp.美国)上测量光密度，并相对于elisa试剂盒中包括的滴定的ril-2和rtnf-α标准品进行定量。

示例性测试的icosl/nkp30堆叠蛋白的生物活性研究的结果显示在图26a和26b中，其示出了培养上清液中的il-2或ifn-γ的计算水平(pg/ml)。在图26a和26b中示出了每种堆叠蛋白的序列标识符(seqidno)。在该测定中在示例性icosl/nkp30堆叠蛋白的存在下孵育导致原代人t细胞中b7-h6依赖的细胞因子诱导的水平升高，这是通过与仅亲本icosl或nkp30蛋白相比icosl/nkp30堆叠导致细胞因子产生增加而证明的。

c.评估增殖

还表征了与icosl/nkp30堆叠蛋白和b7-h6+细胞共培养的人t细胞的增殖。在icosl/nkp30堆叠蛋白或对照蛋白的存在下，用k562/okt3以2.5至10:1的e:t比率将cfse标记的人原代t细胞刺激3-5天。在最终体积为200μl的ex-vivo15培养基中，将示例性icosl/nkp30堆叠蛋白从100nm滴定至49pm。如上所述，使用lsrii流式细胞仪和flowjo软件通过对cd4+或cd8+染色的t细胞的cfse稀释的流式细胞术分析来测量增殖。

如图27所示，示例性测试的icosl/nkp30堆叠蛋白以依赖b7h6的方式共刺激了原代人cd4+t细胞的增殖，这是通过与仅亲本icosl或nkp30蛋白相比icosl/nkp30堆叠的增殖增加而证明的。

实施例33

在肿瘤模型中评估包含icosl和nkp30结构域的堆叠分子与抗pd-1抗体的组合

该实施例描述了如实施例31中所述生成的示例性icosl/nkp30堆叠蛋白的抗肿瘤活性的评估，其在携带b7-h6+ct26结肠癌细胞的小鼠中单独进行评估或与抗小鼠pd-1单克隆抗体(mpd-1mab)组合进行评估。

将大约0.3x10⁵个b7-h6+ct26肿瘤细胞皮下植入小鼠。肿瘤生长至第13天，将小鼠分期并测量平均肿瘤体积(80至120mm³)。从肿瘤细胞植入后第6天开始，用电子卡尺二维测量肿瘤。测量肿瘤体积，并确定中值肿瘤体积。从分析中排除了具有最小起始肿瘤(～75mm³)的三只小鼠/组。

如图28所示，与用fc对照(仅icosl或nkp30)、仅icosl/nkp30堆叠或仅抗小鼠pd-1mab治疗的组相比，测试的icosl/nkp30堆叠蛋白和mpd-1mab的组合随时间推移显著降低了肿瘤生长(中值肿瘤体积)。未观察到任何具有亲本ct26(b7-h6阴性)肿瘤的治疗组的结果存在差异。如图28所示的该组合的抗肿瘤活性与所测试的icosl/nkp30堆叠蛋白和抗pd-1抗体的组合优于仅单独试剂的发现相一致。

实施例34

在cia模型中评估icosligv-fc融合分子的剂量和体内作用

使用预防性或治疗性剂量在胶原诱导的关节炎(cia)模型中评估了变体icosligv-fc融合分子的抗炎活性。在疾病发作之前或发作之后即时，将变体icosligv-fc融合分子给药最多4次。所测试的变体icosligv-fc融合分子包含与惰性fc(含有人igg1fc(例如seqidno:637所示的)中的突变l234a、l235e和l235e)融合的变体icosligv(具有如seqidno:570所示的n52h/n57y/q100p或如seqidno:565所示的n52h/n57y/q100r)。

为了诱导关节发炎，在第-18或-21天向小鼠的尾巴中注射鸡或牛胶原ii/cfa乳剂，并在第0天注射鸡或牛胶原ii/ifa乳剂(“加强免疫”)。为了预防性给药，在疾病发作之前从加强免疫日开始以四剂给小鼠给药变体icosligv-fc融合分子(n52h/n57y/q100p)。对于治疗性/延迟治疗，当观察到的爪得分大于1时，开始给小鼠给药变体icosligv-fc融合分子((n52h/n57y/q100r)，每两天给药，共四剂。作为对照，还测试了仅fc的分子和ctla-4-fc(阿巴西普)分子。确定基于发红和肿胀的爪得分。还收集血清以测量抗胶原(ciiigg)抗体以及il-6和tnfα促炎细胞因子。收集来自引流淋巴结的细胞，对cd4、cd8、cd44或t滤泡辅助(tfh)细胞的标志物(cd25-cd4+pd-1+cxcr5+)进行染色。图29a-29d显示了预防性给药的结果。在类风湿性关节炎的cia小鼠模型中在预防性给药治疗中用变体icosligv-fc融合分子治疗的小鼠显示出疾病抑制，如较低的平均总爪得分(图29a)和降低的检测到的ciiigg(图29b)所表明的。*p<0.05对于icosligv-fc相比于阿巴西普；**p<0.001对于icosligv-fc相比于pbs(通过两因素重复测量anova)。与fc对照相比，在用变体icosligv-fc融合分子治疗的小鼠中还观察到较低水平的血清细胞因子(图29b)和cd44+活化的t细胞或tfh细胞(图29d)；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001(通过单因素anova)。在icosligv-fc治疗组中的引流淋巴结中的b细胞级分相比于fc对照组也是显著减少的(图29e)。

图30a-30d显示了延迟给药的结果。与包括阿巴西普对照在内的其他组相比，变体icosl-igvfc导致最低的平均总爪得分(图30a)和最大的体重变化百分比(图30b)。如图30c和图30d所示，在用变体icosigv-fc治疗的小鼠中，在治疗性cia模型中血清细胞因子也被抑制。组间的统计学显著性：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001通过学生非配对t检验。在图30c和图30d中，水平虚线表示每种细胞因子的测定量化下限(lloq)。

总之，这些数据证明cd28和icos途径在炎性关节炎中起重要作用。特别地，变体icosl双cd28/icos拮抗剂的优异活性与以下观察结果一致：即阻断这两个途径是必需的以及通过单一途径阻断仅实现部分益处。

实施例35

在eae模型中评估icosligv-fc融合分子的体内作用

在过继转移实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)模型中评估了变体icosligv-fc融合分子的抗炎活性。测试的变体icosligv-fc融合分子，其包含与惰性fc(其含有人igg1fc中的突变l234a、l235e和l235e)融合的变体icosligv(n52h/n57y/q100r；seqidno:565)。

给雌性c57bl/6小鼠皮下注射mog35-55/cfa乳剂。11天后，获得脾细胞，并用mog35-55肽、il-12和抗ifnγ培养。培养后三天，经由腹膜内注射递送致脑炎性t细胞(第0天)。从第0天开始，每隔一天对小鼠给药变体icosligv-fc融合分子共五剂。作为对照，还测试了仅fc的分子和ctla-4-fc分子(阿巴西普)。注射t细胞后20天，称重、监测和评估小鼠的如表33中所述的eae得分。研究结束时，收集血清以分析促炎性细胞因子，并收集来自引流淋巴结的细胞用于流式细胞术分析。

如图31a所示，在eae小鼠模型中用变体icosligv-fc融合分子治疗的小鼠抑制了疾病，如较低的eae得分所表明的，通过单因素anova曲线下面积(auc)*p<0.0001；变体icosligv-fc融合分子与对照相比。

对于腹股沟淋巴结t细胞的流式细胞术分析，将细胞用存活力染料染色并用抗cd44、抗cd62l、抗cd4、抗cd8进行分析，并评估存活幼稚的(cd62l+cd44-)和t效应记忆(tem)(cd62l-cd44+)cd4+和cd8+t细胞的百分比。如图31c所示，用变体icosligv-fc融合分子治疗可减少cd4+和cd8+tem细胞(通过单因素anova****p<0.0001；***p<0.001)。

在第0天(第一次给药后2小时)和第6天(第四次给药前1小时)评估血清细胞因子。如图31d所示，测试的变体icosligv-fc融合分子导致第0天血清中促炎细胞因子的减少，包括il-5、il-10、il-12p70和tnfα。在第6天，与fc对照相比，用变体icosligv-fc融合分子治疗降低了ifn-γ和il-6的血清水平。

实施例36

移植物抗宿主疾病模型(gvhd)中变体icosl-igvfc的剂量范围研究

在移植物抗宿主疾病(gvhd)的小鼠模型中使用20、100或500μg的变体icosligv-fc分子进行剂量范围研究，所述变体icosligv-fc分子包含与惰性fc(含有人igg1fc(例如seqidno:637所示的)中的突变l234a、l235e和l235e)融合的变体icosligv(n52h/n57y/q100r；seqidno:565)。将变体icosligv-fc分子的活性与贝拉西普(ctla-4-fcl104e/a29y；美国专利申请公开号us2016/0271218)进行了比较。

雌性nsg小鼠(第1组，每组n＝5，未治疗；第2-7治疗组，每组n＝10)被皮下施用10mgγ球蛋白，然后在第-1天辐射(100cgy/rad)。在第0天(辐射后24小时内)，给第2-7组的小鼠给药表34中所示的测试物品，然后给药后所有小鼠接受经由尾静脉的静脉内注射1x10⁷个人pbmc。

通过在研究期间每周评估小鼠三次并基于小鼠的体重减轻、姿势、活动、毛皮和皮肤的外观对疾病进行评分，来确定疾病活动指数(dai)。研究在第42天终止后，评估了存活、体重减轻和疾病活动的终点测量结果。生成了代表存活到研究终点的动物的百分比的kaplan-meier生存图，并通过mantel-cox和gehan-breslow-wilcox检验(95％ci)分析了存活曲线比较。在研究结束时(第42天)从存活的小鼠中采集血液/血清样本，并通过流式细胞术评估细胞中的t细胞标志物，包括小鼠或人标志物、cd4、cd8、cd28、icos、活化或衰竭标志物(pd-1、ki67)和foxp3(treg的标志物)。还评估了血清促炎细胞因子(例如ifn-γ、il-10、il-12(p70)、il-17a、il-4、il-5和tnfα)的水平。

图32a-32b显示了根据每种给药时间表治疗的gvhd小鼠的存活和dai得分。如同所示，在所有测试的剂量水平下的测试变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)与用贝拉西普治疗的小鼠相比，显著提高了存活(图32a)并降低了疾病得分(图32b)(即第42天的存活分别为100％对比40％率；通过mantel-cox对数秩检验p<0.01)。值得注意的是，单剂量(100μg)变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)的施用与重复给药100μg贝拉西普具有相似的防止疾病的作用。

研究结束时采集的血液的流式细胞术分析证明了，测试的变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)有效抑制了转移的人t细胞的扩增(如由人细胞/小鼠细胞比率降低而观察到的)(图33a)和较大程度上减少了总t细胞计数(图33b)。如图33c-33f所示，在对icos(图33c-33d)和cd28(图33e-33f)共染色的cd4+和cd8+t细胞研究结束时收集的血液的流式细胞术染色证明，在用变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)治疗的组中无染色，尽管在接受贝拉西普治疗的小鼠中可以容易地检测到表达icos的cd4+和cd8+t细胞。这些结果与icosligv-fc治疗的小鼠中缺少t细胞剩余相一致，以及与变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)的结合其靶分子cd28和icos以及阻断通过流式细胞术抗体对它们进行检测的能力相一致。通过使用抗人iggfc的检测，证实了变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)在少量剩余的人t细胞上的结合。值得注意的是，虽然大多数转移的人t细胞最初表达cd28，而只有10-20％是icos+，但是在研究终止/结束时，在盐水或贝拉西普治疗的小鼠中剩余的活化t细胞却>80％icos+。

在用变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)治疗的组中，t细胞的活化或耗竭标志物的存在被抑制，如cd4+和cd8+t细胞中pd1的较低表达和在cd4+t细胞中降低的ki67表达所证明的(图34a-3b)。与贝拉西普相比，在用变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)治疗的组中，效应t细胞与treg的比率保持稳定(图34c)。与贝拉西普相比，在用变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)治疗的组中，血清促炎细胞因子也被抑制(图35a-35d)。

还进行了药代动力学(pk)分析以监测变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)的血清暴露。使用抗人icoslmab捕获抗体和fc特异性小鼠抗人igg作为检测试剂，使用定量pkelisa测量小鼠血清样品中测试物品的浓度。

在单独的研究中确定，在gvhd模型中的观察到的变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)的血清暴露比正常小鼠的变体icosligv-fc血清暴露低45％(图35e)。在gvhd模型中，变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)的终末半衰期较长，可能是由于在gvhd的较晚时间点靶点(cd28、icos)减少(因为人t细胞消失)和/或由于正常小鼠中抗药物抗体(ada)的形成，这可能会干扰药物暴露。与正常小鼠相比，变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)具有较低的血清暴露的观察结果，可能是由于gvhd模型中的靶标介导的药物处置(tmdd)(即，其对人cd28和icos的亲和力比对小鼠直系同源物的亲和力更高)和/或由于在此模型中使用的nod/scid(nsg)小鼠中缺少fcrn。

总之，这些结果与以下观察结果相一致：即变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)表现出有效的拮抗剂活性(即使仅单剂量)和优于贝拉西普的活性。该观察结果可归因于变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)表现出对icos+t细胞的优异控制，否则icos+t细胞逃避单个icos或cd28途径阻断，如用cd28途径拮抗剂贝拉西普所实现的。

实施例37

在cd4+cd45rb高诱导性结肠炎模型中评估变体icosl-igvfc

在cd4+cd45rb高诱导性结肠炎模型中评估了示例性变体icosligv-fc对疾病发展的作用，该示例性变体icosligv-fc包含与惰性fc(包含人igg1fc(例如seqidno:637所示)中的突变l234a、l235e和l235e)融合的变体icosligv(n52h/n57y/q100r；seqidno:565)。

通过阴性选择从获得自15只雄性balb/c供体小鼠的脾细胞悬浮液中富集cd4+cd45rb高供体细胞。在第0天，将30万个cd4+cd25-cd45rb高(treg耗尽的)供体细胞静脉注射到免疫缺陷的c.b17(scid)小鼠中(每组n＝12或21)以诱导结肠炎。作为对照，将在该模型中不诱发结肠炎发展的30万个cd4+细胞(包含treg细胞)注射到scid小鼠受体中(n＝12)。在细胞转移的当天，给每组中的小鼠给药变体icosl-igvfc或仅fc或媒介物对照。表35总结了测试组的治疗方案。

每周评估三次体重(从第0天开始进行)和粪便稠度得分(从第10天开始进行)。根据体重和粪便得分计算每日疾病活动指数(dai)。在第42天终止研究后，收集结肠用于确定长度和重量以及组织学分析。使用双尾学生t检验评估了变体icosl-igvfc治疗组相对于媒介物组的终末体重和终末结肠重量以及长度的统计学分析。使用wilcoxon非参数t检验比较粪便得分和dai得分。

dai结果示于表36(dai)和图36a中，结肠测量结果示于表37中，结肠组织学结果示于表38和图36b中。如图所示，在该模型中，测试的变体icosligv-fc(n52h/n57y/q100r)表现出显著减少的结肠炎发展，这与这种双重cd28/icos拮抗剂有效治疗炎性肠病(ibd)的效用相一致。

^与未诱发结肠炎/媒介物相比

*与媒介物相比

～与fc对照，300μg相比

^与未诱发结肠炎/媒介物相比

*与媒介物相比

～与fc对照，300μg相比

本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施例例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不脱离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践这些变化，并且这些变化旨在落入本公开文本的范围内。