miRNA分子，等同物，安塔够妙或其来源用于治疗和/或诊断与神经元缺陷相关的病症和/或疾病或用于神经元生成和/或再生的制作方法

本发明涉及mirna分子，等同物，安塔够妙(antagomir)或其来源用于治疗和/或诊断神经元缺陷或用于神经元生成和/或再生。发明背景神经元功能不足与多种疾病或病症有关。例如，认知障碍，神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病，或创伤性脊髓损伤的特征在于神经元及其连接丧失。当前的治疗选择仍然非常有限，并且显示出有限的效力。为了暂时恢复(restore)完整的神经元功能(神经修复)，考虑了不同的治疗方法(enciu等,bmcneurology2011,11:75；kraev等,plosone,2011年8月10日,第6卷,第8期)。神经可塑性可以得到改善。神经可塑性是说明大脑在结构和功能上适应环境增强的能力的综合术语。神经可塑性对于认知能力如学习和记忆形成尤其重要。神经元再生可以得到改善。这意味着通过内源性干细胞/祖细胞的增殖或通过给予具有替代丢失组织潜能的外源性干细胞/前体细胞而产生的新神经元或新透射(projection)将分化，存活并整合到现有的神经网络中。可以使用生长因子(神经生长因子(ngf)，脑源性神经因子(bdnf)，神经胶质源性神经因子(gdnf))及其对神经元细胞的促生存作用来促进神经保护。神经突延伸或神经突生长在胚胎发育、神经元分化和神经系统功能中起基本作用。神经突生长在一些神经病理学疾病以及神经元损伤和再生中同样至关重要。各种神经突参数，包括神经突长度和数量，对胞内或胞外环境和药理学试剂敏感。视黄酸，班纳辛(plannexin)和神经肽甘丙肽是这些候选物的实例，它们能够诱导神经元细胞的神经突生长。然而，人们对于神经损伤后调节成人神经元再生的机制和因素仍然知之甚少。对于外周神经的损害导致感觉神经元细胞体内的重大变化，据信通过刺激神经突生长并增强受损神经元的存活来促进再生。另一种神经元功能障碍是癫痫(epilepsy)。癫痫是一种慢性神经障碍并且其特征在于复发性无故发作(seizure)，这是由于脑内的异常和同步神经元放电所引起的(chang和lowenstein,2003)。在一些情况中，癫痫由单个基因突变所导致，主要是编码离子通道的基因，但是大多数癫痫的原因尚不清楚。颞叶癫痫(tle)是癫痫的一个亚类，约占所有癫痫患者的三分之一(engel,2001)。它由几个亚组组成，其中以颞叶癫痫并合海马硬化(mtle-hs)是最严重的一种。mtle-hs具有典型的诊断，临床和病理特征(神经元丢失，神经胶质增生和轴突出芽)，并且已知对药理治疗最有耐药性(wieser和epilepsy，2004)。对于许多患者而言，手术切除海马体是实现发作控制的唯一选择(semah等,1998)。tle的病理机制很大程度不清楚。抗惊厥和抗癫痫药用于治疗这些患者。但是不幸的是，这些方法只能减少发作的发生，而不能治疗潜在的病理生理。因此，迫切需要针对这种残疾状况开发新的治疗策略。研究界和临床实践日益意识到开发疾病调修药物的需求(loscher等,2013)。mtle的病理机制很大程度上仍然不清楚。癫痫动物模型和人组织研究表明，癫痫发生涉及分子，细胞和神经元网络级联改变(rakhade和jensen,2009)。从转录组开始的方法表明，人mtle中(vangassen等,2008)以及tle的动物模型中癫痫发生期间(gorter等,2006；pitkanen和lukasiuk,2009；rakhade和jensen,2009)，基因表达的模式发生了显著地改变。这种失调作用影响了通常控制基于表达的整个基因调节网络，所述基因表达调节涉及炎症，神经胶质增生，突触结构和神经元功能的途径。对于这些机制是否发生改变或者如何发生改变的理解，不仅可以为tle的发病机理提供重要的新见解，而且还可以产生用于治疗的新靶点。用于管理癫痫的已知药物的实例是拉莫三嗪(lamotrigine)，苯妥英(phenytoin)，卡马西平(carbamazepine)，左乙拉西坦(levetiracetam)，奥卡西平(oxcarbazepine)，氯巴占(clobazam)，地西泮(diazepam)，劳拉西泮(lorazepam)，思瑞康(seroquel)，普瑞加巴林(pregabaline)和羟基安定(restoril)。这些药物通常是抗癫痫或抗惊厥剂。例如，拉莫三嗪抑制谷氨酸和天冬氨酸的释放，谷氨酸和天冬氨酸是cns中两种主要的兴奋性神经递质；据信苯妥英通过引起电压门控的钠通道的电压依赖性阻断而防止癫痫发作。卡马西平和奥卡西平是钠通道阻断剂，左乙拉西坦抑制突触前的钙通道。氯巴占是一种gabaa受体激动剂，并且可能影响钠通道和电压敏感性钙通道。这些药物通常易于导致药物之间的相互作用，因为它们经由例如cyp2c19、cyp3a4和cyp3a5被新陈代谢。同时，他们主要治疗症状，而非癫痫的根本原因。微小rna(mirna)是小rna分子，大约20-22个核苷酸长。它们充当翻译阻抑物，从而控制许多细胞过程。在人类中，已鉴定出约1500种mirna，其中约50％存在于脑中。这表明这些mirna是各种神经元发育和维持的一部分；然而，尚不清楚大多数mirna的实际功能。描述了几种脑特异性mirna，其中mir-124最广泛的。当与人相比时，由于家猪在大脑发育和生长曲线上与人的相似性，因此认为家猪是人相关神经学研究的优秀、替代、大型哺乳动物模型。考虑到这些相似性，已经进行了检验猪脑发育过程中微小rna表达的研究，以预测人脑中微小rna的表达谱和作用(podolska等,plosone.2011年1月6日；6(1):e14494,doi:10.1371/journal.pone.0014494)。通过微阵列分析检测了许多发育阶段或组织特异性微小rna，包括mir-17，mir-18a，mir-29c，mir-106a，mir-135，mir-221和mir-222。然而，到目前为止，尚未鉴定出神经元发育中的生物学功能。已知至少两种mir-135，即mir-135a和mir-135b。已经报道了癌细胞中mir-135家族的主要描述，如调节结直肠癌中的腺瘤性结肠息肉病(adenomatouspolyposiscoli)基因(meijer和agami,cancerres2008；68(14):5795–802)。腺瘤性结肠息肉病(apc)基因的失活是结直肠肿瘤发生的主要启动事件。apc中的大多数突变产生提早终止密码子，进而导致丢失了β-连环蛋白结合位点的截短蛋白质。不含apc的β-连环蛋白刺激wnt信号转导途径，导致靶基因的活性转录。mir-135a和mir-135b靶向apc的3'非翻译区，抑制其表达并诱导下游wnt途径活性。有趣的是，结直肠腺瘤和癌中mir-135a和mir-135b的可观上调与低apcmrna水平显著相关。无论apc的突变状态如何，这种基因相互作用也在表达mir-135a和mir-135b的成熟癌细胞系中保留。还报道了mir-135a有助于肿瘤细胞的抗癌药耐药性(holleman等,2011oncogene)。mirna阵列用于筛选紫杉醇耐药性细胞系中差异表达的mirna。在紫杉醇耐药性体内模型中评估了mirna-135a的作用。在体外或体内建立的紫杉醇耐药性细胞系中，mir-135a的阻断使耐药性细胞系对紫杉醇诱导的细胞死亡敏感。mir-135a的上调与腺瘤性结肠息肉病基因(apc)的表达减少有关。apc敲减增加了亲本细胞系的紫杉醇耐药性。这些结果表明无论体外和体内，紫杉醇耐药性与mir-135a上调相关联。mirna-124在神经损伤的运动神经元中下调，并且可能靶向klf6和stat3的mrna(nagata等,doi:10.1016/j.neuroscience.2013.10.055)。而且，已经证明了hdac5作为神经突延长的抑制剂，并且hdac5通过脑富集的微小rnamir-124调节(gu等,doi:10.1002/jcp.25927)。此外，真涡虫(planarian)(扁虫)的大脑再生通过基因表达的精确时空控制所介导，并且对于神经发生的多个方面至关重要。sasidharan等(doi:10.1242/dev.144758)已经报道了mir-124家族的微小rna在真涡虫脑再生中的作用。mir-124家族(mirna-124)在动物中高度保守并调节神经发生。需要更好的诊断标志物，用于评估神经元细胞的生成或再生，以及更好的策略，用于促进神经元细胞的生成，再生或功能。发明详述本发明专注于mirna家族，其促进神经元细胞生成或再生并促进神经元细胞功能的恢复，并且其可用于与神经元缺陷相关的疾病和/或病症的治疗和诊断活性。该发明涵盖了本文所示mirna分子，模拟物(mimic)，isomir，或安塔够妙或其来源的多种用途。该发明还涵盖了各种新发现的mirna分子，分子模拟物，isomir或安塔够妙本身，以及根据本发明用途的各种mirna分子，模拟物，isomir或安塔够妙。在第一方面中，本文提供了mirna，安塔够妙或其来源，用于治疗、逆转(revert)、预防、治愈(cure)和/或延缓神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病和/或病症，其中所述mirna或安塔够妙是mirna分子，isomir或其模拟物，并且是具有种子序列的寡核苷酸，包含seqidno:14-56所示种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，或是其安塔够妙，其中所述mirna或安塔够妙是：mirna-135或其isomir，或其模拟物，或其安塔够妙，或mirna-196a-5p或其isomir，或其模拟物，或其安塔够妙。使用的这类mirna，安塔够妙或其来源在本文中称之为根据本发明的mirna，安塔够妙或其来源。在优选实施方式中，mirna，安塔够妙或其来源用于治疗、逆转、治愈和/或延缓神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病和/或病症。在优选实施方式中，提供了mirna，安塔够妙或其来源，用于治疗、逆转、预防、治愈和/或延缓神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病和/或病症，其中所述mirna是mirna分子，isomir或其模拟物，并且是具有种子序列的寡核苷酸，包含seqidno:14-56所示种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，或其安塔够妙，其中所述mirna或安塔够妙是：mirna-135a或其isomir，或其模拟物，或其安塔够妙，或mirna-135b或其isomir，或其模拟物，或其安塔够妙，或mirna-196a-5p或其isomir，或其模拟物，或其安塔够妙。在特定优选实施方式中，本发明提供了mirna-135的安塔够妙，或这类安塔够妙的来源，用于治疗、逆转、防止、治愈和/或延缓癫痫，其中所述mirna-135是mirna-135分子或mirna-135isomir，并且是具有种子序列的寡核苷酸，包含seqidno:14-17、9-42、52-56所示种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，或是其来源。在本发明的优选实施方式中，本发明提供了根据本发明用途的mirna，安塔够妙或其来源，其中所述mirna或安塔够妙是mirna-135a分子，mirna-135b分子，mirna-196a-5p分子，mirna-135a的isomir，或mirna-135b的isomir，mirna-196a-5p分子的isomir，mirna-196a-5pisomir，mirna-135a的安塔够妙，mirna-135b的安塔够妙，mirna-196a-5p的安塔够妙，或其模拟物。更具体地，在优选实施方式中，本发明提供了根据本发明用途的mirna，安塔够妙或其来源，其中所述mirna或安塔够妙是：i)mirna-135a分子，mirna-135b分子，mirna-196a-5p分子，mirna-135a的isomir，mirna-135b的isomir，mirna-196a-5p的isomir，mirna-135a的安塔够妙，mirna-135b的安塔够妙，mirna-196a-5p的安塔够妙，或其模拟物，或ii)mirna-135a分子，mirna-135b分子，mirna-196a-5p分子，mirna-135a的isomir，mirna-135b的isomir，mirna-196a-5p的isomir，或其模拟物，或iii)mirna-135a分子，mirna-135b分子，mirna-135a的isomir，或mirna-135b的isomir，或任选地，其模拟物，或iv)mirna-196a-5p分子，mirna-196a-5pisomir，或其模拟物，或v)mirna-135a安塔够妙，mirna-135b安塔够妙，或模拟物。在其他实施方式中，本发明提供了根据本发明用途的mirna，安塔够妙或其来源，其中mirna的来源是mirna的前体并且是长度为至少50个核苷酸的寡核苷酸，优选其中安塔够妙的来源是长度为至少50个核苷酸的寡核苷酸。在该方面的优选实施方式中，提供了mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p分子，模拟物，isomir，安塔够妙或其来源，或者这样的组合物，所述组合物包含所述mirna分子mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p，所述模拟物，siomir，安塔够妙，或所述其来源，优选用作用于预防、治疗、逆转、治愈和/或延缓神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病和/或病症的药物。在其他优选实施方式中，提供了根据本发明用途的mirna，安塔够妙或其来源，其中所述mirna是mirna-135a分子，mirna-135b分子，mirna-196a-5p分子，mirna-135a的isomir，mirna-135b的isomir，mirna-196a-5p的isomir，或其模拟物，和/或其中mirna的来源是mirna-135a或amirna-135b或mirna-196a-5p的前体，并且是长度为至少50个核苷酸的寡核苷酸。在该方面的优选实施方式中，提供了mirna-196a-5p分子，模拟物，isomir，安塔够妙或其来源，更优选mirna-196a-5p分子，模拟物，isomir或其来源，或者这样的组合物，其包含所述mirna-196a-5p分子，模拟物，isomir，安塔够妙，或所述其来源，更优选mirna-196a-5p分子，模拟物，isomir或其来源，优选用作用于预防、治疗、逆转、治愈和/或延缓神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病和/或病症的药物。在其他优选实施方式中，提供了根据本发明用途的mirna，安塔够妙或其来源，其中所述mirna或安塔够妙是mirna-196a-5p分子，isomir，安塔够妙，或其模拟物，和/或其中mirna的来源是mirna-196a-5p的前体并且是长度为至少50个核苷酸的寡核苷酸。在该方面的优选实施方式中，提供了mirna-135a和/或mirna-135b分子，模拟物，isomir，安塔够妙或其来源，更优选mirna-135a和/或mirna-135b安塔够妙或其来源，或者这样的组合物，其包含所述mirna-135a和/或mirna-135b分子，模拟物，isomir，安塔够妙或所述其来源，更优选mirna-135a和/或mirna-135b分子安塔够妙或其来源，优选用作用于预防、治疗、逆转、治愈和/或延缓神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病和/或病症优选癫痫的药物。在其他优选实施方式中，提供了根据本发明用途的mirna，安塔够妙或其来源，其中所述mirna或安塔够妙是mirna-135a和/或mirna-135b分子，isomir，安塔够妙，或其模拟物，和/或其中mirna的来源是mirna-135a和/或mirna-135b的前体并且是长度为至少50个核苷酸的寡核苷酸。微小rna(mirna)是17-25个核苷酸的小rna，其作为真核细胞中基因表达的调控因子。mirna在细胞核中最初表达为长初级转录本的部分，称之为初级mirna(初-mirna)。在细胞核中，初-mirna被drosha酶部分消化，形成65-120个核苷酸长的发夹前体mirna(前-mirna)，将其输出到细胞质中，通过dicer进一步加工成较短的成熟mirna，这些较短的成熟mirna是活性分子。在动物中，这些短rna包含5'近端“种子”区(通常为核苷酸2-8)，其似乎是mirna与靶mrna的3'非翻译区(3'-utr)的配对特异性的主要决定区。关于通用定义的部分中给出了更详细的解释。下文所给出的关于mirna分子，mirna模拟物或mirnaisomir或mirna安塔够妙或它们之一的任何来源的各种定义将用于本申请所示各种mirna，分子或模拟物或isomir或安塔够妙或其来源：mirna-135a，mirna-135b，mirna-196a-5p或isomir或模拟物或安塔够妙或其来源。所述mirna分子或模拟物或isomir或其安塔够妙的优选成熟或模拟序列(如表2中seqidno:5-9所示)，种子序列(如表4和5中seqidno:14-56所示)，isomir序列(如表5和6中seqidno:57-241所示)，安塔够妙序列(如表6中seqidno:242-341所示)，或来源序列(如表1(rna前体为seqidno:1-4)或3(编码rna前体的dna为seqidno:10-13)所示)各自在相应表格中示出。在本申请的全文内，除了另外指明，mirna也可以称为mirna分子，mir，isomir，安塔够妙，或模拟物，或其来源或前体。可以将本文所述各序列表示为本申请文本中所用的seqidno或序列表中相应的seqidno。本申请中所述seqidno可以指所述mirna，isomir，安塔够妙，模拟物或其来源诸如前体的碱基序列。对于所有seqidno，本领域技术人员知晓一些碱基可以互换。例如，t的每个实例可以分别被u取代，反之亦然。为成熟mirna提供的rna序列可以例如使用dna核苷酸而非rna核苷酸合成为dna寡核苷酸。在这类情况中，可以使用胸腺嘧啶碱基代替尿嘧啶碱基。或者，可以使用脱氧核糖支架上的胸腺嘧啶碱基。本领域技术人员理解的是，碱基配对行为比确切序列更重要，并且出于这种目的，t和u通常是可互换的。因此，安塔够妙可以是dna或rna分子，或者可以是如本文后续所定义的进一步修饰的寡核苷酸。因此，模拟物可以是dna或rna分子，或者可以是如本文后续所定义的进一步修饰的寡核苷酸。mirna安塔够妙也在本发明提及。该术语涉及本发明的mirna分子，其表达将不被上调/过表达/增加和/或其活性将不增加，从而用于本文所述治疗应用。相反，这些mirna分子的内源表达需要被下调/降低和/或这类mirna分子的活性需要被降低或减少或抑制以获得治疗所需效果。如本文后续所解释，优选使用安塔够妙进行。因此，在本发明中，当在治疗用途中提及任何这些mirna分子时，总是指下述物质的用途：mirna-135a，mirna-135b或mirna-196a-5p分子的安塔够妙或这些mirna的安塔够妙的模拟物或这些mirna的安塔够妙的来源。因此，当提及安塔够妙时，总是指如本文所述的mirna-135a，mirna-135b或mirna-196a-5p分子的安塔够妙或其模拟物或来源的用途。本文所给出的关于mirna分子或模拟物或isomir或它们之一的来源的各种定义也可以适用于待用作该段落中所述的安塔够妙的任何mirna分子。本文所给出的关于mirna分子给定的安塔够妙的各种定义也适用于不同mirna分子的其他安塔够妙，其各自如本文所定义。安塔够妙优选与mirna，isomir或其模拟物互补或反向互补。在本发明的上下文中，mirna分子或模拟物或isomir或其安塔够妙可以是合成的或天然的或重组的或成熟的或成熟mirna或人mirna的部分或源自人mirna，如关于通用定义的部分所进一步定义。人mirna分子是存在于人细胞、组织、器官或体液的mirna分子(即，内源性人mirna分子)。人mirna分子还可以是通过取代、缺失和/或添加核苷酸衍生自内源性人mirna分子的人mirna分子。mirna分子或模拟物或isomir或其安塔够妙可以是单链或双链rna分子。优选地，mirna分子或其模拟物或isomir的长度为6-30个核苷酸，优选长度为12-30个核苷酸，优选长度为15-28个核苷酸，更优选所述分子的长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。优选地，mirna分子的安塔够妙长度为8-30个核苷酸，优选长度为10-30个核苷酸，优选长度为12-28个核苷酸，更优选所述分子的长度为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。在优选实施方式中，mirna分子或模拟物或isomir包含存在于所述mirna分子或其模拟物或isomir的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸(表4和5显示了在本文中以seqidno:14-56表示的mirna分子各自的优选种子序列)，或者是其安塔够妙。优选地，在该实施方式中，mirna分子或模拟物或isomir的长度为6-30个核苷酸并且更优选包含存在于所述mirna分子或模拟物或isomir的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，或者是其相同长度的安塔够妙。甚至更优选地是，mirna分子或模拟物或isomir的长度为15-28个核苷酸并且更优选包含存在于种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，甚至更优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸的mirna分子，或者是其相同长度的安塔够妙。在上下文中，包含存在于种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸旨在指与种子序列在最多一个位置不相同的7个核苷酸的连续串。或者，这可以指代仅通过省略单个核苷酸不同于种子序列的6个核苷酸的连续串在整个申请中，更优选的mirna分子，isomir，模拟物或其前体包含存在于指定种子序列的7个核苷酸中的所有7个核苷酸，或者换言之，与所述种子序列具有100％序列相同性。优选地，当包含在mirna，isomir或模拟物中时，种子序列从核苷酸编号1、2或3开始并在核苷酸编号7、8、9、10或11结束；最优选地是，这类种子序列从核苷酸编号2开始并在核苷酸编号8结束。因此，优选的mirna-135是mirna-135分子，isomir或其模拟物，并包含存在于以seqidno:14-17或19-42表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且更优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。优选地，对于安塔够妙，包含这样的序列，所述序列与存在于以seqidno:14-17或19-42表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸反向互补。mirna-135优选的安塔够妙与如上所述mirna-135分子，isomir或其模拟物互补或反向互补。因此，优选的mirna-135a是mirna-135a分子，isomir或其模拟物，并包含存在于以seqidno:14或15或19-31表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且更优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。优选地，对于安塔够妙，包含这样的序列，所述序列与存在于以seqidno:14或15或19-31表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸反向互补。mirna-135a优选的安塔够妙与如上所述mirna-135a分子，isomir或其模拟物互补或反向互补。因此，优选的mirna-135b是mirna-135b分子，isomir或其模拟物，并包含存在于以seqidno:16或17或32-42表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且更优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。优选地，对于安塔够妙，包含这样的序列，所述序列与存在于以seqidno:16或17或32-42表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸反向互补。mirna-135b优选的安塔够妙与如上所述mirna-135b分子，isomir或其模拟物互补或反向互补。因此，优选的mirna-196a-5p是mirna-196a-5p分子，isomir或其模拟物，并包含存在于以seqidno:18或45-51表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且更优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。优选地，对于安塔够妙，包含这样的序列，所述序列与存在于以seqidno:18或43-51表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸反向互补。mirna-196a-5p优选的安塔够妙与如上所述mirna-196a-5p分子，isomir或其模拟物互补或反向互补。发明人发现mirna-124分子，isomir或其模拟物可以有利地作为本发明的部分使用。因此，优选的mirna-124分子，isomir或其模拟物包含存在于以seqidno:349-350表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且更优选长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸，并且任选地，相对于以seqidno:347-348中任一项所表示的完整成熟序列，具有至少70％相同性。优选地，相同性是至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。优选地，mirna分子，isomir或其模拟物长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸，包含存在于表4或5中以seqidno:14-56表示的给定种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且相对于表6中以seqidno:147-241表示的完整成熟序列具有至少70％相同性。优选地，相同性是至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。或者优选地，mirna分子，isomir或其模拟物长度为不超过6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17,18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸，包含存在于表4或5中以seqidno:14-56表示的给定种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，并且相对于表6中以seqidno:147-241表示的完整成熟序列具有至少70％相同性。优选地，相同性是至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在另一优选实施方式中，mirna分子的isomir相对于完整isomir序列具有至少70％相同性(表5显示了以seqidno:57-146表示的成熟mirna各自优选的isomir)。优选地，相同性是至少75％、80％、85％、90％、95％或更高。优选地，在该实施方式中，mirna分子的isomir或其模拟物的长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸。因此，优选的mirna-135分子，isomir或其模拟物包含存在于以seqidno:14-17表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，和/或相对于seqidno:147-214具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和/或长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸或更多个核苷酸。因此，优选的mirna-135a分子，isomir或其模拟物包含存在于以seqidno:14或15或19-31表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，和/或相对于seqidno:147-187具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和/或长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸或更多个核苷酸。因此，优选的mirna-135b分子，isomir或其模拟物包含存在于以seqidno:16或17或32-42表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，和/或相对于seqidno:188-214具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和/或长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸或更多个核苷酸。因此，优选的mirna-196a-5p分子，isomir或其模拟物包含存在于以seqidno:18或43-51表示的种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，和/或相对于seqidno:215-241具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性，和/或长度为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸或更多个核苷酸。另一优选的mirna分子，isomir或其模拟物具有下述序列具有至少60％相同性：种子序列(如表4和5中seqidno:14-56所示)或成熟序列(如表2中seqidno:5-9所示)或前体序列(如表1中seqidno:1-4所示)或编码rna前体的dna(如表3中seqidno:10-13所示)或isomir序列(如表5中seqidno:57-146所示)。相同性可以是至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。优选在给定表格中所示的完整seqidno评估相同性。然而，也可以在给定seqidno的部分评估相同性。部分可以表示至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或100％的seqidno长度。取决于成熟过程，前体序列可以产生超过一种isomir序列——参见例如mirna-135a，其中在某种组织中已经鉴定了多种isomir(表5)。mirna分子的isomir来自相同前体，并且相反地，前体可以产生多种mirna分子，其一称之为经典mirna(如mirna-135a-5p，seqidno:5)，而其他称之为isomir(如seqidno:57-88所示的寡核苷酸)。可以说经典mirna和其isomir之间的差异仅在于其普遍性——通常，最普遍的分子称为经典mirna，而其他是isomir。取决于类型，环境，在其生命周期的位置，或细胞的病理状态，各种isomir或mirna可以不同水平表达；群组或性别之间的表达甚至可以不同(loher等,oncotarget(2014)doi:10.18632/oncotarget.2405)。模拟物是与mirna分子具有相似或相同活性的分子。在上下文中，赋予相似活性与可接受水平活性相同的含义。模拟物在功能测定中与安塔够妙相对。优选的模拟物是合成寡核苷酸，优选包含一种或多种核苷酸类似物，如锁核酸单体，和/或包含支架修饰的核苷酸和/或包含碱基修饰的核苷酸。因此，mirna分子，isomir，模拟物或其来源的安塔够妙是具有这样活性的分子，所述活性与衍生其的相应mirna分子之一相对或相反。mirna，isomir或模拟物的安塔够妙还可以定义为能够使所述mirna分子或isomir或模拟物的活性拮抗或沉默或降低的分子。与衍生其的相应mirna分子之一相对或相反的活性或者能够使衍生其的所述mirna的活性拮抗的活性优选是这样的活性，其能够降低所述mirna分子或isomir或模拟物或其来源的活性。在上下文中，降低表示所述mirna分子或isomir或模拟物或其来源的活性降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。安塔够妙的模拟物可以是具有化学修饰(如本文后续所定义)的合成寡核苷酸。用于评估所述活性的优选活性和优选试验后续在本文中定义。mirna分子或模拟物或isomir或其来源的安塔够妙可以是核酸，优选与相应mirna分子或isomir或其模拟物互补或反向互补的rna。安塔够妙优选与相应mirna分子或isomir或其模拟物杂交。优选的安塔够妙与表6中以seqidno:147-241显示的成熟mirna或isomir的序列的部分互补或反向互补。部分可以表示至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或100％的seqidno长度。在优选实施方式中，安塔够妙或其模拟物与mirna分子或isomir或其模拟物的种子序列或所述种子序列的部分互补或反向互补。部分可以表示至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或100％的种子序列长度。优选地，安塔够妙长度为8-30个核苷酸，优选长度为10-30个核苷酸，优选长度为12-28个核苷酸，更优选所述分子的长度为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸，并且与表6中所示成熟mirna或isomir的序列(如seqidno:147-241)的部分互补或反向互补。部分可以表示至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或100％的给定序列长度。优选地，安塔够妙长度为8-30个核苷酸，优选长度为10-30个核苷酸，优选长度为12-28个核苷酸，更优选所述分子的长度为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸，并且与种子序列(如表4和5中以seqidno:14-56表示)的部分互补或反向互补。部分可以表示至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或100％的种子序列长度。优选地，安塔够妙或其模拟物与安塔够妙序列(如表6中以seqidno:242-341表示)具有至少60％相同性。相同性可以是至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。优选在表6中表示的完整seqidno上评估相同性。然而，也可以在给定seqidno的部分评估相同性。部分可以表示至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或100％的seqidno长度。优选地，安塔够妙长度为8-30个核苷酸，优选长度为12-28个核苷酸，更优选所述分子的长度为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸或更多个核苷酸，并且与安塔够妙序列(如表6和5中以seqidno:242-341表示)具有至少60％相同性。相同性可以是至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。优选在表6中表示的完整seqidno上评估相同性。然而，也可以在给定seqidno的部分评估相同性。部分可以表示至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或100％的seqidno长度。mirna分子或模拟物或其来源的安塔够妙的核苷酸的化学结构可以经修饰以增加稳定性，结合亲和力和/或特异性。所述安塔够妙可以包含或由rna分子或优选经修饰的rna分子组成。优选的经修饰的rna分子包含修饰的糖。这类修饰的一个实例是在核酸上引入2'-o-甲基或2'-o-甲氧基乙基或2'氟化物基团，以改善核酸酶抗性和对rna的结合亲和力。这类修饰的另一个实例是引入连接核酸2'-o原子和4'-c原子的亚甲基桥以锁定构象(锁核酸(lna))以改善对互补单链rna的亲和力。第三个实例是引入硫代磷酸酯基团作为rna链中核酸之间的接头以改善针对核酸酶攻击的稳定性。第四个修饰是分子3'端上亲脂性部分如胆固醇的偶联，以改善稳定性和细胞递送。在优选实施方式中，mirna分子的安塔够妙由完全lna修饰的硫代磷酸酯寡核苷酸组成，如obad等人所述，被称之为微小lna。本文所定义的安塔够妙可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个糖修饰。本发明还涵盖在一种安塔够妙中引入一个以上的不同糖修饰。在优选实施方式中，安塔够妙在分子的3'端具有偶联的亲脂性部分如类固醇，并且包含修饰的糖，如lna。在优选的实施方式中，该方面提供了根据本发明用途的mirna，安塔够妙或其来源，其中所述mirna与seqidno:147-241中任一项具有至少70％序列相同性，其中所述安塔够妙与seqidno:242-341中任一项具有至少70％序列相同性，和/或其中所述mirna或安塔够妙的长度为15-30个核苷酸，和/或其中所述mirna的来源是所述mirna的前体并且与seqidno:1-4或10-13中任一项具有至少70％序列相同性。更加优选地，该方面提供了根据本发明用途的安塔够妙或其来源，优选地用于治疗、逆转、防止、治愈和/或延缓癫痫，其中所述mirna是mirna-135并与seqidno:147-214中任一项具有至少70％序列相同性，和/或其中所述安塔够妙与seqidno:242-245、247-314中任一项具有至少70％序列相同性，和/或其中所述mirna或安塔够妙的长度为15-30个核苷酸，和/或其中所述mirna的来源是所述mirna的前体并且与seqidno:1-3或10-12中任一项具有至少70％序列相同性。本文所示mirna分子或模拟物或isomir或其安塔够妙各自具有衍生它们的给定mirna的可接受水平的活性。可接受水平的活性优选所述mirna或模拟物或isomir或其安塔够妙仍然能够展现所述mirna可接受水平的所述活性。例如，给定mirna或模拟物或isomir或安塔够妙的活性是这样的能力：表现出神经元细胞生成或再生可检测的促进或诱导，或者恢复神经元细胞内或大脑中正常的(放电)充电，如本文后续所定义。可接受水平的活性优选是衍生它们的mirna或它们模拟的mirna或它们是isomir或安塔够妙的mirna的活性的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。在某些情况下，isomir可以比经典mirna的活性更高。isomir对降解的抗性增强。本文所示mirna分子或isomir或安塔够妙或其模拟物中的任一种(即mirna-135a，mirna-135b，mirna-196a-5p，mir-124)的优选活性是表现出对象中神经元细胞生成或再生可检测的促进或诱导。在上下文中，优选的mirna分子是mirna-135a或mirna-135b或mirna-196a-5p的mirna或等同物或isomir或模拟物。优选的活性是抑制kruppel样因子4(klf4)表达的能力。在该方面的优选实施方式中，本发明提供了根据本发明用途的mirna，安塔够妙或其来源，其中所述用途是用于抑制kruppel样因子4(klf4)的表达。在优选实施方式中，通过诸如实施例中所用的技术例如western印迹，将klf4检测为蛋白质。在其他优选实施方式中，通过定量mrna水平，例如通过qpcr，间接检测klf4。安塔够妙，mirna分子，异构体或其模拟物或其来源中的任一种(即mirna-135a的安塔够妙)的优选活性是表现出对象中神经元细胞生成或再生可检测的促进或诱导，如本文后续所定义。安塔够妙或其模拟物或其来源中的任一种(即mirna-135a的安塔够妙或mirna-135b的安塔够妙)的优选活性是展现正确神经元(放电)充电可检测的促进。根据本发明用途的mirna分子，安塔够妙或其来源中任一种的优选活性是促进神经元细胞内或脑中正常(放电)充电的能力。这能够用于治疗、逆转、预防、治愈和/或延缓癫痫。这类促进优选导致增加正确神经元(放电)充电，这可以是表现出增加正确或改善神经元(放电)充电的细胞数量，或者这可以是增加细胞亚群中正确的(放电)充电行为。在上下文中，优选的mirna或安塔够妙分子是mirna-135的mirna或模拟物或isomir或安塔够妙，或其前体。更优选地是mirna-135的安塔够妙或其模拟物或其来源，如mirna-135a的安塔够妙，mirna-135a的安塔够妙的模拟物，或其来源，或mirna-135b的安塔够妙，或mirna-135b的安塔够妙的模拟物，或其来源。如本文所用，癫痫(epilepsy)指具有以发作(seizure)为特征的多种慢性神经系统疾病的病症。这类发作可能是反复且无故的。或者，它们可能构成伴有大脑改变的单次发作，并因此增加了未来发作的机会。例如，癫痫性发作可能是由于大脑中异常、过度或超同步的神经元活性所引起。癫痫可以根据发作类型或形式进行进一步地分类。通常根据脑内发作的来源是局部的(部分或局部发作发作)还是分布式的(全身性发作)来组织归纳发作类型。包括部分发作的癫痫可以在影响意识的程度上进一步划分。如果意识不受影响，那么其为包括简单部分性发作的癫痫。如果意识受到影响，那么其为包括复杂部分或精神运动性发作的癫痫。部分性发作通常可在脑内扩散，即导致继发性全面化(secondarygeneralization)。全面性发作通常涉及意识丧失，并可以根据对身体的影响而进一步划分。实例包括缺乏(癫痫小发作(petitmal))，肌阵挛性，阵挛性，强直性，强直性-阵挛性(癫痫大发作(grandmal))和无力性发作。下述为根据本发明用途的mirna分子，安塔够妙或其来源的优选适应症和用途；更优选是针对mirna-135的安塔够妙，或这类安塔够妙的来源，其中所述mirna-135是mirna-135分子或mirna-135isomir，并且是具有种子序列的寡核苷酸，包含seqidno:14-17、19-42、52-56所示种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，或者是其来源，更优选地，其中所述用途是用于治疗、逆转、预防、治愈和/或延缓癫痫：i)根据本发明用途的mirna分子，安塔够妙或其来源，其中所述用途是减少，逆转，预防，治愈和/或延缓发作传播。这类用途是治疗单一癫痫持续状态(statusepilepticus)以外的癫痫。在上下文中，应当将癫痫持续状态视为持续超过三十分钟(优选超过五分钟)的单一癫痫发作，或者在三十分钟(优选五分钟的时间内)内两次或更多次发作且对象在之间没有恢复正常。这类处理是有益的，因为它通过消除癫痫的根本原因而不是抑制症状来减少所需药物方案。ii)根据本发明用途的mirna分子，安塔够妙或其来源，其中所述用途是减少发作计数。发作频率降低对于患有或预期患有多重发作的对象在给定的时间段内，如一周或一天内，可以是有益的；或者对于不对已知药物如通道阻断剂应答的对象。发作计数优选减少至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％，更优选至少30、40、50、60、70、80、90或100％，甚至更优选至少50、60、70、80、90或100％，如至少75％。优选在给药后至少1、2、3、4、5或6天，更优选在给药后至少3、4、5或6天，如给药后6天，评估这类减少/降低。iii)根据本发明用途的mirna分子，安塔够妙或其来源，其中所述用途是减少发作持续时间。发作持续时间优选是超过一次发作的平均发作持续时间。发作持续时间减少对于患有或预期患有低频率发作的对象可以是有益的，使得发作计数减少不太有效；或者对于不对已知药物如通道阻断剂应答的对象。发作持续时间优选减少至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100％，更优选至少20、25、30、25、40、50、60、70、80、90或100％，甚至更优选至少30、35、40、50、60、70、80、90或100％，如至少36％。优选在给药后至少1、2、3、4、5或6天，更优选在给药后至少3、4、5或6天，如给药后6天，评估这类减少/降低。iv)根据本发明用途的mirna分子，安塔够妙或其来源，其中所述用途是减少发作总时间。这可以被视为减少了猝发活动(ictalactivity)的总时间，或者被视为增加了发作间期(interictalperiod)的长度。发作总时间减少对于对已知药物如通道阻断剂无应答的对象者可能是有益的。优选地，发作总时间减少至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％，更优选至少40、50、60、70、80、90或100％，甚至更优选至少60、70、80、90或100％，如至少75％。优选在给药后至少1、2、3、4、5或6天，更优选在给药后至少3、4、5或6天，如给药后6天，评估这类减少/降低。v)根据本发明用途的mirna分子，安塔够妙或其来源，其中所述用途是恢复肌细胞特异性增强子因子2a(mef2a)的表达。肌细胞特异性增强子因子2a(mef2a)是这样的转录因子，当其突变时可以导致冠心病或心肌梗塞。发明人惊奇地发现，患有癫痫的对象的mef2a表达降低。恢复mef2a表达可减少发作持续时间，发作计数，发作消耗的总时间，并改善神经元棘成熟，防止神经元棘丢失。恢复mef2a表达可以有益于对已知药物如通道阻断剂无应答的对象；它可以通过消除癫痫的根本原因而不是抑制症状来减少所需药物方案。在上下文中，相较于处理前的表达，mef2a表达的恢复优选是mef2a表达增加。优选地，增加是至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30％或更多。恢复优选导致这样的mef2a表达，其与健康对象的平均mef2a表达大致相同，更优选在健康对象表达的25、20、15、10或5％内，最优选在10％或5％内。vi)根据本发明用途的mirna分子，安塔够妙或其来源，其中所述用途是预防，逆转，治愈和/或延缓神经元棘丢失。神经元棘也称之为树突棘，并且是来自神经元树突的小膜状突起。神经元棘通常由突触处的轴突接收输入。神经元棘作为突触强度的储存位点，并且有助于将电信号传输到神经元的细胞体。发现与癫痫相关的mirna-135(过度)表达导致神经元棘的丢失。预防神经元棘丢失可以有益于对已知药物如通道阻断剂无应答的对象；它可以通过消除癫痫的根本原因而不是抑制症状来减少所需药物方案。优选地完全防止神经元棘丢失，其中可以与健康个体或健康个体群体或基于这类群体设定值进行比较。优选地，至少5、10、15、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％防止棘丢失。预防棘丢失也可以表示为棘密度增加。vii)根据本发明用途的mirna分子，安塔够妙或其来源，其中所述用途是增加神经元棘成熟。增加神经元棘成熟可以有益于对已知药物如通道阻断剂无应答的对象；它可以通过消除癫痫的根本原因而不是抑制症状来减少所需药物方案。神经元棘开始为丝足(filopodium)，然后成熟变薄，然后变短粗状，再到蘑菇状(muschroom)，最后变成杯状棘(cupshapedspine)。成熟的棘被认为是杯状，蘑菇状(mushroom)和粗短状；未成熟的棘被认为是薄且丝足。相较于处理前棘类型的百分比，增加优选表示为处理后棘类型的百分比增加。因此，该用途优选用于增加粗短状，蘑菇状和杯状棘的量，更优选用于增加蘑菇状和杯状棘的量，最优选用于增加杯状棘的量。优选地，成熟棘的量增加至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60％或更多，更优选至少20、25、30、35、40、45、50、55、60％或更多，最优选至少50、55、60％或更多。在优选实施方式中，杯状棘的量增加至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100％或更多，更优选至少30、35、40、50、60、70、80、90或100％或更多，最优选至少80、90或100％或更多，如至少100％。在优选实施方式中，磨菇状棘的量增加至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100％或更多，更优选至少30、35、40、50、60、70、80、90或100％或更多，最优选至少80、90或100％或更多，如至少90％。viii)根据本发明用途的mirna分子，安塔够妙或其来源，其中所述用途是预防，延缓，治愈和/或逆转异常神经元棘形成。这可以有益于对已知药物如通道阻断剂无应答的对象；它可以通过消除癫痫的根本原因而不是抑制症状来减少所需药物方案。ix)根据本发明用途的mirna分子，安塔够妙或其来源，其中所述用途是用于治疗已知对使用通道阻断剂的处理不应答的对象，或者疑似对使用通道阻断剂的处理不应答的对象。对通道阻断剂没有应答可能是对通道阻断剂的部分应答，或者对通道阻断剂没有应答。在优选实施方式中，相较于通道阻断剂的已知功效，对象以至多90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5％或更少的比例应答。mirna分子的来源或模拟物或isomir的来源可以是任何分子，其能够诱导产生如本文所示的mirna分子或模拟物或isomir，并且其优选包含发夹样结构和/或双链核酸分子。发夹样结构的存在可以使用rnashapes程序(steffenp.等2006)评估，使用80、100和120nt或更大的滑动窗(slidingwindow)。发夹样结构通常存在于mirna分子的天然或内源性来源，然而双链核酸分子通常存在于mirna分子或isomir或其模拟物的重组或合成来源。mirna分子的安塔够妙的来源或mirna分子的安塔够妙的模仿物的来源可以是能够诱导产生所述安塔够妙的任何分子，如合适的载体。mirna分子或模拟物或isomir或其安塔够妙的来源可以是单链，双链rna或部分双链的rna或者可以包含三种链，其实例述于wo2008/10558。本文所用部分双链指在5'端和/或在3'端处还包含单链结构的双链结构。当mirna分子的各链长度不同时，可能会发生这种情况。通常，这类部分双链的mirna分子可以具有小于75％的双链结构和大于25％的单链结构，或小于50％的双链结构且大于50％的单链结构，或更优选小于25％、20％或15％的双链结构和大于75％、80％、85％的单链结构。或者，mirna分子或其模拟物或isomir的来源是dna分子，所述dna分子编码mirna分子或其模拟物或isomir的前体。上下文优选的dna分子在表3中以seqidno:10-13所示。本发明涵盖dna分子的用途，所述dna分子编码mirna分子的前体，所述mirna分子与表3中所示序列具有至少70％相同性。优选地，相同性是至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。优选地，在该实施方式中，dna分子的长度为至少50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、130、150、200、250、300、350、400个核苷酸或更多个，并且与表3中以seqidno:10-13表示的dna序列具有至少70％相同性。当使用下述定义的一种试验将所述来源引入细胞中时，优选获得产生给定mirna分子或模拟物或isomir的诱导，或者产生其给定安塔够妙的诱导。后续定义本发明涵盖的细胞。mirna分子或其模拟物或isomir的优选来源是其前体，更优选编码所述mirna分子或其模拟物或isomir的核酸。优选前体是天然存在的前体。前体可以是合成或重组前体。合成或重组前体可以是可以表达天然存在的前体的载体。给定mirna分子的优选前体在表1中以seqidno:1-4表示。本发明涵盖与所述序列具有至少70％相同性的mirna分子或其isomir或模拟物的前体的用途。优选地，相同性是至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。优选地，在该实施方式中，dna分子的长度为至少50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、130、150、200、250、300、350、400个核苷酸或更多个，并且与在表1中以seqidno:1-4表示的序列具有至少70％相同性。优选地，在该实施方式中，前体包含种子序列，其与选自seqidno:14-56所表示的组的种子序列共享7个核苷酸中的至少6个核苷酸。更优选地，前体包含选自seqidno:14-56所表示的组的种子序列。因此，mirna-135分子的优选来源与seqidno:1-3或10-12具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性和/或长度为至少50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、130、150、200、250、300、350、400个核苷酸或更多个和/或包含种子序列，其共享seqidno:14-17或19-42中任一项的7个核苷酸中的至少6个核苷酸。这类来源是mirna-135a分子或mirna-135aisomir的前体。因此，mirna-135a分子的优选来源与seqidno:1或2或10或11具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性和/或长度为至少50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、130、150、200、250、300、350、400个核苷酸或更多个和/或包含种子序列，其共享seqidno:14或15或19-31中任一项的7个核苷酸中至少6个核苷酸。这类来源是mirna-135a分子或mirna-135aisomir的前体。因此，mirna-135b分子的优选来源与seqidno:3或12具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性和/或长度为至少50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、130、150、200、250、300、350、400个核苷酸或更多个和/或包含种子序列，其共享seqidno:16或17或32-42中任一项的7个核苷酸中的至少6个核苷酸。这类来源是mirna-135b分子或mirna-135bisomir的前体。因此，mirna-196a-5p分子的优选来源与seqidno:4或13具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性和/或长度为至少50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、130、150、200、250、300、350、400个核苷酸或更多个和/或包含种子序列，其共享seqidno:18或43-51中任一项的7个核苷酸中的至少6个核苷酸。这类来源是mirna-196a-5p分子或mirna-196a-5pisomir的前体。在该上下文中，指出的是给定的成熟mirna分子的几种前体可能导致相同的mirna分子。例如，mirna-135a可能源自前体mirna-135a-1或mirna-135a-2(优选地，分别表示为seqidno:1或seqidno:2)。在优选实施方式中，mirna-135a-1或与mirna-135a-1或seqidno:1具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同性的分子用作mirna-135a-5p分子的前体。也在该上下文中，指出的是给定的成熟mirna分子的几种isomir可能导致具有相同种子序列的mirna分子。例如，成熟mirna-135a-5p(seqidno:5)以及至少具有seqidno:58-67或96-98的isomir全部共享相同的种子序列(优选表示为seqidno:19)。本文后续定义了优选的来源或前体。优选的来源包括或包含表达构建体，其包含核酸，即编码所述mirna的所述前体或编码所述安塔够妙的dna，更优选地，所述表达构建体是选自下述的病毒基因治疗载体：基于腺病毒、腺相关病毒(aav)、疱疹病毒，痘病毒和逆转录病毒的基因治疗载体。优选病毒基因治疗载体是aav或慢病毒载体。其他优选载体是溶瘤病毒载体。这类载体在下文进一步描述。或者，来源可以是合成mirna分子或化学模拟物，如关于通用定义的部分所进一步定义。可以使用本领域技术人员已知的任何技术来检测mirna分子或模拟物或isomir的存在或者mirna分子或其模拟物的安塔够妙的存在。优选使用经典的分子生物学技术如(实时聚合酶链反应)qpcr，微阵列，珠阵列，rna酶保护分析或northern印迹分析或克隆和测序来进行表达水平或这类分子的存在的评估。本领域技术人员将理解是，本发明的范围涵盖下述内容之一或组合：对mirna分子或其模拟物或isomir进行定量，对已知与所述mirna分子或所述其isomir或模拟物的功能相关的任何化合物的相应mirna分子或其模拟物或isomir的底物进行定量，或者使用特定试验对所述mirna分子或其所述isomir或模拟物的功能或活性进行定量。mirna分子的安塔够妙也是如此。本文后续定义了所有优选的组合物和制剂。mirna分子或模拟物或isomir或其安塔够妙可以诸如裸露的分子形式使用，可以进行化学修饰或不进行化学修饰，或者可以包封成颗粒或与部分偶联。优选的组合物包括包封在纳米颗粒或脂质体结构中的mirna分子或模拟物或isomir或其安塔够妙。mirna分子或模拟物或isomir或其安塔够妙可以是适配体-mirna杂交体。适配体-mirna定义为与rna(或dna)寡核苷酸连接的mirna，后者采用了这样的构象，其将适配体-mirna杂交分子靶向细胞表面蛋白(例如，环rgd肽(环精氨酸(r)-甘氨酸(g)-天冬胺酸(d)肽)。适配体标签标记的mirna可以连接例如聚乙二醇，其增加嵌合体的循环半衰期(dassie,j.p.,等2009)。均如本文所定义的给定的mirna或其模拟物，isomir或其相应来源的活性或者mirna分子或其模拟物或其相应来源的给定安塔够妙的活性优选为表现出神经元细胞生成或再生可检测的促进或诱导的能力。“表现出神经元细胞生成或再生可检测的促进或诱导”可以被逆转、拮抗、延缓、治愈和/或治疗神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病或病症所代替。“表现出神经元细胞生成或再生可检测的促进或诱导”与下述内容中的至少一项等同：-诱导或促进对象中神经元细胞数可检测的增加，-诱导或促进神经元细胞受损功能、活性和/或3d方面的改善，和-诱导或促进神经元生长增加，神经元迁移增加和/或神经元连接性或可塑性增加。在下文中进一步定义这些特征。因此，为了能够预防、延缓，治愈，逆转和/或治疗任何神经元缺陷或与神经元缺陷相关的任何疾病或病状，展示神经元细胞的这种可检测的促进或诱导是至关重要的。可以局部评估和检测对象中的神经元缺陷。在上下文中，“局部”可以指所述对象器官，组织，细胞和/或人体给定的体积或区域或位置，如眼脑之间或者脑和海马体中的视神经。这类器官，组织，细胞和/或所述身体的体积或区域或位置包含或由神经元细胞组成。这类器官，组织，细胞和/或所述身体的体积或区域或位置可以包含至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的神经元细胞。神经元细胞也称之为神经元或神经细胞。这是电可兴奋细胞，其通过电和化学信号接收、处理和传输信息。神经元细胞之间的这些信号通过称为突触的专门连接发生。神经元细胞可以相互连接以形成神经网络。神经元是中枢神经系统的脑和脊髓以及外周神经系统的自主神经节的主要组分。在视神经损伤中，眼脑之间的神经网络被破坏，或者甚至有时被完全破坏。神经元缺陷旨在涵盖定量神经元缺陷和/或定性神经元缺陷。定量神经元缺陷可能意味着对象中神经元细胞数量局部减少。通过与对照对象中相同或相似位置处神经元细胞的相应数量进行比较，或者通过与相同对象中但是在其身体不同位置处神经元细胞的相应数量进行比较，可以评估神经元细胞数量减少。在这样的上下文中，减少可以表示减少1％、减少5％、减少10％、减少15％、减少20％、减少25％、减少30％、减少35％、减少40％、减少45％、减少50％、减少55％、减少60％、减少65％、减少70％、减少75％、减少80％、减少85％、减少90％、减少95％、减少100％、减少150％、减少200％或减少超过200％。通过对细胞进行计数，例如(在转染或在子宫内电穿孔(iue)后)对表达特定报告质粒的细胞进行计数，可以进行神经元细胞数量的评估。报告质粒可以用根据本发明的核酸标签标记，或者与其共引入，或者可以在同一载体中。合适的报告物是gfp或rfp。优选地，神经元细胞体外转染，或使用iue转染体内细胞。转染或iue后，将细胞或脑切片固定并针对特异性标签进行免疫染色，所述特异性标签表达标志物如荧光蛋白。然后可以在显微镜上拍摄图像，并且可以使用本领域已知的图像处理软件对表达特定标签的细胞进行计数。对照对象可以是健康对象。表现出神经元细胞生成或再生可检测的促进或诱导优选地是诱导或促进对象中神经元细胞数量可检测的增加。或者，其表示维持相同数量的神经元细胞，例如，通过停止与神经元缺乏相关的疾病中健康神经元细胞数量的减少或预期减少，或通过防止健康神经元细胞退化进行。例如，减少脑内表现出异常和同步神经元放电的细胞量将不会导致神经元细胞生成或再生，而会减少癫痫的症状。换言之，这种较好的影响是增加了脑内表现出正常神经元放电的细胞量。可以在对象中局部评估并检测对象中神经元细胞数量可检测的增加。在上下文中，“局部”可以指所述对象器官，组织，细胞和/或人体给定的体积或区域或位置，如上所定义。这类器官，组织，细胞和/或所述身体的体积或区域或位置包含或由神经元细胞组成。这类器官，组织，细胞和/或所述身体的体积或区域或位置可以包含至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的神经元细胞。通过与对照对象中相同或相似位置处神经元细胞的相应数量进行比较，或者通过与相同对象中但是在其身体不同位置处神经元细胞的相应数量进行比较，可以评估神经元细胞数量可检测的增加。在上下文中，增加可以表示增加增加1％、增加5％、增加10％、增加15％、增加20％、增加25％、增加30％、增加35％、增加40％、增加45％、增加50％、增加55％、增加60％、增加65％、增加70％、增加75％、增加80％、增加85％、增加90％、增加95％、增加100％、增加150％、增加200％或增加超过200％。可以使用所示用于评估可检测的减少或降低的相同技术进行神经元细胞数量的评估。对照对象可以是健康对象。定性神经元缺陷指神经元细胞在功能和/或活性和/或3d方面受损。在功能和/或活动和/或3d方面受损的神经元细胞可能表现出神经元生长缺陷，神经元迁移缺陷，神经元连接性或可塑性的扰乱和/或神经元(放电)充电缺陷。因此，当本发明的分子逆转、延缓、预防、治疗、治愈或停止定性神经元缺陷时，可认为其表现出神经元细胞生成或再生可检测的促进或诱导。当本发明的分子诱导或促进受损的功能和/或活性(例如，(放电)充电功能丧失)和/或神经元细胞3d方面改善时，和/或当其诱导或促进神经元生长增加，神经元迁移增加和/或神经元连接性和可塑性增加时，优选认为其表现出神经元细胞生成或再生可检测的促进或诱导。神经突生长可以定义为诱导或促进对象中的或来自对象的平均神经突长度可检测的增加。神经元缺陷中或与神经元缺陷相关的病症中可能存在或者可以检测到受损的神经突生长或缺陷或降低的神经突生长。可以局部评估和检测对象中的这类受损、缺陷或降低的神经突生长。在上下文中，“局部”可以指所述对象器官，组织，细胞和/或人体给定的体积或区域或位置。这类器官，组织，细胞和/或所述身体的体积或区域或位置包含或由神经元细胞组成。这类器官，组织，细胞和/或所述身体的体积或区域或位置可以包含至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的神经元细胞。优选的体积是这样的脑体积，优选约1050-1350cm3，更优选约1100-1300cm3。当待处理或预防的病症是癫痫时这样的体积尤其有关。通过与对照对象中相同或相似位置处相应神经突生长能力进行比较，或者通过与相同对象中但是在其身体不同位置处相应神经突生长能力进行比较，可以评估这类受损、缺陷或降低的神经突生长。可以在分离自对象的神经突上评估和检测这类受损、缺陷或降低的神经突生长。优选地，受损、缺陷或降低的神经突生长可以在原代神经元培养物中体外评估，例如通过用mirna模拟物转染培养物中的神经元并评估模拟物对神经突生长的影响，这通过测量转染后最长的神经突长度，如vanspronsen等,2013(pmid:24098357)中所进行。在这种情况中，通过与来自对照对象相同或相似位置处的对照神经突中相应神经突生长能力进行比较，或者通过与来自相同对象但是在其身体不同位置处的神经元细胞的相应神经突生长能力进行比较，可以评估这类受损、缺陷或降低的神经突生长。在上下文中，受损、缺陷或降低可以表示减少或减少1％、减少5％、减少10％、减少15％、减少20％、减少25％、减少30％、减少35％、减少40％、减少45％、减少50％、减少55％、减少60％、减少65％、减少70％、减少75％、减少80％、减少85％、减少90％、减少95％、减少100％、减少150％、减少200％或减少超过200％。神经突生长的评估可以使用诸如实施例中所示的技术进行，例如，通过显微筛选。对照对象可以是健康对象。优选如实验数据(实施例2)中所示评估神经突生长的可检测的增加。可检测的增加优选增加至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多，更优选如实验数据中所示评估。可以局部评估对象中的神经突生长。“局部”的含义已经在本文中定义。神经元迁移可以定义为受损的神经元迁移或者与神经元缺乏相关的病症中可以存在或可检测到缺陷或降低的神经元迁移。在发育皮质中，锥体神经元由脑室区(vz)迁移到表层皮质板(cp)，以分化并建立功能连接。受损或缺陷的神经元迁移优选定义为神经元细胞不能到达其靶区域。任选地，这可能是由于细胞内特定蛋白质/途径的功能丧失，或者是由于环境中不存在外部提示。可以局部评估和检测对象中的这类受损、缺陷或降低的神经元迁移。在上下文中，“局部”可以指所述对象器官，组织，细胞和/或人体给定的体积或区域或位置。这类器官，组织，细胞和/或所述身体的体积或区域或位置包含或由神经元细胞组成。这类器官、组织、细胞和/或所述身体的体积或区域或位置可以包含至少30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％或100％的神经元细胞。通过与对象中相同或相似位置处相应迁移能力进行比较或者通过与相同对象中但在其身体不同位置处神经元细胞的相应迁移能力进行比较，可以评估这类受损、缺陷或降低的神经元迁移。可以在分离自对象的神经元细胞上评估和检测这类受损、缺陷或降低的神经突生长。在这种情况中，通过与来自对照对象相同或相似位置处的对照神经元细胞中相应神经元迁移能力进行比较，或者通过与来自相同对象中但在其身体不同位置处的神经元细胞的相应神经元迁移能力进行比较，可以评估这类受损、缺陷或降低的神经元迁移。在这样的上下文中，受损、缺陷或降低可以表示减少1％、减少5％、减少10％、减少15％、减少20％、减少25％、减少30％、减少35％、减少40％、减少45％、减少50％、减少55％、减少60％、减少65％、减少70％、减少75％、减少80％、减少85％、减少90％、减少95％、减少100％、减少150％、减少200％或减少超过200％。为了评估对体内神经元迁移的影响，优选地，可以通过将质粒dna溶液微注射到脑室系统的腔体中，然后将电脉冲手动导向相关神经源性组织来转染感兴趣的脑区域的神经祖细胞(dalmaschio等,2012.pmid:22805567)。或者，可以使用vanerp等,2015.dev.cell.pmid:26651291所述方法，其采用iue。在其中，向胚胎的侧脑室注射mirna或其来源以及报告质粒pcag-gfp(作为标记摄取dna的细胞的报告物)。运动皮质(motorcortices)优选通过设置成50ms的五个单极脉冲以30v(950ms间隔)的电穿孔靶向，使用固定头部(负极)的铂镊子电极，以及位于头部顶部的第三镀金电极(正极)。电穿孔后，可以将胚胎放回腹部，然后缝合腹部肌肉和皮肤。然后优选在定义的年龄(例如，在e16.5–p10)收集胚胎，然后使用甲醛固定头部，制造冷冻切片，并进行免疫组学化学用于检测摄取mirna，安塔够妙或其来源的细胞。可以使用常规共焦显微镜获取图像。然后可以分析gfp阳性细胞的迁移，并与其他对象或对照对象中的其他迁移或相似迁移进行比较。对照对象可以是健康对象。优选如实验数据(实施例2)中所示评估神经突迁移的可检测的增加。可检测的增加优选增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多，更优选如实验数据中所示评估。可以局部评估对象中的神经突迁移。“局部”的含义已经在本文中定义。神经元连接性或可塑性可以定义为说明大脑在结构和功能上适应环境增强的能力的综合术语。神经可塑性对于认知能力如学习和记忆形成尤其重要。与神经元缺陷相关的病症中可能存在或者可以检测到受损或缺陷或降低的神经元连接性或可塑性。可以局部评估和检测对象中的这类受损、缺陷或降低的神经元连接性或可塑性。在上下文中，“局部”可以指所述对象器官，组织，细胞和/或人体给定的体积或区域或位置，如本文早先所定义。这类器官，组织，细胞和/或所述身体的体积或区域或位置包含或由神经元细胞组成。这类器官，组织，细胞和/或所述身体的体积或区域或位置可以包含至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的神经元细胞。通过与对照对象中相同或相似位置处相应神经元连接性或可塑性能力进行比较，或者通过与相同对象中但是在其身体不同位置处相应神经元连接性或可塑性能力进行比较，可以评估这类受损、缺陷或降低的神经元连接性或可塑性。在这样的上下文中，受损、缺陷或降低可以表示减少1％、减少5％、减少10％、减少15％、减少20％、减少25％、减少30％、减少35％、减少40％、减少45％、减少50％、减少55％、减少60％、减少65％、减少70％、减少75％、减少80％、减少85％、减少90％、减少95％、减少100％、减少150％、减少200％或减少超过200％。神经元连接性或可塑性的评估可以这样进行，使用技术，诸如行为研究(例如，记忆功能测试，莫里斯水迷宫(morriswatermaze)，新型物体识别)或电生理研究(例如，长期增强(ltp)诱导研究)，或使用这些研究的结合。合适的方法述于cole等,2012.(pmid:22885849)。另一合适的方法述于pavlopoulos等,2011.(pmid:22153079)。对照对象可以是健康对象。优选将神经元连接性或可塑性可检测的增加评估为相较于未处理或模拟处理的样品或对象，连接性或可塑性相对增加。可检测的增加优选增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多，更优选如实施例2中所示评估。可以局部评估对象中的神经元连接性或可塑性。“局部”的含义已经在本文中定义。优选将正确的神经元(放电)充电可检测的增加或错误神经元(放电)充电可检测的降低评估为相对于未处理或模拟处理的对象或样品，之前获自对象的样品或对象中的相对增加。可检测的增加优选增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多，更优选如实施例3中所示评估。可以局部评估对象中正确的神经元(放电)充电。“局部”的含义已经在本文中定义。krüppel样因子4(klf4，或肠道富集的krüppel样因子或gklf)是锌指转录因子。这是轴突生长和再生的已知固有抑制剂。klf4在非分裂细胞中高度表达，并且其过表达诱导细胞周期停滞(yoonhs和yangvw(2004).j.biol.chem.279(6):5035–41.doi:10.1074/jbc.m307631200)。神经元中klf4的敲除增强轴突生长，顶突起(leadingprocess)长度和神经元迁移(moore和,2009；qin和zhang,2012)。缺乏klf4的敲除小鼠在视神经损伤后显示出视网膜神经节细胞(rgc)轴突再生显著增强(moore等，2009；qin等，2013)。klf4的这种影响需要经由janus激酶(jak)-信号传导及转录激活因子3(stat3)途径(qin等,2013)的下游信号传导，但是本领域尚不知晓该途径的上游调控机制。发明人现在发现，根据本发明用途的mirna可以抑制klf4的表达，促进神经元生成或再生或神经可塑性或神经连接性。在本发明的疾病或病症中，可以在疾病或病症发作之前(即在所述疾病或病症的症状出现之前)检测到神经元缺乏。本发明进一步涵盖可以在所述疾病或病症发展期间(即在所述疾病或病症症状的迹象出现之后)检测到神经元缺乏。可以在治疗开始之前和/或治疗开始之后评估和检测对象中的神经元缺乏。可以在对象中，优选在所述对象身体区域中评估和检测神经元缺陷。如果使用本文所示mirna分子，isomir，模拟物，安塔够妙或其来源评估神经元生成或再生可检测的促进或诱导，那么将这类mirna分子，isomir，模拟物，安塔够妙或其来源称为用于治疗、逆转、预防、治愈和/或延缓神经元缺陷或与这类神经元缺陷相关的疾病或病症的药物。神经元生成或再生的评估可以周期性地进行，例如，每周，每月。优选地，对于给定对象在多个时间点或者对于给定对象和健康对照在一个或多个时间点进行评估。可以固定的时间间隔进行评估，例如，每周，每月。当神经元生成或再生的一个评估导致发现了神经元生成或再生可检测的增加或促进或诱导时，将mirna分子，模拟物，其isomir或其来源或其安塔够妙或模拟物或来源称为表现出神经元生成或再生可检测的促进。优选地，当至少一个时间点已经检测到神经元生成或再生可检测的增加或诱导或促进时，已经检测到神经元生成或再生可检测的增加或诱导或促进。优选地，已经检测到至少两个，三个，四个，五个时间点神经元生成或再生可检测的增加或诱导或促进。本发明提供了这样的组合：mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p分子，模拟物，isomir，安塔够妙或其来源，和任选地，mirna-124分子，模拟物，isomir，安塔够妙或其来源，或者这样的组合物，所述组合物包含所述mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p分子，模拟物，isomir，安塔够妙或其来源，和任选地，mirna-124分子，模拟物，isomir，安塔够妙或其来源，其优选用作用于治疗、逆转、预防、治愈和/或延缓神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病或病症的药物。令人惊奇地发现了mirna-135分子或其模拟物或isomir能够表现出神经元生成或再生可检测的促进，如本文所述实施例2中所示。具体地，令人惊奇地发现了mirna-135a分子或其模拟物或isomir能够表现出神经元生成或再生可检测的促进，如本文所述实施例2中所示。具体地，令人惊奇地发现了mirna-135b分子或其模拟物或isomir能够表现出神经元生成或再生可检测的促进，如本文所述实施例2中所示。令人惊奇地发现了mirna-196a-5p分子或其模拟物或isomir能够表现出神经元生成或再生可检测的促进，如本文所述实施例2中所示。令人惊奇地发现了mirna-135分子或其模拟物或isomir或安塔够妙，优选其安塔够妙，能够表现出神经元细胞的错误(放电)充电可检测的减少，如本文所述实施例3中所示。具体地，令人惊奇地发现了mirna-135a分子或其模拟物或isomir或安塔够妙，优选其安塔够妙，能够表现出神经元细胞的错误(放电)充电可检测的减少，如本文所述实施例3中所示。具体地，令人惊奇地发现了mirna-135b分子或其模拟物或isomir或安塔够妙，优选其安塔够妙，能够表现出神经元细胞的错误(放电)充电可检测的减少，如本文所述实施例3中所示。优选地，当mirna-135a，mirna-135b，mirna-196a-5p和/或mirna-124分子或其模拟物或isomir或安塔够妙或来源表现出神经元生成或再生可检测的促进时，所述分子能够预防、治疗、逆转、治愈和/或延缓神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病或病症。神经元缺陷或其中涉及或与神经元缺陷相关的疾病或病症是任何这样的疾病或病症，其中数量减少的神经元细胞和/或功能或活性或3d方面受损的神经元细胞可以在疾病或病症发作之前或在所述疾病或病症发展期间检测到。例如，疾病或病症可以是任何神经退行性疾病，如脑血管意外(cva)，阿尔茨海默氏病(ad)，血管相关痴呆，克雅二氏症(cjd)，牛海绵状脑病(bse)，帕金森氏病(pd)，脑外伤，(晚期)多发性硬化症(ms)，肌萎缩性侧索硬化症(als-劳格里格氏病)，肠神经退行，视神经损伤，衰老引起的认知功能下降和亨廷顿氏舞蹈病(huntington’schorea)。疾病或病症可能是神经系统病灶，其来自外伤性挫伤，撕脱，压迫和/或横断或其他身体损伤，或来自由外科手术，血管药物或其他损伤包括出血或缺血性损伤或其他神经学疾病所诱导或导致的组织损伤。疾病或病症可以是青光眼。疾病或病症可以是癫痫。当前存在已知药物，其可以用于特异性治疗、逆转、预防、治愈和/或延缓对象中神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病和/或病症。然而，这些治疗中的每一种都有可能显示出不足以用于患者的治疗活性。这种不足可能源于毒性，源于导致摄取或生物分布不足的药物动力学不良，源于无法穿越血脑屏障，或源于一般低效力。优选地，当这类已知药物不能表现出神经元生成或再生可检测的促进时，这类治疗活性不足以用于患者中。这些特征已经在本文前述部分定义。本发明提供了预期将不具有这些缺点的新药物。本发明涵盖下述内容的用途：mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p，模拟物，isomir，或安塔够妙或其来源，或这样的组合物，所述组合物包含所述mirna-135a和/或mirna-135b分子和/或mirna-196a-5p，模拟物，isomir，或安塔够妙或其来源。该用途包括在对象中，在所述对象的细胞中，在所述对象的组织中或在所述对象的体液中增加，优选药理学地增加所述mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p，isomir或所述其来源的活性或稳态水平。在本发明的上下文中，“增加安塔够妙或其模拟物或所述其来源的活性或稳态水平”可以被“降低mirna分子或其ismor的活性或稳态水平”替代。本文所示其他安塔够妙也是如此。在该用途中，所述mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p或其isomr或来源的活性或稳态水平增加，从而表现出神经元生成或再生可检测的促进。本文前述部分已经定义了评估对象中这类神经元生成或再生可检测的促进。所述mirna-135a和/或mirna-135b分子和/或mirna-196a-5p，isomir或其来源的活性或稳态水平可以在所述mirna分子(或其isomir)本身的水平上增加，例如，通过向对象，优选向对象的细胞，或所述对象的组织，或所述对象的器官或向所述对象，提供所述mirna分子，模拟物或isomir或其来源；所述mirna分子，模拟物，isomir或其来源来自外源性来源。为了由外源性来源提供mirna分子或其模拟物或isomir，所述分子可以这样方便地产生：在如下述的合适宿主细胞中表达编码所述分子或编码所述分子的来源的核酸，或者是通过化学合成的完全合成分子。编码mirna-135a的来源的核酸分子的实例是编码mirna-135a前体的核酸分子。所述核酸分子其自身也是mirna-135a的来源。对象的优选细胞是脑细胞或脊髓细胞或来自外周神经系统的细胞。优选的神经细胞是传出神经细胞和/或运动神经细胞。然而，优选地，mirna分子或其isomir的活性或稳态水平这样增加或降低：通过调节编码所述mirna分子或其isomir或编码所述mirna分子或其isomir的来源的核苷酸序列的表达水平。优选地，调节所述对象的细胞中或所述对象的组织中或对象中核苷酸序列的表达水平。mirna分子或其isomir或所述mirna分子或其isomir的来源的表达水平可以这样增加或降低，通过将mirna，isomir，安塔够妙，模拟物或其来源，或表达构建体(或载体)引入所述对象的细胞、组织、器官或体液，或对象中，从而表达载体包含这样核苷酸序列，所述核苷酸序列包含mirna分子或其模拟物或isomir或安塔够妙或者包含所述mirna分子或其模拟物或isomir或安塔够妙的来源，并且从而核苷酸序列受到这样的启动子的控制，所述启动子能够驱动核苷酸序列在所述细胞、组织、器官、对象中的表达。通常，可以通过使用mirna分子，isomir，模拟物或其前体来增加表达。通常，可以通过使用安塔够妙或其模拟物或其前体来降低表达。还可以通过将表达构建体引入细胞、组织、器官、对象中来增加mirna分子或其模拟物或isomir或安塔够妙或来源的表达水平，从而构建体包含编码能够反式激活这样的内源性核苷酸序列的因子的核苷酸序列，所述内源性核苷酸序列编码mirna分子或其模拟物或isomir或安塔够妙。本发明的用途优选包括向对象给予治疗有效量包含核酸构建体的药物组合物的步骤，用于增加本文所定义的mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p分子或isomir的活性或稳态水平，或者用于降低本文所定义的mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p分子或isomir的活性或稳态水平。使用安塔够妙或其来源可以有利地实现降低。核酸构建体可以是表达构建体，如本文进一步说明。优选地，表达构建体是这样的病毒基因治疗载体，所述病毒基因治疗载体选自基于腺病毒，腺相关病毒(aav)，疱疹病毒，痘病毒，溶瘤病毒载体和逆转录病毒的基因治疗载体。优选的病毒基因治疗载体是腺病毒载体，aav载体或慢病毒载体。在正义方法中，病毒载体是优选的来源或前体。在反义方法中，使用了短发夹阻断剂或反义分子来阻断mirna机制。或者，本发明的用途优选包括向对象给予治疗有效量的药物组合物的步骤，所述药物组合物包含本文所定义的mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p分子，isomir，模拟物，安塔够妙或其来源，或者包含本文所定义的mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p分子，isomir，模拟物，安塔够妙或其来源。在本发明的用途中，细胞，组织，器官或体液优选来自这样的对象，所述对象由于例如其年龄或其遗传背景而疑似处于表现出神经元缺陷或患有与神经元缺陷相关的疾病或病症的高风险中。或者，在另一个优选实施方式中，将本发明的用途应用于来自对象的细胞，组织，器官或体液，将所述对象诊断为处于后续发展出与神经元缺陷相关的疾病或病症的预测风险。优选使用的诊断方法是本文所述的发明之一。或者，可以基于与神经元缺陷相关的疾病或病症的进展的风险来选择待治疗的细胞，组织或器官。可以使用本领域技术人员已知的经典临床病理学标准或基于生物标志物的预后来评估这种进展风险。本发明还涵盖将mirna-135和/或mirna-196a-5p分子isomir，模拟物，安塔够妙或其前体或这样的组合物给予所述对象的组织或器官中，所述组合物包含所述mirna-135和/或mirna-196a-5p分子isomir，模拟物，安塔够妙或其来源。该器官或组织可以对应器官或组织，其中已经诊断了神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病或病症。在发明中，优选的组织是这样的组织，所述组织与神经元组织相关或包含神经元组织或包括神经元组织或由神经元组织组成。在发明中，优选的器官是包含或由神经元细胞组成的器官。优选器官的实例包括脑，海马体和视神经。与神经元细胞相关的组织可以位于此类细胞附近，并且可以作用于神经元细胞。在该上下文中，邻近可以表示长达数厘米。在本发明中，优选的细胞是神经元细胞。在各种情况中，mirna-135和/或mirna-196a-5p分子，isomir，模拟物，安塔够妙或其来源优选给予存在于所述器官、组织中的神经元细胞。所述mirna-135和/或mirna-196a-5p分子，isomir，模拟物，安塔够妙或其来源优选给予这样的组织，所述组织包含30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的神经元细胞。所述mirna-135和/或mirna-196a-5p分子，isomir，模拟物，安塔够妙或其来源可以靶向神经元细胞。神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病或病状的治疗可以包括这样的治疗，所述治疗预防包含神经元的组织中的神经元缺陷的发生或者减少已经诊断为患神经元缺陷的神经元细胞周围的神经元缺陷。可通过将所述mirna-135和/或mirna-196a-5p分子，isomir，模拟物，安塔够妙或其来源与靶向部分或归巢装置连接或偶联来靶向神经元细胞。优选的靶向部分是已知识别或结合在神经元细胞上表达的分子的任何分子。在本发明的上下文中，每当给予mirna-135或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源时，参照单独给予mirna-135a或其isomir或模仿物或安塔够妙或来源，单独给予mirna-135b或其isomir或模拟物或安塔够妙或来源，或组合给予mirna-135a和mirna-135b或其isomir或模拟物或安塔够妙或来源。在另一种用途中，本文所提及的本发明可以组合神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病或病症的标准治疗，如记忆训练或使用作用于cns的已知药物。尽管基因疗法是用于治疗，逆转，预防和/或延缓与神经元缺乏有关的病症或疾病的可能性，但也可以设想其他可能的治疗。例如，还优选通过“小分子”药物进行治疗以将某些分子途径引导至所需方向。这些小分子优选通过本文稍后定义的本发明的筛选方法来鉴定。在本发明的上下文中，治疗、逆转、预防、治愈和/或延缓神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病或状况可能意味着：-该疾病或病症的至少一种症状的严重程度已经降低，和/或-已经改善了与该疾病或病症相关的至少一种参数：优选地，该参数是或与神经元缺乏相关和/或包括许多神经元细胞和/或神经元细胞的功能或活性或3d方面，如本文之前所述。参数可以是如本文之前所解释的神经元缺乏的评估。在本发明的上下文中，治疗、逆转、预防、治愈和/或延缓神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病或状况可以通过实现或促进或诱导神经元生成或再生所替代。除非另有说明，否则优选在至少一周，两周，三周，四周，一个月，两个月，三个月，四个月，五个月，六个月或更长时间后评估或检测治疗对象中实现或促进或诱导神经元的生成或再生。优选将对象中实现或促进或诱导神经元生成或再生鉴定为：-延长患者存活至少一个月，几个月或更长时间(相较于未经治疗或用对照治疗的那些，或者相较于治疗开始时的对象)和/或-改善生活质量并缓解疼痛。在本发明的上下文中，患者可以存活和/或可以被认为是无病的。或者，该疾病或病症可能已经停止或延缓。在本发明的上下文中，改善生活质量和观察到的疼痛缓解可能意味着相较于治疗开始时，患者可能需要更少的疼痛缓解药物。替代地或者与消耗较少的疼痛缓解药物组合，患者相比治疗开始时便秘更少。在本文中，“更少”表示少5％，少10％，少20％，少30％，少40％，少50％，少60％，少70％，少80％，少90％。患者可能不再需要任何疼痛缓解药物。在至少一个星期，两个星期，三个星期，四个星期，一个月，两个月，三个月，四个月，五个月，六个月或更长时间的治疗之后，并相较于患者治疗开始时观察到的疼痛缓解以及生活质量，可以看到、发现或评估患者中这种观察到的疼痛缓解以及生活质量的改善。组合物在本发明的一个方面中，提供了组合物，其包含mirna，安塔够妙或其来源。这类组合物优选用于如上所定义的用途。因此，该方面优选的实施方式提供了根据本发明用途的组合物，其包含mirna，安塔够妙或其来源。本文将这样用途的组合物称之为根据本发明用途的组合物。据本发明用途的这类组合物优选的其他成分是药学上可接受的赋形剂。在优选的实施方式中，组合物包含mirna-135a、mirna-135b和mirna-196a-5p或它们之中任一种的isomir、模拟物或来源，或所述mirna的安塔够妙。因此，这方面内更优选的实施方式提供了根据本发明用途的组合物，其包含：i)mirna-135a分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源，和/或ii)mirna-135b分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源，和/或iii)mirna-196a-5p分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源。这方面更优选的实施方式提供了：根据本发明用途的组合物，其包含mirna-135a分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源，优选mirna分子，或其isomir，模拟物或来源。根据本发明用途的组合物，其包含mirna-135b分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源，优选mirna分子，或其isomir，模拟物或来源。根据本发明用途的组合物，其包mirna-196a-5p分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源，优选mirna分子，或其isomir，模拟物或来源。根据本发明用途的组合物，其包含mirna-135a分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源，优选mirna分子，或其isomir，模拟物或来源，和mirna-135b分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源，优选mirna分子，或其isomir，模拟物或来源。根据本发明用途的组合物，其包含mirna-135a分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源，优选mirna分子，或其isomir，模拟物或来源，和mirna-196a-5p分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源，优选mirna分子，或其isomir，模拟物或来源。根据本发明用途的组合物，其包含mirna-135b分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源，优选mirna分子，或其isomir，模拟物或来源，和mirna-196a-5p分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源，优选mirna分子，或其isomir，模拟物或来源。根据本发明用途的组合物，其包含mirna-135a分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源，优选mirna分子，或其isomir，模拟物或来源，和mirna-135b分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源，优选mirna分子，或其isomir，模拟物或来源，和mirna-196a-5p分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源，优选mirna分子，或其isomir，模拟物或来源。根据本发明用途的组合物，其包含mirna-135a分子的安塔够妙，或其模拟物，或包含其来源。根据本发明用途的组合物，其包含mirna-135b分子的安塔够妙，或其模拟物，或包含其来源。根据本发明用途的组合物，其包含mirna-196a-5p分子的安塔够妙，或其模拟物，或包含其来源。根据本发明用途的组合物，其包含mirna-135a分子的安塔够妙，或其模拟物，或包含其来源，并包含mirna-135b分子的安塔够妙，或其模拟物，或包含其来源。根据本发明用途的组合物，其包含mirna-135a分子的安塔够妙，或其模拟物，或包含其来源，并包含mirna-196a-5p分子的安塔够妙，或其模拟物，或包含其来源。根据本发明用途的组合物，其包含mirna-135b分子的安塔够妙，或其模拟物，或包含其来源，并包含mirna-196a-5p分子的安塔够妙，或其模拟物，或包含其来源。根据本发明用途的组合物，其包含mirna-135a分子的安塔够妙，或其模拟物，或包含其来源，并包含mirna-135b分子的安塔够妙，或其模拟物，或包含其来源，包含mirna-196a-5p分子的安塔够妙，或其模拟物，或包含其来源。本文所述所有组合物优选还包含药学上可接受的赋形剂。本发明还涵盖的是本文所述的组合物，其基本上由描述为包含的组分组成。本发明还涵盖的是本文所述的组合物，其由描述为包含的组分组成。在更优选的实施方式中，本文提供了根据本发明用途的组合物，优选如上文所定义，其进一步包含mirna-124分子，mirna-124模拟物，mirna-124isomir，mirna-124安塔够妙，或其来源，优选包含mirna-124分子，模拟物，isomir或其来源。当本发明涉及包含超过一种mirna分子，isomir，模拟物，安塔够妙或其来源或其安塔够妙的组合物时，其涵盖mirna分子，isomir，模拟物，安塔够妙或其来源或其安塔够妙各自可以存在于单独的组合物中，各组合物依次或同时给予对象。或者，还涵盖超过一种mirna分子，isomir，模拟物或其来源或其安塔够妙存在于如本文所定义的组合物中。因此，本发明还涵盖额外使用mirna-124分子，isomir，模拟物，安塔够妙或其来源或组合物，所述组合物包含所述mirna分子或isomir，模拟物，安塔够妙或其来源和/或mirna-124分子的其他安塔够妙。该优选用途包括增加，优选药理学地增加对象中，所述对象的细胞中，所述对象的组织中或所述对象的体液中所述mirna-124分子，isomir或所述其来源的活性或稳态水平。在该优选用途中，如上所定义的mirna-124分子或isomir或前体的活性或稳态水平可以增加，从而表现出神经元生成或再生可检测的促进。本文前述部分已经定义了增加安塔够妙活性和稳态水平的方法。本文前述部分已经定义了评估对象中神经元生成或再生的促进。在其他方面中，本文提供了下述物质优选地在制备用于预防、治疗、逆转、治愈和/或延缓神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病和/或病症的药物中的用途：mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p分子，isomir，模拟物，安塔够妙或其来源，或者这样的组合物，所述组合物包含所述mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p分子，isomir，模拟物，安塔够妙，或其来源。本文已经描述了这另一方面的每个特征。在另一方面中，本文提供了用于治疗、逆转、预防、治愈和/或延缓神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病和/或病症的方法，其通过向有此需要的对象给予mirna分子，isomir，模拟物或其来源或其安塔够妙或组合物，本文之前所定义。本文已经描述了这方面的每个特征。根据本发明的用途优选简化为在用于治疗、治愈、逆转、预防和/或延缓神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病和/或病症的方法中实践。因此，本发明提供了用于治疗、治愈、逆转、预防和/或延缓神经元缺陷或与神经元缺陷相关的病症或疾病的方法，其通过向有此需要的对象给予根据本发明的mirna，安塔够妙或其来源，或根据本发明的组合物。其他特征在本文的其他部分描述。在另一方面，本文提供了用于诊断对象中神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病或病症的方法，该方法包括下述步骤：(a)确定根据本发明的mirna，isomir或其来源的表达水平，和任选地(b)将根据本发明的所述mirna，isomir或其来源的表达水平与所述mirna，isomir或其来源表达水平的参比值进行比较，所述参比值优选是健康对象中所述mirna，isomir或其来源表达水平的平均值。在本发明的上下文中，诊断表示对对象发展出神经元缺陷或发展出与神经元缺陷相关的疾病或病症的预测性风险评估。在本发明的上下文中，对象可以是动物或人类。优选地，对象是人类。在本发明的上下文中，将(b)中评估的参比值以及(a)中评估的mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna196a-5p分子，isomir或其来源的表达水平在两对象的相应或相似组织中评估。在优选的实施方式中，该方面提供了用于诊断对象中癫痫或与癫痫相关的疾病或病症的方法，所述方法包括下述步骤：(a)确定如上所定义的mirna或其来源的表达水平，优选mirna-135分子或mirna-135isomir，并且任选地，(b)将所述mirna或其来源的表达水平与所述mirna或其来源的表达水平的参比值进行比较，所述参比值优选是健康对象中所述mirna或其来源表达水平的平均值。因为对象中这些核苷酸序列的表达水平和/或相应mirna分子或isomir或其来源的量可能难以测量，所以优选使用来自对象的样品。根据另一优选的实施方式，在获自对象的样品中离体确定表达水平(核苷酸序列或mirna分子或isomir或其来源的表达水平)。因此，在优选的实施方式中，本发明提供了用于诊断的方法，如本文所述，其中在获自所述对象的样品中离体确定表达水平。样品可以包含对象的体液。样品可以是对象的组织活检。优选的组织包含或由神经元细胞组成或与之相关。体液可以包含或源自血液，血清，唾液，血浆，cfs(脑脊液)，粪便，尿液。特别设想了本发明可以用于评价或诊断与神经元缺乏相关的疾病或病症的阶段之间的差异。核苷酸序列表达水平(或编码的mirna分子或isomi或其来源的稳态水平)的增加或降低优选定义为相较于健康对象中相应核苷酸序列(或相应编码的mirna分子或其isomir或来源)的表达水平使用本文之前所定义的方法使核苷酸表达水平(或编码的mirna分子或isomir或其来源的稳态水平或mirna分子或其isomir或来源生活活性中任何可检测的改变)可检测的改变。优选的核苷酸序列是编码mirna分子或其isomir的前体的序列。根据优选的实施方式，mirna活性的增加或降低使用针对mirna活性的具体试验定量。优选的试验是评估神经元缺陷或神经元生成或再生的促进，如之前所定义。优选地，核苷酸序列表达水平降低表示降低至少10％核苷酸序列表达水平，使用阵列。更优选地，核苷酸序列表达水平降低表示降低至少15％，甚至更优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少90％或100％。在该情况中，没有可检测的表达。优选地，mirna分子或其isomir或来源表达水平降低表示降低至少10％mirna表达水平，使用qpcr，微阵列或northern印迹分析。优选地，qpcr是茎-环rtqpcr。更优选地，mirna分子或其isomir或其来源表达水平降低表示降低至少15％，甚至更优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少90％或100％。在该情况中，没有可检测的表达。优选地，mirna活性降低表示降低至少5％mirna活性，使用合适的试验。更优选地，mirna活性降低表示降低至少10％，甚至更优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少90％或100％。在该情况中，没有可检测的活性。优选地，核苷酸序列表达水平增加表示增加至少10％核苷酸序列表达水平，使用本文所提及的任何技术。更优选地，核苷酸序列表达水平增加表示增加至少15％，甚至更优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少90％、至少150％或更多。优选地，mirna分子或其isomir或来源表达水平增加表示增加至少10％mirna分子或其isomir或来源表达水平，使用rt-qpcr，优选茎-环rtqpcr。更优选地，mirna分子或其isomir或来源表达水平增加表示增加至少15％，甚至更优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少90％、至少150％或更多。优选地，mirna活性增加表示增加至少5％mirna活性，使用合适的试验。更优选地，mirna活性增加表示增加至少10％，甚至更优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少90％、至少150％或更多。优选地，在获自对象的样品中离体确定表达水平。更优选地，样品如之前所定义的并且其中使用本领域技术人员已知的方法后续提取和纯化给定的核苷酸序列和/或mirna分子或其isomir或来源。更优选地，样品是或包含或源自活检，血液，唾液，粪便或尿液。在本发明的诊断方法中，优选地，确定超过一种，更优选至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种mirna分子或其isomir或来源的表达水平和/或相应mirna分子或其isomir或来源的稳态水平。根据优选的方法，在步骤(a)中，确定选自下述的另一mirna分子或其isomir或来源的表达水平：i)mirna-124分子，mirna-124isomir，mirna-124前体，或ii)klf4，或iii)mirna-135a和mirna-135b，或者isomir，或其来源，或iv)mirna-135a和mirna-196a-5p，或者isomir，或其来源，或v)mirna-135b和mirna-196a-5p，或者isomir，或其来源，或vi)mirna-135a和mirna-135b和mirna-196a-5p中的任一种，或者isomir，或其来源。在另一优选的方法中，在步骤(a)，确定了下述内容的表达水平：i)mirna-135a和mirna-135b，或者isomir，或其来源，或ii)mef2a，或iii)前-mirna-135a1，或iv)前-mirna-135a2，或v)前-mirna-135a1和前-mirna-135a2。可以通过确定蛋白质内容物或者通过确定mrna确定mef2a的表达。优选地，当发现前-mirna-135a2表达增加时诊断为癫痫，更优选的是对于未发现前-mirna-135a1表达增加的人对象。当前mir-135a1和前-mir-135a2之间的比例确定时，诊断的癫痫优选颞叶癫痫。当前-mir-135a1和前-mir-135a2之间的相对表达比例确定时，当前-mir-135a2的相对表达比pre-mir-135a1的相对表达高至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130％或更高时，更优选至少60、70、80、90、100、110、120、130％或更高时，优选诊断为癫痫。优选地，前-mir-135a1的相对表达比参比值(如健康对象或健康对象的平均值)高至多20、5、10、5或0％。在优选实施方式中，当前-mir-135a1表达相较于参比值不增加或者增加至多15、10或5％时，而前-mir-135a2表达相较于参比值增加或者增加至少30、40、50、60、70、80、90或100％时，诊断为癫痫。优选的参比值是健康对象中的表达或健康对象中的平均表达——在该上下文中，表达水平优选经标准化，如标准化至gapdh表达。前-mir可以通过已知技术确定，例如，qpcr。在另一优选方法中，当比较导致发现所述mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p分子，isomir或其来源表达水平降低时，诊断为神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病或病。更优选地，当比较导致发现所述mirna分子，isomir或其来源表达水平增加时，诊断为癫痫或与癫痫相关的疾病或病。在另一优选方法中，当比较导致发现所述mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p分子，isomir或其来源表达水平降低以及mirna-124分子，isomir或其来源表达水平降低时，诊断为神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病或病症。在另一优选实施方式中，当比较导致发现所述mirna-135，isomir或其来源表达水平降低和/或mirna-124分子，isomir或其来源表达水平降低时，诊断为神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病或病症。在另一方面中，本文提供了用于鉴定能够治疗、逆转、预防、治愈和/或延缓对象中神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病或病症的物质或分子的方法，所述方法包括下述步骤：(a)提供能够表达mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196-5p分子，isomir或其来源的测试细胞群，优选所述测试细胞群包含神经元细胞，如sh-sy5y，更优选所述测试细胞群包含哺乳动物细胞，甚至更优选人细胞；(b)使所述测试细胞群与所述物质接触；(c)确定接触所述物质或用所述物质孵育的测试细胞群中所述mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196-5p分子，isomir或其来源的表达水平，或者所述mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196-5p分子，isomir或其来源的活性或稳态水平；(d)将(c)中确定的所述表达，活性或稳态水平与未接触所述物质的测试细胞群中所述mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196-5p分子，isomir或其来源的表达，活性或稳态水平进行比较；和(e)鉴定这样的物质，所述物质在接触所述物质的测试细胞群和未接触所述物质的测试细胞群之间产生所述mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196-5p分子，isomir或其来源的表达水平，活性或稳态水平差异。优选的测试细胞群是能够表达mirna-135a和/或mirna-135b的测试细胞群；当使用该测试细胞群时，步骤(c)和(d)和(e)仅与mirna-135a和/或mirna-135b相关。优选地，在步骤a)中，测试细胞包含核酸构建体，所述核酸构建体包含mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p分子或其isomir或其前体，如本文之前所示。优选地，在方法中，比较超过一种核苷酸序列或超过一种mirna分子，isomir或其来源的表达水平、活性或稳态水平。优选地，在方法中，测试细胞群包含哺乳动物细胞，更优选人细胞。更优选地，测试细胞是神经元细胞。还可以使用sh-sy5y细胞系。优选的测试细胞群不表达mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196a-5p分子或其isomir或其来源，或者相较于正常对应物的表达降低。更优选地，测试细胞群包含神经元细胞。更优选地，测试细胞群包含20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的神经元细胞。可以通过它们标志物的表达鉴定神经元细胞。替代地或除了之前所述细胞外，本发明的一个方面还涉及在前述方法中鉴定的物质。在优选的方法中，比较mirna-124分子或其isomir或来源的表达水平，活性或稳态水平。在另一方面，提供了体内、体外或离体方法，用于促进神经元生成或再生，其至少包括这样的步骤：使细胞与根据本发明的mirna，安塔够妙或其来源或者与本发明的组合物接触。这类方法可以包括本文其他地方所述的方法的步骤。在本发明的上下文中，使细胞与化合物或组合物接触可以包括将这类化合物或组合物添加到其中培养了细胞的培养基中。使细胞与化合物或组合物接触可以还包括将这类化合物或组合物添加到其中悬浮了细胞或者覆盖了细胞的培养基，缓冲液或溶液。使细胞接触的其他优选方法包括使用化合物或组合物注射细胞，或者将细胞暴露与包含根据本发明的化合物或组合物的材料。在该方面的实施方式中，方法是体外方法。在该方面的另一实施方式中，方法是离体方法。在该方面的另一实施方式中，该方法是体内方法；在这样的情况中，本文其他地方所定义的给予/给药是接触细胞的优选模式。在该方面的优选实施方式中，方法是体外或离体方法。在该方面的实施方式中，细胞可以是获自对象的样品的细胞。这类样品可以是之前获自对象的样品。在该方面的实施方式中，样品可以是之前已经由人对象获得的。在该方面的实施方式中，样品可以是已经由非人对象获得的。在该方面优选的实施方式中，获取样品不是根据本发明的方法的部分。在根据本发明的方法或用途的优选实施方式中，根据本发明的方法或用途使用根据本发明的产品。本文所述一般定义和一般技术微小rna分子("mirnas")通常长度为21-22个核苷酸，虽然已经报道了长度为17和上至25个核苷酸。因此，本发明涵盖了17、18、19、20、21、22、23、24、25中的任意长度。mirna各自由较长的前体rna分子加工而成("前体mirna")。前体mirna转录自非蛋白质编码的基因。前体的长度可以是至少50、70、75、80、85、100、150、200个核苷酸或更多。前体mirna具有能够形成茎-环样或折回样结构的两个互补区域，它们在动物中被称为dicer和drosha的酶切割。dicer和drosha是核糖核酸酶ill样核酸酶。加工的mirna通常是茎的部分。加工的mirna(也称之为“成熟mirna”)成为大型复合物(称为rna诱导沉默复合物(risc)复合物)的部分，以调节(下调)特定靶基因。动物mirna的实例包括与mrna靶标完美或不完美碱基配对的动物mirna，分别导致mrna降解或翻译抑制(olsen等，1999；seggerson等，2002)。sirna分子也由dicer加工，但来自长双链rna分子。sirna在动物细胞中不是天然存在的，但是它们可以在这类细胞中，在rna诱导的沉默复合物(risc)中发挥功能，以指导mrna靶标的序列特异性切割(denli等，2003)。sirocco是一个eu联盟，其研究沉默rna作为真核生物体中复杂性的组织者和协调者(例如，参见cordis.europa.eu/pub/lifescihealth/docs/sirocco.pdf和www.sirocco-project.eu)。作为一个联盟，sirocco维护mirna序列信息的数据库。sirocco数据库中所列出的各mirna条目基于观测和验证的所述mirna表达。内源性mirna分子的研究述于美国专利申请号60/575,743中，其通过引用其全部内容纳入本文。当成熟的单链rna与调节mrna翻译的蛋白质复合物结合时，mirna在细胞中显然具有活性，所述mrna与mirna杂交。引入以与内源性表达的mirna相同方式影响细胞的外源性rna分子需要具有与内源性成熟mirna相同序列的单链rna分子被促进翻译控制的蛋白质复合物所摄取。已经评估了多种rna分子设计。已经鉴定了三种一般设计，它们可以通过mirna途径使所需单链mirna的摄取最大化。具有这样mirna序列的rna分子可以称之为合成mirna，所述mirna序列具有三种设计中的至少一种。本发明的mirna分子可以替代或补充内源性mirna的基因沉默活性。这类分子的实例，这类分子和包含这类分子的组合物的优选特征和修饰述于wo2009/091982中，通过引用其全部内容纳入本文。在一些实施方式中，本发明的mirna分子或其isomir或模拟物或来源包含两种rna分子，其中一种rna与天然产生的成熟mirna相同。与成熟mirna相同的rna分子称之为活性链。第二rna分子称之为互补链或随从链，其与活性链至少部分互补。将活性链和互补链杂交以产生双链rna，该双链nra与天然产生的mirna前体相似，所述天然产生的mirna前体刚好在细胞中mirna激活之前与蛋白质复合物结合。使所述mirna的活性最大化需要通过在翻译水平上调节基因表达的mirna蛋白质复合物使活性链的摄取最大化并使互补链的摄取最小化。提供最佳mirna活性的分子设计涉及修饰互补链。两种设计纳入了互补链的化学修饰。第一种修饰涉及产生互补rna，在其5'末端具有除了磷酸基团或羟基以外的基团。5'修饰的存在明显消除了互补链的摄取，并随后有利于mirna蛋白复合物对活性链的摄取。5'修饰可以是多种分子的任一种，包括nh2、nhcoch3、生物素和其他。通过显著减少mirna途径对互补链摄取的第二种化学修饰策略是在互补链的前2-6个核苷酸中纳入具有糖修饰的核苷酸。应当注意的是，可以将与第二设计策略一致的糖修饰和与第一设计策略一致的5'末端修饰结合，以进一步增强mirna活性。第三种mirna设计涉及在与活性链并不互补的互补链的3'端纳入核苷酸。所得活性和互补rna的杂交体在活性链的3'端非常稳定但是在活性链的5'端相对不稳定。sirna的研究表明5'杂交体稳定性是支持rna干扰的蛋白质复合物摄取rna的关键指标，其至少与细胞中的mirna途径相关。发明人已经发现，在互补rna链中明智地使用错配可以显著增强所述mirna的活性。mirna文库本文所示mirna的关键应用是评估或诊断样品中单独一种或一组mirna的存在。然后可以分析具有各种不同mirna的细胞群，以鉴定其存在会影响细胞表型(即神经元缺陷)的mirna。文库中不同mirna的数量是可变的。设想文库中可以存在，存在至少或存在至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种或其中可衍生的任何范围的不同mirna特异性分子。在具体实施方式中，文库具有1-20种不同的mirna特异性分子，或5-20种不同的mirna特异性分子。“不同的”mirna特异性分子指特异性编码不同序列的mirna的核酸。设想mirna主要由rna制成，虽然在一些实施方式中，它们可以是rna，核苷酸类似物，如锁核酸(lna)或解锁核酸(una)，dna或dna、rna、核苷酸类似物和pna(肽核酸)的任何组合。因此，应当理解的是该文库包含针对这些不同mirna的一种或多种核酸。在具体实施方式中，文库对人mirna具有特异性，虽然设想了多种生物体的文库。本发明的rna分子具有或包含或由mirna区域组成。在具体实施方式中，mirna分子或其isomir或模拟物或安塔够妙或前体具有选自seqidno:57-341中任一项的序列。特别设想了本发明的核酸分子可以衍生自seqidno：5-9中任一项的成熟mirna序列。mirna分子或其isomir或模拟物或前体将包括这样的序列，所述序列在预测的mirna序列上游和/或下游延伸至少1-5个编码序列的核苷酸。在一些实施方式中，分子具有上至1、2、3、4、5、6、7或更多个连续核苷酸或其中可衍生的任何范围，其在一侧或两侧侧接编码主要加工的mirna的序列(5'和/或3'端)。本发明的文库可以包含来自具有mirna的任何生物体的mirna序列，具体包括但不限于，哺乳动物，如人，非人灵长类，大鼠和小鼠。特别设想的是这样的文库，所述文库具有，具有至少或具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种不同的mirna(也就是，具有源自不同mirna基因的不同序列的mirna特异性分子)。特别设想了在之前部分相对于seqidno:1-4或10-13或147-241中任一项所述的这类文库，特别是对应于mirna序列的那些(成熟序列)。核酸本发明涉及也称为mirna来源或前体的核酸分子，其可以将mirna引入培养的细胞或对象中。核酸可以通过纯化的酶在细胞中或体外产生，虽然它们优选通过化学合成产生。它们可以是粗制的或纯化的。除非另有说明，术语“mirna”指在已经从其前体切割后经加工的mirna。表1指示哪个seqidno对应于mirna的特定前体序列(seqidno：1-4)，表6指示哪个seqidno对应于mirna的成熟或模拟序列(seqidno：147-241)。表3鉴定了克隆到慢病毒载体中的dna序列(seqidno：10-13)，其如实施例所述用于功能筛选。表4和5鉴定了表2各成熟mirna的优选种子序列(如seqidno:14-56)。经常将mirna的名称缩写，并且不使用前缀，并且将根据上下文理解。除非另有说明，本申请中所述mirna是表示为mir-x或let-x的人序列，其中x是数字和/或字母。应当理解的是，mirna源自基因组序列或非编码基因。在该方面中，术语“基因”用于指代编码给定mirna的前体mirna的基因组序列。然而，本发明的实施方式可涉及涉及其表达的mirna的基因组序列，如启动子或其他调节序列。可以使用术语“重组”，并且其通常指这样的分子，所述分子已经被体外操纵或者是该分子的复制或表达的产物。术语“核酸”为本领域所熟知。本文所用“核酸”通常指包含核碱基的dna、rna或其衍生物或类似物的分子(一条或多条链)。例如，核碱基包括dna(例如，腺嘌呤“a”，鸟嘌呤“g”，胸腺嘧啶“t”或胞嘧啶“c”)或rna(例如，a，g，尿嘧啶“u”或c)中天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”涵盖术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”，其各自为术语“核酸”的亚属。术语“mirna”通常指单链分子，但是在具体实施方式中，在本发明中实施的分子还将涵盖与同一单链核酸另一区域或与另一核酸部分(整个链长度上互补10-50％)，基本上(整个链长度上互补大于50％但是小于100％)或完全互补的区域或另一链。因此，核酸可以涵盖这样的分子，所述分子包含具有分子的特定序列的一个或多个互补或自互补链或“补体”。例如，补体mirna可以具有自互补区域，其具有高达100％的互补性。如本文所用，“杂交”，“进行杂交”或“能够杂交”应当理解为意指使用本领域技术人员已知的技术如southern印迹过程形成双链或三链分子或具有部分双链或三链性质的分子。本文所用术语“退火”与“杂交”是同义词。术语“杂交”，“进行杂交”或“能够杂交”可以表示“低”，“中”或“高”杂交条件，如下所定义。低到中至高严格条件表示这样的预杂交和杂交：以42℃在5xsspe，0.3％sds，200pg/m剪切和变性的鲑鱼精子dna，以及25％、35％或50％甲酰胺(分别对于低到中至高严格条件)。然后，将杂交反应洗涤3次，每次30分钟，使用2xssc，0.2％sds和55℃、65℃或75℃(对于低到中至高严格条件)。在一些实施方式中，本发明的核酸或其衍生物将包含seqidno:1-4或147-341中所述任一mirna的mirna序列。设想了源自seqidno:1-4或147-341的本发明的核酸序列可以具有，具有至少，或具有至多来自seqidno:1-4或147-341的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23个连续核苷酸(或其中可衍生的任何范围)。在其他实施方式中，核酸与seqidno:1-4或147-341的mirna序列有，有至少或有至多80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％相同性。核碱基如本文所用，“核碱基”指杂环碱基，例如至少一种天然核酸(即dna和rna)中天然存在的核碱基(即a、t、g、c或u)，以及此类核碱基的天然或非天然存在的衍生物和类似物。核碱基通常可以替代天然存在的核碱基对(例如，a与t，g和c，和a和u之间的氢键)的方式与至少一种天然存在的核碱基形成一个或多个氢键(“退火”或“杂交”)。“嘌呤”和/或“嘧啶”核碱基涵盖天然存在的嘌呤和/或嘧啶核碱基以及其衍生物和类似物，包括但不限于，被一个或多个烷基，羧基烷基(caboxyalkyl)，氨基，羟基，卤素(即氟，氯，溴或碘)，硫醇或烷基硫醇部分取代的嘌呤或嘧啶。优选的烷基(例如，烷基，羧基烷基等)部分包含约1，约2，约3，约4，约5至约6个碳原子。嘌呤或嘧啶的其他非限制性实例包括：脱氮嘌呤(deazapurine)，2,6-二氨基嘌呤，5-氟尿嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，8-溴鸟嘌呤，8-氯鸟嘌呤，溴胸腺嘧啶，8-氨基鸟嘌呤，8-羟基鸟嘌呤，8-甲基鸟嘌呤，8-硫鸟嘌呤，氮鸟嘌呤，2-氨基嘌呤，5-乙基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-乙基尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-丙基尿嘧啶，硫尿嘧啶，2-甲基腺嘌呤，甲基硫代腺嘌呤，n,n-二甲基腺嘌呤，氮杂鸟嘌呤，8-溴腺嘌呤，8-羟基腺嘌呤，6-羟基氨基嘌呤，6-硫嘌呤，4-(6-氨基己基/胞嘧啶)等。其他实例是本领域普通技术人员所熟知的。使用本文所述或本领域普通技术人员已知的任何化学或天然合成方法，核碱基可包含在核苷或核苷酸中。这样的核碱基可以被标记，或者可以是分子的部分被标记并包含核碱基。核苷如本文所用，“核苷”指包含共价连接核碱基接头部分的核碱基的单个化学单元。“核碱基接头部分”的非限制性实例是包含5-碳原子的糖(即“5-碳糖”)，包括但不限于，脱氧核糖，核糖，阿拉伯糖或5碳糖的类似物或衍生物。5-碳糖的衍生物或类似物的非限制性实例包括2'-氟-2'-脱氧核糖或碳环糖，其中碳取代了糖环中的氧原子。不同类型的核碱基与核碱基接头部分的共价连接是本领域已知的。作为非限制性的实例，包含嘌呤(即，a或g)或7-脱氮嘌呤核碱基的核苷通常将嘌呤或7-脱氮嘌呤的9位共价连接5-碳糖的l'-位。在另一非限制性的实例中，包含嘧啶核碱基(即，c、t或u)的核苷通常将嘧啶的1位共价连接5-碳糖的l'位(kornberg和baker,1992)。核苷酸如本文所用，“核苷酸”指还包含“主链部分”的核苷。主链部分通常将核苷酸共价连接至包含核苷酸的另一分子，或至另一核苷酸以形成核酸。天然存在的核苷酸中的“主链部分”通常包含磷部分，其共价连接5-碳糖。主链部分的连接通常发生在5-碳糖的3'-或5'-位置。然而，其他类型的连接在本领域中是已知的，特别是当核苷酸包含天然存在的5-碳糖或磷部分的衍生物或类似物时。核酸类似物核酸可以包含或完全由天然存在的核酸中可能存在的核碱基，核碱基接头部分和/或主链部分的衍生物或类似物组成。具有核酸类似物的rna也可以根据本发明的方法进行标记。如本文所用，“衍生物”指天然存在的分子的化学修饰或改变的形式，而术语“模拟物”或“类似物”指这样的分子，其在结构上可能或可能不与天然存在的分子或部分相似，但是具有类似的功能。如本文所用，“部分”通常指较大化学或分子结构的较小化学或分子组分。核碱基，核苷和核苷酸类似物或衍生物为本领域所熟知，并且已经被描述(参见例如scheit，1980，通过引用纳入本文)。包含5-碳糖和/或主链部分衍生物或裂散物的核苷、核苷酸或核酸的其他非限制性实例包括述于下述内容中的那些：美国专利号5,681,947，其描述了包含嘌呤衍生物的寡核苷酸，其与dsdna形成三螺旋和/或防止dsdna表达；美国专利号5,652,099和5,763,167，其描述了这样的核酸，所述纳入dna或rna中存在的核苷的荧光类似物，特别用作荧光核酸探针；美国专利号5,614,617，其描述了在嘧啶环上具有取代的寡核苷酸类似物，其具有增强的核酸酶稳定性；美国专利号5,670,663、5,872,232和5,859,221，其描述了具有修饰的5-碳糖(即，修饰的t-脱氧呋喃糖基部分)的寡核苷酸类似物用于核酸检测；美国专利号5,446,137，其描述了这样的寡核苷酸，其包含至少一个5-碳糖部分，在4'位置被氢以外的取代基取代，可用于杂交测定中；美国专利号5,886,165，其描述了这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有带有3'-5'核苷酸间连接的脱氧核糖核苷酸和带有2'-5'核苷酸间连接的核糖核苷酸；美国专利号5,714,606，其描述了修饰的核苷酸间连接，其中核苷酸间连接的3'位氧被碳替代以增强核酸的核酸酶抗性；美国专利号5,672,697，其描述了包含增强核酸酶抗性的一个或多个5'亚甲基膦酸酯核苷酸间连接的寡核苷酸；美国专利号5,466,786和5,792,847，其描述了可能包含药物或标记物的取代基与寡核苷酸2'碳的连接，以提供增强的核酸酶稳定性和递送药物或检测部分的能力；美国专利号5,223,618，描述了具有2'或3'碳主链连接的寡核苷酸类似物，其连接相邻5碳糖部分的4'位和3'位，以增强细胞摄取，对核酸酶的抵抗力以及与靶rna杂交；美国专利号5,470,967，其描述了包含包含至少一个氨基磺酸酯或磺酰胺核苷酸间键的寡核苷酸，可用作核酸杂交探针；美国专利号5,378,825、5,777,092、5,623,070、5,610,289和5,602,240，其描述了具有三个或四个原子接头部分替代磷酸二酯主链部分的寡核苷酸，用于改善核酸酶抗性，细胞摄取和调节rna表达；美国专利号5,858,988，其描述了连接寡核苷酸2'-0位以增强其膜通透性和稳定性的疏水性载体剂；美国专利号5,214,136，其描述了在5'末端偶联蒽醌的寡核苷酸，其与dna或rna杂交增强；或对核酸酶稳定性增强；美国专利号5,700,922，其描述了pna-dna-pna嵌合体，其中dna包含2'-脱氧-赤-戊呋喃糖基核苷酸，用于增强核酸酶抗性，结合亲和力，以及激活rna酶h的能力；和wo98/39352、wo99/14226、wo2003/95467和wo2007/085485，其描述了修饰的rna核苷酸，其中核糖部分经连接2'氧和4'碳的额外的桥修饰。锁定的核糖显著增加了结合亲和力和特异性；和wo2008/147824，其描述了修饰的rna核苷酸，称之为una(解锁核酸)。una是rna的无环类似物，其中c2'和c3'原子之间的键已被切割，从而降低了对互补链的结合亲和力。una与rna酶h识别和rna切割兼容并改善sirna介导的基因沉默；wo2008/036127描述了吗啉代核酸类似物，其包含不带电荷和阳离子的亚单位间连接；wo/2007/069092和ep2075342描述了zip核酸(zna)，其包含偶联精胺衍生物作为阳离子部分(z单元)与寡核苷酸；美国专利5,708,154，其描述了与dna连接的rna以形成dna-rna杂合体；美国专利5,728,525，其描述了使用通用荧光标记物对核苷类似物进行标记。核苷类似物和核酸类似物的其他教导是美国专利5,728,525，其描述了末端标记的核苷类似物；美国专利5,637,683，6,251,666(l-核苷酸取代)，和5,480,980(7-脱氮2'-脱氧鸟苷核苷酸及其核酸类似物)。特别设想了其他类似物在本发明上下文中使用的用途。这类类似物可以用于本发明的合成核酸分子，在整个分子中或在选定的核苷酸中。它们包括但不限于：1)核糖修饰(如2'f，2'nh2、2'n3、4'硫代或2'o-ch3)和2)磷酸修饰(例如在硫代磷酸酯，甲基膦酸酯和磷硼酸酯中发现的那些)。通过减少或消除其被核糖核酸酶切割的能力，已经创建了这类类似物以赋予rna稳定性。当这些核苷酸类似物存在于rna中时，它们可以对动物中rna的稳定性产生深远的积极影响。设想了核苷酸类似物的用途可以单独使用获自与本发明任何核酸的合成mirna的任何设计修饰联用。修饰的核苷酸本发明的mirna具体地设想了经修饰以增强其活性的核苷酸的用途。这类核苷酸包括在rna的5'或3'末端的那些以及在分子内部的那些。在所述mirna互补链中使用的修饰的核苷酸阻断rna的5'oh或磷酸或引入内部糖修饰，其增加mirna活性链的摄取。对于mirna的修饰包括内部糖修饰，其增加杂交以及稳定细胞内分子，和进一步稳定细胞内核酸的末端修饰。进一步设想可以通过显微镜或其他方法检测的修饰以鉴定含有合成mirna的细胞。核酸的制备核酸可以通过本领域普通技术人员已知的任何技术来制备，例如，化学合成，酶促产生或生物产生。虽然可以使用重组方法产生根据本发明的mirna，但是优选通过化学合成或酶促产生来产生mirna。mirna可以通过多种方法产生，包括涉及重组dna技术的方法。核酸合成根据标准方法进行。参见例如，itakura和riggs(1980)。此外，美国专利号4,704,362、美国专利号5,221,619和美国专利号5,583,013各自描述了制备核酸的各种方法。核酸(例如，寡核苷酸)的非限制性实例包括这样制备的核酸，通过体外化学合成，使用磷酸三酯，亚磷酸酯或亚磷酰胺化学和固相技术，诸如ep266,032(通过引用纳入本文)中所述，或经由如froehler等，1986和美国专利序列号5,705,629(其各自通过引用纳入本文)所述的脱氧核苷h-膦酸酯中间体。在本发明的方法中，可以使用一种或多种寡核苷酸。寡核苷酸合成的各种不同机制已经在例如美国专利号4,659,774、4,816,571、5,141,813、5,264,566、4,959,463、5,428,148、5,554,744、5,574,146、5,602,244中公开，其各自通过引用纳入本文。酶促产生的核酸的非限制性实例包括这样产生的核酸分子：通过扩增反应诸如pcr(tm)中的酶(参见例如，美国专利4,683,202和美国专利4,682,195，其各自通过引用纳入)或美国专利号5,645,897(通过引用纳入本文)所述的寡核苷酸的合成。寡核苷酸合成为本领域普通技术人员所熟知。寡核苷酸合成的各种不同机制已经在例如美国专利号4,659,774、4,816,571、5,141,813、5,264,566、4,959,463,5,428,148、5,554,744、5,574,146、5,602,244中公开，其各自通过引用纳入本文。基本上，化学合成可以通过二酯法，三酯法多核苷酸磷酸化酶法和通过固相化学来实现。这些方法将在下文进一步讨论。二酯法二酯法是最早发展到可用状态的方法，主要由khorana及其同事开发。(khorana，1979年)。基本步骤是将两个适当保护的脱氧核苷酸连接起来，以形成含有磷酸二酯键的双脱氧核苷酸。二酯法已良好建立，并且已经用于合成dna分子(khorana，1979)。三酯法二酯法和三酯法之间的主要区别是后者的反应物和产物的磷酸原子上存在一个额外的保护基团(itakura等，1975)。磷酸酯保护基团通常是氯苯基，其使核苷酸和多核苷酸中间体可溶于有机溶剂。因此，纯化是在氯仿溶液中进行的。该方法的其他改进包括(i)三聚体和较大低聚物的嵌段(block)偶联，(ii)高效液相色谱法的广泛应用以纯化中间物和最终产物和及(iii)固相合成。多核苷酸磷酸化酶法这是一种dna合成的酶促方法，可用于合成许多有用的寡核苷酸(gillam等，1978；gillam等，1979)。在受控条件下，多核苷酸磷酸化酶主要向短寡核苷酸添加单个核苷酸。色谱纯化允许获得所需的单一加合物。至少需要三聚体才能开始该过程，并且该引物必须通过其他方法获得。多核苷酸磷酸化酶法起作用并且优点是所涉及的程序为大多数生物化学家所熟识。固相法利用为多肽固相合成而开发的技术，有可能将初始核苷酸连接到固相支持材料并逐步添加核苷酸进行。简化所有的混合和洗涤步骤，并且该过程适合自动化。现在，这些合成通常使用自动核酸合成仪进行。亚磷酰胺化学(beaucage和lyer，1992)已成为迄今为止最广泛应用的寡核苷酸合成的偶联化学。如本领域技术人员所熟知，寡核苷酸的亚磷酰胺合成涉及通过与活化剂反应形成活化的中间体来活化核苷亚磷酰胺单体前体，然后通过活化的中间体依次添加到生长的寡核苷酸链(通常锚固于合适的固体支持物的一端)以形成寡核苷酸产物。重组方法用于在细胞中产生核酸的重组方法为本领域技术人员所熟知。这些重组方法包括使用载体，质粒，粘粒和其他载剂将核酸递送至细胞，所述细胞可以是靶细胞或者仅仅是宿主细胞(以产生大量所需的rna分子)。或者，只要存在用于产生rna分子的试剂，就可以在无细胞系统下使用这种载剂。这类方法包括sambrook，2003，sambrook，2001和sambrook，1989中所述的那些，通过引用将其纳入本文。在某些实施方式中，本发明涉及非合成的核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子具有天然存在的核酸的化学结构和天然存在的核酸的序列，如单链初级mirna(参见lee2002)，单链前体mirna或单链成熟mirna的精确和完整序列。除了使用重组技术外，这类非合成核酸可以化学方式产生，如通过采用用于产生寡核苷酸的技术来产生。mirna的设计mirna通常包含两条链，一条活性链与正在研究的成熟mirna的序列相同，一条互补链与该活性链至少部分互补。活性链是生物学上相关的分子，并且应优选被细胞中通过mrna降解或翻译控制来调节翻译的复合物摄取。活性链的优选摄取产生两个重要结果：(1)观察到的所述mirna的活性急剧增加，和(2)基本上消除由互补链的摄取和激活所诱导的非预期作用。根据本发明，可以使用多种mirna设计来确保优先摄取活性链。5'阻断剂在互补链的5'端引入除了磷酸基团或羟基以外的稳定部分将削弱其在mirna途径中的活性。这确保了将仅使用mirna的活性链调节细胞中的翻译。5'修饰包括但不限于，nh2，生物素，胺基团，低级烷基胺基团，乙酰基团，2'o-me，dmto，荧光素，硫醇或吖啶或这类功能的任何其他基团。其它正义链修饰。将核苷酸修饰引入mirna的互补链可以消除互补链的活性并增强mirna活性链的摄取，所述核苷酸修饰如2'-ome，2'-脱氧，t-脱氧-2'-氟代，2'-o-甲基，2'-o-甲氧乙基(2'-0-moe)，2'-o-氨丙基(2'-0-ap)，2'-o-二甲基氨乙基(2'-0-dmaoe)，2'-o-二甲基氨丙基(2'-0-dmap)，2'-o-二甲基氨乙氧基乙基(2'-0-dmaeoe)或2'-on-甲基乙酰胺基(2'-0-nma)，nh2，生物素，胺基团，低级烷基胺基团，乙酰基团，dmto，荧光素，硫醇或吖啶或具有这类功能的任何其他基团。正义链中的碱基错配。与sirna一样(schwarz2003)，mirna活性链5'和3'端的相对稳定性显然决定了mirna途径活性成分的活化和摄取。通过策略性定位合成mirna互补链3'端中的碱基错配使mirna活性链5'端不稳定增强了活性链的活性并基本消除了互补链的活性。宿主细胞和靶细胞引入了mirna或其来源或评估了mirna的存在的细胞可以源自或包含在任何生物体中。优选地，细胞是脊椎动物细胞。更优选地，细胞是哺乳动物细胞。甚至更优选地，细胞是人细胞。哺乳动物细胞可以来自种系或体细胞，全能或多能，分裂或非分裂，上皮，永生化或转化等。细胞可以是未分化的细胞，如干细胞，或者分化的细胞，如来自器官或组织的细胞。或者，细胞可以被鉴定为上皮或内皮细胞，基质细胞，脑，乳腺，子宫颈，结肠，胃肠道，心脏，肾脏，大肠，肝，肺，卵巢，胰腺，心脏，前列腺，膀胱，小肠，胃，睾丸或子宫。如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。所有这些术语还包括它们的后代，它们是由细胞分裂形成的任何和所有后代。应当理解的是，由于故意或无意的突变，所有后代可能不相同。宿主细胞可以是“转染的”或“转化的”，这指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。如本文所用，术语“工程改造”和“重组”细胞或宿主细胞旨在指代其中已经引入了外源性核酸序列如小干扰rna或编码报告基因的模板构建体的细胞。因此，重组细胞可以与不包含重组引入的核酸的天然存在的细胞相互区分。组织可以包含这样的一种或多种宿主细胞，其待转化或与核酸递送组合物和/或其他试剂接触。组织可以是生物体的部分或与之分离。在某些实施方式中，组织及其组成细胞可以包括但不限于：脑，小脑，脊髓，臂神经，肋间神经，肌皮神经，肋下神经，腰丛，神经丛，股神经，下颌神经，坐骨神经，股神经肌肉束，隐静脉(saphnous)神经，胫神经，桡神经，正中神经，髂下腹(iliophypogastric)神经，生殖股神经，闭孔神经，尺神经，腓总神经，腓深神经，腓浅神经，神经节，视神经，神经细胞，干细胞。在某些实施方式中，宿主细胞或组织可包含在至少一种生物体中。在某些实施方式中，生物体可以是哺乳动物，人，灵长类动物或鼠。本领域技术人员将进一步理解孵育所有上述宿主细胞以维持它们并允许其分裂形成后代的条件。递送方法在一些实施方式中，本发明涉及将核酸递送到细胞中。这可以作为筛选方法的部分来完成，或者可以与治疗或诊断应用有关。rna分子可以由载体中包含的核酸分子编码。术语“载体”用于指这样的运载体核酸分子，其中可以插入核酸序列，用于引入到其中可以被复制的细胞中。核酸序列可以是“外源性”，这意味着其对引入载体的细胞而言是外来的，或者该序列与细胞中的序列同源，但是在宿主细胞核酸内通常找不到该序列的某个位置。载体包括质粒，粘粒，病毒(噬菌体，动物病毒，慢病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，yac)。通过标准重组技术本领域技术人员将能够很好地构建载体，所述重组技术述于sambrook等，1989和ausubel等，1996，二者通过引用纳入本文。除了编码修饰的多肽，如修饰的白树毒素(gelonin)，载体可以编码未修饰的多肽序列，如标签或靶向分子。靶向分子是将所需核酸引导至对象体内特定器官，组织，细胞或其他位置的分子。术语“表达载体”指这样的载体，其包含编码至少部分能够被转录的基因产物的核酸序列。表达载体可以包含各种“控制序列”，其指特定宿主生物体中可操作连接的编码序列的转录以及可能的翻译所必需的核酸序列。除了管理转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体可以包含还具有其他功能的核酸序列，并进行了描述有多种方法可以将表达载体引入细胞。在本发明的某些实施方式中，表达载体包含衍生自病毒基因组的工程改造的载体或病毒。某些病毒经由受体介导的内吞作用进入细胞，整合到宿主细胞基因组中并稳定且高效地表达病毒基因的能力使其成为将外来基因转移至哺乳动物细胞中吸引人的候选物(ridgeway,1988；nicolas和rubenstein,1988；baichwal和sugden,1986；temin,1986)。用作基因载体的第一病毒是dna病毒，包括乳多空病毒(papovaviruses)(猿猴病毒40，牛乳头状瘤病毒和多瘤病毒)(ridgeway,1988；baichwal和sugden,1986)和腺病毒(ridgeway,1988；baichwal和sugden,1986)。它们对于外来dna序列具有相对低的能力，并且具有受限的宿主光谱。此外，它们在容许性(permissive)细胞中的致癌潜力以及细胞病变效应引起了安全隐患。它们只能最多容纳8kb的外来遗传物质，但可以很容易地引入各种细胞系和实验动物中(nicolas和rubenstein，1988；temin，1986)。表达载体可以包含rnai表达盒，其包含一个启动子和一个或多个茎-环结构，其被一个或多个间隔子区分开(wo2006/084209)。使用亲和素融合蛋白将表达载体引入细胞的另一种方法描述于us6,287,792。逆转录病毒是一组单链rna病毒，其特征在于能够在感染的细胞中将其rna转化为双链dna；它们也可以用作载体。其他病毒载体可以用作本发明中的表达构建体。可以采用源自病毒的载体诸如牛痘病毒(ridgeway,1988；baichwal和sugden,1986；coupar等,1988)，腺相关病毒(aav)(ridgeway,1988；baichwal和sugden,1986；hermonat和muzycska,1984)，慢病毒(wo2008/071959,wo2004/054512),日本的血凝病毒(wo2004/035779)，杆状病毒(wo2006/048662)和疱疹病毒。它们为各种哺乳动物细胞提供了多种吸引人的功能(friedmann,1989；ridgeway,1988；baichwal和sugden,1986；coupar等,1988；horwich等,1990)。据信用于核酸递送以影响本发明组合物表达的其他合适方法实际上包括可以将核酸(例如dna，包括病毒和非病毒载体)引入细胞器，细胞，组织或生物体中的任何方法，如本文所述或本领域普通技术人员已知。这类方法包括但不限于，直接递送dna，诸如通过注射(美国专利号5,994,624,5,981,274,5,945,100,5,780,448,5,736,524,5,702,932,5,656,610,5,589,466和5,580,859，其各自通过引用纳入本文)，包括微注射(harlan和weintraub,1985；美国专利号5,789,215，通过引用纳入本文)；通过电穿孔(美国专利号5,384,253，通过引用纳入本文)；通过磷酸钙沉淀(graham和vandereb,1973；chen和okayama,1987；rippe等,1990)；先用deae-葡聚糖，再用聚乙二醇(gopal,1985)；通过直接声波加载(fechheimer等,1987)；通过脂质体介导的转染(nicolau和sene,1982；fraley等,1979；nicolau等,1987；wong等,1980；kaneda等,1989；kato等,1991)；通过光化学内化(wo2008/007073)；通过微粒轰击(pct申请号wo94/09699和95/06128；美国专利号5,610,042；5,322,7835,563,055,5,550,318,5,538,877和5,538,880，并且其各自通过引用纳入本文)；通过用碳化硅纤维搅拌(kaeppler等,1990；美国专利号5,302,523和5,464,765，其各自通过引用纳入本文)；通过农杆菌(agrobacterium)介导的转化(美国专利号5,591,616和5,563,055，其各自通过引用纳入本文)；或通过peg介导的原生质体转化(omirulleh等,1993；美国专利号4,684,611和4,952,500，其各自通过引用纳入本文)；过干燥/抑制介导的dna摄取(potrykus等,1985)。通过应用诸如此类的技术，可以稳定地或瞬时地转化细胞器，细胞，组织或生物体。一综述提供了配制rna分子从而优化其内化到细胞中的几种方式(kimss.,等,trendsmol.med.,2009,15:491-500)。下述其他出版物公开了配制rna分子从而改善其内化到细胞中的其他方式，其各自通过引用纳入本文：wo2007/095152，描述了使用ptd-drbd(与双链结合结构域连接的肽转导结构域)用于递送寡核苷酸，wo2009/086558，描述了使用snalp(稳定核酸脂质颗粒)颗粒，其包含能够进行细胞摄取并内吞释放颗粒的核酸负载的促融合脂质和阳离子脂质的混合物，wo2009/149418，描述了中性磷脂-油-rnai乳液，wo2007/121947，描述了使用基于阳离子脂质体(lipoplex)递送载剂，wo2009/132131，描述了使用新型脂质和核酸-脂质颗粒，其提供了高效的包封以及将包封的核酸高效递送至细胞，wo2004/091578和wo2004/064805，描述了使围绕核酸分子螺旋的脂质的层交替的螺旋形(cochleate)技术，wo2003/047494和wo2003/047493，描述了纳入了用于口腔和粘膜递送的核酸的反胶束，wo2008/156702，描述了细菌和细菌治疗性颗粒(btp)，包括用作递送载剂至细胞的寡核苷酸。本发明涵盖这些出版物中提及或公开的各种制剂。多种化合物已连接寡核苷酸的末端以促进其跨细胞膜的运输。hivtat、hsvvp22、果蝇触角足突变(drosphilaantennapedia)和其他蛋白质中发现的短信号肽已被发现能够使生物分子跨膜快速转移(由schwarze2000综述)。称之为蛋白质转导结构域(ptd)的这些信号肽已连接寡核苷酸，以促进其递送到培养的细胞中(eguchia,dowdysf,trendspharmacolsci.,2009,7:341-5)。胆固醇已与寡核苷酸偶联，以改善其在动物细胞中的摄取(mackellar1992)。末端胆固醇基团显然与细胞表面的受体或脂质相互作用，并促进修饰的寡核苷酸的内化。同样，多聚-l-赖氨酸已与寡核苷酸偶联，以减少净负电荷并改善摄取到细胞中(leonetti1990)。已经开发了与核酸复合的多种化合物，将其递送至细胞表面，并促进其在核内体中的摄取以及由核内体释放。它们之中是(1)各种脂质，诸如dotap(或其他阳离子脂质)，ddab，dhdeab和dope，和(2)不基于脂质的聚合物，如聚乙烯亚胺，聚酰胺型胺以及这些聚合物和其他聚合物的树状聚合物。在这些实施方式的某些中，采用脂质的组合，如dotap和胆固醇或胆固醇衍生物(美国专利号6,770,291，其通过引用纳入本文)。已经证明这些试剂中的几种促进动物中的核酸摄取。mirna途径涉及的细胞组分已广为人知。在细胞内稳定和/或转运mirna的蛋白质可能会增强mirna的稳定性和活性，因为一旦它们进入细胞，它们就应当保护和引导结合的mirna。mirna转运蛋白和mirna的混合物可以增强基于mirna的治疗剂的效力。由于rna具有阴离子磷酸盐和糖骨架，因此是亲水性分子。虽然核碱基是疏水性的，但由于磷酸盐和糖残基所产生的大量氢键，亲水性占主导地位。亲水性特征和阴离子主链减少细胞渗透。已经证明亲脂性基团如胆固醇(manoharan，2002)以及具有c32功能的月桂酸和石胆酸衍生物(lorenz等，2004)的偶联改善细胞摄取。此外，类固醇偶联的寡核苷酸与血流中不同脂蛋白如ldl的结合保护其完整性并管理其生物分布(rump等，2000)。还证明了与反义分子(bijsterbosch等，2001)和适配体(rusconi等，2004)连接的胆固醇通过与脂蛋白结合来稳定寡核苷酸。已经证明胆固醇增强体外(lorenz等，2004)和体内(soutschek等，2004)sirna的血清稳定性和摄取。此外，许多小分子如b-435495(blackie等，(2002))，依拉地平(isradipine)(oravcova等，1994)，氨氯地平(amlodipine)(oravcova等，1994)和2,2',4,4',5,5'-六氯联苯(borlakoglu等，1990)可以增强细胞摄取，并且通过促进脂蛋白结合来改善核酸酶抗性。使用mirna文库筛选如专利申请中所用，筛选是这样的过程，其中多种mirna特异性试剂被分别递送到个别细胞群或动物中。递送后一个或多个指定时间，分析细胞群或动物的一种或多种表型。将具有与阴性对照组中细胞或动物显著不同表型的那些细胞或动物分类为阳性。样品中被操纵的mirna被定义为命中(hit)。命中代表用于进一步研究和潜在治疗发展的目标。在一些实施方式中，存在用于筛选的多步骤过程，在某些实施方式中，存在四个通用步骤：(1)开发定量分析以监测正在研究的细胞过程。衡量细胞表型强度的试验包括监测细胞大小，细胞周期状态或抗体染色的显微镜试验，评估细胞裂解物中特定底物的周转(turnover)的酶促试验，以及直接测量裂解物中、细胞上或培养基中的生物分子或小分子。筛选成功与否的关键是创建真正测量细胞表型并使试验的信噪比最大化的试验。使信噪比最大化涉及测试变量，例如试验时间，试验组分，细胞类型以及转染和试验之间的时间长度。阳性表型和阴性对照表型之间试验结果的差异越大，筛选结果的扩散范围越大，并且将发现有趣基因的机会就越大。存在使用批量感染的其他筛选方法。(2)优化所需细胞的转染条件。该过程的第一步是确定使合成mirna的摄取最大化同时保持高细胞活力的转染试剂和铺板条件。我们发现使用细胞系时，测试2-5种不同的转染试剂是有用的，或者使用原代或悬浮细胞时，测试5-10种电穿孔条件是有用的。可以针对在所测试的条件中效果最好的试剂或电穿孔条件来优化转染。筛选mirna特异性文库需要高通量转染的条件。在这种类型的筛选中，使用慢病毒引入而非转染。这可能需要其他优化技术。(3)筛选一旦已经开发了试验和转染方法，就可以将合成的mirna或病毒表达的mirna库依次引入24孔或96孔板的细胞中。对于各试剂一式两份或一式三份为合理的统计学分析提供了足够的数据。实验部分进行的mts试验是这类筛选的实例。(4)验证命中验证命中涉及显示观察到的表型是由于mirna被靶向。通常通过将登记为命中的mirna抑制剂或合成的mirna的稀释系列递送到最初测试的细胞中来确认命中。确认与验证略有不同。确认是mirna诱导的表型的重复，而验证也可以包括通过拮抗mirna介导的表型来逆转表型。标记和标记技术在一些实施方式中，本发明涉及经标记的mirna，如用于筛选试验以评估特定mirna种类的治疗或诊断相关性。设想了可以在标记之前首先对mirna进行分离(从其中mirna对于细胞而言是内源性的细胞或从其中mirna对细胞而言是外源性的细胞)和/或纯化。与其中mirna在标记之前未经分离或纯化的样品中的其他rna相反，这可以实现更高效地标记mirna的反应。在本发明的许多实施方式中，标记不具有放射性。通常，可以通过添加标记的核苷酸(一步法)或添加核苷酸并标记添加的核苷酸(两步法)来标记核酸。此外，mirna可以如美国专利申请序列号60/649,584所述标记，其通过引用纳入本文。这类核苷酸包括可以用染料(包括荧光染料)或用分子如生物素标记的核苷酸。容易获得标记的核苷酸；它们可以商购获得，或者可以通过本领域技术人员已知的反应合成。用于标记的核苷酸用于标记的核苷酸不是天然存在的核苷酸，而是指在其上具有反应性部分的制备核苷酸。感兴趣的特定反应性官能团包括：氨基，巯基，亚砜基(sulfoxyl)，氨基巯基，叠氮基，环氧化物，异硫氰酸盐/酯，异氰酸盐/酯，酸酐，一氯三嗪，二氯三嗪，单或二卤素取代的吡啶，单或二取代的二嗪，马来酰亚胺，环氧化物，氮杂环丙烷，磺酰卤，酰基卤，烷基卤，芳基卤，烷基磺酸盐/酯，n-羟基琥珀酰亚胺酯，亚氨基酯，肼，叠氮基硝基苯，叠氮化物，3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺，乙二醛，乙醛，碘乙酰基，氰基甲基酯，对硝基苯酯，邻硝基苯酯，羟基吡啶酯，羰基咪唑和其他这类化学基团。在一些实施方式中，反应性官能团可以直接结合核苷酸，或可以通过连接基团结合核苷酸。功能性部分和任何接头不会实质上破坏待添加到mirna或待标记的核苷酸的能力。代表性的连接基团包括含碳连接基团，通常为约2-18，一般为约2-8个碳原子，其中含碳连接基团可以包含或者可以不包含一个或多个杂原子，例如s，o，n等，并且可以包含或可以不包含一个或多个不饱和位点。在许多实施方式中，特别感兴趣的是烷基连接基团，通常是1-16，一般是1-4个碳原子的低级烷基连接基团，其中连接基团可包含一个或多个不饱和位点。用于上述功能化靶标产生方法的功能化核苷酸(或引物)可以使用已知方案制造或购自商业供应商，例如西格玛公司(sigma)，罗氏公司(roche)，安碧公司(ambion)和idt。可以根据本领域技术人员已知的方法来制备官能团，包括在美国专利号4,404,289；4,405,711；4,337,063和5,268,486以及英国专利号1,529,202中存在的代表性信息，将其全部通过引用纳入。胺修饰的核苷酸用于本发明的几个实施方式中。胺修饰的核苷酸是具有用于连接标记的反应性胺基的核苷酸。设想可以修饰任何核糖核苷酸(g，a，u或c)或脱氧核糖核苷酸(g，a，t或c)用于标记。实例包括但不限于下述修饰的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸：5-(3-氨基烯丙基)-utp；8-[(4-氨基)丁基]-氨基-atp和8-[(6-氨基)丁基]-氨基-atp；n6-(4-氨基)丁基-atp,n6-(6-氨基)丁基-atp,n4-[2,2-氧基-双-(乙胺)]-ctp；n6-(6-氨基)己基-atp；8-[(6-氨基)己基]-氨基-atp；5-炔丙基氨基-ctp，5-炔丙基氨基-utp；5-(3-氨基烯丙基)-dutp；8-[(4-氨基)丁基]-氨基-datp和8-[(6-氨基)丁基]-氨基-datp；n-(4-氨基)丁基-datp，n6-(6-氨基)丁基-datp，n4-[2,2-氧基-对-(乙胺)]-dctp；n6-(6-氨基)己基-datp；8-[(6-氨基)己基]-氨基-datp；5-炔丙基氨基-dctp，和5-炔丙基氨基-dutp。可以根据本领域技术人员已知的方法制备这类核苷酸。此外，本领域普通技术人员可以制备具有相同胺修饰的其他核苷酸实体，如5-(3-氨基烯丙基)-ctp，gtp，atp，dctp，dgtp，dttp，或dutp代替5-(3-氨基烯丙基)-utp。标记技术在一些实施方式中，通过向核酸酶促添加已经标记的一个或多个核苷酸来标记核酸。一个或多个标记的核苷酸可以添加到mirna分子。参见美国专利号6,723,509，其通过引用纳入本文。在其他实施方式中，将未标记的一个或多个核苷酸酶促添加到mirna，并且用随后能够被标记的化学部分修饰未标记的核苷酸，在本发明的实施方式中，该化学部分是反应性胺，从而使核苷酸是胺修饰的核苷酸。胺修饰的核苷酸的实例为本领域技术人员所熟知，许多是可商购自例如安碧公司、西格玛公司、耶拿生物科学公司(jenabioscience)和trilink公司。与在合成过程中标记cdna相反，标记mirna的问题是如何标记已经存在的分子。为了解决这一问题，我们可以使用这样的酶，其能够使用二磷酸或三磷酸核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸作为底物用于将其添加到小rna分子mirna中。此外，在具体实施方式中，其涉及使用修饰的二磷酸或三磷酸核糖核苷酸，其被添加到mirna的3'端。酶的来源没有限制。酶来源的实例包括酵母，革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌，乳酸乳球菌和绵羊痘病毒。能够添加这类核苷酸的酶包括但不限于：多聚(a)聚合酶，末端转移酶和多核苷酸磷酸化酶。在本发明的特定实施方式中，设想了连接酶不是用于添加标记的酶，而是采用非连接酶的酶。多聚(a)聚合酶已由来自植物的许多生物体克隆到人。已经证明其催化均聚物束(tract)向rna的添加(martin等,rna,4(2):226-30,1998)。末端转移酶催化添加核苷酸至核酸的3'末端。多核苷酸磷酸化酶可以聚合核苷酸二磷酸，不需要引物。标记和标签在根据本发明方法的优选实施方式中，通过对核苷酸序列的量进行定量来间接确定mirna或其来源的表达水平。合适的定量方法述于本文他处。或者，mirna或mirna探针可以用正电子发射(包括放射性)，酶促，比色(包括可见光谱和uv光谱，包括荧光)，发光或其他标记或标签进行标记用于检测或分离目的。可以直接或间接检测标记。放射性标记包括125i、32p、33p和35s。酶促标记的实例包括碱性磷酸酶，荧光素酶，辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶。标记也可以是具有发光特性的蛋白质，例如，绿色荧光蛋白和藻红蛋白(phicoerythrin)。预期用作偶联物的比色和荧光标记包括但不限于，amca，alexafluor染料，bodipy染料，如bodipyfl，bodipy630/650，bodipy650/665，bodipy-r6g，bodipy-trx；级联蓝；级联黄；香豆素及其衍生物，如7-氨基-4-甲基香豆素，氨基香豆素和羟基香豆素；花青素染，例如cy3和cy5；曙红和赤藓红素；荧光素及其衍生物，如异硫氰酸荧光素；镧系离子的大环螯合物，如quantumdye(tm)；滨海蓝；俄勒冈绿色；罗丹明染料，如罗丹明红，四甲基罗丹明和罗丹明6g；德克萨斯红；染料的具体实例包括但不限于上文或下述所示的那些：alexafluor350，alexafluor405，alexafluor430，alexafluor488，alexafluor500.alexafluor514，alexafluor532，alexafluor546，alexafluor555，alexafluor568，alexafluor594，alexafluor610，alexafluor633，alexafluor647，alexafluor660，alexafluor680，alexafluor700和alexafluor750；胺反应性bodipy染料，如bodipy493/503，bodepy530/550，bodepy558/568，bodipy564/570，boddpy576/589，bodipy581/591，bodepy630/650，bodipy650/655，bodipyfl，bodipyr6g，bodepytmr和bodipy-tr；cy3，cy5，6-fam，异硫氰酸荧光素，hex，6-joe，俄勒冈绿488，俄勒冈绿500，俄勒冈绿14，太平洋蓝，reg，若丹明绿，若丹明红，肾造影剂(renographin)，rox，sypro，tamra，2',4',5',7'-四溴磺砜荧光素和tet。由分子探针公司(molecularprobes)获得荧光标记的核糖核苷酸的具体实例，并且它们包括alexafluor488-5-utp，荧光素-12-utp，bodepyfl-14-utp，bodipytmr-14-utp，四甲基罗丹明-6-utp，alexafluor546-14-utp，德克萨斯红-5-utp和bodipytr-14-utp。其他荧光核糖核苷酸获自安玛西亚生物公司(amershambiosciences)，诸如cy3-utp和cy5-utp。荧光标记的脱氧核糖核苷酸的实例包括二硝基苯基(dnp)-11-dutp，级联蓝-7-dutp，alexafluor488-5-dutp，荧光素-12-dutp，俄勒冈绿488-5-dutp，bodepyfl-14-dutp，若丹明绿-5-dutp，alexafluor532-5-dutp，bodepytmr-14-dutp，四甲基罗丹明-6-dutp，alexafluor546-14-dutp，alexafluor568-5-dutp，德克萨斯红-12-dutp，德克萨斯红-5-dutp，bodepytr-14-dutp，alexafluor594-5-dutp，bodepy630/650-14-dutp，bodipy650/665-14-dutp；alexafluor488-7-obea-dctp，alexafluor546-16-obea-dctp，alexafluor594-7-obea-dctp，alexafluor647-12-obea-dctp。设想了可以用两种不同的标记来标记核酸。此外，可以在本发明的方法中采用荧光共振能量转移(fret)(例如，klostermeier等,2002；emptage,2001；didenko,2001，其各自通过引用纳入)。荧光能量转移染料，如噻唑橙-乙啡啶异二聚体；并且，可以使用totab。或者，标记本身可能不可检测，但可以间接地检测或允许分离或分隔靶核酸。例如，标记可以是生物素，异羟基洋地黄毒苷，多价阳离子，螯合基团和其他配体，包括抗体的配体。可视化技术容易获得许多技术用于可视化或检测标记的核酸。stanleyt.crooke,2000对这类技术进行了讨论(第6章)，将其通过引入纳入。这些技术包括：显微镜，阵列，荧光测定法，光循环仪或其他实时pcr(tm)机器，facs分析，闪烁计数器，磷光成像仪(phosphoimager)，geiger计数器，mri，cat，基于抗体的检测方法(western，免疫荧光，免疫组织化学)，组织化学技术，hplc(griffey等，1997，光谱学，毛细管凝胶电泳(cummins等，1996)，光谱学；质谱；放射学技术和质量平衡技术。或者，可以对核酸进行标记或标签标记，以使其有效分离。在本发明的其他实施方案中，核酸是生物素化的。当采用两个或更多个不同颜色的标记时，可以采用荧光共振能量转移(fret)技术来表征dsrna。此外，本领域普通技术人员熟知可视化、鉴定和表征标记的核酸的方式，因此，这类方案可以用作本发明的部分。可以使用的工具示例还包括荧光显微镜，生物分析仪(bioanalyzer)，酶标仪，storm(分子动力学)，阵列扫描仪(arrayscanner)，facs(荧光激活细胞分选仪)或任何具有激发和检测荧光分子能力的仪器(例如，acumen[ttplabtech]平板细胞仪(platecytometer)。阵列制备本发明可以与mirna阵列一起使用，所述mirna阵列是排列的核酸分子(探针)宏阵列或微阵列，所述核酸分子(探针)与多个mirna分子或前体mirna分子完全或几乎互补或相同并位于空间分离的组织中的支持材料上。宏阵列通常是硝化纤维素或尼龙的片材，其上已经点样了探针。微阵列将核酸探针更密集地放置，从而使至多10,000个核酸分子可以刚好放入通常为1-4平方厘米的区域中。可以通过将核酸分子例如基因，寡核苷酸等点样到基材上或在基材上原位制造寡核苷酸序列来制造微阵列。可以每平方厘米至多约30个不同核酸分子或更高，例如每平方厘米至多约100或者甚至1000个的高密度矩阵模式施加点样或制造的核酸分子。不同于基于硝酸纤维素的过滤器阵列材料，微阵列通常使用涂覆的玻璃作为固体支持物。通过具有补充mirna的核酸样品的排列阵列，可以追踪各样品的位置并连接原始样品。本领域技术人员已知多种不同的阵列装置，其中多种不同的核酸探针与固体支持物表面稳定结合。对于阵列有用的基材包括尼龙，玻璃和硅。这类阵列可能会在许多不同的方面有所不同，包括平均探针长度，探针的序列或类型，探针与阵列表面之间键的性质，例如，共价或非共价，等。已经描述了代表性的方法和设备用于制备微阵列，例如，述于美国专利号5,143,854；5,202,231；5,242,974；5,288,644；5,324,633；5,384,261；5,405,783；5,412,087；5,424,186；5,429,807；5,432,049；5,436,327；5,445,934；5,468,613；5,470,710；5,472,672；806；5,525,464；5,503,980；5,510,270；5,525,464；5,527,681；5,529,756；5,532,128；5,545,531；5,547,839；5,554,501；5,556,752；5,561,071；5,571,639；5,580,726；5,580,732；5,593,839；5,599,695；5,599,672；5,610；287；5,624,711；5,631,134；5,639,603；5,654,413；5,658,734；5,661,028；5,665,547；5,667,972；5,695,940；5,700,637；5,744,305；5,800,992；5,807,522；5,830,645；5,837,196；5,871,928；5,847,219；5,876,932；5,919,626；6,004,755；6,087,102；6,368,799；6,383,749；6,617,112；6,638,717；6,720,138，以及wo93/17126；wo95/11995；wo95/21265；wo95/21944；wo95/35505；wo96/31622；wo97/10365；wo97/27317；wo99/35505；wo09923256；wo09936760；wo0138580；wo0168255；wo03020898；wo03040410；wo03053586；wo03087297；wo03091426；wo03100012；wo04020085；wo04027093；ep373203；ep785280；ep799897和uk8803000；其公开全部通过引用纳入本文。设想了阵列可以是高密度阵列，因此它们包含100个或更多个不同的探针。设想了它们可能包含1000、16,000、65,000、250,000或1,000,000或更多个不同的探针。探针可以针对一种或多种不同生物体中的靶标。在一些实施方式中，寡核苷酸探针的长度范围为5-50、5-45、10-40或15-40个核苷酸。在某些实施方式中，寡核苷酸探针的长度为20-25个核苷酸。阵列中每个不同探针序列的位置和序列是众所周知的。此外，大量不同的探针可以占据相对较小的区域，从而提供这样的高密度阵列，其探针密度通常大于约60、100、600、1000、5,000、10,000、40,000、100,000或400,000个不同寡核苷酸探针/cm2。阵列的表面积可以为约或小于约1、1.6、2、3、4、5、6、7、8、9或10cm2。此外，本领域普通技术人员可以容易地分析使用阵列产生的数据。这类方案在上文中公开，并包括wo9743450；wo03023058；wo03022421；wo03029485；wo03067217；wo03066906；wo03076928；wo03093810；wo03100448a1中存在的信息，其具体通过引用纳入。最近，基于溶液杂交以及后续固化和鉴定，已经能够获得替代性的概述方法，例如，illumina平台。样品制备设想了可以使用本文所述试验分析多种样品的mirna。虽然设想了将内源性mirna与一些实施方式一起使用，但是重组或合成mirna(包括与内源性mirna或前体mirna相同的核酸)也可以如本文所述进行处理和分析。样品可以是生物样品，在这种情况中，它们可以来自血液，csf，组织，器官，肿瘤，精液，唾液/痰，粪便，尿液，唾液，眼泪，其他体液，毛囊，皮肤或含有或组成生物细胞的任何样品。或者，样品可以不是生物样品，而是化学混合物，如无细胞反应混合物(其可以包含一种或多种生物酶)。细胞试验以鉴定与疾病有联系的mirna特别设想的应用包括鉴定mirna，所述mirna导致促进神经元缺乏，其本身是疾病或病症的部分，或者可能与特定的疾病状态相关。另外，设想的应用包括鉴定能够促进神经元生成或再生的mirna。同样，可以在认为对与神经元缺乏相关的特定疾病或病症易感的样品与认为对该疾病或病症不易感或无抗性的样品之间比较mirna功能。特别设想了本发明的rna分子可以用于治疗前述部分中所讨论的任何疾病或病症或调节前述部分所讨论的任何细胞途径。特别设想的应用包括鉴定这样的mirna，所述mirna导致神经元缺乏细胞过程和/或诱导神经元生成或再生，其本身是疾病的部分或者可能与特定疾病状态相关。可样，可以在认为对与神经元缺乏相关的特定疾病或病症易感的样品与认为对该疾病或病症不易感或无抗性的样品之间比较mirna功能。不同治疗性药物的效力可以通过如本发明所定义和根据本发明使用的mirna改变。促进神经元生成或再生的mirna分子，模拟物，isomir，安塔够妙或其来源可以增强对于其他药物的敏感性。其他试验除了使用阵列和微阵列以外，还可以设想了可以采用多种不同试验来分析mirna，其活性及其作用。这类试验包括但不限于，rt-pcr，原位杂交，杂交保护试验(hpa)(genprobe)，支链dna(bdna)试验(collins,m.l.等(1997).nucleicacidsresearch25:2979–2984)，滚环扩增(rca)，单分子杂交检测(美国基因组公司(usgenomics))，invader试验(三威科技公司(thirdwavetechnologies))和桥连试验(bridgelitigationassay)(凯杰公司(qiagen)。设想可以在阵列的背景下以及在诊断性试验的背景下使用这类方法。治疗和诊断应用影响表型性状的mirna为治疗应用以及诊断应用提供干预点(通过筛选特定mirna的存在与否)。特别设想了本发明的rna分子可以用于治疗前述部分中所讨论的任何疾病或病症。此外，就本发明的治疗和诊断方面而言，也可以采用上述任何方法。例如，关于检测mirna或对其进行筛选的方法也可以用于诊断环境中。在治疗应用中，将有效量的本发明的mirna给予细胞，该细胞可以在或可以不在动物中。在一些实施方式中，将治疗有效量的本发明的mirna给予个体用于治疗疾病或病症。本文所用术语“有效量”定义为这样的本发明的分子的量，其是在给予本发明的分子的细胞或组织中导致所需的生理变化所必需的。本文所用术语“治疗有效量”定义为这样的本发明的分子的量，其就如之前所定义的与血管新生(neo-angiogenesis)相关的疾病或病症而言，实现所需效果。本领域技术人员容易认识到的是，在许多情况下，分子可能无法提供治愈，但可以提供部分益处，如缓解或改善至少一种症状。在一些实施方式中，具有某些益处的生理变化也被认为是治疗上有益的。因此，在一些实施方式中，提供生理变化的分子的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。在一些实施方式中，分子具有这样的序列，所述序列与来自该特定动物而不是来自另一动物的mirna序列相对应。因此，在一些实施方式中，在本发明的rna分子中利用人序列。在体内实验中，相较于人序列，测试动物中的mirna序列可能有所不同。这种情况中，可以使用不同于人序列的mirna来证明其在动物中的治疗作用。用该序列在动物中测试所得结果可以推测用相应mirna分子在人中的预期结果。给药和剂量的模式本发明的核酸分子可以单独或以药物组合物的形式给予对象，用于治疗病症或疾病。可以使用一种或多种生理学上可接受的运载体，稀释剂，赋形剂或助剂以常规方式配制药物组合物，所述运载体，稀释剂，赋形剂或助剂促进将mirna加工成可以药用的制备物。适当的制剂取决于所选的给药途径。对于局部给予来说，本发明的mirna可以配制为如本领域熟知的溶液、凝胶、软膏、乳膏、悬浮液等。全身性制剂包括旨在通过注射给予的那些，例如，皮下，静脉内，肌肉内，鞘内，脑室内或腹膜内注射，以及旨在经皮，经粘膜，吸入，口服或肺部给予的那些。为了在治疗癫痫的情况下给予安塔够妙，高度优选脑室内给药，尤其是脑室内注射。为了注射，可以在水溶液中，优选在生理相容性缓冲液如汉克斯(hank’s)溶液、林格(ringer’s)溶液或生理缓冲盐水中配制本发明的核酸。溶液可以包含配制剂，如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。或者，本发明的核酸分子可以是粉末形式，用于在使用前用合适的载剂(例如无菌无热原的水)构建。对于经粘膜给药，在适合于待渗透屏障的制剂中采用渗透剂。这种渗透剂通常是本领域已知的。为了口服给药，可以通过将分子与本领域熟知的药学上可接受的运载体组合来容易地配制核酸。这些运载体能够使本发明的核酸配制成片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊，液体，凝胶，糖浆，浆液，悬浮液等，用于待治疗患者的口服摄入。对于口服固体制剂，例如，粉末、胶囊和片剂，合适的赋形剂包括填充剂，如糖，例如乳糖，蔗糖，甘露糖醇和山梨糖醇；纤维素制备物，如玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄芪胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)；成粒剂；和粘合剂。如果序列，可添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸，或其盐，如海藻酸钠。如果需要，固体剂型可以是使用标准技术的包糖衣或肠溶衣的。对于口服液体制备物，例如，悬浮液，酏剂和溶液，合适的运载体，赋形剂或稀释剂包括水，二醇，油，醇等。另外，可以添加调味剂，防腐剂，着色剂等。对于含服给药，分子可以采用常规方式配制的片剂或锭剂等的形式。对于通过吸入给药，藉由使用合适的推进剂，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或二氧化碳，由加压包装或喷雾器中以气雾剂形式方便地递送根据本发明用途的分子。在增压式气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供阀以递送计量的量来确定。可将用于吸入器或吹入器中的明胶药筒和胶囊配制成含有核酸和合适粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物。还可以将rna配制成直肠或阴道组合物，如栓剂或保留灌肠剂，例如，含有常规的栓剂基底，如可可脂或其他甘油酯。除了之前所述制剂外，分子还可以配制成贮库制剂。这类长效制剂可通过植入(例如，皮下或肌肉内)或肌肉内注射给予。因此，例如，分子可与合适的聚合或疏水材料(例如，可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物，例如，微溶盐。或者，可以使用其他药物递送系统。脂质体和乳液是熟知的可以用于递送本发明核酸的递送载剂的实例。本发明的核酸可以与运载体或脂质组合给予以增加细胞摄取。例如，寡核苷酸可以与阳离子脂质组合给予。阳离子脂质的实例包括但不限于，脂质体转染试剂，dotma，dope和dotap。通过引用特别纳入的wo0071096的出版物描述了可以有效地用于基因治疗的不同制剂，如dotap；胆固醇或胆固醇衍生物制剂。其他公开还讨论了不同的脂质或脂质体制剂，包括纳米颗粒以及给药方法；它们包括但不限于，美国专利公开20030203865、20020150626、20030032615和20040048787，通过引用特别纳入它们，它们公开了制剂以及核酸给予和递送的其他相关方面。美国专利号5,844,107、5,877,302、6,008,336、6,077,835、5,972,901、6,200,801和5,972,900还公开了用于形成颗粒的方法，这些方面通过引用纳入本文。核酸也可以与阳离子胺如多聚-l-赖氨酸组合给予。核酸也可以偶联化学部分，如运铁蛋白和胆固醇基。此外，通过将特定化学基团与寡核苷酸连接可以使寡核苷酸靶向某些器官或组织。例如，将寡核苷酸与合适的甘露糖残基阵列连接将寡核苷酸靶向肝。其他靶向配体述于liub.,brieffunct.genomicproteomic6:112-119,2007中。其他实例是碳水化合物糖，如半乳糖，n-乙酰半乳糖胺，甘露糖；维生素，如叶酸；小分子，包括萘普生，布洛芬或其他已知蛋白质结合分子，环糊精，其靶向运铁蛋白受体，也称为转移修饰的环糊精(hu-lieskovan等，2005)，pei(rgd靶向的peg-pei，schifelerers等2004)，茴香酰胺，rgd肽或rgd模拟物，多聚精氨酸，抗-tfr单链抗体片段/tfrscfv，膜联蛋白a5(靶向暴露磷脂酰丝氨酸的膜，garnierb.等，,bioconjugaetchem.,2009,11:2114-22)，wo2009/126933描述了通过将核酸与靶向配体和内溶性(endosomolytic)组分组合用于位点特异性递送核酸的组合物和方法。优先适合的靶向配体是神经元相关细胞表面蛋白质。靶向核酸还可以通过使用如wo2005/111238中所述的适配体技术来实现。此外，对于上文述及的递送载剂而言其他的脂质部分，如peg-脂质，胆固醇，内溶性辅助脂质或肽(wo2009/046220)或所产生的纳米颗粒的总体形态(通过电荷和颗粒大小表征)可以赋予对癌细胞和/或肿瘤脉管系统的靶向特异性。此外，可以使用缓释系统，如含有治疗剂的固体聚合物的半透性基质来递送分子。已经建立了各种缓释材料并为本领域技术人员所熟知。根据其化学性质，缓释胶囊可能会释放分子数周，上至100天以上。取决于嵌合分子的化学性质和生物学稳定性，可以采用针对分子稳定的其他策略。或者，可以使用如wo2007011217(其通过引用特别地纳入本文)中所述的基于配位化学的递送系统来递送分子。除上述内容之外，可以使用电穿孔递送本发明的分子，用于局部或靶向治疗。电穿孔方法为本领域技术人员所知并且述于例如daud等(2008)或bodles-brakhop(2009)。这些出版物中的每一篇均通过引用纳入。核酸可作为游离酸或碱或作为药学上可接受的盐包含在任何上述制剂中。药学上可接受的盐是基本上保留游离碱生物活性并通过与无机酸反应制备的那些盐。相比相应的游离碱，药用盐倾向于更易溶于水性或其它质子溶剂中。本发明的药物组合物包含有效量溶解或分散于药学上可接受的运载体中的一种或多种mirna分子。短语“药学上或药理学上可接受的”指这样的分子实体和组合物，当将其适当地给予动物如人时，不产生或产生可接受的不利，过敏或其他不良反应。根据疾病的严重程度确定某些不良反应是否可以接受。包含至少一种嵌合多肽或其他活性成分的药物组合物的制备鉴于当前公开将是本领域技术人员已知的，诸如通过《雷明顿药物科学》(remington'spharmaceuticalsciences)，第18版，马克印刷公司(mackprintingcompany)，1990(通过引用纳入本文)所例证。另外，就动物(如人)给药而言，理解制备应该满足由fda官方生物学标准要求的无菌性、致热原性、常规安全和纯度标准。本文使用的“药学上可接受的运载体”包含任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、诸如此类的物质和其组合，此应为本领域普通技术人员已知(参见，例如，《雷明顿药物科学》(remington'spharmaceuticalsciences)，马克出版公司，1990，第1289-1329页，通过引用纳入本文)。除非任何常规载体都与活性成分不相容，否则应考虑在治疗或药物组合物中使用这些载体。取决于是以固体、液体还是气雾剂形式给予，以及对于诸如注射等给药途径而言是否需要是无菌的，mirna可以包含不同类型的运载体。可以静脉内，皮内，动脉内，腹膜内，病变内，颅内，关节内，前列腺内，胸膜内，气管内，鼻内，玻璃体内，阴道内，直肠内，局部，瘤内，肌肉内，腹膜内，皮下，结膜下，血管内，黏膜，心包内，脐内，眼内，口服，总体，局部，吸入(例如，气雾剂吸入)，注射，输注，连续输注，局部灌注直接浸浴靶细胞，经由导管，经由灌洗，在乳脂中，在脂质组合物(例如，脂质体)中，或通过本领域普通技术人员已知的其他方法或上述方法的任何组合(参见，例如，《雷明顿药物科学》，第18版，马克印刷公司，1990，通过引用并入本文)给予本发明。可以通过物理和生理因素，例如体重，病情的严重程度，所治疗的疾病的类型，先前或同时的治疗干预措施，病人的特发病和给药途径来确定给予动物或患者本发明组合物的实际剂量。在任何事件中，负责给予的医师将确定组合物中活性成分的浓度，以及对于个体对象合适的剂量。在某些实施方式中，药物组合物可包含，例如，至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方式中，活性化合物可以包含2％-75％单位重量，或者25％-60％，例如，其中可衍生的任何范围。在其他非限制性实例中，每次给药的剂量可以还包含少于1微克/kg/体重，或1微克/kg/体重，从5微克/kg/体重，10微克/kg/体重，50微克/kg/体重，100微克/kg/体重，200微克/kg/体重，350微克/kg/体重，500微克/kg/体重，1毫克/kg/体重，5毫克/kg/体重，10毫克/kg/体重，50毫克/kg/体重，100毫克/kg/体重，200毫克/kg/体重，350毫克/kg/体重或500毫克/kg/体重至1000mg/kg/体重或更多，和其他可衍生的任何范围。在本文列举的数字衍生范围的非限定实例中，基于上述数字，可以给予的范围是约5mg/kg/体重-100mg/kg/体重，5微克/kg/体重-500毫克/kg/体重等。在任何情况下，组合物可包含各种抗氧化剂以延迟一种或多种组分的氧化。此外，预防微生物作用可以通过防腐剂如各种抗菌和抗真菌剂来实现，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯)，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞或其组合。分子可以以游离碱，中性或盐形式配制成组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如，由蛋白质组合物的游离氨基团形成的那些，或由无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸诸如乙酸，草酸，酒石酸或扁桃酸形成的盐。由游离羧基基团形成的盐还可以衍生自无机碱，例如，钠，钾，铵，钙或铁氢氧化物；或有机碱诸如异丙胺，三甲胺，组氨酸或普鲁卡因。在组合物处于液体形式的实施方式中，运载体可以是这样的溶剂或分散介质，其包含但不限于，水，乙醇，多元醇(例如，甘油、丙二醇，液体聚乙二醇等)，脂质(例如，甘油三酸酯，植物油，脂质体)及其组合。可以维持适当的流动性，例如，通过使用涂层，诸如卵磷脂；通过分散在运载体诸如液体多元醇或脂质中来维持所需的颗粒大小；通过使用表面活性剂，例如羟丙基纤维素；或这类方法的组合。在许多情况中，将优选包括等渗剂，例如，糖，氯化钠或其组合。在其他实施方式中，可以在本发明中使用滴眼剂，鼻溶液或喷雾剂，气雾剂或吸入剂。通常将这类组合物设计成与靶组织类型相容。在非限制性实例中，鼻溶液通常是旨在以滴剂或喷雾剂形式给予于鼻道的水溶液。配制鼻溶液，使其在许多方面与鼻分泌物相似，从而维持正常的纤毛作用。因此，在优选的实施方式中，水性鼻溶液通常是等渗的或经稍微缓冲以维持约5.5至约6.5的ph。另外，如果需要，与眼科制备物、药物或合适的药物稳定剂中使用的那些相似的抗微生物防腐剂可以包含在制剂中。例如，各种商业鼻用制备物是已知的，并且包括药物，诸如抗生素或抗组胺。在某些实施方式中，制备分子用于通过诸如口服摄取的途径给药。在这些实施方式中，固体组合物可包括，例如，溶液，悬浮液，乳剂，片剂，丸剂，胶囊剂(例如，硬壳或软壳明胶胶囊)，缓释制剂，口腔组合物，锭剂，酏剂，混悬液，糖浆，晶片，或其组合。口服组合物可以与饮食中的食物直接混合。口服给药的优选运载体包括惰性稀释剂，可吸收的可食用运载体或其组合。在本发明的其他方面，口服组合物可以被制成糖浆剂或酏剂。糖浆剂或酏剂，并且可以包含例如至少一种活性剂，甜味剂，防腐剂，调味剂，染料，防腐剂或其组合。在某些优选实施方式中，口腔组合物可以包含一种或多种粘合剂，赋形剂，崩解剂，润滑剂，调味剂及其组合。在某些实施方式中，组合物可以包含一种或多种下述内容：粘合剂，如黄蓍胶，阿拉伯树胶，玉米淀粉，明胶或其组合；和赋形剂，例如磷酸二钙，甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁或其组合；崩解剂，例如玉米淀粉，马铃薯淀粉，海藻酸或其组合；润滑剂，例如硬脂酸镁；甜味剂，例如蔗糖，乳糖，糖精或其组合；调味剂，例如薄荷，冬青油，樱桃调味剂，橙色调味剂等，或上述的组合。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料以外，它可以包含运载体，如液体运载体。各种其他材料可以作为涂层存在或以其他方式修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂，丸剂或胶囊剂可以用虫胶，糖或两者涂覆。组合物在制造和储存条件下必须是稳定的，并且在保存过程中能够抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。应当理解的是，最低限度地，内毒素污染应保持在安全水平，例如，小于0.5ng/mg蛋白质。在特定实施方式中，可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝，明胶或其组合来实现可注射组合物的延长吸收。上述关于递送或运输至细胞的任何实施方式也可以用于该部分所讨论的实施药物化合物的递送。有效剂量本发明的分子通常将以有效实现预期目的的量使用。为了用于治疗或预防疾病病症，以治疗有效量给予或施用本发明的分子或其药物组合物。治疗有效量是有效改善或预防症状或延长经治疗患者存活的量。治疗有效量的测定在本领域技术范围内，由其是在本发明的详细公开内容的教导下。对于全身给药，最初可以从体外测定估计治疗有效剂量。例如，可以在动物模型中配制剂量，以实现包括细胞培养中确定的ec50的循环浓度范围。可利用这类信息更精确地确定人用剂量。也可以使用本领域所熟知的技术，由体内数据，例如动物模型，估计初始剂量。本领域普通技术人员可以根据动物数据容易地优化对人的给药。剂量和间隔可以单独调节以提供足以维持治疗效果的分子的血浆水平。通过注射给药的常规患者剂量为0.01至0.1mg/kg/天，或0.1至5mg/kg/天，优选0.5至1mg/kg/天或更高。治疗有效的血清水平可以通过每天给予多个剂量实现。在局部给药或选择性摄取的情况下，蛋白质有效的局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够在无需过度实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。当然，给予的分子的量将取决于接受治疗的对象，对象的体重，患病的严重程度，给药方式和处方医生的判断。可在可检测到症状甚至在无法检测到症状时，间歇性地重复治疗。治疗可以单独提供，也可以与其他药物或治疗(包括手术)联用。毒性优选地，本文所述分子的治疗有效剂量将提供治疗益处而不会引起实质性毒性。通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序，例如，通过确定ld50(对50％种群致死的剂量)或ld100(对100％种群的致死的剂量)可以确定本文所述分子的毒性。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数。优选显示高治疗指数的蛋白质。获自这些细胞培养实验和动物研究的数据可以用于配制对人不具有毒性的剂量范围。本文所述的蛋白质的剂量优选处于循环浓度范围内，所述循环浓度包括具有较少或不具有毒性有效剂量。该剂量可根据所用的剂型和所用的给药途径在此范围内变化。具体制剂、给药途径和剂量可以由单个医师根据患者的状况来选择。(参见例如，fingl等,1975,述于：《治疗学的药理学基础》(thepharmacologicalbasisoftherapeutics),第l章,p.l)。侧基(pendantgroup)“侧基”可以连接或偶联核酸。侧基可以增加核酸的细胞摄取。侧基可以连接核酸的任何部分，但是通常连接寡核苷酸链的末端。侧基的实例包括但不限于：吖啶衍生物(即，2-甲氧基-6-氯-9-氨基吖啶)；交联剂，如补骨脂素衍生物，叠氮基苯甲酰甲基，原黄素和叠氮原黄素；人工核酸内切酶；金属复合物，如edta-fe(ii)，邻菲咯啉-cu(i)和卟啉-fe(ii)；烷基化部分；核酸酶，如氨基-1-己醇葡萄球菌核酸酶和碱性磷酸酶；末端转移酶；抗体酶；胆甾醇基部分；亲脂性运载体；肽偶联物；长链醇；磷酸酯；氨基；巯基；放射性标志物；非放射性标志物，如染料；和聚赖氨酸或其他多胺。在一实例中，核酸与碳水化合物、硫酸化碳水化合物或聚糖偶联。试剂盒本文所述的任何组合物可以包含在试剂盒中。在非限制性实例中，试剂盒中包含单个mirna。试剂盒可以进一步包含一种或多种阴性对照合成mirna，其可以用于合成mirna递送的作用的对照。试剂盒可进一步包含水和杂交缓冲液以促进合成mirna两条链的杂交。试剂盒还可以包含一种或多种转染试剂以促进mirna向细胞的递送。在非限制性实例中，试剂盒中包含多种合成mirna。试剂盒可以进一步包含一种或多种阴性对照合成mirna，其可以用于控制合成mirna递送的作用。试剂盒还可以包含一种或多种转染试剂以促进向细胞的递送。试剂盒的组分可包装在水性介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器用具通常包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器用具，其中可放置组分，并且优选，合适的等分。如果试剂盒中有多个组分(标记试剂和标记可以包装在一起)，那么试剂盒通常还将包含第二、第三或其他额外容器，可以将其他组分单独放入其中。然而，组分的各种组合可以包含在小瓶中。本发明的试剂盒通常还将包括用于容纳核酸的工具，以及封闭限制件中的其他试剂容器用于商业销售。这类容器可包括注塑或吹塑的塑料容器，其中保留所需小管。当试剂盒的组分以一种和/或多种液体溶液提供时，液体溶液是水溶液，特别优选无菌水溶液。然而，试剂盒的组分可以干粉形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂重建粉末。设想了溶剂还可以在另一个容器用具中提供。容器用具通常包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器用具，其中可放置核酸制剂，并且优选，合适等分的。试剂盒还可以包含第二容器用具，用于容纳无菌的，药学上可接受的缓冲液和/或其他稀释剂。本发明的试剂盒通常还将包括用于将小瓶包含在封闭限制件中以进行商业销售的用具，例如将所需小瓶保留在其中的注射和/或吹塑塑料容器。这类试剂盒还可以包括保护或维持mirna或防止其降解的组分。这类组分可以是无rna酶的或保护免于rna酶影响的。这类试剂盒通常将以合适的方式包含针对每种单独试剂或溶液的不同容器。试剂盒还将包括说明书，用于使用试剂盒组分以及试剂盒中未包含的任何其他试剂的用途。说明书可能包括可以实施的变体。本发明的试剂盒还可包括下述一种或多种：mirna，mirna文库，mirna组合文库，阴性对照mirna，无核酸酶水；无rna酶容器，如1.5ml试管；杂交缓冲液；和转染试剂。设想这类试剂是本发明试剂盒的实施方式。然而，这类试剂盒不限于上述鉴定的特定项目，并且可以包括用于操纵或表征mirna的任何试剂。序列相同性“序列相同性”在本文中定义为通过比较序列确定的两个或更多个核酸(核苷酸，多核苷酸，rna，dna)序列之间的关系。在本领域中，“相同性”还表示核酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，这取决于这类序列串之间的匹配。“相同性”和“相似性”可以通过已知的方法容易地计算，包括但不限于《计算机分子生物学》(computationalmolecularbiology),lesk,a.m.,等,牛津大学出版社(oxforduniversitypress),纽约,1988；《生物运算：信息学和基因组工程》(biocomputing:informaticsandgenomeprojects),smith,d.w.编著,学术出版社(academicpress),纽约,1993；《序列数据的计算机分析》(computeranalysisofsequencedata),第i部分,griffin,a.m.和griffin,h.g.编著,胡马纳出版社(humanapress),新泽西州,1994；《分子生物学的序列分析》(sequenceanalysisinmolecularbiology),vonheine,g.,学术出版社,1987；和《序列分析引物》(sequenceanalysisprimer),gribskov,m.和devereux,j.编著,m斯托克顿出版社(mstocktonpress),纽约,1991；和carillo,h.和lipman,d.,siamj.appliedmath.,48:1073(1988)中所述的那些。在一实施方式中，在给定的seqidno.的全长上评估相同性。确定相同性的优选方法旨在为经测试的序列之间给出最大的匹配。鉴定相同性和相似性的方法已编入可公开获得的计算机程序中。确定两条序列之间的相同性和相似性的优选计算机程序包括，例如，gcg程序包(devereux,j.,等,nucleicacidsresearch12(1):387(1984))，bestfit，blastp，blastn，和fasta(altschul,s.f.等,j.mol.biol.215:403-410(1990)。blastx程序可由ncbi和其他来源公开获得(《blast手册》(blastmanual),altschul,s.,等,ncbinlmnihbethesda,md20894；altschul,s.,等,j.mol.biol.215:403-410(1990)。也可以将熟知的smithwaterman算法用于确定相同性。用于核酸比较的优选参数包括：算法：needleman和wunsch,j.mol.biol.48:443-453(1970)；比较矩阵：匹配＝+10，错配＝0；缺口罚分：50；缺口长度罚分：3。作为gap程序可由位于威斯康星州麦迪逊市的geneticscomputergroup获得。上述给出的是用于核酸比较的默认参数。在本文件以及其权利要求中，动词“包括/包含”及其变化形式以其非限制性意义使用，表示包括该词之后的项目，但不排除未特别提及的项目。此外，动词“由……组成”可以由“由……基本上组成”代替，意指mirna，isomir，模拟物或其来源或安塔够妙或本文定义的组合物可以包含除特别指出的组件之外的其他组件，所述其他组件不改变本发明的独特特征。此外，用“一个”或“一种”指示“一个种元素”时不排除存在多于一个/种元素的情形，除非明确要求仅有或仅为一个/种元素。因此，不定冠词“一”或“一个”通常表示“至少一个”。本说明书中所引用的所有专利和文献通过参引全文纳入本文。提供以下实施例仅用于说明目的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。本发明的优选实施方式：1.mirna，安塔够妙或其来源，用于治疗、逆转、预防、治愈和/或延缓神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病和/或病症，其中所述mirna或安塔够妙是mirna分子，isomir或其模拟物，并且是具有种子序列的寡核苷酸，包含seqidno:14-56所示种子序列的7个核苷酸中的至少6个核苷酸，或是其安塔够妙，其中所述mirna或安塔够妙是：mirna-135或其isomir，或其模拟物，或其安塔够妙，或mirna-196a-5p或其isomir，或其模拟物，或其安塔够妙。2.如实施方式1所述用途的mirna，安塔够妙或其来源，其中所述mirna或安塔够妙是mirna-135a分子，mirna-135b分子，mirna-196a-5p分子，mirna-135a的isomir，mirna-135b的isomir，mirna-196a-5p的isomir，mirna-135a的安塔够妙，mirna-135b的安塔够妙，mirna-196a-5p的安塔够妙，或其模拟物。3.如实施方式1或2所述用途的mirna，安塔够妙或其来源，其中mirna的来源是mirna的前体并且是长度为至少50个核苷酸的寡核苷酸。4.如实施方式1-3中任一项所述用途的mirna，安塔够妙或其来源，其中所述mirna与seqidno:147-241中任一项具有至少70％序列相同性，其中所述安塔够妙与seqidno:242-341中任一项具有至少70％序列相同性，和/或其中所述mirna或安塔够妙的长度为15-30个核苷酸，并且其中所述mirna的来源是所述mirna的前体并且与seqidno:1-4或10-13中任一项具有至少70％序列相同性。5.如实施方式1-4中任一项所述用途的mirna，安塔够妙或其来源，其中所述用途是用于抑制kruppel样因子4(klf4)的表达。6.包含如实施方式1-5中任一项所定义的mirna，安塔够妙或其来源的组合物，用于如实施方式1-5中任一项所述的用途。7.如实施方式5所述用途的组合物，包含：i)mirna-135a分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源，和/或ii)mirna-135b分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源，和/或iii)mirna-196a-5p分子，或其isomir，模拟物，安塔够妙或来源。8.如实施方式6或7所述用途的组合物，还包含mirna-124分子，mirna-124模拟物，mirna-124isomir，mirna-124安塔够妙或其来源。9.一种用于治疗、治愈、逆转和/或延缓神经元缺陷或与神经元缺陷相关的病症或疾病的方法，其通过向有此需要的对象给予如实施方式1-5中任一项所定义的mirna，安塔够妙或其来源，或如实施方式6-8中任一项所定义的组合物。10.一种用于诊断对象中神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病或病症的方法，所述方法包括下述步骤：(a)确定如实施方式1-5中任一项所定义的mirna或其来源的表达水平，并且任选地，(b)将如实施方式1-5中任一项所定义的所述mirna或其来源的表达水平与所述mirna或其来源的表达水平的参比值进行比较，所述参比值优选是健康对象中所述mirna或其来源表达水平的平均值。11.如实施方式10所述的方法，其在步骤(a)中包括确定下述内容的表达水平：i)mirna-124分子，mirna-124isomir，mirna-124前体，或ii)klf4，或iii)mirna-135a和mirna-135b，或者isomir，或其来源，或iv)mirna-135a和mirna-196a-5p，或者isomir，或其来源，或v)mirna-135b和mirna-196a-5p，或者isomir，或其来源，或vi)mirna-135a和mirna-135b和mirna-196a-5p中的任一种，或者isomir，或其来源。12.如实施方式10或11所述的方法，其中当比较导致发现所述mirna-135，isomir或其来源表达水平降低和/或mirna-124分子，isomir或其来源表达水平降低时，诊断为神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病或病症。13.如实施方式9-12中任一项所述的方法，其中，在获自所述对象的样品中离体确定所述表达水平。14.一种用于鉴定能够治疗、逆转、治愈和/或延缓对象中神经元缺陷或与神经元缺陷相关的疾病或病症的物质的方法，所述方法包括下述步骤：(a)提供能够表达mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196-5p分子，isomir或其来源的测试细胞群，优选所述测试细胞群包含神经元细胞，如sh-sy5y，更优选所述测试细胞群包含哺乳动物细胞，甚至更优选人细胞；(b)使所述测试细胞群与所述物质接触；(c)确定接触所述物质或用所述物质孵育的测试细胞群中所述mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196-5p分子，isomir或其来源的表达水平，或者所述mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196-5p分子，isomir或其来源的活性或稳态水平；(d)将(c)中确定的表达、活性或稳态水平与未接触所述物质的测试细胞群中所述mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196-5p分子，isomir或其来源的表达、活性或稳态水平进行比较；和(e)鉴定这样的物质，所述物质在接触所述物质的测试细胞群和未接触所述物质的测试细胞群之间产生所述mirna-135a和/或mirna-135b和/或mirna-196-5p分子，isomir或其来源的表达水平，活性或稳态水平差异。15.一种体内、体外或离体方法，用于促进神经元生成或再生，其至少包括这样的步骤：使细胞与如实施方式1-5中任一项定义的mirna，安塔够妙或其来源或者与实施方式6-8中任一项定义的组合物接触。附图说明图1：基于图像的高含量筛选鉴定涉及神经突生长的mirna。(a)细胞组学阵列扫描(cellomicsarrayscan)筛选的示意图。接种sh-sy5y细胞，并使用视黄酸进行分化。添加病毒文库，并在3天后将细胞固定并免疫染色。使用热阵列扫描(thermoarrayscan)自动化显微镜拍摄覆盖孔的整个表面的图像，并使用神经元概述算法(neuronalprofilingalgorithm)进行分析，以评估mirna对一般神经元样特征如神经突数量，神经突长度和分支点数量的影响。mirna对各参数的影响进行二进制评分(0或1)。当对所有mirna的参数影响偏离中值超过2倍标准偏差时，给予阳性评分(1)。当mirna在3个平板中的至少2个中评分为阳性时，将一式三份的平板各自的分数组合，并考虑针对某个参数的评分(影响为“是(true)”)。这产生了最终(累积的)“命中评分(hitscore)”，将其用于排序对神经元形态学有影响的慢病毒克隆。(b)未经处理的sh-sy5y细胞(左图)和经视黄酸处理的sh-sy5y细胞(中图)的代表图像。右面显示了由神经元概述算法生成的示踪结果。比例尺：100μm。(c)图表显示了经注释的mirna的列表的神经元概述算法的所有参数的累积评分，所述经注释的mirna对经病毒转导的sh-sy5y细胞的神经元特征产生阳性影响。(d)图表显示了平均总命中评分(左)，基于描述神经突长度的参数的命中评分(中)和基于描述了用所示miridianmirna模拟物电穿孔的sh-sy5y细胞的神经突分支的参数的命中评分(右)。数据表示平均值±sem。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，带tukey多重比较检验的单尾anova。比例尺：200μm。图2：神经元发育过程中mir-135a和mir-135b的表达。(a、c)图表显示了来自5个不同胚胎阶段和出生后阶段的分离的小鼠皮质(a)或来自海马体(c)的rna的定量pcr实验的结果。将来自不同窝的三只不同小鼠的组织用于分析。样品一式两份运行。倍数变化与5s管家rrna表达有关。数据表示平均值±sem。(b)锁核酸(lna)原位杂交显示了e14、p10和成熟皮层中的mir-135a和mir-135b表达。mir-135a和mir-135b在成熟皮层的皮质板(cp)和上层中表达。使用乱序lna原位探针处理的切片没有特异性染色。比例尺：200μm。(d)锁核酸(lna)原位杂交显示了e16、p0、p10和成熟海马体中mir-135a和mir-135b表达。在海马体中，齿状回(dg)和ca3区域特别显示出强烈的mir-135a和mir-135b染色。使用乱序lna原位探针处理的切片没有特异性染色。比例尺：200μm。图3：mir-135a和mir-135b增加神经突生长和分支。(a)图表显示了体外培养不同天数(div)对原代海马体神经元进行定量pcr的结果。由两种不同的培养物的3-4个盖玻片收集rna。样品一式两份运行。倍数变化与5s管家rrna表达有关。数据表示平均值±sem。(b)使用对照-1、mir-135a、mir-135b和mir-135a/mir-135b模拟物转染后，体外培养第4天(div)的原代神经元的代表性轮廓。最长的神经突以灰色阴影表示。(c)图表显示了在与a中一样在实验中div4海马体神经元最长的神经突的示踪结果。从≥3个单独的实验中至少追踪到173个神经元。数据表示平均值±sem。**p<0.01，****p<0.0001，t检验。(d)使用乱序或mir-135a和mir-135bh1-mcherry-海绵状载体转染后div4海马体神经元最长的神经突的示踪的定量。将海绵标记为“sp”，并且是所示mirna的安塔够妙(antagonomir)。从≥3个单独的实验中至少追踪到100个神经元。数据表示平均值±sem。**p<0.01，t检验。(e)使用对照海绵载体或mir-135ab海绵载体转染后，div4时的原代神经元代表性轮廓。最长的神经突以灰色阴影表示。(f)对于31个对照1(深灰色)、15个mir-135a(浅灰色)、16个mir-135b(黑色)或23个mir-135a和mir-135b(浅灰色并带有黑色轮廓)过度表达的神经元的sholl分析显示近端神经突和远端轴突分支增加。数据表示平均值±sem。****p<0.0001，多重t检验。在轮廓中，近端神经突源自主要的细胞体(corpus)，而远端分支源自长神经突；两者均为灰色阴影。(g)来自使用对照1或mir-135a和mir-135b转染的神经元的神经突经sholl循环(sholl-circle)的累积交点(如d所示)。数据表示平均值±sem。**p<0.01，t检验。图4：皮层神经元迁移需要mir-135。(a)使用对照1、mir-135a或mir-135b模拟物离体电穿孔的皮质的代表性图像。通过在皮质上垂直放置包含8个方格的矩形来定量神经元迁移。对每个方格中的细胞进行计数，并表示为矩形中细胞总数的百分比。方格与皮质的层完美对齐：脑室区(vz)，脑下区(svz)，中间区(iz)，皮质板(cp)和边缘区(mz)。为了比较，我们使用了各切片2到3个矩形的细胞计数。使用来自不同窝的≥3只动物的至少2-3个切片。数据表示平均值±sem。红色**方格7对照1相对mir-135a：mwu＝24，p＝0.0042；蓝色*方格4对照1相对mir-135b：mwu＝32，p＝0.0195；蓝色**方格7对照1相对mir-135b：mwu＝25，p＝0.0051，曼-惠特尼u检验。比例尺：100μm。(b)使用对照1或mir-135a和mir-135b模拟物处理的小鼠胚胎子宫内电穿孔的e16.5皮质中的顶突起(leadingprocess)长度和神经元迁移的定量和代表性图像。gfp信号为白色。如(f)中所述对神经元迁移进行定量。数据表示平均值±sem。方格3:mwu＝198，p<0.0001；方格6mwu＝282，p<0.0053；方格7:mwu＝161，p<0.0001；方格8:mwu＝164，p<0.0001。**p<0.01，****p<0.0001，曼-惠特尼u检验，****p<0.0001t检验。比例尺：100μm。(b)使用乱序或mir-135a和mir-135bh1-mcherry海绵载体处理的小鼠胚胎子宫内电穿孔的e16.5皮质中的顶突起长度和神经元迁移的定量和代表性图像。mcherry信号为白色。如(a)中所述对神经元迁移进行定量。数据表示平均值±sem。方格2:mwu＝70，p＝0.018；方格5:mwu＝69，p＝0.016；方格6:mwu＝75，p＝0.030；方格8:mwu＝69，p＝0.016，曼-惠特尼u检验，*p<0.05。****p<0.0001t检验。比例尺：100μm。(b)使用对照1或mir-135a和mir-135b模拟物以e14.5电穿孔的小鼠幼崽子宫内电穿孔的p4皮质中的神经元迁移的定量和代表性图像。gfp信号为白色。如(a)中所述对神经元迁移进行定量。数据表示平均值±sem。方格3:mwu＝475，p＝0.0114；方格4:mwu＝392.5，p＝0.0016；方格5:mwu＝148，p<0.0001；方格6:mwu＝319.5，p＝0.0004；方格7:mwu＝194.5，p<0.0001，曼-惠特尼u检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。比例尺：200μm。(e)使用对照1或mir-135a和mir-135b模拟物以e14.5电穿孔的小鼠幼崽子宫内电穿孔的p10皮质中的神经元迁移的定量和代表性图像。gfp信号为白色。如(a)中所述对神经元迁移进行定量。数据表示平均值±sem。bin6:mwu783.5，p＝0.032，曼-惠特尼u检验。*p<0.05。比例尺：200μm。图5：krüppel样因子4(klf4)是轴突发育和神经元迁移过程中mir-135a和mir-135b的功能性靶标。(a)klf4mrna的3'-utr中预测的mir-135a和mir-135b结合位点的示意图。预测位点394将介导最强的结合(由箭头标记)。(b)将klf4的3'-utr克隆到psi-check2载体中，并用于使用对照1或mir-135a和mir-135b模拟物的海肾荧光素酶试验。随后，使用具有klf43'-utr的psi-check载体(其中位点394中的3个核苷酸发生了突变)以确认mirna-135-klf4结合的特异性。将荧光素酶活性标准化为野生型或突变的3'-utr(utrm)的仅3'-utr条件。重复实验3次。数据表示平均值±sem。**p<0.01，*p<0.05，t检验。(c)小鼠的皮质和海马体e16.5和成年期的切片中klf4的免疫组织化学。klf4在皮质板(cp)，在贯穿中间区的轴突(iz)以及在齿状回(dg)的海马颗粒细胞和ca3的锥体细胞中高度表达。比例尺：200μm。(d)neuro2a细胞中对照1或mir-135a和mir-135b模拟物转染后，klf4蛋白水平的western印迹分析。数据表示平均值±sem。**p<0.01，t检验。(e)使用对照1模拟物，与对mirna结合不敏感的klf4cdna组合的对照1模拟物(cmv-klf4-gfp)，mir-135a和mir-135b模拟物，以及与cmv-klf4-gfp组合的mir-135a和mir-135b模拟物转染后，体外培养4天(div4)的原代海马神经元的代表性轮廓。(f)图表显示了在与e中一样在实验中div4海马体神经元最长的神经突的示踪结果。从≥3个单独的实验中至少追踪到182个神经元。数据表示平均值±sem。*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001，t检验。(g)使用mir-135a和mir-135b模拟物，或者与对mir-135调节不敏感的pcag-klf4载体组合的mir-135a和mir-135b模拟物处理的小鼠胚胎子宫内电穿孔的e16.5皮层中的顶突起长度和神经元迁移的定量和代表性图像。如图4中所述对神经元迁移进行定量。数据表示平均值±sem。方格1:mwu＝422，p＝0.0171，方格2:mwu＝332，p＝0.0005，方格3:mwu＝293，p<0.0001，方格4:mwu＝395，p＝0.0068，方格5:mwu＝357，p＝0.0016，方格6:mwu＝261，p<0.0001，方格7:mwu＝219，p<0.0001和方格8:mwu＝211.5，p<0.0001。曼-惠特尼u检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。对照1条件如图4b所述。比例尺：100μm。图6：外源性mir-135增强视神经损伤后的轴突再生。(a)视神经挤压研究的实验设置。(b、c)图表显示了注射模拟物后眼组织上的定量pcr结果。两次注射mirna模拟物后，mir-135a和mir-135b的水平升高，而klf4的水平降低(c)。倍数变化与5s管家rrna表达有关。数据表示平均值±sem。*p<0.05，**p<0.01，对δct值进行t检验。(d)视神经挤压后14天，对视神经进行偶联有alexa-555的霍乱毒素b染色的代表性图像。注射mir-135模拟物后，轴突长入并超出损伤部位(虚线表示损伤的近端和远端的边界点)。方框表示右侧显示的更高放大率的图像。比例尺：100μm。(e)图表显示了对于(d)中所表示的情况，受伤后14天时相对于挤压位点远端的再生轴突的数量的定量。n＝各条件9只小鼠。*p<0.05；****p<0.0001,anova，然后进行sidak检验。数据表示为平均值±sem。(f)突变显示了共转染mir-135模拟物和gfp或klf4载体后，眼组织上定量pcr的结果。gfp或klf4转染组之间mir-135a和mir-135b表达没有差异。倍数变化与5s管家rrna表达有关。数据表示平均值±sem。(g)玻璃体内注射aav2-gfp病毒。注射后一周，在rgc中检测到强gfp信号，但是未在视网膜的其他细胞类型中检测到。比例尺100μm。(h)图表显示了对于使用玻璃体内注射表达对照mirna或mir-135a和mir-135b(除了gfp)的aav2(病变后7天)进行的实验，损伤后14天时相对于挤压位点远端的再生轴突数量的定量。****p<0.0001，anova，然后进行sidak检验。数据表示为平均值±sem。(i)图表显示了对于使用玻璃体内注射对照或mir-135a和mir-135b海绵载体进行的实验，损伤后14天时相对于挤压位点远端的再生轴突数量的定量。**p<0.01，anova，然后进行sidak检验。数据表示为平均值±sem。图7：mir-135a的人数据a)通过定量pcr确定人tle患者中mir-135a的表达水平。c-对照，mtle-hs，mtle+hs。n＝6患者/组。斯氏t检验。标准化至u6和5srrna。斯氏t检验，*p<0.05，**p<0.01。b)不同组之间mir-135a原位定位的代表性图像。比例尺，200μm。图8：mir-135a的细胞类型特异性定位。与神经元标志物neun共定位。在不同群体的ca区中与neun共同染色的神经元中观察到了mir-135a的特异性定位。比例尺，25μm。图9：杏仁核内动物模型中mir-135a表达上调。(a)癫痫持续状态后2周发现mir-135a的表达水平被显著上调。标准化至5srrna，n＝4pbs注射，3ka注射的小鼠。斯氏t检验。*p<0.05，**p<0.01。(b)ish，显示相较于24小时在2周时的mir-135a上调。比例尺，300μm。图10：体内数据；红藻氨酸诱导后的小鼠表型和安塔够妙给药。a)安塔够妙给药后24小时的mir-135a表达，测试了三个剂量(0.5、1.0、1.5nmol)。进一步使用1nmol的浓度，因为它具有最大的敲减作用，而没有任何脱靶作用。在该浓度下，mir-124表达没有变化，n＝3只小鼠/组。标准化至rnu6b，单向anova。*p<0.05。b)安塔够妙实验计划的示意图。c)图表显示了使用eeg遥测法(telemetry)注射安塔够妙后2周记录的自发性癫痫发作的数量。在7天的清除期内，治疗动物和对照动物的癫痫发作频率无显著的差异(p＝0·743)。治疗后，治疗动物和对照动物的癫痫频率的分布几乎完全分离，wilcoxon曼-惠特尼统计量为0·90，95％ci为0·65至0·97，这表明90％可能性的对照动物的癫痫发作频率比治疗动物高(p<0·001)。n＝5只对照小鼠和用ant-135a注射的5只ka小鼠。相较于对照，注射安塔够妙的小鼠癫痫发作显著减少。图11：人tle中mir-135a表达增加。a)通过定量pcr确定人tle患者中mir-135a的表达水平。对照(n＝8)，mtle+hs(n＝7)。标准化至5srrna。数据表示为平均值±sem，**p<0.01。曼-惠特尼u检验。b)lna原位杂交，其显示了mir-135a在对照组和mtle+hs组中的定位。比例尺，200μm。c)mir-135a的细胞类型特异性定位。与神经元标志物neun共定位。在ca区域的神经元胞体中观察到mir-135a的特异性定位。箭头指示共标记的细胞。没有观察到与星形细胞标志物gfap的共定位。比例尺，25μm。图12：tle的小鼠模型中mir-135a增加。a)se后2周，iak小鼠海马体中mir-135a水平升高。n＝4只pbs小鼠和3只ka小鼠。标准化至5srrna。数据表示为平均值±sem。*p<0.05，t检验。b)ish的代表性图像，其显示相较于24小时和pbs注射，se诱导后2周时海马体和杏仁核区域中的强mir-135a表达。错配染色的图像没有信号。比例尺，300μm。c)fish，用星形细胞标志物gfap共标记mir-135a，未观察到特异性共定位。齿状回ml-分子层，gcl-颗粒细胞层，门区(hilus)，海马角区域ca2，ca3和ca4。比例尺，100μm。d)在mtle+hs条件下，mir-135a-2水平升高，但是mir-135a-1没有变化。n＝8个对照和7个mtle+hs样品。数据表示为平均值±sem，*p<0.05。t检验。e)相较于注射pbs的对照，ka小鼠中mir-135a-1和mir-135a-2水平增加。n＝4只pbs小鼠和3只ka小鼠。数据表示为平均值±sem，***p<0.001，*p<0.05。t检验。图13：ant-135a减少了癫痫小鼠杏仁核内钾盐镁矾模型中的发作计数。a)注射ant-135a的小鼠中mir-135a抑制剂探针的lnaish。在图像1、2的同侧(注射)海马体中观察到mir-135a.inh的强信号，而对照组则没有任何信号。比例尺，200μm。ant-135a主要被海马体ca1、ca4和dg区域的神经元细胞吸收。比例尺，50μm。b)雄性c57bl6成年小鼠(约25g)植入dsi遥测设备，所述dsi遥测设备与皮质电极(两个脑半球)连接用于eeg记录。经适当的手术恢复后，将小鼠与eeg连接，并在第0天(d0)进行杏仁核内红藻氨酸诱导的癫痫状态(se)。遥测设备在第7天(d07)关闭并重新激活以记录7天的“癫痫基线”。在第14天(d14)，用ant-135a或其错配对照脑室内(icv)注射小鼠，并连续监测6天(d14至d20；“mir治疗期之后”)。c)癫痫基线——在癫痫基线的7天中，治疗和对照动物的发作频率无显著差异——mir治疗之前(p＝0·743)。mir治疗后——治疗后(在d14)，从d15开始，治疗和对照动物发作的数量几乎都大大减少。d)在第7天应用ant-135a(虚线)导致发作计数相对于时间显著减少。对于对照和ant-135a，n＝5。***——混合设计重复测量普通线性模型；天*治疗相互作用；f统计量——5.834(对于α＝0.05，f(20,60)＝1.75)；p＜0.001。e)平均发作持续时间：癫痫基线——在癫痫基线的7天中，治疗和对照动物的发作持续时间无显著差异——mir治疗之前(p＝0·4721)。mir治疗后——治疗后(在d14)，经由斯氏t检验分析，用ant-135a治疗的小鼠的发作比对照组显著地缩短(p＝0·0006)。n＝每组5只。f)猝发活动(ictalactivity)消耗的时间：癫痫基线——在癫痫基线的7天中，治疗和对照动物发作消耗的总时间无显著差异——mir治疗之前(p＝0·7546)。mir治疗后——治疗后(在d14)，经由斯氏t检验分析，用ant-135a治疗的小鼠的发作比对照组小鼠消耗显著更短的时间(p＝0·0021)。n＝5只/组。g)使用ant-135a(底部)或对照(顶部)治疗3天后自发发作的代表性eeg痕迹。h)癫痫消耗的总时间–每只小鼠每天癫痫的总时间(秒)。图14：使用生物素化探针对mir-135a进行靶标鉴定。a)mirna双链体设计的示意图。成熟链(seqidno：5)经由c6接头在3'羟基处用生物素分子标记。b)显示了免疫沉淀(ip)过程的示意图。用生物素标签标记的探针转染neuro2a细胞，使用链霉亲和素珠进行ip。提取总rna并对进行深度rna测序。n＝3个生物学重复/组c)显示mir-135a和scrip样品中ago2带的示例性wb。β-肌动蛋白作为加载对照仅存在于输入样品中。d)输入和ip的热图，其显示了差异性基因表达。e)输入和ip的主成分分析(pca)图，其显示了基于其差异性基因表达的样本的聚类。图15：ip的geneontology术语(a.生物过程，b.细胞区室，c.分子功能)，其显示了mir-135a可能调控的各种过程。虚线表示p＝0.05。d)维恩图显示了转录本的各个片段中预测的种子序列位置(mir-135a的靶向位点)的重叠。e)维恩图显示了mir-135a和mir135b的共有靶标(50.4％)和独特靶标。mir-135a和mir-135b包含相同的成熟序列，并且在种子区域之外只有一个错配，因此它们基本上可以靶向相似的靶标。图16：bio-ip靶标的验证。a)通过qpcr对很少的选定靶标进行了测试，并且发现相较于输入在ip样品中显著富集。柱状图和代表性的印迹图像显示了mir-135a在n2a细胞中过表达后，标准化至β-肌动蛋白的gr(b-b1)、plxna4(c-c1)和mef2a(d-d1)的蛋白质水平。相较于错配条件，mir-135a过表达后，所有经过验证的靶标显著下调。数据表示为平均值，平均值±sem，*p<0.05。t检验。图17：tle中的mef2a。a)具有高度保守的mir-135a靶位点的mef2a的3'utr的示意图。b)将mir-135a的靶位点连接到psicheck2载体多克隆位点中，并用海肾荧光素酶测试其结合。荧光素酶试验在hela细胞中用携带了分离自mef2a3'utr的突变体结合位点和mir-135awt的构建体转染，并与mir-135a模拟物共转染或不与mir-135a模拟物共转染。进行n＝3次独立的转染，每次用4孔/条件。数据表示为平均值±sem，**p<0.01。t检验。c)代表性图像显示了对棘密度进行定量的继发性尖端树突。在div13用mir-135a(与mef2一起或不与其一起)或对照载体转染解离的神经元，并在div17进行固定和分析。d)示意图显示了定量的不同类型的棘。e)柱状图显示了定量，观察到mir-135a过表达后棘密度降低，并且该作用通过与mef2共转染来挽救。从三个独立的转染中分析了n＝12-22个神经元。数据表示为平均值，平均值±sem。****p<0.0001，单向anova多组比较。f)图表显示了不同棘类型的百分比。mir-135a过表达后观察到未成熟类型的棘增加，其在mef2共表达后挽救。g)发现se大大减少后2周的对照和iak小鼠中mef2a的代表性wb图像。h)总蛋白水平的定量标准化至β肌动蛋白。n＝5只对照，4只ka小鼠海马体。数据表示为平均值，平均值±sem。*p<0.05。曼-惠特尼检验。i)iak小鼠中mef2a染色的代表性图像。比例尺，200μm。j)对照和mtle+hs患者的海马体中mef2a的代表性wb图像。k)总蛋白水平的定量标准化至β肌动蛋白。n＝6只对照，4只tle+hs。数据表示为平均值，平均值±sem。*p<0.05。曼-惠特尼检验。l)对照和mtle+hs齿状回(dg)和ca区域中mef2a染色的代表性图像。比例50μm。m)对照和注射ant-135a的小鼠中的mef2a免疫染色。比例尺，100μm。实施例实施例1.生成编码mirna的慢病毒文库由公共mirna信息库(www.mirbase.org)和专有小型rna深度测序数据库sirocco中选择人mirna(参见wo2007/081204)。使用含有全长前-mirna发夹以及位于两侧50-150个碱基对的侧接序列的扩增子，由mirna序列的基因组位置扩增mirna序列。使用定制实施的primer3软件(www.geneious.com)设计扩增子的引物。如果引物设计程序在指定的序列中找不到合适的引物，那么将侧接序列的要求调整为0-200个碱基对。设计的引物与定向克隆的限制性酶切位点和5'gcgc突出端互补。默认情况下，mirna上游的引物与bamhi限制性酶切位点(ggatcc)互补，而mirna下游的引物与ecori限制性酶切位点(gaattc)互补。具有内部bamhi或ecori限制性位点(即，在基因组序列中出现)的扩增子的引物分别与bglii位点(agatct)或xbai位点(tctaga)互补。使用上述引物在下述pcr反应中由单个个体的人基因组dna扩增mirna：所有mirna基因座均在单独的10μlpcr反应中扩增。使用qiagenpcrclean-up缓冲液套装和whatmanunifiltergf/c滤板(目录号7700-1101)纯化产物。用17μlh20/孔洗脱dna。分离的洗脱液用于以下限制性反应：*分别用xbai或bglii进行切割具有针对ecori或bamhi的内部限制性位点的扩增子。用promega缓冲液d进行了ecori+bglii反应。用promega缓冲液e进行了bamhi+xbai反应。*对于定向克隆，用ecori和bamhi切割pcdh。用反向ecori和bamhi限制性切位点制备了另一种构建体，称之为pcdh-，从而以正确的方向克隆了具有5'bamhi和3'ecori的扩增子。使用xbai切割具有内部ecori位点的扩增子，并连接到用xbai和bamhi限制的pcdh载体中。将所得的连接物分别转化到细菌中(promegasinglestep(krx)感受态细胞，目录号l3002)。用950μl转化缓冲液ii(10mmmops，75mmcacl2，10mmrbcl，15％甘油，过滤灭菌)稀释50μl感受态细胞。每20μl连接物添加20μl稀释的感受态细胞。将混合物在冰上孵育15分钟，于37℃热激30秒，然后放回冰上。2分钟后，在150μlluria肉汤(lb)中重建转化的细菌。允许细菌在37℃恢复20分钟，之后将其分别铺板到包含氨苄青霉素的(50μg/ml)的lb琼脂平板上，并使其在37℃下过夜生长。挑选各平板的单个菌落，并在400μl含氨苄青霉素(50μg/ml)的lb中传代培养过夜。将1μl传代培养物在100μl水中裂解以进行测序。细菌裂解物用于下述pcr反应中：pcdh-正向cacgctgttttgacctccataga(seqidno:344)pcdh-反向cactgacgggcaccggag(seqidno:345)将pcr产物稀释25倍。在下述sanger测序反应中使用1μl稀释的pcr产物：pcdh-seqgacctccatagaagattctagagctagc(seqidno:346)将30μl沉淀混合物(80％乙醇，50mm乙酸钠，ph5.5)添加到各测序反应产物中。将混合物涡旋10秒，并于4℃以5000rcf(相对离心力)离心45分钟。吸出上清液，用30μl冰冷80％乙醇洗涤dna沉淀，并于4℃以5000rcf离心5分钟。吸出上清液并将dna沉淀在热块上进行10分钟的干燥。将干燥dna沉淀溶解于10μlh2o中。所得dna溶液在abi3730xldna分析仪上测序。将序列与预期的基因组序列进行比较。将正确的克隆添加到文库中。对于不正确的克隆，挑出另外4个细菌菌落，并分析插入序列。将文库构建体在50ml含氨苄青霉素(100ug/ml)的lb中传代培养过夜，并使用补充有qiagenqiafilterendofree质粒缓冲液套装(目录号19048)的qiagenqiafilter质粒midi试剂盒(目录号12245)分离，根据制造商的说明。将dna溶解在提供的te缓冲液中，并使其最终浓度为500ng/μl。我们从整合dna技术公司订购了我们自身无法克隆的构建体作为迷你基因(minigene)。在这些情况中，通过idt提供的服务，将全长发夹加上侧接各位点的20个碱基对克隆到我们的载体中。包装和病毒生产由系统生物学公司进行，如cd-500b1-cd523-a1用户手册所述。实施例2：基于图像的mirna筛选通过靶向krüppel样因子4将mirna-135鉴定为cns轴突生长和再生的调节剂材料和方法动物所有动物的使用和护理按照机构指南进行，并得到当地伦理动物实验委员会(dec)的批准。c57bl/6j小鼠(rrid:imsr_jax:000664，雄性和雌性)获自查尔斯河公司(charlesriver)。当使用定时怀孕的雌性时，将检测到阴道堵塞的早晨视为胚胎第0.5天(e0.5)。对于幼崽，出生日期被认为是出生后的第0天(p0)。慢病毒人全mir组(mirnome)文库高内涵物筛选和命中确认获自dsmz(acc209，rrid:cvcl_0019)的sh-sy5y细胞在dmem-f12(吉布可公司(gibco)+10％fcs+l-谷氨酰胺+青霉素/链霉素中生长，并在第12和21代之间使用。使用自动细胞接种器multidropcombi试剂分配器(赛默飞世尔科技公司(thermoscientific))将细胞以6000细胞/孔接种到96孔板中。接种后一天，用60μm视黄酸处理细胞，并用慢病毒人全基因组mirna文库以平均7.34*105ifu/孔进行转导(interna技术公司(internatechnologies))。各文库平板一式三份评估。慢病毒文库包含640个经注释的人mirna基因(mirbase12)以及来自深度测序的400个候选mirna，并且基于pcdh-cmv-mcs-ef1-puro载体(编号cd510b-1，系统生物科学公司)(poell等,2011)。系统生物科学公司进行慢病毒包装，并且文库的平均ifu/ml为1.22*109。将文库储存在14个96孔板中。体外培养(div)4天时，通过在pbs中添加1:18％多聚甲醛来固定细胞，并封闭在0.4％曲通-x100、5％山羊血清，1％bsa，1％甘氨酸和0.1％溶素的pbs中。用与alexa488偶联的二抗(英杰公司(invitrogen))对细胞进行βiii-微管蛋白(1:3000，小鼠单克隆t8660，西格玛公司(sigma)，rrid:ab_477590)进行免疫染色，并用dapi复染。通过使用aquamax2000(分子设备公司(moleculardevices))的两个洗涤循环自动彻底洗涤细胞。使用thermoarrayscanvtihcs读取器(赛默飞科学公司)进行自动显微镜检查，并使用细胞组神经元概述v3生物应用(cellomicsneuronalprofilingv3bioapplication)算法提取形态特征。使用自定义脚本(阿姆斯特丹自由大学(vrijeuniversiteitamsterdam)的ronaldvankesteren馈赠)将原始数据(.mdb文件)转换为excel格式。去除所有有效核计数低于100的孔。由数据集中去掉非神经元属性以及依赖于细胞数量的属性。对于所有其他属性，计算板平板中值。将各空的各属性进行二进制评分(0或1)，当偏离对照中值标准偏差2倍以上时，为阳性评分(1)。假设大多数mirna不会影响细胞形态，那么将所有mirna的中值用作对照。将一式三份的各板组合，并且当最少2/3的板评分为阳性时，认为孔属性是“阳性”。这产生了最终(累积的)“命中评分”(“hitscore”)，将其用于对对神经元形态学有影响的慢病毒克隆排序。对于命中确认，通过胰蛋白酶消化收获sh-sy5y细胞，用pbs洗涤，并以8*106个细胞/ml重悬于inb缓冲液中(135mmkcl，0.2mmcacl2，2mmmgcl2，10mmhepes，5mmegta，ph7.3)。然后，将细胞与20pmolmiridian模拟物(总是人(has)同种型，达马可公司(dharmacon)，赛默飞世尔科技公司)混合，并在具有pep比色皿模块的ecm830方形声波发射器中(所有btx哈佛仪器)，以1mm缺口大小尺寸用900μs和2s脉冲间隔的3个120v脉冲电穿孔。以此方式，电穿孔了超过98％的细胞。将各电穿孔分开并均匀分布到24孔板的4个孔中，考虑到可能的边缘孔效应，左侧和右侧外部孔没有细胞。电穿孔后一天，用60μm视黄酸处理细胞，以诱导神经元样特征的发展。电穿孔后四天，如上所述将细胞固定并免疫染色。使用上文概述的cellomics软件进行形态学细胞特征分析。锁核酸(lna)原位杂交收集e16.5c57bl/6j小鼠胚胎并断头。将大脑固定在pbs中的4％pfa中，并在pbs中的30％蔗糖中进行冷冻保护。制作20μm厚的冠状脑冰冻切片。如先前所述进行lna原位杂交(kan等，2012)。简言之，将切片风干并在4％pfa中固定10分钟，乙酰化(10分钟，室温下)，用蛋白酶k(5μg/ml，室温下5分钟)处理，并预杂交(室温下1小时，55℃下30分钟)，然后与15nm含lna的双dig标记的mir-135a，mir-135b或对照原位探针(exiqon公司)孵育(55℃下2小时)。杂交后，将载玻片于55℃在0.2xssc中洗涤1小时。用pbs中的10％fcs封闭载玻片1小时，并与抗地高辛-apfab片段(1:2500，罗氏诊断公司(rochediagnostics))在封闭缓冲液中过夜4℃孵育。pbs洗涤后，将载玻片与硝基蓝和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(nbt/bcip，罗氏诊断公司)底物在室温下孵育2-20小时。通过在pbs中洗涤载玻片来终止染色。将载玻片固定在pbs中的90％甘油中。使用乱序lna-dig探针染色的切片没有特异性染色。定量pcr将e14.5和e16.5c57bl/6胚胎，p0和p10幼崽和成年小鼠断头并去除大脑。解剖海马体和皮质并立即在干冰上冷冻。按照生产商的方案使用mirneasy试剂盒(凯杰公司)，由3个不同窝中的至少3只动物中分离出总rna。此外，在div2、7、14和21由2种不同培养物的3-4个盖玻片的原代海马神经元中分离总rna。此外，在视神经挤压实验和玻璃体内注射mirna模拟物后14天，由视网膜分离总rna(参见描述神经损伤实验的段落)。使用nanodrop(赛默飞世尔科技公司)确定rna量，并使用通用cdna合成试剂盒(exiqon公司)将等量的各样品用于第一链cdna合成。使用micrornalnatmpcr引物组和sybrgreen主混合物(exiqon公司)，在quantstudio6flex实时pcr系统(应用生物系统公司)上进行定量pcr反应。所有样品均一式两份进行。使用quantstudio实时pcr软件v1.1确定ct值。通过标准化至5srrna来估计不同mirna的表达水平，并用单因素anova分析其统计学意义。将p<0.05评估为具有显著性。小鼠海马和皮质神经元的培养和转染如先前所述(vanbattum等，2014)产生海马和皮质培养物。简而言之，将p0-p1c57bl/6小鼠幼仔断头，并在冰冷解剖培养基中迅速去除大脑。分离海马或皮质，胰蛋白酶消化并解离成单个细胞。将它们培养在补充了b-27，l-谷氨酰胺，青霉素/链霉素和β-巯基乙醇的神经基础培养基中，在酸洗涤的，多聚d-细胞溶解酶(pdl，20μg/ml)和层粘连蛋白(40μg/ml)涂覆的玻璃盖玻片上，以37℃+5％co2，于12孔板中。在div1，使用lipofectamine2000(英杰公司)，神经元与各孔0.5μgcag-gfp载体以及mir-135a、mir-135b或对照1模拟物的50pmolmiridian模拟物(也称之为阴性对照a，均获自达马可公司)，或者与各孔mir-135a或mir-135b的0.5μgmirnah1-mcherry-海绵载体(tebu-bio)共转染。为了进行拯救实验，使用了pcmv-klf4-egfp载体(傲锐基因公司(origene))。在div4，神经元用4％pfa和4％蔗糖的pbs固定。对于免疫细胞化学，神经元与溶解于3％正常马血清、0.1％bsa和0.1％曲通-x100的pbs溶液中的兔抗-gfp(1:1000,a-11122，英杰公司，rrid:ab_221569)或兔抗-rfp(1:1000，罗克兰德公司(rockland)，rrid:ab_11182807)和小鼠抗-βiii微管蛋白(1:3000，t8660，西格玛公司，rrid:ab_477590)孵育。使用axioskop2epi荧光显微镜(蔡司公司(zeiss))拍摄图像。使用imagej的neuronj插件(rrid：scr_002074)半手动追踪最长的神经突，并使用imagej软件(rrid：scr_003070)进行sholl分析。追踪了来自至少3个独立实验的100多个转染的神经元。在prism6(graphpad软件，rrid：scr_002798)中进行非配对的参数t检验，以统计分析数据。mirna靶标发现和验证将mirecords数据库用于搜索mir-135a和mir-135b共有的mrna靶标，其由至少6个靶标预测程序预测(xiao等，2009)。根据潜在参与神经元发育的情况，对mir-135a和mir-135b共有的预测靶标进行后选。为了进行靶标验证，由cdna中恢复klf4的整个3'-utr，并克隆到psicheck2载体(普洛麦格公司(promega))中。进行pcr介导的klf43’-utr诱变，以改变位于klf43’-utr394nt处的结合位点(图5a，箭头)。使用lipofectamine以及250ng载体和20pmolmiridianmirna模拟物(达马可公司)转染hek293细胞(rrid:cvcl_0045)。转染后24小时将细胞裂解，并在分光光度计上用双重荧光素酶报告物分析(e1960，普洛麦格公司)进行检查。进行t检验以比较prism6中的荧光素酶活性(graphpad软件，rrid:scr_002798)。为了进行蛋白质分析，使用lipofectamine2000，将miridianmirna模拟物(达马可公司)转染到neuro2a细胞(atcc，rrid:cvcl_0470)中。24小时后，将细胞在裂解缓冲液(20mmtrisph8.0，150mmkcl，1％曲通-x-100，蛋白酶抑制剂(罗氏公司)的mq)中裂解。样品在8％sds-page凝胶上分离，并印迹到硝化纤维素膜上。用5％乳tbs吐温在室温下阻断非特异性结合1小时。在与1％乳tbs吐温中的兔-抗-klf4(1:500，圣克鲁兹公司(santa-cruz)，rrid:ab_669567)和小鼠-抗-β-肌动蛋白(1:5000，西格玛公司，rrid:ab_476743)孵育后，用过氧化物酶偶联的二抗(阿柏堪穆公司(abcam))对印迹进行染色。使用pierceeclwestern检测试剂(赛默飞世尔科技公司)检测信号，并使用fluorchemm成像系统(proteinsimple公司)制作图像。使用imagej确定各个条带中的蛋白质水平，并将klf4表达标准化至同一样品中的β-肌动蛋白水平。进行t检验以比较条件之间的相对klf4表达(graphpadprism6软件，rrid:scr_002798)。免疫组化收集e16.5c57bl/6j小鼠胚胎或成年小鼠并断头。将大脑固定在pbs中的4％pfa中，并在pbs中的30％蔗糖中进行冷冻保护。制作20μm厚的冠状脑冰冻切片。将切片与在3％bsa和0.1％曲通-x-100的pbs中稀释的兔抗-klf4(圣克鲁兹公司，1:500(不再可用)或labnedln20238801:100，rrid:ab_2687557)孵育，用alexafluor偶联的二抗染色，并用dapi复染。使用axioscopeepi荧光显微镜(蔡司公司)和共焦扫描显微镜(奥林巴斯公司(olympus))制作图像。离体电穿孔如先前所述(yau等，2014)进行离体电穿孔。简言之，通过颈脱位法处死怀孕的c57bl/6小鼠，并迅速取出e14.5胚胎并断头。将mir-135a、mir-135b或对照1的30μmmiridian模拟物(达马可公司)与0.4μg/μlpcag-gfp载体合并，溶于0.1％fastgreen的mq中，并使用玻璃微量移液器(哈佛仪器公司(harvardapparatus))和微型注射器将1.7μl该混合物注入侧脑室。使用镀金基因桨电极和830方波发生器(btx哈佛仪器公司(btxharvardapparatus))，对头部施加三个30v的100ms脉冲，脉冲间隔为100ms。然后分离大脑，收集在chbss中，包埋在chbss中的3％lmp-琼脂糖(世尔科技公司(fisherscientific))中，并用振动切片机(莱卡公司)将其冠状切成250μm厚的切片。切片收集于聚-d-细胞溶解酶-层粘连蛋白涂覆的培养膜插入物(falcon公司)上，置于切片培养基(70％v/v基础依氏培养基，26％v/vchbss，20mmd-葡萄糖，1mml-谷氨酰胺，青霉素/链霉素)上，并培养4天，以评估迁移的程度。培养物用4％pfa固定，用pbs中的3％bsa和0.1％曲通封闭，并用兔抗-gfp(1:1000，a-11122，英杰公司，rrid:ab_221569)和小鼠抗-map2smi52(1:1000，阿柏堪穆公司，rrid:ab_776173)抗体染色。使用共聚焦激光扫描显微镜(奥林巴斯公司)拍摄z堆栈图像。gfp阳性细胞的迁移如下分析：使用adobephotoshop，将分成8个相等方格的均匀矩形置于图像的顶部，从而使方格1包括心室区(vz)，而方格8覆盖边缘区(mz，如图4a所示)。对每个方格中的细胞进行计数，并除以矩形中的细胞总数。各图像的至少两个矩形的平均值用于比较。对于各种条件，使用至少3个不同实验的12个皮质切片。在prism6(graphpad软件，rrid:scr_002798)中进行非参数曼-惠特尼u检验，以比较对照和mirna过表达之间的迁移。子宫内电穿孔子宫内电穿孔如先前所述进行(vanerp等，2015)。怀孕c57bl/6小鼠在e14.5时用异氟烷(诱导：3-4％，手术：1.5-2％)深度麻醉，注射0.05mg/kg盐酸丁丙诺芬(buprenorfinhydrochloride)盐水，然后在无菌手术条件下打开腹腔。将子宫角暴露，并使用玻璃微量移液器(哈佛仪器公司)和pli-100pico-注射器(哈佛仪器公司)将与0.05％fastgreen(西格玛公司)溶解于mq的1.7μldna混合物注射注入胚胎的侧脑室，所述dna混合物包含0.4μg/μlpcag-gfp，和15μmmir-135a和15μmmir-135b模拟物，或30pmol对照1模拟物，或0.6μg/μl乱序海绵载体，或0.3μg/μlmir-135a海绵载体和0.3μg/μlmir-135b海绵载体(h1-mcherry载体，tebu-bio)。对于挽救实验，将0.2μg/μlpcag-gfp与0.2μg/μlpcag-klf4和15μmmir-135a和15μmmir-135b模拟物组合。使用设置为30v(50ms脉冲长度间隔和950ms脉冲长度)的五个单极脉冲的ecm830电方形脉冲发生器(哈佛仪器公司)对大脑进行电穿孔。通过用铂金镊子电极(阴极)夹紧头部靶向运动皮质，而在头顶部放置第三个镀金的genepaddle(阳极，飞世尔公司)。将胚胎放回腹部，分别缝合腹部肌肉和皮肤。释放异氟烷唤醒母鼠。在e16.5收集胚胎，在p4或p10收集幼崽。将头部固定在pbs中的4％pfa中，并浸入30％蔗糖中。制备20μm厚的冠状冰冻切片，并如对离体电穿孔切片所述进行免疫组织化学和皮质迁移分析。为了测量体内神经突生长，使用imagej追踪顶突起长度。在内源性mir-135下调的情况中，使用h1-mcherry海绵载体(tebu-bio)电穿孔大脑，使用兔-抗-rfp(1:1000，罗克兰德公司，rrid:ab_11182807)染色后分析神经元迁移和顶突起长度。对照和mirna测试条件在子宫内胚胎之间始终平均分布。分析总是在切片上进行，其中胼胝体首先完成并且在1或2个连续切片中。来自至少2个单独实验的至少5个胚胎用于比较。视神经损伤和体内基因转染从slc公司(滨松公司(hamamatsu)，日本)获得3周龄的c57bl/6j小鼠。如先前详细描述的那样进行视神经损伤(vanerp等，2015)。在视盘后约1mm处用细镊子将左视神经挤压10秒钟。在损伤后即刻以及在轴切术后第7天，玻璃体内注射(用lipofectamine)50pmol/μlmir-135a和50pmol/μlmir-135b或100pmol/μl对照-1模拟物。如先前所述(vanerp等，2015)进行体内基因转染。简言之，将pcag-gfp或pcag-klf4与mirna模拟物和lipofectamine2000混合。在损伤后即刻以及轴切术后第7天，玻璃体内注射2μl复合物。各组使用9只小鼠。相似地，玻璃体内注射4ug特异性靶向mir-135a和mir-135b的海绵载体或对照海绵(tebu-bio)(用lipofectamine)。各组使用6只小鼠。在视觉神经挤压损伤前7天注射aav2病毒(aav-mir-gfp-空对照病毒，目录号am00102，gfpmmu-mir-135a-5paavmirna病毒，目录号amm1006802，gfpmmu-mir-135b-5paavmirna病毒，目录号amm1007002，abm)。为了显示rgc轴突，在受伤后12天用玻璃针将1μl与alexafluor555(2μg/μl，英杰公司)偶联的霍乱毒素β亚基注入玻璃体。轴切术后第14天，用4％pfa灌注动物。将附着神经节段的眼杯固定，并在4℃下浸入30％蔗糖中过夜。将组织包埋在tissuetek中，并使用低温恒温器制备连续横切片(16μm)，并收集在涂覆mas的载玻片上(松波公司(matsunami)，日本大阪)。通过对5个切片中从病变位点远端延伸0.2、0.5和1.0mm的ctb标记的纤维进行计数来定量轴突再生。在进行计数的点测量视神经的横截面宽度，并用于计算每毫米神经宽度的轴突数目。然后将这5个切片的每毫米轴突数量平均。∑ad是在半径为r的神经中延伸距离为d的轴突的总数，其通过将具有厚度t(16μm)的所有切片相加估算。∑ad＝πr2x[平均轴突/mm]/t。使用单向anova进行统计学分析。将p<0.05认为是具有显著性的。实验设计与统计学分析在这项研究中，使用雌性和雄性c57bl/6j小鼠，不论其性别如何。为了进行统计学分析，使用prism6软件(graphpad)。除了神经元迁移分析(非参数曼-惠特尼u检验)和q-pcr分析(单因素anova)外，通常使用非配对t检验以比较两组的均值。对于所有统计学检验，显著性设定为p<0.05。结果中提供了精确的p值、t值和自由度，并且在附图图例中提供了n。在这项研究开始时，对用包含1140种独特人mirna的慢病毒文库转导的视黄酸处理的sh-sy5y细胞(poell等，2011)进行自动化形态学细胞组学筛选，以鉴定(正向)影响神经元特征的mirna(图1a)。进行三重(intriplo)筛选，并用神经概况算法对形态学参数进行评分。为了确认最稳健的mirna的作用，在用mirna模拟物电穿孔的sh-sy5y细胞上重复细胞组学分析，用于选择命中。该实验在四重(inquadruplo)中进行三次(即，三次，四盖玻片，图1d)，并使用斯氏t检验进行了统计学分析。通过lna原位杂交和q-pcr实验测试不同年龄小鼠大脑中mir-135a和mir-135b的表达(各年龄至少3只不同小鼠的组织中(图2))。在培养的原代海马神经元中也确定了mir-135a和mir-135b的表达(图3a)。使用单因素anova对q-pcr实验进行统计学分析。然后，在原代神经元培养物中检查mir-135a和mir-135b过表达和下调的作用。基于lipofectamine的转染以三重重复至少3次(即，3次，3盖玻片)。mirna模拟物与gfp载体共转染，在海绵载体的情况下，使用imagej的neuronj插件利用内部rfp追踪神经突长度(图3b-f)。进行斯氏t检验以比较各组的均值与对照条件。为了评估mir-135a和mir-135b在神经元发育期间的内源性作用，将与gfp载体组合的mirna模拟物进行离体电穿孔，并随后进行了小鼠胚胎皮质的器官切片培养(e14，图4a)。将一名母亲的胚胎在这三种条件中分配以比较同窝仔，并重复进行三次实验。将来自3个不同母亲的至少6个胚胎的相似皮质切片用于比较。然后，在e14小鼠胚胎中进行子宫内电穿孔实验以体内过表达和下调mir-135a和mir-135b。为了进行胚胎分析，这三种条件都是根据子宫内存在的胚胎来分配以总能比较同窝仔。每个母亲在子宫内进行专门用于分离产后组织的电穿孔。为了分析电穿孔皮质神经元的迁移和神经突向生长，使用三个连续冷冻切片，其显示了胼胝体并获自源自至少3个不同母亲的至少9个幼崽。对于离体和子宫内电穿孔分析，我们进行了曼-惠特尼u检验以比较迁移细胞的分布。将它们在2-3个栅格(raster)中人工计数，与迁移方向完全垂直放置的各切片包含8个皮质“方格”，其中方格1的底部接触心室的边界(对于胚胎脑)或前连合的轴突(对于出生后的大脑)，并且方格8的顶部到达皮质表面(图4a)。然后，使用生物信息学工具mirecords鉴定mir-135a和mir-135b可能的mrna靶标(xiao等，2009)。选择klf4是基于其对神经突生长和神经元迁移报道的影响。选择klf43'-utr中mir-135a和mir-135b的最强预测结合位点，并将其用于在hek293细胞中进行3次荧光素酶试验，以确认直接靶标结合(图5a，b)。然后使用免疫组织化学评估klf4和mir-135a和b是否在相似的大脑区域表达(图5c)。然后，在mir-135a和mir-135b给予后，我们测试了n2a细胞中内源性klf4表达是否下调。为了确定mir-135-klf4信号转导的内源性作用，在原代海马神经元培养物中进行拯救实验和使用klf4cdna(对mirna调节不敏感)的子宫内电穿孔，使用与上述相同的实验步骤和重复次数。因为klf4是阻碍轴突再生最重要的信号之一，所以我们研究了mir-135a和mir-135b是否可用于以特定且细胞自主的方式降低不良再生的神经元中的klf4表达。我们首先玻璃体内注射了mirna模拟物(在第0天和第7天)，以了解这是否足以将mirna传递至视神经并下调klf4表达。第一次注射模拟物后14天，对各种条件的3个视神经进行q-pcr。然后，将模拟物与gfp载体和/或klf4cdna组合，以确定视神经损伤后14天的轴突再生。各种条件在9只小鼠中重复进行。q-pcr实验显示条件之间的转染效率没有差异。注射含有mir-135a，mir-135b或对照mirna的aav2病毒，以仅在视神经压迫前7天的6只小鼠中转导rgc，并评估经由模拟物注射所观察到的效应的细胞自主性。最后，我们通过在第0天和第7天于6只小鼠中注射海绵载体，确定mir-135a和mir-135b是否在视神经挤压后14天测量的视神经再生中具有内源性作用。轴突再生通过anova进行统计学检验，然后进行sidak事后检验结果mir组(mirnome)范围筛选调节神经突生长的mirna为了鉴定可促进神经突生长的mirna，在神经元sh-sy5y细胞(常用于细胞筛选的细胞系)中进行基于图像的mirna筛选。通过视黄酸处理诱导sh-sy5y细胞的神经元分化，然后转导包含1140种独特人mirna的慢病毒文库(poell等，2011)(图1a、b)。使用cellomicsarrayscan平台，分析了各种条件下成千上万个细胞的神经元形态学相关参数。这种多参数分析产生了基于参数如神经突长度和分支的累积命中评分。为了鉴定命中，将各单独mirna的评分与所有mirna的中值评分进行比较。该方法假定大多数mirna不影响神经元形态。该方法鉴定了13种经注释的mirna，它们对分化的sh-sy5y细胞的特定形态学特性(例如，神经突长度)具有显著影响。在这些mirna中，mir-135b的作用最大(图1c)。后续显示mirna-135a在该筛选中具有相似性，其在平板的一角并受到边缘孔伪像的影响。为了证实mir-135b的作用，用mir-135b模拟物电穿孔视黄酸处理的sh-sy5y细胞以模拟过表达。还包括mir-135b的近缘同源物mir-135a(表7)，因为它与mir-135b共有许多mrna靶标，并且因为我们怀疑由于技术问题(培养板中的边缘孔作用)在最初的筛选中未鉴定到mir-135a。还包括了mir-124(在筛选中鉴定的熟知的脑富集的mirna)(图1d)，以及两个对照mirna模拟物(都来自秀丽隐杆线虫(c.elegans)，并被证明不靶向特定哺乳动物mrna)(达马可公司，自行观测))。与筛选结果一致，mir-135b模拟物影响sh-sy5y细胞的总体形态(6.58±1.11相对1.24±0.50，t(188)＝4.64，p<0.0001(对照1)，或者相对1.67±0.52，t(188)＝4.19，p<0.0001(对照2)，单向anova，sidak事后检验，图1d，左图)。此外，mir-135b增强的神经突生长(3.53±0.69，t(189)＝4.46，p<0.0001相对0.55±0.28(对照1)，或相对0.90±0.35t(189)＝3.87，p＝0.0006(对照2)，单向anova，sidak事后检验；图1d，中间图)。总命中评分以及与神经突长度相关的命中评分似乎受到mir-135a的影响，但这些影响并未达到统计学显著性。相较于对照模拟物(0.14±0.12(对照1)，或0.15±0.11(对照2)；图1d，右图)，mir-135a(2.00±0.71，t(189)＝3.62，p＝0.0015相对对照1和t(189)＝3.54；p＝0.0020相对对照2)和mir-135b(1.53±0.36，t(189)＝3.11，p＝0.0085相对对照1和t(189)＝3.03，p＝0.011相对对照2，单向anova，sidak事后检验)模拟物显著增加了神经突分支。这些数据共同证实了mir-135b和mir-135a增加了神经突生长和复杂性。发育中的小鼠和海马体中mir-135a和mir-135b的表达mir-135a和mir-135b序列跨物种保守并在小鼠脑组织中检测(lagos-quintana等，2002；sempere等，2004；ziats和rennert，2014；caronia-brown等，2016)，但是对这些mirna在神经元中表达的精确时空模式和功能作用仍然知之甚少。我们通过定量pcr(qpcr)分析了发育中的(在e14，e16，p0和p10时，期间发生神经突生长和分支)和成年小鼠皮质和海马体中的mir-135a和mir-135b的表达。qpcr分析了胚胎和出生后皮质和海马体中检测的mir-135a和mr-135b。两种mirna的表达随着皮质发育的进展而下降，并在成年人中增加。相反，虽然海马体mir-135a的表达朝着p10时下降，并在成年人中增加，但mir-135b水平保持不变(图2a、c)。基于锁核酸(lna)的原位杂交通过揭示皮质(在e14，p10和成人时，图2b)和海马体(在e14，p0，p10和成人时，图2d)中mir-135a和mir-135b表达来支持这些结果。在海马体的齿状回(dg)和ca3锥体细胞层以及发育中的皮质的皮质板中观察到特定信号。此外，两种mirna在成年小鼠脑中大量表达(图2b、d)。因此，mir-135a和mir-135b在发育中的小鼠脑中显示出表达的特定时空模式。mir-135控制轴突生长和分支mir-135a和mir-135b显示出突出的海马体表达，因此，为了研究它们在神经元中的功能，将海马神经元解离，用mirna模拟物转染，并在体外培养第4天(div)分析轴突生长。首先，使用qpcr确认mir-135a和mir-135b在原代海马培养物中的内源表达(图3a)。在div4，经mir-135a(354.9±24.41μm)或mir-135b(392.8±15.24μm)模拟物转染的神经元中最长神经突(确认为轴突)显著长于对照(271.7±7.18μm，t(776)＝4.443(对照1相对mir-135a)，t(900)＝8.181(对照1相对mir-135b)，两者p<0.0001，未配对的t检验；图3b和c)。共转染mir-135a和mir-135b进一步增加轴突长度(428.7±14.97μm，相对对照-1t(1022)＝10.36，p<0.0001；相对mir-135at(590)＝2.628，p＝0.0088，未配对的t检验)。为了评估mir-135a和mir-135b的内源性作用，将旨在隔绝mir-135a和mir-135b的特异性mirna海绵共传染到海马神经元。相较于乱序对照海绵转染(340.1±18.09μm，t(211)＝3.053，p＝0.0026，未配对的t检验；图3d)，mirna可用性的降低导致轴突长度显著减少(270.1±13.63μm)。因为sh-sy5y细胞的初始筛选显示出对神经突生长和分支的影响，所以对经mir-135a、mir-135b和这两种模拟物的组合转染的原代海马神经元进行了sholl分析。两种mirna单独和其组合的过表达都会导致更远端区域中神经突分支明显增加(图3e)。有趣的是，mir-135a和mir-135b或单独的mir-135b的组合过表达还导致靠近细胞体区域的分支增加。这些数据表明原代神经突(的分支)数量增加和轴突分支增加(对照1相对mir-135a:t(12800)，范围为3.728-8.52，对照1相对mir-135b:t(13144)，范围为3.735-6.426；对照1相对mir-135ab:t(12164)，范围为3.84-7.496；对于所有p<0.001；未配对的t检验)。相较于对照(38.69±2.67，t(37)＝2.414，p＝0.021，未配对的t检验；图3f)，mir-135ab处理的神经元中具有sholl环的神经突的累积交点数量较高。这些实验共同显示mir-135(mir-135a和mir-135b)调节轴突生长和分支。皮质神经元迁移需要mir-135a和mir-135b在mir-135a和mir-135b迁移进入发育中的神经系统和延伸神经突时，mir-135a和mir-135b在海马体和皮质神经元中表达(图2)，并且操纵这些mirna会影响培养的海马体以及皮质神经元的神经元形态(图3；数据未显示)。为了下一步评估mir-135a和mir-135b在胚胎脑复杂环境中神经元中的作用，我们进行了离体和子宫内电穿孔(vanerp等，2015)。在e14.5使用mir-135a和mir-135b模拟物对小鼠皮质进行离体电穿孔，将脑切片并培养，并在div4进行分析。mir-135a或mir-135b模拟物的电穿孔诱导皮质神经元由脑室区(vz)到皮质板(cp)的迁移显著增加，例如相较于对照模拟条件，cp中较多数量的电穿孔gfp阳性神经元和中间区(iz)中较少数量的细胞(图4a，统计结果参见附图)。为了在体内确认这些作用，我们通过子宫内电穿孔将mirna模拟物或海绵传递至e14.5皮质，并分析了e16.5的迁移神经元。将mir-135a和mir-135b的模拟物组合在一起，以在短时间内引发重要的表型。与离体电穿孔数据一致，递送mir-135ab模拟物至皮质将增强向皮质表面的神经元迁移，并在更深层如svz中诱导伴随性消耗(图4b，统计结果请参见附图图例)。电穿孔mir-135a和mir-135b海绵具有小但是相反的作用，即延缓皮质神经元的迁移，这证实了皮质神经元迁移中mir-135a和mir-135b的内源性需求(图4c，统计结果参见附图图例)。作为体内神经突生长的测量，我们在子宫内电穿孔后对迁移神经元顶突起的长度进行了定量。虽然mir-135a和mir-135b模拟物诱导顶突起长度增加(30.65±1.09相对23.91±1.01，t(364)＝4.497，p<0.0001，未配对的t检验；图4b)，但是应用mir-135海绵后的顶突起较短(25.23±0.80相对33.78±1.28，t(325)＝5.712，p<0.0001，未配对的t检验；图4c)。为了评估体内mir-135过表达的长期影响，我们在p4(图4d)和p10(图4e)由e14.5子宫内电穿孔的胚胎分离了大脑。有趣的是，在p4时电穿孔mir-135a和mir-135b显著增强了神经元迁移，导致上皮质区域中较多数量的神经元(图4d，统计结果请参见附图图例)。在p10时，在用对照或mir135模拟物电穿孔的胚胎之间，上皮质层中细胞的分布仍然存在微小但显著的差异(图4e，统计结果请参见附图图例)。总之，这些数据表明，与其在培养的神经元中的作用一致，mir-135a和mir-135b在体内控制神经突长度和神经元迁移。mirna-135通过klf4控制轴突生长和神经元迁移mir-135(mir-135a和mir-135b两者)如何控制神经元的形态和迁移？基于神经元中的高序列相似性和类似的生物学效应，我们假设mirna-135(mirna-135a和mirna-135b)可能共有它们的许多mrna靶标。为了识别这些靶标，我们使用mirecords进行了靶标预测分析(xiao等，2009)。通过组合来自mirecords中至少6个数据库的数据，发现mir-135a和mir-135b的57个重叠靶标。已经证实这些靶标中的几种在神经突生长和神经元形态中起作用。然而，对于许多这些靶标(例如，ptk2，taf4)，已经报道敲减降低神经突生长或神经元迁移(数据未显示)。klf4作为神经元中klf4的敲减是特别令人感兴趣的，类似于mir-135的过表达，其增强轴突生长，顶突起长度和神经元迁移(moore等，2009；qin和zhang，2012)。此外，血管平滑肌和肝细胞癌细胞中最近的工作将mirna-135a连接klf4(lin等，2016；yao等，2016)。最后，klf4包含在我们初始筛选的列表中的几个mirna的预测结合位点(mir-124，mir-449，mir-488，mir-499；图1c)。klf4的3'-utr带有两个预测的mir-135结合位点(图5a)，并且为了确认klf4是mir-135真正的靶标，我们首先通过将psicheck2-klf43’-utr和mir-135a和mir-135b模拟物转染进入hek293细胞进行了双重荧光素酶报告物基因检测。当单独转染或当组合转染时，mir-135a和mir-135b模拟物显著降低了荧光素酶活性(图5b)。为了证实直接和特异性结合，将预测具有最强结合(根据www.microrna.org)的mirna-135结合位点突变(位点394；图5a)。该突变完全消除了mir-135介导的对荧光素酶活性的影响，表明位点394是klf4中的主要mir-135结合位点(klf4wtmir-135a相对klf4突变的mir-135a，t(4)＝4.715，p＝0.0092；klfwtmir-135b相对klf4突变的mir-135b，t(4)＝2.933，p＝0.0427；klf4wtmir-135ab相对klf4突变的mir-135ab，t(4)＝4.735，p＝0.0091，未配对的t检验)(图5b)。然后，我们对klf4进行了免疫组织化学，以评估mir-135和klf4是否在相同的脑区域中表达。确实，与我们对mir-135a和mir-135b的原位杂交数据一致，在e16.5和成年皮质的cp中以及发育中和成年海马体中的神经元中检测到了明显的klf4表达(图5c)。为了进一步验证mir-135与klf4之间的关系，通过western印迹在转染的neuro2a细胞中分析了内源性klf4蛋白水平。相较于对照模拟转染，用mir-135a和mir-135b模拟物转染后观察到klf4表达降低(mir-135ab相对对照1:0.378±0.032相对0.643±0.01，t(10)＝3.170，p＝0.010，未配对的t检验；图5d)。这些数据共同表明klf4是mir-135a和mir-135b的靶标。然后，我们评估了mir-135(mir-135a和mir-135b)对轴突生长和神经元迁移的影响是否需要klf4。在原代海马神经元中，共转染缺少3’-utr的klf4cdna(klf4δ3’-utr)，因此mir-135结合位点，通过转染mir-135模拟物显著降低轴突生长的增加(图5e，对照1相对对照1+klf4:271.1±7.178相对239.9+9.701，t(785)＝2.250，p＝0.025；对照1相对mir-135ab+klf4:271.1±7.178相对331.7±10.92，t(980)＝4.787，p<0.0001；mir-135ab+klf4相对mir-135ab:331.7±10.92相对428.7±14.97，t(794)＝5.139，p<0.0001，未配对的t检验)。图5f)。相似地，mir-135a和mir-135b过表达对皮质神经元迁移和顶突起长度的积极影响通过共电穿孔klf4δ3’-utr进行标准化(神经元迁移的统计数据参见附图图例，对于顶突起长度：mir-135ab:32.34±1.084，mir-135ab+klf4:20.42±0.79，t(240)＝8.851，p<0.0001。未配对的t检验。图5g)。这些实验共同表明mirna-135通过抑制klf4蛋白表达来增强轴突生长和神经元迁移。外源性mir-135的应用通过klf4促进视神经再生降低神经元klf4表达不仅促进了发育中的神经元中的轴突生长，而且还是cns损伤后促进再生性轴突生长的少数实验处理之一。缺乏klf4的敲除小鼠在视神经损伤后显示出视网膜神经节细胞(rgc)轴突再生显著增强(moore等，2009；qin等，2013)。klf4的这种影响需要经由janus激酶(jak)-信号传导物及转录激活因子3(stat3)途径(qin等,2013)的下游信号传导，但是仍不知晓该途径的上游调控机制。因为这些结果以及我们的数据显示mir-135模拟物可以通过降低klf4表达来促进轴突生长，我们接下来询问了应用mir-135模拟物是否可以促进cns中再生性轴突的生长。为了验证这一假设，我们使用了视神经挤压模型。sirna和mirna模拟物可以高效地靶向成人rgc，并且可以可靠地定量视神经再生(dickendesher等，2012；vanerp等，2015)。此外，klf4和mir-135均在成年小鼠rgc中表达，并且减少klf4表达将增强视神经再生(moore等，2009；qin等，2013)。首先，我们确认玻璃体内注射mir-135模拟物将会导致mir-135a和mir-135b水平升高(图6a，b)。虽然检测到mir-135的内源性表达，但是相较于注射乱序对照，玻璃体内注射模拟物显著增加了mir-135a和mir-135b表达(ctrl1相对mir-135a:t(4)＝2.462，p＝0.0348；ctrl1相对mir-135b:t(4)＝4.309，p＝0.0063，未配对的t检验)。与我们鉴定klf4为mir-135靶标的数据一致(图5)，在眼中注射mir-135模拟物导致klf4表达下降(ctrl1相对mir-135ab:t(3)＝2.901，p＝0.0312，未配对的t检验。图6c)。然后，我们评估了mir-135注射对视神经再生的作用。在给予乱序对照模拟物后，大多数ctb标记的rgc轴突在挤压部位突然停止，只有很少的纤维穿过病灶进入远端神经(图6d，e)。与此相反，mir-135模拟物诱导病变部位之外显著的再生(0.2mm，对照1+gfp相对mir-135ab+gfp:46.89±6.816相对208.4±35.11，t(96)＝7.374，p<0.0001。带sidak事后检验的单向anova)以及神经末梢更显著的芽生(图6d，e)。为了检查这种作用是否是由于mir-135降低klf4表达的能力所引起的，我们将玻璃体内注射mir-135模拟物与共转染表达gfp(pcag-gfp)或不被mir-135靶向的klf4cdna(pcag-klf4)的载体组合(vanerp等，2015)。过表达klf4不影响rgc轴突再生，但是在on1后将mir-135模拟物注射的再生促进作用部分地标准化(0.2mm，对照-1+gfp相对mir-135ab+klf4:46.89±6.816相对115.4±24.63，t(96)＝3.128，p＝0.028，带sidak事后检验的单向anova)(图6d、e)。重要的是klf4的这种作用不是由于其调节mir-135表达的能力，因为在给予mir-135ab+gfp和mir-135ab+klf4后视网膜中的mir-135a和mir-135b水平相似(图6f)。玻璃体内注射可将mirna模拟物靶向小鼠视网膜中不同的细胞类型。为确保mir-135a和mir-135b在rgc中对轴突再生具有积极的细胞自主作用，通过玻璃体内注射aav2(已知特异性靶向rgc的病毒血清型)诱导了两种mirna的过表达(图6a、g)(weitz等，2013)。.事实上，将mir-135靶向rgc诱导与下述模拟物注射后所观测到的水平相当的rgc轴突再生(0.2mm，aav2对照相对aav2-mir-135ab:53.76±10.62相对243.6±23.59，t(30)＝10.98，p<0.0001。带sidak事后检验的单向anova)(图6h)。最后，为了评估mir-135a和mir-135b在再生rgc轴突中潜在的内源性作用，玻璃体内注射旨在隔绝mir-135a和mir-135b的特定mirna海绵。相较于乱序对照海绵转染，mirna的可用性降低导致靠近损伤部位再生轴突的数量小幅度但是显著地减少(0.2mm，对照海绵相对mir-135a/b海绵:49.6±4.566相对28.46±7.593，t(18)＝3.589，p＝0.0063。带sidak事后检验的单向anova)(图6i)。总之，这些结果表明，mir-135的过表达部分通过降低klf4表达来促进cns轴突再生，而降低功能性mir-135的水平进一步降低了成年rgc的再生潜能。在胚胎发育过程中，轴突延伸很长一段距离以建立功能性连接。与之相反，成年哺乳动物中枢神经系统(cns)中的轴突再生受到限制，部分原因是轴突生长的固有能力降低。因此，深入了解轴突生长的内在控制可能会提供增强cns再生的新途径。在这里，我们进行了第一mir组(mirnome)范围内的功能性mirna筛选之一以鉴定对轴突生长具有稳健作用的微小rna(mirna)。高内涵物筛选将mirna-135(mir-135a和mir-135b)鉴定为雄性和雌性小鼠体内外轴突生长和皮质神经元迁移的有效刺激剂。有趣的是，mir-135的这两种发育作用都部分依赖于klf4(轴突生长和再生的内在抑制剂)的沉默。这些结果促使我们测试了损伤后mir-135对轴突再生的作用。我们的研究表明，视神经损伤(oni)后，在成年小鼠中玻璃体内应用mir-135部分通过抑制klf4来促进视网膜神经节细胞(rgc)轴突再生。与之相反，mir-135的消耗进一步减少了rgc轴突的再生总之，这些数据鉴定了mir-135和mir-135-klf-4途径的新型神经元作用，并突出了mirna作为增强cns轴突再生工具的潜力。实施例3：mir-135a在颞叶癫痫中的作用癫痫是影响全世界6500万人的一种慢性神经障碍，其是主要的社会经济负担(moshe等，2015)。其特征在于反复无故的发作，这是由于脑内的异常和同步神经元放电所引起的(chang和lowenstein,2003)。在一些情况中，癫痫由单个基因突变所导致，主要是编码离子通道的基因，但是大多数癫痫的原因尚不清楚。颞叶癫痫(tle)是癫痫的一个亚类，约占所有癫痫患者的三分之一(engel,2001)。它由几个亚组组成，其中以颞叶癫痫并合海马硬化(mtle-hs)是最严重的一种。mtle-hs具有典型的诊断，临床和病理特征(神经元丢失，神经胶质增生和轴突出芽)，并且已知对药理治疗最有抵抗力(wieser和epilepsy，2004)。对于许多患者而言，手术切除海马体是实现痉挛控制的唯一选择(semah等,1998)。tle的病理机制很大程度不清楚。抗惊厥和抗癫痫药用于治疗这些患者。但是不幸的是，这些方法只能减少发作的发生，而不能治疗潜在的病理生理。因此，迫切需要针对这种残疾状况开发新颖的治疗策略。研究界和临床实践日益意识到到开发疾病调修药物的需求(loscher等,2013)。mtle的病理机制很大程度上仍然不清楚。癫痫动物模型和人组织研究表明，癫痫发生涉及分子，细胞和神经元网络级联改变(rakhade和jensen,2009)。从转录组开始的方法表明，人mtle中(vangassen等,2008)以及tle的动物模型中癫痫发生期间(gorter等,2006；pitkanen和lukasiuk,2009；rakhade和jensen,2009)，基因表达的模式发生了显著地改变。这种失调作用影响了通常控制基于表达的整个基因调节网络，所述基因表达调节涉及炎症，神经胶质增生，突触结构和神经元功能的途径。对于这些机制是否发生改变或者如何发生改变的理解，不仅可以为tle的发病机理提供重要的新见解，而且还可以产生用于治疗的新靶点。在过去的几年中，微小rna(mirna)逐渐成为基因表达的重要转录后调节剂，其为大型基因组提供了全新水平的控制。mirna是小型非编码rna(长度为18-25个核苷酸)，其是由转录自基因组的较长rna前体通过一系列切割事件所产生的。mirna识别同源mrna中的部分互补靶序列，并通过使其mrna靶标不稳定或者通过抑制蛋白翻译来抑制蛋白表达(kosik，2006)。单个mirna可以有许多不同的靶标，它可以调节多个途径中的多个基因或多个途径中的单个基因(ebert和sharp，2012)。mir-128(大脑中表达的mirna)的缺失导致上千个转录本的上调，其中154个是mir-128的直接靶标，而25个来自胞外信号激酶调节的激酶1/2(erk1/2)网络(tan等，2013)。多重靶向的这种特性是有利的，因为它可以靶向基因并破坏多种途径，但是同时是不利的，因为基于mirna疗法可能会产生不良副作用(henshall等，2016)。总体而言，mirna可以控制细胞生理的不同方面，并被视为治疗的新型靶标(czech，2006)。mirna的失调与tle中观察到的多种病理机制有关(gorter等，2014；jimenez-mateos等，2012；jimenez-mateos和henshall，2013；kan等，2012)。小鼠中的研究表明，癫痫状态后的mir-134抑制将抑制自发性发作的发展(jimenez-mateos等，2012)，而mir-128的完全丧失将导致致命的癫痫(tan等，2013)。相似地，发现mir-324-5p抑制癫痫中的kv4.2表达(大脑中超极化a型电流的主要介导物，其是神经元兴奋性的重要调节剂)，并且拮抗mir-324具有抑制发作和保护神经的作用。(gross等，2016)。不仅研究了这些mirna的功能，还在各种癫痫动物模型中使用mirna抑制剂(称为安塔够妙(antagomir)：靶向mirna的反义寡核苷酸)和模拟物(安够妙(agomir))研究了更多mirna的功能(综述于(henshall等，2016))。已发现在功能上经过验证的这些mirna(14个中的12个)对脑电图(eeg)，发作或组织病理学水平具有有益作用。因此，mirna可以是用于治疗发作的灵活且广泛的靶标类别(henshall等，2016)。材料和方法rna分离和定量pcr使用了两个患者组(各组6名患者)mtle-hs(无海马硬化)，mtle+hs(有海马硬化)和6个死后对照。在nissl染色后选择代表所有海马区域的患者组织。通过在低温恒温器上切割25μm厚的切片收集了大约20mg的组织，并将其储存在-80℃。按照制造商的说明，使用mirneasy试剂盒(凯杰公司)分离总rna。使用nanodrop(赛默飞世尔科技公司)确定rna量，使用通用cdna合成试剂盒(exiqon公司)进行第一链cdna合成。使用micrornalnatmpcr引物组和sybrgreen主混合物(exiqon公司)，在quantstudio6flex实时pcr系统(应用生物系统公司)上进行定量pcr反应。所有样品均一式两份进行。使用quantstudio实时pcr软件v1.1确定ct值。通过标准化至5srrna来估计不同mirna的表达水平，并用单因素anova分析统计学显著性，并将p<0.05认为具有显著性。非放射性原位杂交如先前所述进行非放射性原位杂交(obernosterer等，2007)。来自各患者组中的三名患者(对照，mtle-hs和mtle+hs)的每名患者2-3个切片用于进行原位处理。简言之，将来自新鲜冷冻的人海马组织的16μm厚切片在载玻片上收集，并保存在-80℃直至使用。原位处理当天，将切片固定(4％pfa，室温下(rt)10分钟)，乙酰化(rt下10分钟)，并用蛋白酶k(5μg/ml，rt下5m)处理。在rt下进行预杂交1小时。用针对人mir-135a-5p的10nm的双dig(3'和5')标记的锁核酸(lna)探针(exiqon公司)或lna-dig乱序探针在50℃进行过夜杂交。在55℃下于0.2×ssc中洗涤切片1小时，然后用10％胎牛血清(fcs)b1缓冲液(0.1mtrisph7.5/0.15mnacl)于rt下封闭1小时。将切片与抗-异羟基洋地黄毒苷-apfab片段(1:2,500，罗氏诊断公司(rochediagnostics))在10％fcs的b1缓冲液中4℃孵育过夜。使用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(bcip)和硝基蓝四唑(nbt)底物(nbt/bcip储液，罗氏诊断公司)在b3中(0.1mtrisph9.5/0.1mnacl/50mmmgcl2)在rt下处理载玻片5-20h。通过在pbs中洗涤来停止染色，并使用vectashield(载体实验室公司(vectorlabs))安装载玻片。并未在用乱序探针杂交的切片中观察到染色。用明场(brightfiled)显微镜采集图像并在imagej上处理。fishfish使用了相似的方案，除了杂交在55℃进行且洗涤在60℃进行，以减少背景染色。封闭后，载玻片与抗-异羟基洋地黄毒苷-pod(1；500，罗氏诊断公司)和neun(1；400，密理博公司(millipore))或gfap(1；1000，dakocytomation公司)抗体在4℃过夜共孵育。在rt下使用tsatmcyanine3系统(在放大稀释液中1；50，帕金埃尔默公司(perkinelmer))10分钟放大信号。用pbs洗涤后，将载玻片与针对一抗具有特异性的二抗(alexafluor488，英杰公司)在rt下孵育1.5小时。细胞核用dapi染色(rt下10分钟)，并使用prolonggold(生命技术公司(lifetechnologies))固定载玻片。使用共聚焦激光扫描显微镜(lsm880，蔡司公司)获取图像。杏仁核内红藻氨酸小鼠癫痫状态(se)诱导，如先前研究进行eeg记录和分析(jimenez-mateos等，2012；mouri等，2008)。简言之，将遥测eeg发射器(数据系统国际公司(datasystemsinternational))植入小鼠。手术后两天，通过给予红藻氨酸(0.3ug，在0.2ulpbs中)诱导se40分钟。对照动物接受相同体积的pbs。显微注射后40分钟，小鼠接受静脉注射劳拉西泮(lorazepam)(6mg/kg)以停止se。注射后对小鼠进行eeg监测1小时，以确保所有发作活动减少。由se诱导后的第7天开始记录基线eeg。脑室内(i.c.v)注射对于安塔够妙，定向性地(streotractically)进行i.c.v注射。在14天后，se小鼠接受输注1.0nmol/2ul安塔够妙-135alna修饰的和3’-胆固醇修饰的寡核苷酸(exiqon公司)的pbs。对照接受相同体积的pbs。在此期间，小鼠连续进行eeg，并视频监控额外的2周。使用labchart8软件(adinstruments有限责任公司)进行eeg数据分析。用于该实验的安塔够妙购自丹麦的exiqona/s(产品号199900，批号182482–exiqon公司是qiuagen公司)，并且包含这样的寡核苷酸，其特征在于硫代磷酸酯主链连接，而非磷酸二酯主键连接，并且具有cacataggaataaaaagccat(seqidno：261)所表示的序列。用四乙二醇连接的胆固醇对安塔够妙进行了3'修饰。结果tle人和小鼠模型中的mir-135a表达增加使用微小rna阵列在人tle中观察到mir-135a表达增加(kan等，2012)。在通过定量pcr验证人tle组织中mir-135a的表达后，比较两个患者组(mtle+hs，mtle-hs)和对照的表达，在mtle-hs条件下观察到mir-135a水平显著降低，然而在mtle+hs条件下，mir-135a的表达增加(图7a)。通过原位杂交(ish)，检查了mir-135a的定位，并发现了mtle+hs条件下更强的信号(图7b)。为了确认细胞类型，进行了特异性定位荧光ish，并发现mir-135a主要与神经元标志物neun共定位(图8)。然后，我们检查了通过杏仁内显微注射谷氨酸受体激动剂红藻氨酸在tle的实验模型中诱导发作(癫痫状态)(mouri等，2008)是否会模拟人患者组织中发现的mir-135a水平升高。通过qpcr，在se诱导后2周观察到mir-135a水平显著增加，特别是在海马体的ca3和dg区(图9a)。相似地，在se后2周，通过ish在海马体锥形神经元的神经元胞体中以及皮质，丘脑和杏仁核区的神经元细胞中检测到mir-135a较强的信号，并且在24h时表达没有变化(图9b)。沉默mir-135a后减少自发性发作为了进一步理解mir-135a在tle中增加表达的体内作用并检查其是否有助于自发性发作的复发，我们通过安塔够妙将其靶向。se后2周后，给予靶向mir-135a的安塔够妙以降低mir-135a增加的水平。se诱导的小鼠在se后2周注射pbs或mir-135a的抗mir(脑室内)，并在注射后进行两周连续地eeg监测(图10b)。se后，基线记录，从第7天-第14天，治疗动物和对照动物的发作频率无显著的差异(p＝0·743)。在第14天mir-135a治疗后，治疗动物和对照动物的发作频率分布几乎完全分离，wilcoxon曼-惠特尼统计量为0·90，95％ci为0·65至0·97，这表明90％可能性的对照动物的发作频率比治疗动物高(p<0·001)。相较于注射的pbs，沉默mir-135a表达保护小鼠免于自发性癫痫发作。自发性癫痫发作的数量显著减少，发作期间花费的总时间减少，但发作的严重程度未见差异(图10c)。这些数据表明，mir-135a在se后2周增加表达，导致发作活性增加，并且可以通过mir-135a的体内消耗来挽救。将在注射了antimir的大脑中进行进一步的组织学分析以评估是否挽救了tle的病理学印迹(神经元丢失，神经胶质过多症，苔状纤维重排)。没有观察到抗-mir的脱靶作用，ant-135a特异性地靶向mir-135a，因为mir-124的水平在1nmol不变(图10a)。总结在该研究中，我们发现杏仁核内红藻氨酸小鼠中mir-135a水平升高(se后2周)，并且使用安塔够妙沉默mir-135a表达保护小鼠免于自发性癫痫发作。这是首次发现，在癫痫发生后已经建立的癫痫中沉默mir-135a可以显著降低自发性发作的复发。为了鉴定介导tle中mir-135a功能的新靶标，我们使用生物素标签标记的mirna模拟物进行了免疫沉淀，并发现了多个有趣的靶标(数据未显示)，例如mef2，作为潜在的靶标。mef2蛋白是介导活性依赖性突触发育的转录因子家族。mef蛋白通过神经营养蛋白刺激以及因突触处神经递质释放增加而导致的钙流激活(flavell等，2008)。mef2负调节兴奋性突触(flavell等，2006)，并且mtle中mef2的丢失可能导致异常棘形成，并导致癫痫中观察到的异常放电模式和细胞死亡。表1-筛选中鉴定或所述的mirna的前体序列mirna前体序列(5'-3'方向)的列表。所有序列均获自mirbase(公开21：2014年6月；www.mirbase.org)，并检查与sirocco的一致性。如果出现差异，使用sirocco数据.表2-筛选中鉴定或所述的典型mirna的成熟序列和模拟序列成熟mirna序列(5'-3'方向)的列表。所有序列均获自mirbase(公开21：2014年6月；www.mirbase.org)，并检查与sirocco的一致性。如果出现差异，使用sirocco数据.表3-筛选中鉴定mirna的dna序列表4-典型mirna的种子序列mirna种子序列(5'-3'方向)的列表。种子序列定义为由mirna前体发夹加工而成的成熟mirna序列的核苷酸2-8(5'至3'方向)。所有序列名称均获自mirbase(公开21：2014年6月；www.mirbase.org)。该表格中包括了表2中所列成熟mirna的种子序列。表5-在筛选中鉴定(请参见表1)或在本申请中所述mirna的isomir和种子序列。这些isomir序列源自小型rna高通量深度测序分析，并且是在将87个人组织样品的数据合并后获得的表6-安塔够妙的序列(抗-mirna，5'至3'方向)，基于成熟mirna序列和基于获自mirbase(公开21：2014年6月；www.mirbase.org)或获自sirocco的mirnaisomir序列(5'至3'方向)。如果出现差异，使用sirocco数据.序列后括号内的数字指代相应seqidno。表7-mirna-135(mirna-135a和mirna-135b)的序列和基因组位置。mirna-135a和mirna-135b成熟序列仅相差一个核苷酸(带下划线)，其位于种子区域之外(粗体)。序列后括号内的数字指代相应seqidno。chr1:205448302-205448398mir-135a-1chr3:52294219-52294308mir-135a-2chr12:97563812-97563911实施例4：mirna-135a降低mef2a表达方法：动物：c57bl6j小鼠(雄性和雌性)获自查尔斯河实验室公司(charlesriverslaboratories)。靶标验证：western印迹和荧光素酶试验根据atcc提供的指导，培养hek293(rrid：cvcl_0045)和n2a(rrid：cvcl_0470)细胞。在hek293细胞中进行荧光素酶试验，在n2a细胞中通过western印迹进行靶标验证。对于荧光素酶试验，在rnaseq数据中鉴定mef2a3'utr上存在的mir-135a的mirna识别元件(mre)，并由targetscan预测。将具有这些位点的寡核苷酸克隆到psi-check2载体(普洛麦格公司)中。将在mef2a3’utr上具有wt(mef2a-135a-fw：tcgagagcagaaccttggaaaaaaaaagccatggc(seqidno:351)，rv-ggccgccatggctttttttttccaaggttctgctc(seqidno:352))和mut(mef2a-135am-fw：tcgagagcagaaccttggaaaaaaaaaggcttggc(seqidno:353)；rv-ggccgccaagcctttttttttccaaggttctgctc(seqidno:354))mir-135a结合位点的寡核苷酸磷酸化，退火并连接到多克隆位点的noti和xhoi位点之中。使用lipofectamine2000(英杰公司)与250ng报告物构建体以及25pmolmiridianmirna模拟物或乱序对照(nc-1，达马可公司)转染细胞(8x104)。24小时后收获细胞，并在光度计上使用双荧光素酶试验系统(e1960，普洛麦格公司)进行荧光素酶试验。针对海肾荧光素酶活性的标准化用于确定相对荧光素酶活性。对于蛋白质分析，进行western印迹。使用lipofectamine2000用mir-135a或乱序对照的miridian模拟物转染n2a细胞。48小时后，收获细胞并在ripa缓冲液(0mmtrisph.7.5，150mmnacl，0.5％np-40，0.5％nadoc，1％triton，蛋白酶抑制剂(罗氏公司)于milliq(mq)中)中裂解。将等量蛋白质样品在sds-page凝胶上分离(8％)，并转移到硝酸纤维素印迹膜(ge健康生命科学公司(gehealthcarelifesciences))上，然后在rt下将印迹在1xtbs-吐温中的5％奶粉中封闭1小时。将印迹与下述物质在4℃下孵育过夜：兔-抗nr3c1(gr)(1；1000，圣克鲁兹生物技术公司，rrid：ab_2155786)，兔-抗-plxna4(1；250，阿柏堪穆公司，rrid：ab_944890)，小鼠-抗-β-肌动蛋白(1；2000，西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，rrid：ab_476743)。印迹用过氧化物酶偶联的二抗在rt下染色1小时，并通过用pierceecl底物(塞默飞世尔科学公司)孵育印迹来检测信号。使用fluorchemm成像系统(proteinsimple公司)获取图像。使用imagej，测量各样品单个条带强度并标准化至相应的β-肌动蛋白水平。通过t检验估计各蛋白质的条件之间的相对表达(graphpadprism版本6软件，rrid：scr_002798)。除了mef2a，将印迹在supermix封闭溶液(tris50mm，nacl154mm，0.25％明胶，0,5％曲通-x-100于mq中，ph-7.4)中于rt下封闭10分钟，并在4℃下与兔-抗-mef2a(1；50,000，阿柏堪穆公司公司，rrid：ab_10862656)和小鼠-抗-β肌动蛋白(1；2000，西格玛奥德里奇公司，rrid：ab_476743)孵育过夜。将印迹在1xtbs-吐温中洗涤，并与偶联了ir染料的二抗(抗-兔-irdye8001；5000可抗-小鼠-irdye7001；2000于1xtbs-吐温中)在rt下孵育1小时。最终，在1xtbs-吐温中洗涤印迹，并使用li-corimagestudiov3.1软件(rrid：scr_015795)在odysseyclx成像系统(li-cor生物科学公司，westburg)上扫描，并且测量条带强度，并通过t检验估计条件之间的相对表达(graphpadprism版本6软件，rrid：scr_002798)。原代小鼠海马神经元的培养和转染培养解离的海马神经元。简言之，将c57bl6j(p0-1)小鼠幼仔断头，并在冰冷解剖培养基(leibovitz的l-15，补充有7mmhepes(热科学公司(thermoscientific))中迅速分离大脑。分离海马体，在0.25％胰蛋白酶的l15-hepes培养基中于37℃胰蛋白酶化20分钟，然后使用火焰磨光的巴斯德吸管在生长培养基中(神经基础培养基，补充有b27，青霉素/链霉素l-谷氨酰胺和β-巯基乙醇)研磨。将解离的细胞接种到生长培养基中涂覆有pdl(20μgml-1)和层粘连蛋白(40μgml-1)的玻璃盖玻片上，并在37℃以5％co2孵育。每周两次更新一半的生长培养基。体外培养(div)第14天，用0.5μg的前-mir-135a1(克隆到具有cmv启动子的pjebb载体，包含gfp报告物)或仅pjebb载体转染神经元。为了进行拯救实验，将pjebb-前-mir-135a1和组成型活性突变体mef2-vp16(fiore等，2009)共转染。在div16，将转染的神经元用4％pfa和4％蔗糖的pbs固定20分钟。通过将神经元在封闭缓冲液(4％ngs,0.1％bsa,0.1％曲通-x-100in1xpbs(ph-7.4))中以rt封闭1小时来进行免疫细胞化学反应，然后与封闭液中稀释的一抗鸡-抗-gfp(1；1000，阿柏堪穆公司，rrid:ab_300798)孵育。第二天，在1×pbs中洗涤，然后与封闭缓冲液中的适当二抗在rt下孵育1小时。使用prolonggold(塞默飞世尔科学公司)固定切片。使用共聚焦激光扫描显微镜的油浸式63倍物镜(lsm880，蔡司公司)获取高分辨率图像。捕获靠近胞体各顶端树突的6-7z堆栈图像。使用带有细胞计数器插件的imagej软件(rrid:scr_003070)，将不同类型的棘从未成熟到成熟归类为：对次级树突上的丝足(filopodium)，细，短茎，蘑菇和杯状进行鉴定并计数。通过将分支上的棘数量除以分支的长度来确定棘密度。rna分离和定量pcr使用来自患有mtle+hs(伴有海马硬化)的7名患者的样本以及8个验尸后对照样本(有关患者的详细信息，参见表8)。使用nissl染色，选择代表所有海马区域的患者组织。通过在低温恒温器上切割25μm厚的切片，收集大约20mg的组织。对于杏仁核内红藻氨酸(iak)小鼠，解剖海马体，冷冻并储存在-80℃。按照制造商的说明，使用mirneasy试剂盒(凯杰公司)分离总rna。使用nanodrop(赛默飞世尔科技公司)测定rna量。对于mirna定量pcr(qpcr)，根据制造商的建议，使用通用cdna合成试剂盒(exiqon公司)进行第一链cdna合成。使用micrornalnatmpcr引物组(mir-135a，mir-124)和sybrgreen主混合物(exiqon公司)，在quantstudio6flex实时pcr系统(应用生物系统公司)中运行qpcr反应。对于前-mirnaqpcr，使用primer3软件设计了引物序列(前-mir-135a1和a2)。表11中提供了各靶标的引物序列。使用superscriptiii第一链合成试剂盒(赛默飞世尔科技公司)逆转录100ngrna。相似地，为了验证生物ip靶标，如上所述逆转录等量的输入和iprna。表11中提供了各靶标的引物序列。使用快速启动通用sybrgreen主混合物(罗氏公司)，在quantstudio6flex实时pcr系统(应用生物系统公司)上运行qpcr反应。所有样品均一式两份进行。使用quantstudio实时pcr软件v1.1确定ct值。对于mirna，通过标准化至5srrna来评估表达水平。将前-mir标准化至gapdh(人)和β-肌动蛋白(小鼠)。对于bio-ip，标准化至输入δct后，估计ip样品中靶基因的倍数富集。计算δct和倍数变化，并通过曼-惠特尼u检验和斯氏t检验分析统计显著性。将p<0.05认为是具有显著性的。非放射性原位杂交如先前所述进行非放射性原位杂交(obernosterer等，2007)。将来自各组(对照和mtle+hs)的3名患者用于原位杂交。相似地，对于iak小鼠切片，每组使用3只小鼠。简言之，将来自新鲜冷冻的海马组织的16μm厚切片在载玻片上收集，并保存在-80℃直至使用。将切片固定(4％pfa，rt下10分钟)，乙酰化(rt下10分钟)，并用蛋白酶k(5μg/ml，rt下5分钟)处理。在rt下进行预杂交1小时。用针对人mir-135a-5p的10nm的双dig(3'和5')标记的锁核酸(lna)探针(exiqon公司)或lna-dig乱序探针在50℃进行过夜杂交。在55℃下于0.2×ssc中洗涤切片1小时，然后用10％胎牛血清(fcs)b1缓冲液(0.1mtrisph7.5/0.15mnacl)于rt下封闭1小时。将切片与抗-异羟基洋地黄毒苷-apfab片段(1:2,500，罗氏诊断公司)在10％fcs的b1缓冲液中4℃孵育过夜。使用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(bcip)和硝基蓝四唑(nbt)底物(nbt/bcip储液，罗氏诊断公司)在b3中(0.1mtrisph9.5/0.1mnacl/50mmmgcl2)在rt下处理载玻片5-20h。通过在pbs中洗涤来停止染色，并使用vectashield(载体实验室公司)固定载玻片。并未在用乱序探针杂交的切片中观察到染色。用明场显微镜采集图像并使用imagej处理。fish使用了相似的方案，除了杂交在55℃进行且洗涤在60℃进行。封闭后，载玻片与抗-异羟基洋地黄毒苷-pod(1；500，罗氏诊断公司)和小鼠-抗-neun(1；400，密理博公司，rrid:ab_2298772)或兔-抗-gfap(1；1000，dakocytomation公司，rrid:ab_10013482)抗体在4℃过夜共孵育。在rt下使用tsatmcyanine3系统(在放大稀释液中1；50，帕金埃尔默公司)10分钟放大信号。用pbs洗涤后，将载玻片与针对一抗的二抗(alexafluor488，英杰公司)在rt下孵育1.5小时。细胞核用dapi染色(rt下10分钟)，并使用prolonggold(生命技术公司)固定载玻片。使用共聚焦激光扫描显微镜(lsm880，蔡司公司)获取图像。使用生物素化的miridian模拟物进行rna免疫沉淀在补充了l-谷氨酰胺，青霉素/链霉素(分别为100u/ml和100mg/ml)和10％fcs(英杰公司)的达氏改良伊氏培养基(dmem)低葡萄糖中于37℃以5％co2培养n2a细胞。对于各种条件(mir-135a，乱序且无转染)，将具有2x106个细胞/培养皿的10cm培养皿铺板，并使用highperfect转染试剂(凯杰公司)用37.5nm的3'生物素化的mirna模拟物(mir-135a和乱序：达马可公司)转染。如先前所述(wani和cloonan，2014)并进行一些修改，进行rna免疫沉淀。简言之，转染后24小时，收集细胞并在裂解缓冲液(10mmtris-clph7.5，10mmkcl，1.5mmmgcl2，5mmdtt，0.5％np-40，60u/mlsuperase-inrna酶抑制剂(英杰公司)，蛋白酶抑制剂片剂(罗氏公司)的mq)中裂解，并将澄清的细胞裂解物与dynabeadsm-280链霉亲和素珠(英杰公司)在rt下孵育30分钟。将珠在洗涤缓冲液(裂解缓冲液含有1mnacl)中洗涤三次，并于-80℃存储在qiazol中。使用mirneasy试剂盒(凯杰公司)提取总rna。将珠的部分与4xnu-page样品缓冲液(含10％β巯基乙醇的mq)于70℃孵育10分钟以提取结合的蛋白质。然后在8％sds-page凝胶上分离蛋白质，随后将蛋白质转移印迹与兔-抗-ago2抗体(1；1000，细胞信号转导公司(cell-signalling)，rrid：ab_2096291)和小鼠-抗-β肌动蛋白(1；2000，西格玛奥德里奇公司，rrid：ab_476743)在封闭溶液(5％乳的1xtbs-t)中以4℃孵育过夜，最后如上所述检测信号。文库制备和总rna测序对于输入样品，使用truseq链式总rna(w/ribozerogold)样品制备试剂盒(亿明达公司(illumina))制备用于总rna测序的文库。使用ribo-zerogold(去除胞质和线粒体rrna)基于磁珠的捕获探针系统(亿明达公司)，消耗rrna的总rna的起始材料(100ng)。随后将剩余的rna，包括mrna，lincrna和其他rna物质纯化(rnacleanxp)，并进行酶促片段化。对于ip样品，根据制造商的说明并进行一些修改，使用truseq链式mrna样品制备试剂盒(亿明达公司)制备了文库：文库合成前，总rna的起始原料(37.5–50.0ng)未经mrna富集或片段化。进行第一链合成和第二链合成，并纯化双链cdna(agencourtampurexp，贝克曼库尔特公司(beckmancoulter))。cdna经末端修复，将3'腺苷酸化和illumina测序衔接子连接到片段末端，并纯化文库(agencourtampurexp)。将多聚a+rna链文库通过pcr进行预扩增并纯化(agencourtampurexp)。使用2100生物分析仪(高灵敏度dna芯片，安捷伦公司(agilent))验证了文库大小分布并检查质量。使用qubit荧光计(生命技术公司)对高质量的文库进行定量。根据制造商的说明(亿明达公司)，使用nextseq500仪器进行单端测序。读数映射和差异性表达分析使用fastq-mcf(0.0.13版)修剪低质量碱基和衔接体序列后，将处理的读段映射到具有tophat2(2.0.13版)的grcm38.p6参照小鼠基因组(ensembl)(kim等，2013)。选择“fr-secondstrand”选项，用于总rna测序数据的比对。使用python脚本htseq-count汇总各基因的映射计数(anders等，2015)。对于差异性表达分析，使用bioconductor程序包edger版本3.12.1(robinson等，2010)以正常化方法的m-值修整均值(tmm)(robinson和oshlack，2010)，针对r中的差异性表达分析基因和转录本的计数数据。通过包括一系列测序回合，针对批处理效应校正基因表达水平。使用benjamini-hochberg错误发现率(fdr)计算多次测试的调整p值，并且仅将fdr<0.05的基因视为显著差异性表达的。使用ggplot2文库在r中进行数据可视化。在r中使用bioconductorpheatmap程序包创建具有表达概况分层聚类的基因表达热图。使用r程序包goseq(young等，2010)进行了富集分析，以纠正由于转录本长度引起的偏差。mirna结合位点的计算机预测将miranda软件3.3a版本用于预测microrna特征。该研究使用下述参数：最小阈值评分的匹配150；具有最小折叠自由能阈值-7kcal/mol的靶mrna双链体；缺口开放罚分-8；缺口延伸罚分-2；互补核苷酸匹配评分的缩放参数4。mef2a的免疫组织化学和western印迹在切除的人海马切片和2周龄iak小鼠组织上进行mef2a免疫染色。将16μm切片在10％ngs，0.4％曲通的1xpbs(ph7.4)中以rt封闭1个小时，然后在抗-mef2a抗体(1；150，阿柏堪穆公司公司)和抗-neun抗体(1；400，密理博公司)的封闭溶液中4℃过夜孵育。洗涤切片，并与相应的alexa-fluor偶联的(赛默飞世尔科技公司)二抗以rt孵育1.5小时，然后在1xpbs中洗涤，并用dapi(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)对细胞核进行染色，并使用prolonggold(赛默飞世尔科技公司)固定。使用共聚焦显微镜(lsm880，蔡司公司)获取高分辨率图像，并使用imagej对其进行处理。用于分析人tle和iak小鼠海马组织中的mef2a蛋白水平。在ripa缓冲液中制备蛋白质裂解物，并在sds-page凝胶上分离等量的蛋白质(小鼠样品为8％凝胶，人样品为10％凝胶)，并转移至硝酸纤维素膜上，封闭并与兔-抗-mef2a(对人为1；20,000，对小鼠为1；50,000，阿柏堪穆公司，rrid：ab_10862656)和小鼠-抗-β肌动蛋白(1；2000，西格玛奥德里奇公司，rrid：ab_476743)于4℃过夜孵育。对印迹进行染色，显影并定量，如上所述。杏仁内红藻氨酸小鼠癫痫状态(se)诱导，如先前所述进行eeg记录和分析(jimenez-mateos等，2012)(mouri等，2008)。简言之，将遥测eeg发射器(数据系统国际公司)植入小鼠。手术后两天，通过给予红藻氨酸(0.3ug，在0.2ulpbs中)诱导se40分钟。对照动物接受相同体积的乱序模拟物或pbs。显微注射后40分钟，小鼠接受静脉注射劳拉西泮(lorazepam)(6mg/kg)以停止se。注射后对小鼠进行eeg监测1小时，以确保所有发作活动减少。脑室内注射对于安塔够秒，如所述进行脑室内(i.c.v)注射(jimenez-mateos等，2012)(mouri等，2008)。由se诱导后的第7天开始记录基线eeg。在第14天(d14)，小鼠接受输注1.0nmol/2ul安塔够妙-135alna修饰的和3’-胆固醇修饰的寡核苷酸(exiqon公司)的pbs。对照接受相同体积的pbs。在此期间，小鼠连续进行eeg，并视频监控额外的2周。使用labchart8软件(adinstruments有限责任公司)进行eeg数据分析。统计学分析使用graphpadprism进行统计学分析，将p值<0.05认为具有显著性。使用配对的t检验分析ant-135a之前(基线)和之后的发作频率，使用f统计混合设计重复测量普通线性模型的每日发作数量。使用t检验分析发作持续时间和发作消耗的总时间。两组之间的差异使用双尾斯氏t检验或曼惠特尼检验进行检验。为了比较两个以上的组，使用了单向anova。表8-对照和mtle患者组详细信息。tle患者使用药物的详细信息。ltg拉莫三嗪(lamotrigine)，pht苯妥英(phenytoin)，cbz卡巴咪嗪(carbamazepine)，lev左乙拉西坦(levetiracetam)，oxc奥卡西平(oxcarbazepine)，clo氧异安定(clobazam)，dzp安定(diazepam)，lzp劳拉西泮(lorazepam)，ser思瑞康(seroquel)，pgb普瑞加巴林(pregabaline)，res羟基安定(restoril)。结果人和实验性tle中的mir-135a表达增加为了开始表征mir-135a在tle的病理生理中潜在的作用，我们在人tle海马体(mtle+hs)和对照中评估了mir-135a表达。相较于对照，mtle海马中mir-135a表达水平增加(图11a)。为了验证mir-135a在人海马组织中的空间分布，我们进行了原位杂交(ish)。与qpcr数据一致，相较于对照，在mtle+hs海马体中观察到mir-135a更强的信号。信号主要局限于ca和dg区的神经元(图11b)。为了证实这种细胞类型特异性定位，将荧光ish(fish)与针对neun(神经元)或gfap(星形胶质细胞)的免疫组织化学结合进行。mir-135a与neun特异地共定位，但不与gfap共定位(图11c)。然后，我们检查了通过杏仁内显微注射谷氨酸受体激动剂红藻氨酸在tle的实验模型中诱导发作(癫痫状态，se)(mouri等，2008)是否也会导致mir-135a的水平升高。事实上，我们在se后第14天(d14)通过qpcr和/或ish观察到mir-135a表达强烈增加(图12a，12b)。ish揭示了在d14时海马体中锥体神经元胞体中以及皮质、丘脑和杏仁核中mir-135a的强烈信号(图12b)。类似于我们在人mtle海马体中的观察，mir-135a主要位于神经元而不是星形胶质细胞中(图12c)。mir-135a的成熟形式mir-135a-5p由人和小鼠的两个不同的转录本中剪接而来，它们来自染色体上的不同基因座(表9)。为了检查特定基因座是否导致tle中mir-135a表达增加，在人和小鼠中研究了前-mir水平。人tle中前-mir-135a2显著增加(图12d)，然而在小鼠中，前-mir-135a1和前-mir-135a2均显著增加(图12e)。总之，我们发现mir-135a在tle中表达增加，并且增加的mirna主要定位于神经元细胞。表9-人和小鼠中mir-135a的基因组位置和序列。成熟的mir-135a-5p由小鼠和人的两个前序列剪接而来。序列mir-135a-5p:uauggcuuuuuauuccuauguga(seqidno:5)沉默mir-135a拯救小鼠免于自发性反复性发作我们的数据表明，在检测到复发性自发性发作时，mir-135a水平高。为了将mir-135a表达增加与自发性发作联系起来，该mirna被安塔够妙(在这种情况下，锁核酸(lna)3'胆固醇偶联的寡核苷酸(exiqon公司))靶向。几项研究已经表明，在癫痫状态之前(jimenez-mateos等，2012)(gross等，2016)或se后立即(reschke等，2017)给予安塔够妙可以有效减少自发性发作。然而，尚不知道自发性复发性发作阶段给予安塔够妙是否可以影响发作传播。以不同的浓度给予(脑室内，icv)安塔够妙，以测试其对mir-135a的特异性作用。注射后24小时，mir-135a水平在1.0nmol安塔够妙时显著降低，然而另一个无关mirnamir-124的表达不受影响。注射1.5nmol对mir124表达有很小但不显著的影响(数据未显示)。根据这些数据，我们决定在后续实验中使用1.0nmol的注射剂。然而，安塔够妙或对照注射后，首先用ish来检测内源性mir-135a和ant-mir-135a。该分析表明，ant-mir-135a主要被ca和dg区的海马神经元细胞摄取(图13a)。为了评估阻断mir-135对自发性发作的影响，在d14为se诱导的小鼠注射mir-135a的安塔够妙或对照，并在注射后通过eeg连续监测6天(图13b)。注射前一周(se后d7-d14)，进行基线eeg记录，并且在治疗和对照动物之间未观察到发作频率有显著差异(图13c-13d)。我们在一项独立实验中证实，注射pbs或改良的乱序(与安塔够妙相同)在se后产生了类似的发作模式(数据未显示)。在d14注射抗-mir-135a后，检测到每天发作数量显著地减少(图13c)。相较于对照小鼠，在ant-mir-135a中观测到发作计数显著的不同和强烈减少(图13d(n＝5对照和ant-mir-135a注射；混合设计重复测量普通线性模型；f统计-5.834(f(20,60)＝1.75对于α＝0.05)；p<0.001))。ant-135a注射之前，各组之间的平均发作持续时间无区别(p＝0.4721)，然而在注射后显著降低(p＝0.0006，斯氏t检验)(图13e)。相似地，ant-mir-135a注射后，发作所花费的时间总量在最初的6天降低(p＝0.0021，斯氏t检验)(图13f)。平均而言，相较于对照注射的小鼠(>300秒)，注射ant-135a的小鼠每天发作花费的时间更少(<300秒)(图13h)。这些数据共同显示，在反复性自发性发作期间阻断mir-135a升高表达具有急性和发作抑制作用。mir-135a靶标的鉴定mir-135a可通过控制klf4表达来影响轴突的生长和再生。然而，ant-mir-135a注射对体内发作活性的急性性质暗示了干扰调节神经元活性的细胞过程，如细胞内信号传导，突触传递或突触形态。mirna通过结合特异性序列起作用，已知所述特异性序列为靶标转录本3'非翻译区(utr)的mirna识别元件(mer)。结合后，mirna抑制翻译或诱导靶rna降解。存在预测工具，其根据源自实验的少量实验规则来预测目标(brennecke等，2005)(lewis等，2005)，但是由于高假阳性率，这些计算机预测工具中有许多在实验验证中表现不佳(krek等，2005)。为了鉴定与mir-135a物理相互作用的靶标，我们使用生物素标签标记的模拟物在神经元小鼠neuro2a细胞中进行了mirna免疫沉淀。mir-135a和乱序模拟物在其3'端用生物素分子标签标记(图14a，14b)，因为据报道3'分子标记不干扰种子识别和mirna结合(wani和cloonan，2014)。虽然将先前报道的方案用于bio-mirip(wani和cloonan，2014)，但我们在mir-135和乱序模拟物后通过对ago2(risc复合物的主要成分)进行免疫印迹确认了ip过程。在输入和ip样品中均检测到ago2，然而仅在输入样品中检测到细胞骨架蛋白β肌动蛋白(图14c)。ago2的存在确认生物mirna模拟物已被risc复合物免疫沉淀，并可能与rna靶标结合。scr对照的序列基于秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)微小rna，与人、小鼠和大鼠的序列相同性最小。scrip样品中ago2的存在很可能可以通过这样的事实解释，即argonaute蛋白在物种之间非常保守(和meister，2008)。ip后，进行总rna测序。对于输入样品，获得平均5850万个高质量读数，对于ip样品获得4870万个高质量读数。对于输入样品，这些读数中的大多数可以与小鼠参考基因组对齐，但是对于ip样本，39.7％的读数可以与参考基因组对齐。由于未进行多聚a+富集或核糖体rna消耗，因此大部分对齐的序列源自核糖体rna。对于各样品，使用sailfish生成了基因水平读数计数和kpkm值(k-mer/每百万读数的外显子千碱基)(patro等，2014)。输入样品的分析显示，只有很少显著变化的转录本，包括经验证的mir-135a靶标，如complexins(cplx1和cplx2)(hu等，2014)。在ip样品中，587个转录本的水平发生了显著变化(使用fdr<0.05和p<0.01的截止值)(图14d)。这些观察结果得到主成分分析(pca)的支持，其显示了ip样本(scr相对mir-135aip)基因表达概况清晰的分离，而输入没有清晰的分离(图14e、f)。此外，ip样品包含许多先前报道的mir-135a靶标，如转移抑制蛋白(mtss)1(zhou等，2012)，周期蛋白依赖性激酶(cdk)4(dang等，2014)，多功能蛋白聚糖(proteoglycanversica，vcan)(zhao等，2017)，锌指蛋白(zfp)217(xiang等，2017)。基因本体(go)分析证明，ip样品中发现的差异性表达的转录本与神经元相关的功能有关，如脑信号蛋白(semaphorin)-神经丛蛋白(plexin)信号转导，脑信号蛋白受体活性，离子转运和camp反应元件结合(图15a-c)。作为鉴定与体内ant-mir-135a处理观测效果相关的mir-135a靶标的第一步，我们使用miranda软件由具有预测mir-135amre的ip样品中选择了转录本。发现mre不仅存在于3'utr(258)中，而且还存在于578个转录本的编码序列(cds)(279)和5'utr(33)中。177个推定靶标没有预测的靶位点(图15d)。mir-135a和mir-135b非常相似，并且具有相同的种子区，所以在原则上，这些mirna应该靶向一组相似的mrna。比较mir-135a和mir-135b的ip样品中的靶标(未显示)发现50％的重叠，而25.8％的靶标对于mir-135a是唯一的，而对于mir-135b为23.8％(图15e)。使用上文概述的方法，我们鉴定了mir-135a的几个新靶标，并且报道了其在调节神经元发育和功能中作用(表10)。为了进一步验证，根据它们在神经元中的功能和/或在癫痫中的影响选择了7个靶标(结节性硬化复合物(tsc)1，钙通道(cacnac1c))。相较于输入样品，测试的所有靶标在ip中富集(图16a)。测试了n2a细胞中mir-135a模拟物的过表达对一些选定靶标表达的影响，并显示了nr3c1(gr)、plxna4和mef2a蛋白表达显著下调(图16b-d)。该实验确认通过ip鉴定的靶标可以被mir-135a调控。表10-用于验证bio-ip的选定靶标的基因列表ag-轴突导向,mfs–苔藓状纤维发芽(mossyfibersprouting)。tle中mir-135靶标mef2a受调控mef2蛋白(mef2a-d)形成了在大脑中时间和空间上表达的转录因子家族(lyons等，1995)，其中mef2a，2c和2d的表达最为突出。mef2介导活性依赖性突触发育，并且通过神经营养蛋白刺激以及因突触处神经递质释放增加而导致的钙流激活(flavell等，2008)。mef2c突变述于患有严重智力障碍和癫痫的患者(bienvenu等，2013)(nowakowska等，2010)。此外，mef2a在人和实验性tle的颞叶皮层中失调(huang等，2016)。基于ant-mir-135a实验(图13)及其通过mir-135aip的特异性富集，我们将关注对于mef2a的后续实验。mef2a3'utr包含mir-135a的一个特异性保守结合位点(种子序列为1024-1030nt)(图17a)。如荧光素酶试验所示，该位点被mir-135a靶向。在荧光素酶报道物载体中共表达mir-135a模拟物与mir-135a结合位点导致荧光素酶活性降低。位点的突变消除了mir-135a的作用(图17b)。为了验证mir-135a是否也调节棘数目，mir-135a在小鼠原代海马神经元中过表达。棘密度在离顶端分支上第一次级树状分枝100um的距离处测量(图17c)，并对5种不同类型的棘(杯状，蘑菇，短茎，细和丝足)进行计数(图17d)。相较于对照(0.55±0.06棘/um)，mir-135a的过表达导致棘数量显著减少(0.34±0.13棘/um)。mir-135a的体外过表达类似于在tle中体内观察到的病理神经元细胞，因此，尽管确切的机制尚不清楚，但癫痫脑中mir-135a的增加可能直接或间接地导致了观察到的神经元棘丢失。当缺少3’utr的mef2载体与mir-135a共表达时，这种作用被救助至对照水平(0.49±0.08棘/um)(图17e)。有趣的是，相较于对照(杯状：6.60％，蘑菇：34.51％，短茎：26.53％，细：23.16％，丝足：9.2％)，mir-135a过表达导致成熟棘的数量明显减少：杯状(3.32％)，蘑菇(18.05％)，短茎(20.81％)；但是导致不成熟类型的棘增加：细(31.00％)和丝足(26.82％)。当mir-135a与mef2共表达时，由于mir-135a过表达而导致的成熟棘减少和未成熟棘类型增加标准化至对照水平(杯状：5.49％，磨菇：32.77％，短茎：25.00％，细：21.12％，丝足：15.63％)。因此，mir-135a的表达增加导致棘数量和类型的mef2依赖性增加。为了检验mir-135a是否可以在tle中相互作用，我们测试了小鼠和人tle海马体中的mef2a表达。与我们的模型一致，d14iak小鼠海马体中mef2a蛋白表达显著降低(图17g-h)，并且观察到较弱的免疫信号(图17i)。相似地，在mtle患者中，相较于对照，mtle+hs海马样品中mef2a表达大大降低(图17j-k)，并在mtle+hs条件下观测到较弱的免疫染色，相较于齿状回和ca区域中的对照(图17j)。最后，如通过免疫组织化学所检测，使用安塔够妙体内阻断mir-135a导致mef2a表达增加(图17m)。这些结果共同表明，mtle的海马神经元中mir-135a的表达增加导致mef2a水平降低。mtle中mef2的丢失导致异常棘形成，从而导致癫痫中观察到的异常放电模式和细胞死亡。表11：用primer3软件设计前-mirnaqpcr引物序列(前-mir-135a1和a2)。相似地，为了验证bio-ip靶标，各靶标的引物序列如下所示。前-mir引物bio-ip靶向小鼠引物参考文献列表adamsr.h.和alitalok.natrevmolcellbiol8(6):464-478,2007.aksoy-aksela,zampaf,schrattg(2014)philostransrsoclondbbiolsci369:20130515–20130515-rstb.royalsocietypublishing.org/cgi/doi/10.1098/rstb.2013.0515anands.,majetib.k.,acevedol.m.,等natmed16(8):909-914,2010.aparaa,goldbergjl(2014)neuralregenres9:1418–1421可获自：www.nrronline.org/text.asp？2014/9/15/1418/139454aravin,a.和tuschl,t.febslett579:5830-40,2005.asaharat.,masudah.,takahashit.,kalkac.,pastorec.,silverm.,kearnem.,magnerm.和isnerj.m.circres85(3):221-228,1999.baldwinkt,gigerrj(2015)frontmolneurosci8:23可获自：www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26113809vanbattumey,gunputr-af,lemstras,等(2014)natcommun5:4317可获自：www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25007825baudetm-l,bellona,holtce(2013)semincelldevbiol24:146–155可获自：www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23219835beijnum,j.r.,rousch,m.,castermans,k.,vanderlinden,e和griffioen,aw.natureprotocols3(6):1085-1091,2008.berezikov,e.,cuppen,e.,和plasterk,r.h.natgenet38增刊,s2-7,2006.berezikov,e.,liu,n.,flynt,a.s.,hodges,e.,rooks,m.,hannon,g.j.,和lai,e.c.natgenet42,:6-9；作者回复9-10,2010.berezikov,e.等genomeres21:203-215,2011.blackmoremg,mooredl,等(2010)molcellneurosci44:43–54可获自：linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/s1044743110000254bodles-brakhopam,hellerr和draghia-aklir.currentclinicaldevelopments.moleculartherapy第17卷第4:585–592号,2009年4月bonnet,e.,wuyts,j.,rouze,p.和vande,p.e.y.bioinformatics20:2911-2917,2004.carmelietp.nature438(7070):932-936,2005.carmelietp.natmed6(4):389-395,2000.carmelietp.和jainr.k.nature407(6801):249-257,2000.caronia-browng,anderegga,awatramanir(2016)neuraldev11:9可获自：neuraldevelopment.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13064-016-0065-ychang,b.s.,和lowenstein,d.h.(2003).epilepsy.n.engl.j.med.349,1257-1266.changt.c.和mendellj.t.annurevgenomicshumgenet8:215-239,2007.chenc.z.,lil.,lodishh.f.和barteld.p.science303(5654):83-86,2004.creighton,cj.,等briefingsinbioinformatics.vol10.no5:490-497,2009.czech,m.p.(2006).n.engl.j.med.354,1194-1195.daud,a.i.等journalofclinicaloncology26(36):58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