一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法及应用与流程

本发明涉及低分子量κ-卡拉胶钾制备技术领域，更具体的说是涉及一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法及应用。

背景技术：

海洋藻类作为海洋中有机物的原始生产者，具有特殊的碳水化合物和人类正常生理代谢所不可缺少的矿物质。海藻多糖是指海藻中具有高粘度和凝固能力的各种高分子碳水化合物。随着海洋药物近年来的蓬勃发展，海藻多糖的研究日益受到重视。κ-卡拉胶作为海洋三大藻类之一的红藻的提取物，以其独特的理化性质和广泛的用途，为当代生物学、生物化学和医药界所关注，目前已成为一个研究热点。

κ-卡拉胶是由1，3-β-d-吡喃半乳糖和1，4-α-d-吡喃半乳糖作为基本骨架交替连接而成的线性硫酸多糖，主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等细胞壁中。κ-卡拉胶用于食品工业，可做凝固剂、粘合剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、增稠剂等，广泛用于乳制品、饮料、牛乳布丁、咖啡、果冻、罐头等食品工业上。此外，κ-卡拉胶还具有很重要的生物活性，如皮下注射κ-卡拉胶能促进结缔组织和骨胶原的生长，增加骨骼对钙的吸收；κ-卡拉胶对类风湿性关节炎有疗效，通过皮下注射或静脉注射κ-卡拉胶的多糖复合液后，可阻止滑膜中的成粒作用，使滑膜细胞明显增生，起到治疗作用；κ-卡拉胶在病理研究方面还表现出能防治胃溃疡和十二指肠溃疡，这是由于酸能降解κ-卡拉胶，以调节胃粘液中硫含量，防止溃疡的发生，且可与粘膜层上粘蛋白结合形成更具抵抗力的膜性结构，对胃肠粘膜起保护作用；κ-卡拉胶在抗病毒、抗凝血及免疫方面亦具有重要的生理活性。

然而，目前几乎没有对低分子量κ-卡拉胶钾降血压方面的研究，也没有任何分子量范围κ-卡拉胶钾制备工艺的研究。

因此，如何提供一种步骤简单、条件温和且能够酶解制备具有降压作用的低分子量κ-卡拉胶钾的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种酶解制备具有降压作用的低分子量κ-卡拉胶钾的方法，以红藻来源的精制κ-卡拉胶粉为原料，经特定酶酶解、醇沉后获得分子量为1-4kda的低分子量κ-卡拉胶寡糖，经钾盐混合处理后，得到低分子量κ-卡拉胶钾。本发明步骤简单，条件温和，制备得到的低分子量κ-卡拉胶钾分子量稳定在较小范围内，且钾离子含量高。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法，包括如下步骤：

(1)在40-50℃水浴锅中，将κ-卡拉胶粉末配成质量浓度为0.5-1.5％的κ-卡拉胶水溶液，搅拌均匀，加入κ-卡拉胶酶，搅拌酶解6-8h；

(2)酶解液进行醇沉，得到低分子量κ-卡拉胶寡糖；

(3)将得到的κ-卡拉胶寡糖配制成质量浓度为4-10％的溶液，与质量浓度0.1-2％的氯化钾水溶液混合；对混合液进行醇洗除盐，得到低分子量的κ-卡拉胶钾。

优选地，步骤(1)中κ-卡拉胶的分子量为100-700kda，钾离子含量为6.0-6.5％；κ-卡拉胶的来源为麒麟菜、石花菜、鹿角菜等天然红藻。

酶解底物分子量较大，钾离子含量低，在特定的酶解条件下使用κ-卡拉胶酶进行酶解，制备得到低分子量κ-卡拉胶寡糖分子量稳定，生物活性高。

优选地，步骤(1)中初始添加κ-卡拉胶酶所占体积分数为0.5-3％。

酶解形式为一次性加酶，酶解中间过程不再补加酶液。

进一步优选地，添加1％的κ-卡拉胶酶，原始ph条件下40℃酶解8h。

κ-卡拉胶酶添加量、酶解时间、酶解温度均保证了酶解产物的稳定性。

优选地，编码κ-卡拉胶酶的基因如seqidno:1所示。

进一步优选地，κ-卡拉胶酶的制备方法如下：

1)设计上游引物f1：5’-cggggtaccatgacaaaactaaagtttaacggc-3’，seqidno:2；

以及下游引物r1：5’-ataagaatgcggccgcttaagccgaagttccgggcg-3’，seqidno:3；

pcr扩增后得到的seqidno:1所示pcr产物用纯化试剂盒进行纯化，电泳成像后将目的条带与空载体ppic9k分别进行avrii与noti双酶切，将目的基因与载体过夜连接，连接产物转化至dh-5α感受态细胞，阳性克隆培养并提取质粒，采用电穿孔仪导入到毕赤酵母体内，培养，挑选重组毕赤酵母。

2)将所挑选的重组毕赤酵母接种到ypd培养基中，26-32℃培养20-24h；以0.5-2％接种量接种于bmgy发酵液培养基中培养36-48h，加入甲醇，20-24℃培养20-24h，重复加甲醇3-4次继续培养，培养结束后离心得到上清液即κ-卡拉胶酶。

优选地，甲醇添加量为1-2％。

进一步优选地，甲醇添加量为1％。

特定甲醇添加量的可以诱导κ-卡拉胶酶的酶解表达。

优选地，步骤(2)中低分子量κ-卡拉胶寡糖的分子量为1-4kda；低分子量κ-卡拉胶寡糖包括κ-卡拉胶二十二糖和κ-卡拉胶二十四糖，两者所占比例均为40％以上。

优选地，步骤(2)中醇沉方法如下：

1)酶解液离心，取上清，加入95％乙醇，使酒精计读数在45-55％，冷藏静置1-2h；

2)取上清，浓缩5-6倍，加入95％乙醇使酒精计读数在75-78％，冷藏静置1-2h；

3)取沉淀，溶于水，旋转蒸发，冷冻干燥，得到低分子量κ-卡拉胶寡糖。

优选地，步骤(3)中的低分子量κ-卡拉胶钾的分子量为1-4kda。

优选地，步骤(3)中低分子量κ-卡拉胶钾的钾离子含量为8.2-8.8％。

优选地，步骤(3)中具体步骤如下：

1)配制质量浓度4-10％的κ-卡拉胶钾寡糖溶液，与质量浓度0.1-2％氯化钾等体积混合，混合液旋蒸浓缩1倍，加入95％乙醇，使酒精计读数在75-78％之间，静置1-2h，离心，取沉淀；

2)沉淀用水复溶到混合液旋蒸后的体积，再次加入95％乙醇使酒精计读数在75-78％之间，静置1-2h，离心，取沉淀；

3)沉淀复溶旋蒸去除乙醇，冷冻干燥得低分子量κ-卡拉胶钾。

进一步优选地，κ-卡拉胶钾寡糖溶液质量浓度为4-8％，氯化钾质量浓度为0.1-1％。

上述一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法制备的低分子量κ-卡拉胶钾在制备预防或治疗高血压药物中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法，将大分子κ-卡拉胶粉末溶于水后，加入κ-卡拉胶酶酶解，再和氯化钾溶液混合，得到的低分子量κ-卡拉胶钾纯度高，钾离子含量高，既可作为食品添加剂，又可用作药品以及功能食品。

附图说明

下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为实施例1中低分子量κ-卡拉胶钾一次醇洗的盐峰图；

图2附图为实施例1中低分子量κ-卡拉胶钾二次醇洗的盐峰图；

图3附图为大分子κ-卡拉胶gpc图；

图4附图为实施例1中低分子量κ-卡拉胶寡糖gpc图；

图5附图为实施例1中低分子量κ-卡拉胶钾gpc图；

图6附图为实施例2中低分子量κ-卡拉胶钾一次醇洗的盐峰图；

图7附图为实施例2中低分子量κ-卡拉胶钾二次醇洗的盐峰图；

图8附图为实施例2中低分子量κ-卡拉胶寡糖gpc图；

图9附图为实施例2中低分子量κ-卡拉胶钾gpc图；

图10附图为对比例1中κ-卡拉胶寡糖gpc图；

图11附图为对比例1中κ-卡拉胶钾gpc图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.κ-卡拉胶酶的制备

根据来源于zobelliasp.zm-2的κ-卡拉胶酶的全基因序列，设计上游引物f1：5’-cggggtaccatgacaaaactaaagtttaacggc-3’，seqidno:2；以及下游引物r1：5’-ataagaatgcggccgcttaagccgaagttccgggcg-3’，seqidno:3；

扩增过程采用基因组dna为模板，采用高保真pfu聚合酶(takara)扩增目的基因。扩增反应体系(50μl)如表1所示。

表1扩增反应体系

pcr扩增程序如下：预变性98℃，2min；变性94℃，30s；退火56℃，30s；延伸72℃，1min；最终延伸72℃，10min；循环次数30次。

pcr扩增后用pcr产物纯化试剂盒进行纯化，电泳成像后将目的条带与空载体ppic9k分别进行avrii与noti双酶切，将目的基因与载体过夜连接，连接产物转化至dh-5α感受态细胞，阳性克隆培养并提取质粒，采用电穿孔仪导入到毕赤酵母体内，培养，挑选重组毕赤酵母。

选取构建成功的重组菌株，接种到ypd培养基中，30℃培养24h；以1％接种量接种于bmgy发酵液培养基中培养38h，加入1％体积的甲醇，22℃培养24h，加入1％的甲醇，22℃培养24h，加入1％的甲醇，22℃培养24h，加入1％的甲醇，22℃培养24h后，离心得到上清液即为κ-卡拉胶酶粗酶液。

2.酶解

以分子量为κ-卡拉胶粉末配制质量浓度1％的κ-卡拉胶水溶液，在40℃水浴条件下搅拌溶解；将粗酶液10000r/min高速离心10min取上清，按1％体积比加入到κ-卡拉胶水溶液中，继续保持40℃水浴条件酶解8h。

3.醇沉

酶解液离心，取上清，旋蒸浓缩1倍，加入95％乙醇，使酒精计读数保持在50％，4℃静置1.5h；离心取上清，浓缩6倍，加入95％乙醇，使酒精计读数保持在75％，4℃静置1h；离心取沉淀，复溶于400ml蒸馏水中，60℃旋转蒸发，尽量浓缩，冷冻干燥，得到低分子量κ-卡拉胶寡糖。

4.醇洗脱盐

将所得低分子量κ-卡拉胶寡糖配制成6％的水溶液，与0.1％的氯化钾溶液等体积混合，混合液旋蒸浓缩1倍，加入95％乙醇，使酒精计读数保持在75％，4℃静置2h，离心取沉淀，复溶到旋蒸浓缩后体积，取部分利用sephadexg-10脱盐柱测定游离盐离子浓度，结果如图1所示；再次加入95％乙醇，使酒精计读数保持在75％，4℃静置2h，离心取沉淀，足量蒸馏水复溶，60℃旋蒸，尽量浓缩，冷冻干燥即为高钾离子的低分子量κ-卡拉胶钾，取部分利用sephadexg-10脱盐柱测定盐浓度，结果如图2所示，盐峰(即游离盐离子浓度)可以忽略不计。

利用高效液相色谱结合tskgelg4000pwxl色谱柱对未酶解的κ-卡拉胶、本实施例所得低分子量κ-卡拉胶寡糖以及低分子量κ-卡拉胶钾的分子量进行测定，结果分别如图3、图4和图5所示，重均分子量分别为700kda，3.5kda，3.5kda。

火焰原子吸收光谱测定κ-卡拉胶中的钾含量为6.0％，低分子量κ-卡拉胶钾中的钾含量为8.2％。

实施例2

1.κ-卡拉胶酶的制备

同样方法重组菌株，接种到ypd培养基中，30℃培养24h；以1％接种量接种于bmgy发酵液培养基中培养40h，加入1.2％体积的甲醇，22℃培养24h，加入1.2％的甲醇，22℃培养24h，加入1.2％的甲醇，22℃培养24h，加入1.2％的甲醇，22℃培养24h后，离心得到上清液即为κ-卡拉胶酶粗酶液。

2.酶解

配制1％的κ-卡拉胶水溶液(同实施例1)，在40℃水浴条件下搅拌溶解；将粗酶液10000r/min高速离心10min取上清，按2％的体积比加入κ-卡拉胶水溶液中，继续保持40℃水浴条件酶解7h。

3.醇沉

酶解液离心，取上清，旋蒸浓缩1倍，加入95％乙醇，使酒精计读数保持在50％，4℃静置2h；离心取上清，浓缩5倍，加入95％乙醇，使酒精计读数保持在75％，4℃静置1h；离心取沉淀，复溶于水，60℃旋转蒸发，尽量浓缩，冷冻干燥，得到低分子量κ-卡拉胶寡糖。

4.醇洗脱盐

将所得κ-卡拉胶寡糖配制成8％的水溶液，与0.5％的氯化钾溶液等体积混合，混合液旋蒸浓缩1倍，加入95％乙醇，使酒精计读数保持在75％，4℃静置1h，离心取沉淀，复溶到旋蒸浓缩后体积，取部分利用sephadexg-10脱盐柱测定游离盐离子浓度，结果如图6所示；再次加入95％乙醇，使酒精计读数保持在75％，4℃静置1h，离心取沉淀，足量蒸馏水复溶，60℃旋蒸，尽量浓缩，冷冻干燥即为高钾离子的低分子量κ-卡拉胶钾，取部分利用sephadexg-10脱盐柱测定盐浓度，结果如图7所示，盐峰(即游离盐离子浓度)可以忽略不计。

利用高效液相色谱结合plaquagel-oh30色谱柱对本实施例所得低分子量κ-卡拉胶寡糖以及低分子量κ-卡拉胶钾的分子量进行测定，结果分别如图8和图9所示，重均分子量均为3.8kda。

火焰原子吸收光谱测定κ-卡拉胶中的钾含量为6.5％，低分子量κ-卡拉胶钾中的钾含量为8.5％。

对比例1

1.κ-卡拉胶酶的制备

同样方法重组菌株，接种到ypd培养基中，30℃培养24h；以1％接种量接种于bmgy发酵液培养基中培养38h，加入1％体积的甲醇，22℃培养24h，加入1％的甲醇，22℃培养24h，加入1％的甲醇，22℃培养24h，加入1％的甲醇，22℃培养24h后，离心得到上清液即为κ-卡拉胶酶粗酶液。

2.酶解

以κ-卡拉胶粉末配制质量浓度1％的κ-卡拉胶水溶液，在40℃水浴条件下搅拌溶解；将粗酶液10000r/min高速离心10min取上清，按1％体积比加入到κ-卡拉胶水溶液中，继续保持40℃水浴条件酶解8h。

3.醇沉

酶解液离心，取上清，旋蒸浓缩1倍，加入95％乙醇，使酒精计读数保持在50％，4℃静置2h；离心取沉淀，复溶于足量蒸馏水中，60℃旋转蒸发，尽量浓缩，冷冻干燥，得到κ-卡拉胶寡糖。

4.醇洗脱盐

将所得κ-卡拉胶寡糖配制成6％的水溶液，与0.1％的氯化钾溶液等体积混合，混合液旋蒸浓缩1倍，加入95％乙醇，使酒精计读数保持在50％，4℃静置2h，离心取沉淀，复溶到旋蒸浓缩后体积，再次加入95％乙醇，使酒精计读数保持在50％，4℃静置2h，离心取沉淀，足量蒸馏水复溶，60℃旋蒸，尽量浓缩，冷冻干燥即为κ-卡拉胶钾。

利用高效液相色谱结合plaquagel-oh30色谱柱对对比例1所得κ-卡拉胶寡糖以及κ-卡拉胶钾的分子量进行测定，结果分别如图10和图11所示。可以看出只进行1倍醇沉得到的κ-卡拉胶寡糖的分子量不均一，比较杂乱，与实施例1相比较，存在约20％的分子量在500kda以上的多糖。由于组成成分复杂，不适合研究特定分子量κ-卡拉胶寡糖的活性作用。

实施例3低分子量κ-卡拉胶钾对自发性高血压大鼠的降压作用研究

选用9周龄的spf级雄性自发性高血压大鼠(shr)，根据血压和体重随机分组，空白组10只，灌胃蒸馏水；实验组6只，灌胃实施例1低分子量κ-卡拉胶钾，灌胃剂量为600mg/kgbw/day；卡托普利组6只，卡托普利灌胃剂量为10mg/kgbw/day；每周测量收缩压(sbp)和心率1次，称重2次(计算灌胃体积用)。

低分子量κ-卡拉胶钾对shr的sbp影响如表2所示，可以看出第三周灌胃结束后，实验组的收缩压有了明显的降低，统计学分析结果显示，与空白组相比，有显著性差异(p＝0.034)，说明低分子量κ-卡拉胶钾从第三周开始有降压效果，第四周的统计学分析结果显示，降压效果保持稳定(p＝0.027)，无反弹波动迹象。说明低分子量的κ-卡拉胶钾对shr有持续且稳定的降压作用，可应用于生物医药领域。

表2低分子量κ-卡拉胶钾对shr的sbp影响

注：*表示与空白对照相比，p<0.05；**表示与空白对照相比，p<0.01。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>中国海洋大学

<120>一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法及应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1168

<212>dna

<213>zobelliasp.

<400>1

atgacaaaactaaagtttaacggcaagattcgtagaactgcactttcatgtcttttctac60

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<212>dna

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