一种利用鲁氏接合酵母提高葡萄糖醛酸产量的方法与流程

本发明涉及一种利用鲁氏接合酵母提高葡萄糖醛酸产量的方法，属于发酵技术领域。

背景技术：

葡萄糖醛酸(glucuronicacid)是一种糖醛酸化合物，因其分子中同时存在高反应活性的醛基和羧基，可作为受体与多种人体内源性及外源性有毒物质结合，提高毒性物质的水溶性使其易于随尿与胆汁排出体外，发挥排毒功能，提高机体免疫功能。

葡萄糖醛酸在医药和保健品等领域也有着广泛的应用，可作为中间物质合成具有防癌抗癌作用的d-葡糖二酸钙、d-葡萄糖二酸1，4-内酯和l-抗坏血酸等，也可作为食品添加剂加入到功能性饮料中。其优势作用正在不断被发掘，有巨大的潜在经济效益。

目前葡萄糖醛酸主要以淀粉为原料在酸性条件下通过硝酸氧化来实现生产。该工艺存在能耗高、选择性差、产品收率低、环境污染严重等问题。以葡萄糖为底物用发酵法生产葡萄糖醛酸成本较低，对环境污染也较小，并且发酵生产葡萄糖醛酸可以大大减轻原料来源的限制。由于缺少能够产游离葡萄糖醛酸的独立菌株，现阶段利用微生物发酵生产葡萄糖醛酸的方法还未得到广泛应用，且单菌发酵产量最高也只有3.94g/l。

因此，通过微生物发酵的方法生产葡萄糖醛酸，并对培养条件进行优化以获得更高产量的葡萄糖醛酸，对工业微生物发酵生产葡萄糖醛酸具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种提高葡萄糖醛酸产量的方法，所述方法是以含红茶粉或红茶粉功能性成分和抗氧化成分物质的培养基进行发酵，并在发酵第18～22h添加l-半胱氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述红茶粉功能性成分和抗氧化成分包括但不限于：儿茶酚、β-胡萝卜素、天冬氨酸、茶氨酸、茶叶碱、可可碱、茶皂素、维生素c、绿原酸、茶多酚、白藜芦醇。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基含蔗糖60～70g/l，大豆蛋白胨30～40g/l，磷酸二氢钾1～1.5g/l。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基中还添加柠檬酸铵。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基中共同添加柠檬酸铵和大豆蛋白胨。

在本发明的一种实施方式中，所述柠檬酸铵和大豆蛋白胨的含氮量比分别为(1/3～3)：1。

在本发明的一种实施方式中，所述柠檬酸铵和大豆蛋白胨的含氮量比分别为1:3，或1:1，或3:1。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将鲁氏接合酵母活化后，接种于培养基中，25～30℃，200～220r/min培养10～12h。

在本发明的一种实施方式中，所述接种是按3％的接种量，接种种龄为8～10h的种子液。

本发明的第二个目的是提供一种生产葡萄糖醛酸的方法，所述方法是以鲁氏接合酵母为发酵菌株，以含红茶粉或红茶粉功能性成分和抗氧化成分物质的培养基，在25～30℃发酵10～30h，并在发酵第18～22h添加浓度为0.5～3mmol/l的l-半胱氨酸。

本发明还要求保护所述方法在制备葡萄糖醛酸或其衍生物中的应用。

本发明还要求保护所述方法在制备含葡萄糖醛酸或其衍生物的产品方面的应用。

有益效果：本发明提供的菌株能将较廉价的底物蔗糖转化成具有高附加值的葡萄糖醛酸，提供的培养基和培养条件最终发酵产葡萄糖醛酸产量能达到35.26g/l，较目前国内外微生物单菌发酵法产量(国内2.03g/l，国外3.94g/l)高出7.9倍以上，较化学生产法具有反应条件温和、产品工艺简单、生产过程易于控制、可用于制备食品药品或保健品等优点，同时有利于保护环境，易于推广使用。

附图说明

图1为不同红茶粉添加量对鲁氏接合酵母酵母生长和产葡萄糖醛酸影响；

图2为红茶粉中功能性成分和抗氧化成分对鲁氏接合酵母生长的影响；

图3为红茶粉中功能性成分和抗氧化成分对鲁氏接合酵母产葡萄糖醛酸影响；

图4为不同发酵时间下鲁氏接合酵母产葡萄糖醛酸途径相关酶的酶活；

图5为提高miox酶活对鲁氏接合酵母产葡萄糖醛酸影响；

图6为补加氮源对鲁氏接合酵母生长和产葡萄糖醛酸影响；

图7为补加不同复合氮源对鲁氏接合酵母生长的影响；

图8为补加不同复合氮源对鲁氏接合酵母产葡萄糖醛酸影响；

图9为补加不同浓度l-半胱氨酸对鲁氏接合酵母产葡萄糖醛酸影响；

图10为3l罐上鲁氏接合酵母发酵过程曲线。

具体实施方式

1.葡萄糖醛酸检测方法

用离子色谱法(ic)检测发酵液中产葡萄糖醛酸的生成量。

标准样品：准确配置葡萄糖醛酸标准品1.000g/l，用超纯水稀释10倍，配置成终浓度为0.1000g/l的葡萄糖醛酸标准溶液。

将发酵液在10000g离心5min后，取上清液，用超纯水稀释100倍，0.22μm孔径的微孔滤膜过滤。

色谱方法：分离柱ionpacas11-hc(4×250mm)，保护柱ionpacag11-hc(4×50mm)；淋洗液发生器(eg产生)：0～15min，0.8mmol/l；15～27min，0.8～12mmol/l；27.1～31min，45mmol/l；31.1～35min，0.8mmol/l；流速：1.00ml/min；柱箱温度：30℃；进样体积：25μl；

检测方式：抑制型电导，aers5004mm。

2.培养基配方

ypd培养基：葡萄糖20g/l，酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l。添加琼脂20g/l得到ypd固体培养基。

发酵培养基：蔗糖60-70g/l，大豆蛋白胨30-40g/l，磷酸二氢钾1-1.5g/l，初始ph4.5-5.0，种龄8-10h，接种量3％，发酵时间20-30h。

实施例1红茶粉促进鲁氏接合酵母生长和产葡萄糖醛酸

取保藏于-80℃的鲁氏接合酵母菌体甘油管，在ypd培养基中活化后，分别转接于含有1％，2％，3％红茶粉的发酵培养基中，30℃，220r/min摇床培养20h，取发酵液，检测菌体浓度和葡萄糖醛酸含量，结果见图1。鲁氏接合酵母在含有3％红茶粉的发酵培养基中发酵20h，菌体浓度(od660为16.61)和产量最高，葡萄糖醛酸产量(18.06g/l)与对照组(14.21g/l)相比，提高了27.1％。

实施例2红茶粉中功能性成分和抗氧化成分对鲁氏接合酵母生长和产葡萄糖醛酸影响

取保藏于-80℃的鲁氏接合酵母菌体甘油管，在ypd培养基中活化后，转接于含有10mmol/l红茶粉中功能性成分和抗氧化成分的发酵培养基中，其中各成分过滤除菌后加入培养基中，30℃，220r/min摇床培养20h，取发酵液，检测菌体浓度和葡萄糖醛酸含量，结果见图2和图3。添加茶皂素对鲁氏接合酵母产葡萄糖醛酸促进作用最明显，产量为16.36g/l，与对照相比提高了14.9％，添加其他成分如绿原酸，葡萄糖醛酸产量为16.25g/l，提高了14.1％；添加β-胡萝卜素后，葡萄糖醛酸产量为15.88g/l，提高了11.5％；添加可可碱后，葡萄糖醛酸产量为15.74g/l，提高了10.5％；添加维生素c后，葡萄糖醛酸产量为15.73g/l，提高了10.5％。

实施例3提高限速酶活对鲁氏接合酵母产葡萄糖醛酸影响

取保藏于-80℃的鲁氏接合酵母菌体甘油管，在ypd培养基中活化后，转接于发酵培养基中，分别在6,12,18,24h取样，检测鲁氏接合酵母产葡萄糖醛酸途径中各酶的酶活。结果如图4所示，在发酵过程中，肌醇氧化酶(miox)酶活始终处于较低水平，且在对数中后期18h，达到最高，酶活为0.774u/g，因此确定该酶为限速酶。

取保藏于-80℃的鲁氏接合酵母菌体甘油管，在ypd培养基中活化后，转接于发酵培养基中，在第18h分别加入1mmol/l亚铁离子，2mmol/ll-半胱氨酸和10g/l肌醇，其中亚铁离子和l-半胱氨酸过滤除菌，肌醇高温高压蒸汽灭菌。检测添加后，菌体的miox酶活以及发酵液中葡萄糖醛酸的含量。结果如图5所示。2mmol/ll-半胱氨酸提升效果最明显，miox酶活最高提高到了1.2u/g，与对照相比提高了52.5％，葡萄糖醛酸产量最高达到20.44g/l，与对照相比提高了25.6％。

实施例4补加氮源对鲁氏接合酵母生长和产葡萄糖醛酸影响

取保藏于-80℃的鲁氏接合酵母菌体甘油管，在ypd培养基中活化后，转接于发酵培养基中，在对数后期(20h)补加大豆蛋白胨10g/l，以等量无菌水作为对照。继续发酵至30h，检测发酵过程葡萄糖醛酸产量。结果如图6所示。补加氮源后，菌体出现二次生长情况，菌体浓度上升，并且葡萄糖醛酸产量也有所提高，相较于对照提高了14.3％。

实施例5补加复合氮源对鲁氏接合酵母生长和产葡萄糖醛酸影响

取保藏于-80℃的鲁氏接合酵母菌体甘油管，在ypd培养基中活化后，转接于发酵培养基中，在对数后期(20h)补加不同浓度比例的复合氮源(大豆蛋白胨和柠檬酸铵)，以等量无菌水作为对照。继续发酵至30h，检测发酵过程中菌体生长情况和葡萄糖醛酸的产量。结果如图7图8所示。不同浓度比例的复合氮源对鲁氏接合酵母生长及产葡萄糖醛酸具有明显差异，其中，当复合氮源全为柠檬酸铵时，菌体呈现最好的生长状况和葡萄糖醛酸产量。其中菌体浓度最高可以达到15.2(od660值)，较对照提高了17.7％。葡萄糖醛酸产量提高到了22.36g/l，较对照提高了52.5％。

实施例6补加不同浓度l-半胱氨酸对鲁氏接合酵母产葡萄糖醛酸影响；

取保藏于-80℃的鲁氏接合酵母菌体甘油管，在ypd培养基中活化后，转接于发酵培养基中，在第18h分别加入浓度为0.5～3mmol/ll-半胱氨酸。结果如图9所示。发酵22h的葡萄糖醛酸产量可达14.59～18.36g/l，发酵24～26h的葡萄糖醛酸产量可达15.11～20.44g/l。

实施例73l罐上发酵鲁氏接合酵母产葡萄糖醛酸

取保藏于-80℃的鲁氏接合酵母菌体甘油管，在ypd培养基中活化后，转接到3l罐中，其中发酵培养基配方为红茶粉3％，蔗糖70g/l，大豆蛋白胨34g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，控制ph4.9-5.0，600r/min，发酵，定点取样。在菌体对数末期，生长速度开始减缓时，进行补料，按照实施例3的方式补加硫酸亚铁铵、l-半胱氨酸，并补加8/l柠檬酸铵，检测发酵液中葡萄糖醛酸含量，结果如图10所示。从溶氧曲线可知，12-12.5h时，发酵液中溶氧开始迅速上升，表明此时菌体生长速度减慢，因此在12.5h进行补料。最终在菌体进入到稳定期后结束发酵。结果显示，发酵20h时间，3l罐上葡萄糖醛酸产量可达35.26g/l。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。