本发明涉及五环三萜衍生物，具体涉及3-(l-苯丙氨酸)-五环三萜衍生物及其合成方法和应用。
背景技术：
五环三萜类化合物在自然界中分布广泛，是很多常用中草药的有效成分，按其烷烃结构骨架的不同主要分为：齐墩果烷型、熊果烷型、和羽扇豆烷型等。五环三萜类化合物一般具有广泛的生物活性，如降血糖血脂、抗炎、抗肿瘤、抗hiv、抗病毒等。齐墩果酸作为护肝片在中国已上市近40年。
氨基酸，作为生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，在生命过程中发挥着重要的作用。肿瘤细胞代谢旺盛，需要大量的营养物质来维持细胞高速繁殖的状态，其中氨基酸是其必须的营养物质。
l-苯丙氨酸属于人体必需氨基酸，人体不能自主合成，必须从食物中摄取。目前尚未见有关于3-(l-苯丙氨酸)-五环三萜衍生物用于肿瘤治疗的相关报道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一系列结构新颖的3-(l-苯丙氨酸)-五环三萜衍生物，以及它们的合成方法和应用。
本发明涉及下述式1-4所示的3-(l-苯丙氨酸)-五环三萜衍生物及其药学上可接受的盐：
本发明还提供上述3-(l-苯丙氨酸)-五环三萜衍生物的合成方法，包括：
化合物1的合成方法，主要包括以下步骤：取齐墩果酸和boc-l-苯丙氨酸溶于有机溶剂中，加入二环己基碳二亚胺(dcc)和4-二甲氨基吡啶(dmap)，于加热或不加热条件下反应，反应完成后，所得物料过滤，收集滤液，回收溶剂，得到化合物1粗品；
化合物2的合成方法，主要包括以下步骤：取化合物1和三氟乙酸，在有机溶剂存在或不存在的条件下，于加热或不加热条件下反应，反应完成后，向反应所得物料中滴加碱性溶液，直至无气泡生成；所得物料用萃取剂萃取，收集有机相，经洗涤、干燥后旋干，得到化合物2粗品；
化合物3的合成方法，主要包括以下步骤：取甘草次酸和boc-l-苯丙氨酸溶于有机溶剂中，加入二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，于加热或不加热条件下反应，反应完成后，所得物料过滤，收集滤液，回收溶剂，得到化合物3粗品；
化合物4的合成方法，主要包括以下步骤：取化合物3和三氟乙酸，在有机溶剂存在或不存在的条件下，于加热或不加热条件下反应，反应完成后，向反应所得物料中滴加碱性溶液，直至无气泡生成；所得物料用萃取剂萃取，收集有机相，经洗涤、干燥后旋干，得到化合物4粗品；
其中，所述的有机溶剂为选自二氯甲烷、氯仿、甲醇、四氢呋喃和乙酸乙酯中的一种或两种以上的组合；所述的萃取剂为二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯。
在上述各化合物的合成方法中，反应均优选在低于或等于50℃条件下进行，更优选是在常温下进行。反应是否完全可用薄层层析(tlc)跟踪检测。当反应在常温条件下进行时，各反应的时间通常控制在1-24h。
在上述各化合物的合成方法中，涉及的碱性溶液可以是现有常用碱性物质的水溶液，优选为选自碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液、碳酸钾水溶液和碳酸氢钾水溶液中的一种或两种以上的组合；更优选为饱和碳酸钠水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和碳酸钾水溶液或饱和碳酸氢钾水溶液。
在上述各化合物的合成方法中，各反应原料的摩尔比均为它们的化学计量比。在化合物1或化合物3的合成方法中，二环己基碳二亚胺作为缩合剂使用，其加入量优选为齐墩果酸或甘草次酸摩尔量的1-5倍；而4-二甲氨基吡啶作为催化剂使用，其加入量优选为齐墩果酸或甘草次酸摩尔量的10-20％。
在上述各化合物的合成方法中，有机溶剂的用量通常为能够溶解参加反应的原料为宜。在化合物2或化合物4的合成方法中，三氟乙酸即作为反应原料使用也可作为溶剂使用，当三氟乙酸现时作为反应原料和溶剂使用时，其加入量相应增多。
上述合成方法制得的是各化合物的粗品，可采用现有常规的纯化方法对它们进行纯化以提高各化合物的纯度。通常采用硅胶柱层析进行纯化。当将化合物1粗品或化合物3粗品上硅胶柱层析时，用于洗脱的洗脱剂为由石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂，其中石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为5-10：1，进一步优选为5-8：1。当将化合物2粗品或化合物4粗品上硅胶柱层析时，用于洗脱的洗脱剂优选为由石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂，其中石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为1-5：1，进一步优选为1-3：1。
为了进一步减少硅胶柱的负担，优选先将化合物1粗品或化合物3粗品分散于二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯中，经水、饱和食盐水洗涤，干燥(无水硫酸钠或无水硫酸镁干燥)后旋干，所得残余物再进行柱层析。
本发明所述合成方法中，涉及的萃取操作中，萃取后收集的有机相通常先水、饱和食盐水进行洗涤，之后用无水硫酸钠或无水硫酸镁干燥后再旋干。
本发明进一步包括上述化合物1-4中任一化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明更进一步包括一种药物组合物，含有治疗上有效剂量的上述化合物1-4中任一化合物或其药学上可接受的盐。所述药物组合物的剂型可以是药学上可接受的剂型，如液体剂型、固体剂型或半固体剂型。
与现有技术相比，本发明提供了一系列结构新颖的3-(l-苯丙氨酸)-五环三萜衍生物及其合成方法，申请人的体外试验试验结果表明，它们对某些肿瘤细胞株具有良好的增殖抑制活性，具有较好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：化合物1的合成
取齐墩果酸(2.00g,4.38mmol)和boc-l-苯丙氨酸(1.74g,6.57mmol)溶于ch2cl2(50ml)中，依次加入dcc(1.80g,8.77mmol)、dmap(0.10g,0.87mmol)，室温条件下搅拌反应24h，所得反应物料过滤，滤饼用二氯甲烷(20ml)洗涤，收集滤液，减压旋干，所得残余物分散于etoac(200ml)中，依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干得到粗产物。粗产物上硅胶柱层析分离(洗脱剂:v石油醚:v乙酸乙酯＝8:1-5:1)，得化合物1(1.98g,64.0％，白色固体)。
yield:1.98g,64.0％,whitesolid；rf＝0.72(petroleumether:etoac＝2:1).m.p.116-118℃.1hnmr(500mhz,cdcl3):δ0.73(s,3h,ch3),0.79(s,6h,2×ch3),0.90,0.91,0.92,1.12(4s,each3h,4×ch3),1.38(s,9h,3×ch3),0.83-2.00(m,22h),2.79-2.83(m,1h,h-18),2.99-3.15(m,2h,phch2),4.49-4.58(m,2h,h-3,nchcoo),4.91(d,j＝8.6hz,1h,nh),5.26(t,j＝3.6hz,1h,h-12),7.16-7.30(m,5h,ar-h).13cnmr(125mhz,cdcl3):δ15.6,16.0,17.4,18.4,23.2,23.7,23.9,26.2,28.0,28.4,28.6,31.0,32.7,32.8,33.3,34.1,37.2,38.0,38.3,38.8,39.6,41.2,41.8,46.1,46.8,47.8,54.9,55.6,80.1,82.8,122.8,127.2,128.8,129.7,136.4,143.9,155.4,172.2,184.2.hrms(esi)m/z:calcdforc44h65no6na[m+na]+726.4710；found726.4672.
实施例2：化合物1的合成
取齐墩果酸(2.00g,4.38mmol)和boc-l-苯丙氨酸(1.74g,6.57mmol)溶于meoh(50ml)中，依次加入dcc(1.80g,8.77mmol)、dmap(0.10g,0.87mmol)，室温条件下搅拌反应10h，所得反应物料过滤，滤饼用meoh(20ml)洗涤，收集滤液，减压旋干，所得残余物上硅胶柱层析分离(洗脱剂:v石油醚:v乙酸乙酯＝8:1-5:1)，得到白色固体(1.21g，40.0％)。
所得产物经核磁氢谱表征，确定为化合物1。
实施例3：化合物2的合成
取化合物1(0.20g,0.28mmol)溶于ch2cl2(15ml)中，加入tfa(0.6ml，0.2ml/1h)，室温条件下搅拌反应3h，向反应所得物料中滴加饱和碳酸氢钠水溶液直至无气泡生成，用ch2cl2(3×50ml)萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干得粗产物。粗产物上硅胶柱层析分离(洗脱剂:v石油醚:v乙酸乙酯＝3:1-1:1)，得化合物2(0.11g,64.0％，白色固体)。
yield:0.11g,64.0％,whitesolid；rf＝0.31(petroleumether:etoac＝1:1).m.p.144-146℃.1hnmr(400mhz,cdcl3):δ0.74,0.80,0.82,0.89,0.921,0.926,1.12(7s,each3h,7×ch3),0.84-2.00(m,22h),2.79-2.86(m,2h,h-18,phch),3.14(dd,j＝5.4,13.6hz,1h,phch),3.74-3.77(m,1h,nchcoo),4.50-4.54(m,1h,h-3),5.26(t,j＝3.6hz,1h,h-12),7.19-7.30(m,5h,ar-h).13cnmr(100mhz,cdcl3):δ15.6,17.0,17.4,18.4,23.2,23.7,23.8,23.9,26.2,28.0,28.4,31.0,32.81,32.89,33.4,34.1,37.2,38.1,38.3,39.6,41.2,41.3,41.9,46.2,46.8,47.8,55.6,56.1,82.2,122.6,127.1,128.9,129.6,137.4,144.1,174.7,183.5.hrms(esi)m/z:calcdforc39h58no4[m+h]+604.4366；found604.4360.
实施例4：化合物2的合成
取化合物1(0.20g,0.28mmol)和tfa(10ml)于室温条件下搅拌反应1h，向反应所得物料中滴加饱和碳酸钠水溶液直至无气泡生成，用ch2cl2(3×50ml)萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干得粗产物。粗产物上硅胶柱层析分离(洗脱剂:v石油醚:v乙酸乙酯＝3:1-1:1)，得到白色固体(0.08g，45.0％)。
所得产物经核磁氢谱表征，确定为化合物2。
实施例5：化合物3的合成
取甘草次酸(0.25g,0.53mmol)和boc-l-苯丙氨酸(0.21g,0.79mmol)溶于ch2cl2(25ml)中，依次加入dcc(0.16g，0.79mmol)，dmap(9.6mg,0.079mmol)，室温条件下搅拌反应24h，所得反应物料过滤，滤饼用二氯甲烷(20ml)洗涤，滤液减压旋干，残余物分散在ch2cl2(100ml)中，依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干得粗产物。粗产物上硅胶柱层析分离(洗脱剂:v石油醚:v乙酸乙酯＝8:1-5:1)，得化合物3(0.21g，56.8％，白色固体)。
yield:0.21g,56.8％,whitesolid；rf＝0.533(petroleumether:etoac＝1:1).m.p.132-134℃.1hnmr(500mhz,cdcl3):δ0.79,0.80,0.82,1.11,1.13,1.21,1.36(7s,each3h,7×ch3),1.38(s,9h,3×ch3),1.00-2.21(m,19h),2.35(s,1h,h-9),2.77-2.80(m,1h,h-18),3.010-3.13(m,2h,phch2),4.50-4.59(m,2h,h-3,nchcoo),4.91(d,j＝8.6hz,1h,nh),5.71(s,1h,h-12),7.16-7.29(m,5h,ar-h).13cnmr(125mhz,cdcl3):δ16.6,17.0,17.6,19.0,23.6,23.7,25.0,25.7,26.7,26.8,28.3,28.6,28.7,28.8,31.2,32.1,33.0,33.8,37.2,38.0,38.3,38.7,39.0,41.2,43.5,44.1,45.7,48.5,54.9,55.3,61.9,80.1,82.5,127.2,128.7,128.8,129.7,136.4,155.4,169.9,172.1,181.7,200.5.hrms(esi)m/z:calcdforc44h63no7na[m+na]+740.4502；found740.4470.
实施例6：化合物3的合成
取甘草次酸(0.25g,0.53mmol)和boc-l-苯丙氨酸(0.21g,0.79mmol)溶于thf(25ml)中，依次加入dcc(0.16g，0.79mmol)，dmap(9.6mg,0.079mmol)，室温条件下搅拌反应10h，所得反应物料过滤，滤饼用thf(20ml)洗涤，滤液减压旋干，残余物分散在ch2cl2(100ml)中，依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干得粗产物。粗产物上硅胶柱层析分离(洗脱剂:v石油醚:v乙酸乙酯＝8:1-5:1)，得到白色固体(0.19g，51.8％)。
所得产物经核磁氢谱表征，确定为化合物3。
实施例7：化合物4的合成
取化合物3(1g,1.39mmol)溶于ch2cl2(15ml)中，室温下加入tfa(2ml，1ml/1h)，室温条件下搅拌反应2h，向反应所得物料中滴加饱和碳酸氢钾水溶液直至无气泡生成，用etoac(3×50ml)萃取，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液旋干得粗产物。粗产物上硅胶柱层析分离(洗脱剂:v石油醚:v乙酸乙酯＝3:1-1:1)，得化合物4(0.82g,95.00％，白色固体)。
yield:0.82g,95.00％,whitesolid；rf＝0.21(petroleumether:etoac＝1:1).m.p.152-154℃.1hnmr(500mhz,cdcl3):δ0.80,0.81,0.84,1.11,1.14,1.19,1.36(7s,each3h,7×ch3),1.00-2.20(m,19h),2.35(s,1h,h-9),2.77-2.81(m,1h,h-18),2.87-3.19(m,2h,phch2),3.82-3.84(m,nchcoo),4.56(dd,j＝4.8,11.5hz,1h,h-3),5.70(s,1h,h-12),7.21-7.31(m,5h,ar-h).13cnmr(125mhz,cdcl3):δ16.7,17.1,17.6,19.0,23.7,23.8,26.7,26.8,28.4,28.83,28.88,31.3,32.2,33.0,37.2,38.1,38.4,39.0,40.5,41.3,43.5,44.1,45.7,48.6,55.3,55.8,61.9,82.4,127.3,128.7,129.0,129.7,136.8,169.8,173.7,181.3,200.4.hrms(esi)m/z:calcdforc39h56no5[m+h]+618.4159；found618.4120.
实施例8：化合物4的合成
重复实施例7，不同的是：用etoac替代ch2cl2作为溶剂，反应在50℃条件下进行，其余不变。最终得到白色固体(0.71g，85.8％)。
所得产物经核磁氢谱表征，确定为化合物4。
实验例：本发明所述化合物1-4对多种肿瘤细胞株的增殖抑制活性实验：
1、细胞株与细胞培养
本实验选用人膀胱癌细胞t24、人非小肺癌细胞a549、人胃癌细胞mgc-803、人肝癌细胞hepg2、人正常肝细胞hl-7702等5种人类细胞株。
所有细胞株均培养在含10％小牛血清、100u/ml链霉素的rpmi-1640培养液内，置37℃含体积浓度5％co2孵箱中培养。
2、待测化合物的配制
所用的受试药物的纯度≥95％，将其dmso储液用生理缓冲液稀释后配置成200μmol/l的终溶液，其中助溶剂dmso的浓度≤1％，测试该浓度下化合物对各种肿瘤细胞生长得抑制程度。
3、细胞生长抑制实验(mtt法)
(1)取对数生长期的肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培养液配置成浓度为5000个/ml的细胞悬液，以没孔190μl接种于96孔培养板中，使待测细胞浓度至每孔1000～10000/孔(边缘孔用无菌pbs填充)；
(2)5％co2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物10μl，每个浓度梯度设4个复孔；
(3)5％co2，37℃孵育48h，至倒置显微镜下观察；
(4)每孔加入10μl的mtt溶液(5mg/mlpbs，即0.5％mtt)，继续培养4h；
(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μl的dmso充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值；
(6)同时设置调零孔(培养基、mtt、dmso)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、mtt、dmso)。
(7)根据测得的光密度值(od值)，来判断活细胞数量，od值越大，细胞活性越强。利用公式：
肿瘤细胞生长抑制率(％)＝[(1-实验组平均od值)/(对照组平均od值)]×％；
ic50测定：利用以上方法，每种化合物须设置浓度梯度，其中含多个(一般5-8个)浓度，每个浓度也须设置3～5个副孔，实验得到每个不同浓度的抑制率，然后在spss软件中计算化合物的ic50值，结果如下述表1所示。
表1：各化合物对不同细胞株的ic50值(μm)
注：实验数据为3次实验的平均值。ic50值越低，说明该化合物抑制肿瘤细胞生长的活性越强。