一种高效低成本从茶多酚中获得3种儿茶素单体的分离方法与流程

本发明属于天然植物有效成分的提取及深加工领域，具体涉及一种高效低成本从茶多酚中获得3种儿茶素单体的分离方法。

背景技术：

茶多酚（teapolyphenols）是茶叶中多酚类物质的总称，包括黄烷醇（儿茶素）类、黄酮醇类、花色苷类和酚酸类等。主要为黄烷醇（儿茶素）类，儿茶素占60-80%。儿茶素类主要成分为表没食子儿茶素没食子酸脂（egcg），另外还存在其它具有生物活性的儿茶素单体。儿茶素不仅是一种天然无毒的抗氧化剂，也是一种天然的备选药物，具有消炎、杀菌、抗氧化和抗辐射等作用。目前高纯度的儿茶素单体分离方法主要有高效液相制备色谱法（hplc），柱层析分离法，高速逆流色谱法，膜分离法，聚酰胺分离法等。hplc优点为能有效地分离儿茶素多种组分且纯度较高，缺点为重现性不好，量少，且成本较高。柱层析分离法优点为可以得到较高纯度的egcg，缺点为收集得率低，所需时间长，分离后严重拖尾。高速逆流色谱法优点为可以分离出多个儿茶素单体组分，但上样量过多的时候，组分会发生重叠，导致分离效果显著降低。目前高纯度的儿茶素单体分离方法仍主要停留在色谱分离技术，虽能获得纯度较高的儿茶素单体，但分离方法复杂，耗时长，成本高，难以用于工业化生产。本发明采用蛋白纯化仪来分离茶多酚，不仅开创了新的儿茶素单体分离技术，且分离方法简便，成本低，具有较好的工业应用价值。

值得一提的是，相比于其它儿茶素单体的分离方法，本发明中对于儿茶素分离过程，因为分离液在收集时候用检测波长280nm，儿茶素在280nm处有明显的吸收峰,虽然蛋白质在280nm处也有吸收峰，但因为蛋白质是大分子，很容易利用树脂和小分子儿茶素分离，故可根据a-t（吸光度-透光度）来判断儿茶素单体的分离状态，这对于儿茶素分离与纯化的研究，提供了一种参考途径。另外，本发明在一次实验中，相较于单纯用大孔树脂只能提取一种儿茶素单体，可一次性连续分离出3种较高纯度儿茶素单体，。因此，通过本发明，可提高提取多种儿茶素单体的高效，进一步拓展了茶叶深加工领域技术，使茶叶资源得到合理利用，促进茶产业的健康发展。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高效低成本从茶多酚中获得3种儿茶素单体的分离方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高效低成本从茶多酚中获得3种儿茶素单体的分离方法，包括如下具体步骤：

（1）实验前预处理，将大孔树脂进行放在94%-96%的乙醇中浸泡24-26h，激活树脂。

（2）将茶多酚和up水进行质量体积比1mg：1ml混合，轻微振荡得到茶多酚溶液。处理时间为2-3min，现配现用。

（3）连接好装置，用up水，以9.2r/min速率对蛋白纯化仪进行平衡1.5-3h，调平基线。将溶解后的茶多酚以6.9r/min的速率进行上样，上样时间为20-25min。上样后按照up水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇的梯度，9.2r/min的速率分别进行洗脱。

（4）每个洗脱梯度，洗脱5-7bv液体，每隔14-16min（0.5bv）收集1.3-1.5ml分离液。如出现峰值，则需另外收集峰值分离液。

（5）将各梯度收集的蛋白纯化仪分离液，运用hplc对分离成分进行检测。a项为100%乙腈，b项为nah2po4.2h2o，ph=2.2。c项为100%甲醇，d项为10%甲醇。平衡柱子时，b项为超声后的up水，超声功率为60-70w，时间为20-30min。作为流动项时，b项为nah2po4.2h2o，ph=2.2。检测波长280nm，流速为0.9-1.2ml/min。

三种儿茶素单体的确认利用购买的三种儿茶素单体的标准品，通过出峰时间，以及全波长扫描的图谱进行确认。

茶多酚在分离程度时易发生氧化，故在实验中，茶多酚溶液应进行现配现用，尽快上样分离。如使用茶叶来提取茶多酚，需要茶叶进行预处理，如将茶叶进行超高温处理（500℃）预处理，使茶多酚在分离过程中氧化程度降低。

本发明的优点在于：本发明采用蛋白纯化仪结合大孔树脂，通过监测吸收峰自动收集分离液，得到纯度较高的3种儿茶素单体，该分离方法简便，自动化高，且成本低，具有较好的工业应用价值。另外，相较于单纯用大孔树脂只能提取一种儿茶素单体，本发明能明显提高提取效率。

附图说明

图1：为hplc图谱中样本ga（没食子酸）最高浓度的分离图；上图是ga的全波长扫描图。

图2：为hplc图谱中标品ga最高浓度的分离图；上图是ga的全波长扫描图。

图3：为hplc图谱中样本c（儿茶素）最高浓度的分离图；上图是c的全波长扫描图。

图4：为hplc图谱中标品c最高浓度的分离图；图中的小图是c的全波长扫描图，箭头所指图为小图放大图。

图5：为hplc图谱中样本egcg最高浓度的分离图；上图是egcg的全波长扫描图。

图6：为hplc图谱中标品egcg最高浓度的分离图；上图是egcg的全波长扫描图。

具体实施方式

为了是本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

本发明一种高效低成本从茶多酚中获得3种儿茶素单体的分离方法，包括以下步骤：

（1）实验前预处理，将大孔树脂进行放在95%的乙醇中浸泡24h，激活树脂。

（2）将茶多酚和up水进行35mg：35ml混合，轻微振荡得到茶多酚溶液。处理时间为2min，现配现用。

（3）连接好装置，用up水，以9.2r/min速率对蛋白纯化仪进行平衡2h，调平基线。将溶解后的茶多酚以6.9r/min的速率进行上样，上样时间为20min。上样时容器用锡箔纸包被以避光。上样后按照up水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇的梯度，9.2r/min的速率分别进行洗脱。

（4）每个洗脱梯度，洗脱6bv液体，每隔15min（0.5bv）收集1.3ml分离液。如出现峰值，则也收集峰值分离液。

（5）将各梯度收集的蛋白纯化仪分离液，运用hplc对成分进行检测，检测儿茶素单体的含量。a项为100%乙腈，b项为up水/nah2po4.2h2o，ph=2.2。c项为100%甲醇，d项为10%甲醇。平衡柱子时，b项为超声后的up水，超声功率为60w，时间为30min。作为流动项时，b项为nah2po4.2h2o，ph=2.2。流速为1ml/min。

三种儿茶素单体的确认利用购买的三种儿茶素单体的标准品，通过出峰时间，以及全波长扫描的图谱进行确认。

本试验证明，应用蛋白纯化仪自动分离茶多酚，可以高效的得到3种高纯度的儿茶素单体，ga（没食子酸）、c（儿茶素单体）、egcg的洗脱液梯度分别为10%乙醇溶液、up水、40%乙醇溶液，并且可对儿茶素分离状态进行监测。儿茶素单体的通过hplc和全波长扫描进行鉴定。

表一：儿茶素单体的分离情况

从表一可以看出，在整体上，茶多酚经过蛋白纯化仪装置纯化后，可得到3种儿茶素单体，分别为ga、c、egcg；其中ga纯度为82.97%，c纯度为85.14%，egcg纯度为95.56%，分离纯度较高。

因此，本实验证明，可根据蛋白纯化仪分离蛋白质的原理，来分离茶多酚，可获得较高纯度的儿茶素单体。另外，通过蛋白纯化仪a-t（吸光-透光）图谱，可对茶多酚的分离状态进行监测，了解茶多酚分离的情况。相对来说，本方法简单快速，自动化高，安全无毒，节约资源，能耗低，其提取纯度相对较高，同时提高了茶叶的附加价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。