一种西瓜血瓤病诊断及病原物检测的RPA方法与流程

本发明植物检疫技术领域，尤其涉及一种西瓜血瓤病诊断及病原物检测的rpa方法。

背景技术：

黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumbergreenmottlemosaicvirus，cgmmv)属于烟草花叶病毒属(tobamovirus)成员之一，是世界范围内葫芦科作物上一种重要检疫性病毒，严重威胁着西瓜、甜瓜、黄瓜等葫芦科作物生产。cgmmv可以通过种子、花粉、土壤、水和昆虫媒介以及机械接触传播。感染cgmmv植株叶片上会出现明显的花叶症状，生长发育迟缓，果实畸形，最终导致产量降低，从而引起巨大的经济损失。

cgmmv有多种传播方式，但以带毒种子和机械传播为主。(1)种子传播：cgmmv是典型的种传病毒，病毒主要在种子外部表皮上通过种子传毒，在花粉、种皮、病苗的胚轴中也能发现，并且能够在种子内长期存活。(2)接触传播：cgmmv还可以通过接触病残体、带毒种苗等，从寄主微伤口进入植株体内进行传播；也可通过人为汁液的接触传染，如嫁接操作等，如在西瓜种植区以嫁接生产方式常造成病害广泛发生。(3)土壤传播：cgmmv的土壤传毒率较低，韩国有报道称土壤自然传毒率仅0-3.5％。(4)菟丝子传播：cgmmv也可通过菟丝子传播。(5)此外，还有报道发现cgmmv还可以随河水和灌溉水传播，苋色藜、马齿苋等田间杂草也是病害自然扩展的重要媒介。许多研究者对cgmmv的传毒昆虫展开了研究，但目前尚未发现有特异性的昆虫介体可以传播该病毒。

为了有效防止cgmmv传播，多种检测方法已经被建立，包括免疫电镜法、酶联免疫吸附法(elisa)、rt-pcr、实时荧光定量pcr(real-timepcr)和环介导等温扩增(lamp)等，然而免疫电镜设备昂贵，操作困难。交叉反应性限制了酶联免疫吸附试验的应用。rt-pcr、实时荧光定量pcr是应用最广泛的实验室诊断技术，但其反应过程需要热循环，设备昂贵，反应时间通常大于1小时。环介导等温扩增虽然对设备要求低，但其产物结构复杂，无法测序，并且很难与探针技术结合，产生非特异性扩增无法鉴定，反应通常需要1个小时。上述方法均不能满足cgmmv快速检测的需要。

中国发明专利cn108456746a公开了一种基于一步法rpa技术检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法提供了用于检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的引物对，所述引物对由引物cgmmv-rpa-f和引物cgmmv-rpa-r组成。所述引物对的用途为检测或辅助检测黄瓜绿斑驳花叶病毒或检测待测植物样本是否感染黄瓜绿斑驳花叶病毒。虽然该方法基本满足了检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的要求，但是在灵敏度方面仍有较大的提高空间。

本方案利用重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification,rpa)，一种新型的等温dna扩增和检测技术，以摩擦接种cgmmv的葫芦叶片为材料，提取总rna，反转录得到cdna，并以此为模板，通过反应条件优化，特异性及灵敏度检测等试验，建立了一种新的快速检测cgmmv的方法。

技术实现要素：

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种西瓜血瓤病诊断及病原物检测的rpa方法。

本发明的技术方案如下：

一种西瓜血瓤病诊断及病原物检测的rpa方法，包括以下步骤：

a、提取待测病毒样品的总rna；

b、以步骤a得到的总rna为模板，采用特异性引物对进行rpa扩增，得到扩增产物；按照如下方法判断待测病毒是否为黄瓜绿斑驳花叶病毒：

若所述扩增产物含有140bp的dna片段(序列1)，则所述待测病毒为黄瓜绿斑驳花叶病毒；若所述扩增产物不含有140bp的dna片段，则所述待测病毒不为黄瓜绿斑驳花叶病毒。

所述的含有140bp的dna片段为序列表中序列1所示的dna片段，具体如下：

acttattgcgtttagtgcttcttatgttcccgtcaggactttacttaattttctagttgcttcacaaggtaccgctttccagactcaagcgggaagagattctttccgcgagtccctgtctgcgttaccctcgtctgtcg

由于病毒序列变异性较大，上述序列可允许存在3％的差异。

优选的，所述的特异性引物对，根据cgmmv-lnxg分离物基因组(ky040049.1)序列，根据rpa引物的设计原则，利用软件及人工修正设计检测cgmmv的特异性rpa引物对cgmmv-f/cgmmv-r，引物序列见表1。

表1cgmmv特异性检测引物

优选的，所述的rpa扩增的条件为：37-40℃反应20-30min。

本发明的有益之处在于：本发明结合现代分子生物学研究技术手段，建立了一套高效、经济以及快速检测cgmmv的技术体系，发明了rpa快速检测方法，即在一个rpa反应中以带毒样品的cdna为模板，加入一对检测引物，水浴锅恒温(37-40℃)反应20-30min，灵敏度达到10^-6，灵敏度更高实现快速、准确地检测cgmmv的目的，同时缩减了鉴定时间，节约了生化试剂，降低了成本，为cgmmv这种检疫性病害的监测、预测预报和防治提供理论基础和技术保障。

附图说明

图1：cgmmv-rpa反应时间优化；其中，m：2,000bpdnamarker；泳道a～d分别为10-40min反应时间；

图2：rt-rpa灵敏度检测；其中，m：2,000bpdnamarker；1～7：pcr模板分别为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍的反转录产物；8：以ddh2o为模板的阴性对照；

图3：rt-rpa反应特异性检测；其中，m：2,000bpdnamarker；a～e分别为：cgmmv、ddh2o、西瓜花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、南瓜花叶病毒；

图4：rt-rpa田间样品检测；其中，m：2,000bpdnamarker；1、4、9、11未检出病毒，2-3、5-8和10检测结果为带毒样品，其中a为pcr检测，b为rpa检测。

具体实施方式

实施例：

1.cgmmv基因特异性引物

根据cgmmv-lnxg分离物基因组(ky040049.1)序列，根据rpa引物的设计原则，利用软件及人工修正设计检测cgmmv的特异性rpa引物对cgmmv-f/cgmmv-r，引物序列见表1。

2.西瓜样品总rna的快速提取

在洗净灭菌的研钵中放入0.1g样品材料加液氮研磨，再加入1mltrizolreagent试剂混匀。将以上匀浆样本转移到2mlrnase-free的离心管中，加盖好后剧烈震荡混匀，室温放置5min；加入0.2ml氯仿，上下颠倒混匀15s，室温放置15min；4℃，12,000rpm，离心20min，将上层无色水相转入新的1.5mlrnase-free离心管；加入等体积异丙醇(约400-500ul)，混匀，室温静置10min；4℃，12,000rpm，离心10min；小心弃去上清，得到胶状rna沉淀；加入1ml75％无水乙醇(rnase-freeddh2o配置)，涡旋混匀，令rna与乙醇充分接触，静置1-2min；4℃，7,500rpm，离心5min；小心弃去上清液。重复上述两步步骤；置于空气中5-10min，干燥rna沉淀；加入适量rnase-freeddh2o溶解，待浓度测定和电泳检测后于-80℃保存。通过超微量分光光度计检测，总rna的浓度为689.2-863.3ng/μl；总rna的a260/a280和a260/a230的比值分别2.01-2.05和1.79-1.92。

3.反转录

取总rna2μl(约2μgrna)为模板，加入0.5μloligodt(0.5μg/μl)、0.5μl随机引物(0.5μg/μl)和1μldntps(10mm)，depc水定容至14.5μl，70℃反应5min，冰上放置3-5min；加入4μl5×反转录buffer、0.5μlribonucleaseinhibitor(40u/μl)和1μlm-mlv反转录酶(200u/μl)，混匀后42℃水浴1h。获得的cdna置于-20℃保存。

4.cgmmv-rpa反应体系建立——反应时间优化

以总rna反转录制备的cdna为模板,采用cgmmv-f和cgmmv-r进行rpa扩增。rpa扩增体系如下：向含有冻干酶粉的0.2mltwistamp反应管(twistampbasickits，twist)中加入再水化缓冲液(rehydrationbuffer)29.5μl，去离子水12.5μl，上、下游引物各2μl(终浓度为0.4μmol/l)，模板cdna1μl，最后再加入醋酸镁溶液2.5μl(280mmol/l)。将rpa扩增体系充分混匀，置于37℃的水浴锅中分别反应10min、20min、30min、40min。rpa反应结束后，使用dna纯化试剂盒对产物进行纯化，并于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像系统上观察结果。结果表明，如图1所示，在10min的反应后，出现了一个清晰的预期大小的条带(～140bp)。dna条带的密度分析表明，20min反应后的dna产率是10min反应的2倍，而30和40min的产物之间没有显著差异。因此，在随后的研究中，将30分钟作为所有常规rt-rpa检测的反应时间。

5.cgmmv-rpa灵敏度检测

将提取的总rna进行10倍连续稀释，依次为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6分别作为模板进行反转录得到cdna,以最佳反应条件进行rpa检测，以确定最低检出限度，见图2。

6.cgmmv-rpa反应特异性检测

为验证cgmmv-rpa反应体系的特异性，分别以西瓜花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒和南瓜花叶病毒侵染的西瓜材料进行rpa扩增。采用1.5％的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳，利用凝胶成像系统观察电泳结果，对cgmmv-rpa反应体系的特异性进行验证，见图3。结果表明，非目的病原物侵染的西瓜材料不能扩增出其他条带，说明本专利发明设计的检测体系特异性强。

7.cgmmv-rpa的田间样品检测

从辽宁省沈阳市新民市梁山镇、大连市瓦房店市三台子东蓝旗、营口市盖州市博洛铺、锦州市凌海市右卫镇、锦州市黑山县半拉门镇、盘锦市盘山县石新镇、朝阳市建平县黑水镇等地采集西瓜叶片，按照上述方法对部分样品进行rt-rpa检测；同时，以普通rt-pcr法对同一批样品进行平行检测，并对结果进行观察比对分析并记录。结果表明，11份样品中，7份检测为带毒样品，检测结果与pcr结果一致，检测准确性为100％。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>沈阳农业大学

<120>一种西瓜血瓤病诊断及病原物检测的rpa方法

<130>2010

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>140

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acttattgcgtttagtgcttcttatgttcccgtcaggactttacttaattttctagttgc60

ttcacaaggtaccgctttccagactcaagcgggaagagattctttccgcgagtccctgtc120

tgcgttaccctcgtctgtcg140

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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