鸭2型甲肝病毒的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒的制作方法

本发明提供一种鸭2型甲肝病毒（dhav-2）的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒，属于动物传染病学领域。

背景技术：

当前，引起雏鸭病毒性肝炎的病原为鸭甲肝病毒（duckhepatitisavirus，dhav），属小rna病毒科（picornaviridae）禽肝病毒属（avihepatovirus）成员，分为三种基因型：dhav-1、dhav-2和dhav-3。dhav病毒完整基因组长约7.7kb，单股正链rna。基因组rna由5’非编码区（untranslatedregion,utr）、一个开放阅读框（orf）、3’utr和poly（a）尾巴组成，它作为遗传物质稳定传代的同时还可以直接作为mrna指导合成一条完整的病毒多肽链（polyprotein）（即开放阅读框orf）。5’utr长626nt，含有丰富的二级结构。dhav的3′utr长为314~317nt，为已知小rna病毒科成员中3′utr最长的病毒。dhav的orf可进一步切割形成l-vp0-vp3-vp1-2a1-2a2-2b-2c-3a-3b-3c-3d。

关于dhav各地的流行病学数据存在较大差异，1945年，第一株鸭病毒性肝炎病毒发现于美国纽约长岛鸭场。1950年，levine和fabricant从鸡胚中首次分离到鸭病毒性肝炎病原，随后世界上很多国家相继报道了dhav-1的流行。在我国，1963年上海畜牧研究所的黄均建首次报道了鸭病毒性肝炎发现于上海；1980年，王平等在北京地区分离到了第一株dhav-1。随后，浙江、福建等地都先后报道了dhav-1的发生和流行。苏敬良等于1999年5月从北京、广西疑似鸭肝炎的病死鸭体内分离到2株病毒（分别编号为b株和c株），经鸭胚血清中和试验表明两者为同一血清型，但与经典dhav-1无血清学交叉免疫反应，人工感染雏鸭可复制出与临床病例相似的病变，于是认为有新的血清型出现，并把分离到的病毒命名为新型dhav，基因组序列测定表明该毒株与kim报道的韩国新型同源性最高。袁率珍等对1999-2010年从广东、山东、云南、河南和黑龙江等地发病死亡雉鸭分离得到dhav分离株进行血清型鉴定与抗原相关vpl基因序列分析，结果表明目前dhav-1和dhav-3两种基因型同时流行。流行病学调查显示，dhav-2仅在我国台湾地区报道（tsengch,tsaihj.molecularcharacterizationofanewserotypeofduckhepatitisvirus.virusres,2007,126(1-2):19-31.）。目前genbank数据库仅2株dhav-2基因组序列，90d株，genbank登录号ef067924；04g株，genbank登录号ef067923，dhav-2在我国大陆地区和世界其他国家和地区尚未见该病报道。

实时荧光定量pcr方法（realtimepcr）是一种在dna扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（pcr）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定dna序列进行定量分析的方法。实时荧光定量pcr是在pcr扩增过程中，通过荧光信号，对pcr进程进行实时检测。由于在pcr扩增的指数时期，模板的ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。当前国内外尚未见利用sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr检测鸭2型甲肝病毒的试剂盒相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

技术实现要素：

本发明的目的是为了填补现有国内外尚未见利用sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr检测鸭2型甲肝病毒（dhav-2）的相关研究报道，提供一种鸭2型甲肝病毒的sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测40.8个拷贝，可用于对临床样本中鸭2型甲肝病毒的分子流行病学调查及其感染程度分析，为明确鸭2型甲肝病毒的分子流行病学特点及其致病机理提供检测方法和手段。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鸭2型甲肝病毒实时荧光定量pcr检测的引物，所述引物序列如下：

上游引物dhav-2-f：5’-ctgtgatttgtgcagaaaaatga-3’，

下游引物dhav-2-r：5’-ggtctgattcaatttcaagatgga-3’；

目的片段大小为113bp。

同时提供用于检测鸭2型甲肝病毒的实时荧光定量pcr的试剂盒，包含所述鸭2型甲肝病毒实时荧光定量pcr检测的引物（上游引物dhav-2-f和下游引物dhav-2-r）。

一种检测鸭2型甲肝病毒的实时荧光定量pcr方法的建立：

1、鸭2型甲肝病毒阳性标准品的构建

本研究经过分析比对，选取dhav-1、dhav-2和dhav-3三个基因型相互之间氨基酸同源性最低的蛋白（2a2）为设计的基因靶区来设计引物。本研究直接利用全基因合成技术合成dhav-2（90d株）全基因组序列，全基因合成在生工生物工程(上海)股份有限公司进行，并将获得的质粒作为本研究的阳性标准质粒（t-dhav-2），经线性化酶切后进行连续倍比稀释后-80℃冻存备用（质粒浓度为4.08×10⁸～4.08×10⁰拷贝/μl）。

2、实时荧光定量pcr反应体系和程序：

建立的鸭2型甲肝病毒实时荧光定量pcr检测方法，优化出的20μl最佳反应体系为：tbgreenpremixextaq（tlirnasehplus）（2×）混合液10μl、上/下游引物（dhav-2-f、dhav-2-r）（10μmol/l）各0.4μl、模板2μl、水补足至终体积20μl。

优化出的最佳反应条件为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃20s，40个循环；循环结束后，做出融解曲线。

用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgc）为横坐标，以循环数阈值（cyclethreshold，ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线），获得其敏感性试验数据。

有益效果：

本发明提供的一种鸭2型甲肝病毒的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒，具有以下优点和效果：

1、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量pcr机器自带的程序进行结果判定。从核酸提取到结果判定仅需2.5h，且一次可以同时进行96个样品检测。

2、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，可根据实时荧光定量试验检测的待检样品中的ct值，直接计算出待见样品（检测结果为阳性）的拷贝数，可直接对其鸭2型甲肝病毒感染程度进行准确定量。

3、灵敏度高：最低可检测40.8个拷贝。

4、特异性强：特异性强：对鸭群中的常见传染病（如dhav-1、dhav-3、禽流感病毒、禽1型副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒、禽坦布苏病毒）均无反应信号，仅对鸭2型甲肝病毒检测出现单一的特异性峰，无引物二聚体及非特异性产物。

5、重复性好：建立的sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr方法进行鸭2型甲肝病毒检测的组内变异系数为0.59-1.88%，组间变异系数0.64-2.30%，重复性好。

附图说明

图1实时荧光定量检测鸭2型甲肝病毒的pcr方法的扩增曲线。其中1～8：4.08×10⁷～4.08×10⁰拷贝/μl。

图2实时荧光定量检测鸭2型甲肝病毒的pcr方法的标准曲线。

图3实时荧光定量检测鸭2型甲肝病毒的pcr方法的融解曲线。其中dhav-2：dhav-2阳性对照；试验对照：dhav-1、dhav-3、禽流感病毒、禽1型副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒、禽坦布苏病毒，因均没有特异性tm峰值，肉眼无法区分。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、相关试验病原

试验用病原鸭2型甲肝病毒（dhav-2）、dhav-1、dhav-3、禽流感病毒、禽1型副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒、禽坦布苏病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

2、引物设计

参考鸭2型甲肝病毒（鸭2型甲肝病毒90d株，genbank登录号为ef067924）基因序列特征，设计实时荧光定量检测鸭2型甲肝病毒的pcr方法的特异性引物（dhav-2-f、dhav-2-r），引物设计区选择dhav-2与dhav-1、dhav-3氨基酸同源性最低的2a2蛋白区域设计，三种相关蛋白的氨基酸同源性低于70.0%。设计的特异性引物序列为：

上游引物dhav-2-f：5’-ctgtgatttgtgcagaaaaatga-3’，

下游引物dhav-2-r：5’-ggtctgattcaatttcaagatgga-3’；

目的片段大小为113bp。

并在ncbi数据库进行引物blast分析，验证设计引物的特异性。

上述引物均在宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

3、鸭2型甲肝病毒实时荧光定量pcr检测方法的建立

3.1鸭2型甲肝病毒阳性标准品的构建

本研究直接利用全基因合成技术合成dhav-2（90d株）全基因组序列，全基因合成在生工生物工程(上海)股份有限公司进行，并将获得的质粒作为本研究的阳性标准质粒（t-dhav-2），经线性化酶切后进行连续倍比稀释后-80℃冻存备用（质粒浓度为4.08×10⁸、4.08×10⁷、4.08×10⁶、4.08×10⁵、4.08×10⁴、4.08×10³、4.08×10²、4.08×10¹、4.08×10⁰拷贝/μl）。

3.2鸭2型甲肝病毒实时荧光定量pcr方法的建立

以鸭2型甲肝病毒阳性标准品（t-dhav-2）为模板，进行连续稀释（质粒浓度为4.08×10⁷、4.08×10⁶、4.08×10⁵、4.08×10⁴、4.08×10³、4.08×10²、4.08×10¹、4.08×10⁰拷贝/μl），在不同退火温度和引物浓度下进行实时荧光定量pcr反应，对反应条件进行优化。

优化出的20μl最佳反应体系为：tbgreenpremixextaq（tlirnasehplus）（2×）混合液10μl、上/下游引物（dhav-2-f、dhav-2-r）（10μmol/l）各0.4μl、模板2μl、水补足至终体积20μl。

优化出的最佳反应条件为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃20s，40个循环；循环结束后，做出融解曲线。

用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgc）为横坐标，以循环数阈值（cyclethreshold，ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线），获得其敏感性试验数据。

从图1可以看出，建立的实时荧光定量pcr方法最低检测限为40.8拷贝/μl（图1中第7号）。以各标准品中质粒含量（c）的常用对数（lgc）为横坐标，以循环数阈值（cyclethreshold，ct值）为纵坐标，获得鸭2型甲肝病毒实时荧光定量pcr标准曲线（图2），所获得标准曲线斜率为-3.457，y轴截距为39.86，相关系数为0.999，扩增效率为95%，符合实验预期。

观察溶解曲线峰值（tm值）分析试验结果：在tm=（83.54±0.13）℃出现单一的特异性峰判为鸭2型甲肝病毒阳性（图3）。对其他病原（如dhav-1、dhav-3、禽流感病毒、禽1型副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒、禽坦布苏病毒）均未见特异性扩增（图3）。

3.3重复性试验

实时荧光定量pcr方法检测标准阳性样品的组内变异系数为0.59-1.88%，组间变异系数0.64-2.30%，表明建立的实时荧光定量pcr检测方法重复性好。

4、临床应用

对75份临床送检鸭源病料进行鸭2型甲肝病毒感染的实时荧光定量rt-pcr检测，用病毒核酸提取试剂盒easypureviraldna/rnakit提取相应的rna，按照建立实时荧光定量pcr体系和条件进行检测。结果发现，在tm=83.60℃出现单一的特异性峰的除本研究合成的阳性质粒对照外，临床收集的75份鸭病料均为检测到阳性扩增信号，表明我们收集的75份疑似病料未出现dhav-2感染。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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<110>福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>鸭2型甲肝病毒的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒

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