单纯疱疹病毒II型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及病原微生物的检测
技术领域：
，尤其涉及单纯疱疹病毒ii型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法。
背景技术：
：单纯疱疹是一种由单纯疱疹病毒所致的病毒性皮肤病，能引起人类多种疾病，如龈口炎(gingivostomatitis)、角膜结膜炎(keratoconjunctivitis)、脑炎(encephalitis)以及生殖系统感染和新生儿的感染。单纯疱疹病毒(hsv)属于疱疹病毒科a病毒亚科，病毒质粒大小约180纳米。根据抗原性的差别目前把该病毒分为i型(hsv-1)和ii型(hsv-2)。hsv-1主要由口唇病灶获得，hsv-2可从生殖器病灶分离到。感染是由于人与人的接触，是最易侵犯人的一种病毒，但在临床仅有一部份发病。此病可分为：口唇性疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、阴部疱疹、卡波西病等，有时也是脑膜炎、脑炎的病因。hsv可通过胎盘感染，影响胚胎细胞分裂，造成流产、胎儿畸形、智力低下等先天性疾病，新生儿在通过hsv-2感染的产道时会被感染，出现高热、呼吸困难和中枢神经系统病变。必要的产检并且进行早期抗感染治疗，可以有效减少hsv-2患者将病毒传播给下一代。hsv基因组为一线性dna分子，由共价连接的长片段(l)和短片段(s)组成，每片段均含有单一序列和反转重复序列，其中长片段单一序列分别为ul1-ul56，另有2条命名为ul26.5和ul49a，长片段反转重复序列分别为rl1和rl2，短片段单一序列分别为us1-us12，另有1条命名为us8a，短片段反转重复序列为rs1。基因组共编码70多种各异的蛋白质，其中除24种蛋白的特性还不清楚外，有18种编码蛋白组成病毒dna结合蛋白及各种酶类，参与病毒dna合成，包装及核苷酸的代谢等。30多种不同蛋白组成病毒结构蛋白(如衣壳蛋白、囊膜蛋白)，在保护hsv的dna，以及hsv的致病作用和诱导机体免疫应答中起重要作用。目前，单纯疱疹病毒的检测方法主要有细菌的分离培养、免疫学诊断和分子生物学诊断，三种方法具有以下特点：1)病毒分离培养是当今临床上明确诊断疱疹病毒感染的可靠依据。可采集皮肤、生殖器等病变部位的水疱液、脑脊液、角膜刮取物、唾液等标本，接种人二倍体成纤维细胞株wi38及其它传代细胞株如vero、bhk等，经24～48小时后，细胞则出现肿胀、变圆、细胞融合等病变。病毒分离培养时间周期长、操作繁琐、需要专业操作人员和严苛的实验室条件，因此临床快速诊断方面应用很少。2)免疫学诊断诊断还存在滞后性，不能准确反映当前是否感染或携带病原体，难以满足早期诊断的要求。3)病原体核酸检测：具有快速、准确、检测窗口短、高灵敏度等优点，能够对病原物作出早期诊断，给疫情的快速分析和控制提供有力的技术支撑。其中实时定量pcr检测平台已成为最简捷和可靠的核酸检测方法，在目前国内外的核酸诊断中应用最为广泛，检测原理为，检测探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸，当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光，引物延伸时，与模板结合的探针被taq酶(5′→3′外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。在每次pcr循环中，都有新的报告基团被剪切，因此荧光信号强度的增加与扩增产物的数量成正比，可实时监控扩增情况。目前产品大部分采取针对hsv-1/hsv-2单一的荧光定量pcr检测方法，必须对一个临床样本进行分管检测，才能分别得出结论，增加了检测成本和操作繁琐度。国内外已有大量报道，介绍hsv-1/hsv-2核酸分型检测，应用到的靶标主要包括：糖蛋白g(us4，核酸相似度78.4％)、糖蛋白j(us5，核酸相似度69.8％)、糖蛋白d(us6，核酸相似度79.2％)、糖蛋白i(us7，核酸相似度69.6％)、糖蛋白e(us8，核酸相似度67.3％)、糖蛋白b(ul27，核酸相似度77.3％)、dna聚合酶(ul30，核酸相似度89.1％；ul42，核酸相似度76.6％)、胸苷激酶(ul23，核酸相似度79.9％)等。以上靶基因均为单拷贝，由于丰度不足，在检测过程中易造成漏检。而由于两种hsv型间核酸相似度均在65％以上，甚至有些基因的相似度高达80％～90％。hsv-1与hsv-2两者之间的高相似度，造成了对hsv分型检测的困难。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供本发明要解决的技术问题在于提供单纯疱疹病毒i型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法。本发明提供了rs1片段作为hsv-2病毒检测标志物的应用。hsv的rs1片段在基因组中共有2个拷贝，且该片段在hsv-1和hsv-2之间存在着较大的差异(核酸相似度58.1％)。本发明对hsv-2进行检测的特异性靶基因片段序列为：gtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcagacgaggaggcggatgcagacgaggaggaggaggcggaggaggaggcggaggacgccgacgacgaggatccggattttgatgagtcagaggcggccgag(seqidno.7)。本发明提供了hsv-2病毒检测试剂盒，其包括：seqidno:1～2所示核苷酸序列的2条引物。本发明所述的试剂盒中，还包括seqidno:3所示核苷酸序列的探针。本发明所述的引物和探针针对rs1片段设计，具有良好的准确性、灵敏度、特异性，即便在同一个扩增体系中进行检测，也能够良好的区分hsv的i型和ii型。其最低检测限可达5拷贝。本发明所述的探针的荧光报告基团选自fam、joe或hex或vic、rox、cy3或cy5、texasred；荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1、mgb和tamra。本发明实施例中，所述hsv-2病毒检测探针的荧光基团为fam，淬灭基团为bhq1。本发明所述的试剂盒中，还包括荧光定量pcr检测试剂和/或样本提取试剂；所述荧光定量pcr检测试剂包括qpcrmastermix酶混合液、qpcrmastermix反应缓冲液；所述样本提取试剂包括naoh、tritonx-100和te缓冲液。所述qpcrmastermix酶混合液，包括taq酶和ung酶，所述的taq酶为anstarttaqdna聚合酶，所述的ung酶为尿嘧啶-n-糖基化酶。所述样本提取液包括naoh终浓度为0.01％～0.5％，优选为0.1％。所述样本提取液包括tritonx-100终浓度为0.01％～0.5％，优选为0.1％。进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照。本发明的阴性对照品为depc水。本发明的阳性对照品为含有hsv-2靶基因片段的质粒溶液。所述hsv-2特异性靶基因片段序列为：gtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcagacgaggaggcggatgcagacgaggaggaggaggcggaggaggaggcggaggacgccgacgacgaggatccggattttgatgagtcagaggcggccgag(seqidno.7)。作为优选的，含有hsv-2靶基因片段的质粒溶液浓度为10000拷贝/μl，对应的ct值在23左右。进一步的，所述试剂盒中，还包括内参引物和探针。本发明采用的内参基因为hbb，所述hbb特异性靶基因片段序列为：tctgactcctgaggagaagtctgccgttactgccctgtggggcaaggtgaacgtggatgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatg(seqidno.8)。针对hbb的引物包括：seqidno:4～5所示核苷酸序列的2条引物。针对hbb的探针的核苷酸序列如seqidno:6所示。hbb-p探针荧光基团为rox，猝灭基团为bhq1。本发明提供了检测hsv-2病毒的方法，其包括：seqidno:1～2所示核苷酸序列的2条引物和seqidno:3所示的探针对待测样品dna进行实时荧光定量pcr检测，产生s型扩增曲线则为阳性。所述实时荧光定量pcr的体系包括：水补足至25μl。体系中，所述引物浓度为100～1000nm，优选为500nm。所述探针浓度为10～500nm，优选为200nm。所述反应缓冲液为qpcrmastermix反应缓冲液，一些实施例中，采用anstartqpcrmastermix反应缓冲液。所述酶混合液为qpcrmastermix酶混合液。一些实施例中，采用anstartqpcrmastermix酶混合液。所述实时荧光定量pcr的程序包括：50℃2分钟；95℃5分钟预变性；95℃15秒→60℃35秒，45个循环。本发明提供了检测hsv-2病毒的方法，其包括：seqidno:1～2所示核苷酸序列的2条引物对待测样品dna进行实时荧光定量pcr检测，产生s型扩增曲线则为阳性。所述实时荧光定量pcr的体系包括：体系中，所述引物浓度为100～1000nm，优选为500nm。所述探针浓度为10～500nm，优选为200nm。所述反应缓冲液为含染料(如sybrgreen、evagreen)的qpcrmastermix反应缓冲液，一些实施例中，采用含染料的anstartqpcrmastermix反应缓冲液。qpcrmastermix酶混合液。一些实施例中，采用anstartqpcrmastermix酶混合液。所述实时荧光定量pcr的程序包括：50℃2分钟；95℃5分钟预变性；95℃15秒→60℃35秒，45个循环。对于结果的判断，具体包括：待检样品dna的扩增曲线ct值<38且有典型s型扩增曲线，为阳性结果；待检样品dna的扩增曲线ct值等于45(或显示为undet)或无典型s型扩增曲线，为阴性结果；待检dna样品的扩增曲线38≤ct值<45，为灰色区域，如重测结果仍为ct值<45，且有典型s型扩增曲线，则判定为阳性结果；如ct值仍不显示或无典型s型扩增曲线，则判定为阴性结果；待检样品hsv-2为阴性的情况下，考察hbb扩增情况，或hbb没有s型扩增曲线，或者ct值大于35，表明取样失败、提取失败或加样错误，需重新试验。对于设置阳性对照的实验，还应满足：阳性对照，cy5通道、rox通道均有明显的扩增，具有典型s型扩增曲线，且ct值小于30；对于设置阴性对照的实验，还应满足：阴性对照，cy5通道、rox通道ct值＝45(或显示为undet)或无典型s型扩增曲线，进行后续判断，否则应进行问题查找。本发明所述的引物和探针可用于多种来源样品的检测。对生物样品的检测可以判断该样品是否被hsv-2感染，而对非生物样品的检测可以判断该样品是否被hsv-2污染。因此，本发明所述的试剂盒可用于样品的非诊断目的的检测。本发明中，所述检测的样品来自疱疹、阴道、泌尿道、医疗器械、药品、食品或化妆品。一些具体实施例中，所述的待测样品阴道分泌物、泌尿道分泌物和/或疱疹疱液。本发明的有益效果至少包括：(1)发明以hsv基因组中反向重复序列rs1为靶标区域，一方面基因组内有2个拷贝，可进一步提高检测灵敏度，另一方面型间核酸相似度低，不易造成交叉反应；(2)发明针对hsv-2/hbb的保守区域，共特异性设计了4条引物和2条taqman探针，与目的基因的保守区域结合，具有很高的特异性，与铜绿假单胞菌菌株cmcc10104、金黄色葡萄球菌菌株cmcc26001、脑膜炎奈瑟菌株cmcc29108、脑膜炎奈瑟菌株cmcc29204、干酪乳杆菌株cmcc34103、大肠埃希氏菌株cmcc44103、变形杆菌株cmcc49102、伤寒沙门氏菌株cmcc50096、福氏志贺氏菌株cmcc51573、白色念珠菌株cmcc98001、人型支原体(mh)、弓形虫(gd)、人乳头瘤病毒(hpv)、人巨细胞病毒(hcmv)、肺炎支原体(mp)、生殖支原体(mg)、加德纳杆菌(gv)、白色念珠菌(cc)、阴道毛滴虫(tv)、淋球菌(ng)、沙眼衣原体(ct)、解脲脲原体(uu)、细小脲原体(up)、hsv-1病毒均没有交叉反应；(3)靶标基因片段较短，均在100～150bp之间，若过短会影响ung酶的去污染效果，若过长会造成反应效率下降，因此本发明既能有效避免污染，又能保证反应的高效性和灵敏度，均能检测到低至5个拷贝的hsv-2dna；(4)在反应管内加入人类β-珠蛋白基因特异性引物探针，可有效监控样本采样、样本提取、pcr检测全过程，克服提取过程中加入外标，不能有效监控样本采样成功与否的弊端。本发明的试剂盒非常适合临床使用和推广，对我国的hsv-2的防控工作具有重要的意义。附图说明图1为实施例4特异性实验的hsv-2(fam通道)荧光检测结果，各检测曲线对应的模板是1：铜绿假单胞菌菌株cmcc10104、2：金黄色葡萄球菌菌株cmcc26001、3：脑膜炎奈瑟菌株cmcc29108、4：干酪乳杆菌株cmcc34103、5：大肠埃希氏菌株cmcc44103、6：变形杆菌株cmcc49102、7：伤寒沙门氏菌株cmcc50096、8：福氏志贺氏菌株cmcc51573、9：白色念珠菌株cmcc98001、10：人型支原体(mh)、11：弓形虫(gd)、12：人乳头瘤病毒(hpv)、13：人巨细胞病毒(hcmv)、14：肺炎支原体(mp)、15：生殖支原体(mg)、16：加德纳杆菌(gv)、17：白色念珠菌(cc)、18：阴道毛滴虫(tv)、19：淋球菌(ng)、20：沙眼衣原体(ct)、21：解脲脲原体(uu)、22：细小脲原体(up)、23：hsv-1病毒；图2为实施例5灵敏度实验的hsv-2(fam通道)荧光检测结果，各检测曲线对应的模板是1～7为含有hsv-2/hbb靶基因片段的质粒溶液，浓度依次为1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100拷贝/μl；图3为实施例6重复性试验的阳性对照100倍稀释品(r1)的hsv-2(fam通道)荧光检测结果。具体实施方式本发明提供了单纯疱疹病毒ii型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1：用于快速检测hsv-2的引物探针对的设计针对ncbi中hsv-2rs1基因hbb基因序列，设计引物对和探针，序列如下：表1引物和探针序列实施例2：用于快速检测hsv-2的实时荧光定量pcr试剂盒用于快速检测人hsv-2的实时荧光定量pcr试剂盒，包括hsv-2引物、hsv-2探针、hbb引物、hbb探针、酶混合液、反应缓冲液、样本提取液、阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体。其中引物hsv-2-f、hsv-2-r序列依次如seqidno.1-2所示，浓度500nm；探针hsv-2-p序列如seqidno:3所示，荧光基团为fom，猝灭基团为bhq1，浓度为200nm。其中引物hbb-f、hbb-r序列依次如seqidno.4-5所示，浓度500nm；探针hbb-p序列如seqidno:6所示，探针荧光基团为rox，猝灭基团为bhq1，浓度为200nm。其中anstartqpcrmastermix酶混合液、anstartqpcrmastermix5×反应缓冲液由菲鹏生物股份有限公司提供，anstartqpcrmastermix酶混合液稀释25倍使用，anstartqpcrmastermix5×反应缓冲液稀释5倍使用。其中样本提取液为含0.1％naoh、0.1％tritonx-100的te缓冲液。其中阳性对照品，为含有hsv-2、hbb靶基因片段的质粒溶液，浓度为10000拷贝/μl，对应的ct值均在在23左右。其中阴性对照品为depc水。其中阳性对照：hsv-2特异性靶基因片段序列为：gtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcagacgaggaggcggatgcagacgaggaggaggaggcggaggaggaggcggaggacgccgacgacgaggatccggattttgatgagtcagaggcggccgag(seqidno.7)。其中阳性对照：hbb特异性靶基因片段序列为：tctgactcctgaggagaagtctgccgttactgccctgtggggcaaggtgaacgtggatgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatg(seqidno.8)。实施例3：hsv-2核酸检测试剂盒的快速检测方法利用实施例2的试剂盒快速检测人阴道分泌物、泌尿道分泌物、疱液样本中的hsv-1，具体步骤如下：(1)核酸提取：分别向阴道分泌物4例(样本编号1-4)、泌尿道分泌物3例(样本编号5-7)、疱液样本3例(样本编号8-10)(采用病毒分离培养和分型法测定是否被hsv-2感染，该方法为目前行业金标准)收集管中加入1ml生理盐水，充分振荡洗涤棉拭子，然后将棉拭子靠壁挤干丢弃，取500μl液体转移至1.5ml的离心管中，13000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀中加入1ml生理盐水，打散沉淀，13000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀中加入已振荡混匀的样本提取液50μl，漩涡振荡器上振荡打散沉淀(必要时用枪头轻轻打散沉淀)，100℃干浴或者水浴10分钟，13000rpm离心5分钟，上清液用于pcr反应(吸取时不用触动管子底部的沉淀物)。(2)实时定量荧光pcr：利用上述hsv-2实时荧光定量pcr检测试剂盒进行pcr扩增反应，分别以提取的待检样品dna、阳性对照和阴性对照各5μl为模板。以单独的hsv-2引物、探针进行检测。将模板与试剂盒的试剂混合，进行实时荧光定量pcr反应，pcr反应条件设置为：50℃2分钟ung酶去污染，95℃5分钟预变性，95℃15秒→60℃35秒，cy5、fam、rox通道用于收集检测荧光信号，共45个循环。(3)结果判断：①应满足：阳性对照，fam通道、cy5通道、rox通道均有明显的扩增，具有典型s型扩增曲线，且ct值小于30；阴性对照，fam通道、cy5通道、rox通道ct值＝45(或显示为undet)或无典型s型扩增曲线，进行后续判断，否则应进行问题查找；②待检样品dna的扩增曲线ct值<38且有典型s型扩增曲线，为阳性结果；③待检样品dna的扩增曲线ct值等于45(或显示为undet)或无典型s型扩增曲线，为阴性结果；④待检dna样品的扩增曲线38≤ct值<45，为灰色区域，如重测结果仍为ct值<45，且有典型s型扩增曲线，则判定为阳性结果；如ct值仍不显示或无典型s型扩增曲线，则判定为阴性结果；⑤待检样品hsv-2为阴性的情况下，考察hbb扩增情况，或hbb没有s型扩增曲线，或者ct值大于35，表明取样失败、提取失败或加样错误，需重新试验。判定结果如表2：表2样品检测结果结果显示，hsv-2阳性样品4份，阴性样品6份。结果与现有技术鉴定一致，准确率可达100％。实施例4特异性实验利用实施例2中的试剂盒、实施例3的方法分别对铜绿假单胞菌菌株cmcc10104、金黄色葡萄球菌菌株cmcc26001、脑膜炎奈瑟菌株cmcc29108、脑膜炎奈瑟菌株cmcc29204、干酪乳杆菌株cmcc34103、大肠埃希氏菌株cmcc44103、变形杆菌株cmcc49102、伤寒沙门氏菌株cmcc50096、福氏志贺氏菌株cmcc51573、白色念珠菌株cmcc98001、人型支原体(mh)、弓形虫(gd)、人乳头瘤病毒(hpv)、人巨细胞病毒(hcmv)、肺炎支原体(mp)、生殖支原体(mg)、加德纳杆菌(gv)、白色念珠菌(cc)、阴道毛滴虫(tv)、淋球菌(ng)、沙眼衣原体(ct)、解脲脲原体(uu)、细小脲原体(up)及hsv-1病毒进行pcr检测，结果见图1，结果表明，各样本均为阴性。结果表明，本发明的检测试剂盒特异性高，与常见的阴道、生殖道感染样本均无交叉反应。实施例5灵敏度实验取阳性对照品(即含hsv-2/hbb靶基因片段的质粒溶液)，测定其浓度并计算拷贝数，按照10倍的浓度梯度稀释，选取1.0×100～1.0×106拷贝/μl(相当于病毒浓度50cfu/ml～5×107cfu/ml)的浓度作为样品，用本发明的试剂盒和检测方法进行检测。检测结果如图2所示，结果表明，本试剂盒对hsv-2的最低检出限浓度为1.0×100拷贝/μl(相当于病毒浓度为50cfu/ml)，即最低检出限为5拷贝(相当于病毒浓度50cfu/ml)。实施例6重复性试验取试剂盒中阳性对照的1000倍稀释品，命名为r1，用本发明的试剂盒和检测方法，连续重复10次试验，检测结果见图3、表3所示，结果显示阳性对照的100倍稀释品ct值变异系数均小于5％。表3重复性试验模板hsv-2(fam)r130.61r130.84r131.47r130.82r130.33r130.29r131.57r130.88r130.98r130.56平均值30.84标准差0.43cv值(％)1.39实施例7妇科用药对样本检测影响选择市面上常见的妇科用药及清洁品，包括消糜栓、硝呋太尔制霉素阴道软胶囊、美妇康卡波姆凝胶、宫炎洁卡波姆凝胶、氧氟沙星凝胶、氧氟沙星凝胶、甲硝唑呋喃酮栓、洁尔阴洗液，进行试验，验证其对试剂盒检测的影响。结果表明，0.1mg/ml消糜栓、10mg/ml硝呋太尔制霉素阴道软胶囊、10mg/ml美妇康卡波姆凝胶、10mg/ml宫炎洁卡波姆凝胶、10mg/ml氧氟沙星凝胶、10mg/ml甲硝唑呋喃酮栓、0.1％洁尔阴洗液，对检测不存在干扰。本发明提供的试剂盒能够实现对药品中是否存在hsv-2感染。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>中生方政生物技术股份有限公司<120>单纯疱疹病毒ii型检测标志物、引物探针对、试剂盒及检测方法<130>mp1833641<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gtcgtcgtcgtcgtcgtcgtc21<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ctcggccgcctctgactcatc21<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cctccgcctcctcctccgcc20<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tctgactcctgaggagaagtctgcc25<210>5<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5catgcccagtttctattggtctcctt26<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ccttgccccacagggcagtaacgg24<210>7<211>121<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gtcgtcgtcgtcgtcgtcgtcagacgaggaggcggatgcagacgaggaggaggaggcgga60ggaggaggcggaggacgccgacgacgaggatccggattttgatgagtcagaggcggccga120g121<210>8<211>138<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tctgactcctgaggagaagtctgccgttactgccctgtggggcaaggtgaacgtggatga60agttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagac120caatagaaactgggcatg138当前第1页12