一种粪链球菌及其应用的制作方法

本发明属于人体微生态学
技术领域：
，尤其涉及一种粪链球菌及其应用。
背景技术：
：乳酸菌(lacticacidbactria,lab)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏染色阳性细菌的通称，粪链球菌也属于此类。有学者将乳酸菌定义为：细胞为革兰氏阳性，细胞形态为杆状或球状，过氧化氢酶反应阴性，可发酵碳水化合物主要产乳酸，兼性或专性厌氧菌。消耗葡萄糖50％以上产生乳酸，不形成内生孢子，无运动性，或仅少数运动。乳酸菌在自然界分布广泛，与人类生活密切相关，可栖居于人和各种动物的肠道及其它器官内，且有的属种细菌对人致病，而益生乳酸菌通常被定义为有益于宿主健康的细菌，现已被广泛应用于食品加工、医药保健方面。从目前乳酸菌的分类工作看，这类菌在细菌分类学上现在划分至少有23个属，产细菌素的益生乳酸菌通常属于乳杆菌属,肠球菌属以及双歧杆菌属。这些益生乳酸菌是典型的化能有机营养菌，且能发酵碳水化合物产生乳酸作为主要终产物。在分类学上，具有发酵同类型碳水化合物，对不同浓度的nacl具有抵抗力，可以生长于不同营养介质、不同限定的温度范围及对抗生素有一定的抵抗力。另外，基于它们对低ph值和胆汁抵抗力以及温度生长范围等生理特性，生长于胃肠道中，将有益于乳酸菌产细菌素。益生菌的作用已被越来越多的人所接受，目前益生菌销售额逐年上升，主要菌种为嗜酸乳杆菌和双歧杆菌，但是益生菌的作用效果并不是预期的那样理想，由于乳酸菌的耐受性较差，不能耐受高温和酸碱和一些金属离子，因此，决定肠道优势菌的因素不仅取决于菌种的产酸能力，而且还与菌种是否产生细菌素等因素有关。细菌素是由某些细菌在发酵过程中通过核糖体合成机制产生的一类对亲缘关系接近有抑(杀)菌活性的蛋白或多肽类物质。细菌素是一类选择性作用于细菌靶细胞的抗菌物质，可以由革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌或某些古细菌产生。细菌素具有无抗药性、不残留、能够抑制或杀死某些致病菌等特点，它与抗生素完全不同的性质弥补了传统抗生素的缺陷，被认为是食品添加剂、化妆品、皮肤保健、抑制病原菌和调节肠道菌群的好材料，在医药、食品、等领域具有很好的应用前景。由于细菌素本身具有许多优良性质：具有较好的选择性杀菌效果，例如，有的人体的胃中有一种能致胃癌的幽螺门杆菌，细菌素对其有抑制和杀灭的作用。另外，细菌素易被人体消化道中的一些蛋白酶(如胰蛋白酶)所降解，不会在动物体内蓄积而引起不良反应，无副作用、无残留和无抗药性，同时也不污染环境；具有热稳定性，并耐酸、耐低温贮藏等优势，细菌素广泛使用于食品防腐剂中，细菌素比益生菌好，但没有广泛使用的最主要原因是纯化难度大，难以应用于工业化生产。作为益生菌之一的粪链球菌，其广泛应用仍然受上述限制，并且粪链球菌制为冻干菌粉的冻干工艺直接关系到冻干后菌粉的存活率，其制为冻干菌粉后，活菌数量较低，影响其效用。技术实现要素：为此，本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种能够稳定产生细菌室、抑制病原菌能力强且制为冻干粉后存活率高的粪链球菌。本发明所要解决的第二个技术问题是现有技术中的冻干菌粉工艺得到的粪链球菌菌粉的存活率低的问题，进而提供一种菌株存活率高的粪链球菌冻干粉的制备方法。本发明的粪链球菌，于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)予以保藏，保藏编号为：cgmccno.16128。所述的粪链球菌，其16srdna序列具有如seqidno.1所示的序列结构。所述seqidno.1的序列结构具体如下：gaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtagaacgctgaagagaggagcttgctcttcttggatgagttgcgaacgggtgagtaacgcgtaggtaacctgccttgtagcgggggataactattggaaacgatagctaataccgcataacaatggatgacacatgtcatttatttgaaaggggcaattgctccactacaagatggacctgcgttgtattagctagtaggtgaggtaatggctcacctaggcgacgatacatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatgggggcaaccctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgtaagtcaagaacgggtgtgagagtggaaagttcacactgtgacggtagcttaccagaaagggacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtcccgagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggtttgataagtctgaagttaaaggctgtggctcaaccatagttcgctttggaaactgtcaaacttgagtgcagaaggggagagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaggaacaccggtggcgaaagcggctctctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaggtgttggatcctttccgggattcagtgccgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcccgatgctatttctagagatagaaagttacttcggtacatcggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctattgttagttgccatcattcagttgggcactctagcgagactgccggtaataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggttggtacaacgagttgcgagtcggtgacggcgagctaatctcttaaagccaatctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagt。所述的粪链球菌在制备调理胃肠道健康和/或提高免疫力的保健品、乳制品、药物中的应用。优选地，所述的粪链球菌在制备治疗和/或预防腹泻的保健品、药物中的应用。由所述的粪链球菌制备得到的粪链球菌冻干粉。本发明的粪链球菌冻干粉的制备方法，包括如下步骤：向所述的粪链球菌中加入保护剂，混合均匀，将其置于-30～-50℃的温度下预冻1-3h，然后置于-10～-20℃的温度下升华10-20h，再置于-10～-25℃的温度下升华10-20h，再在20-30℃的温度下二次升华1-5h，在真空下放置1-5h后，即得粪链球菌冻干粉。优选地，所述保护剂为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸钠、l-半胱氨酸、明胶中的一种或多种。优选地，所述的粪链球菌冻干粉的制备方法，具体包括如下步骤：(1)取所述的粪链球菌，培养，得到发酵液；(2)取步骤(1)中发酵得到的所述发酵液，将其置于转速为8000-12000r/min下，离心10-30min，收集菌泥；(3)向步骤(2)中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂与所述菌泥的重量比为3:1，混合均匀，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5％，即得粪链球菌冻干粉。优选地，取所述的粪链球菌，按照0.5-3％的接种量接种至一级发酵培养基中培养，在温度为37±3℃、转速为100-180rpm的条件下，发酵12-14h，得到一级发酵液；然后，取所述一级发酵液，按照5-10％的接种量接种至二级发酵培养基中，在温度为37±3℃、转速为100-180rpm的条件下，培养4-6h，得到二级发酵液；再取所述二级发酵液，按照5-12％的接种量接种至三级发酵培养基中，在温度为37±3℃、转速为150-250rpm的条件下，培养14-16h，得到三级发酵液。优选地，所述一级发酵培养基、所述二级发酵培养基、所述三级发酵培养基的ph值均为7.0-7.4，并均包括如下组分：蛋白胨1.5重量份；酵母浸出粉0.6重量份；葡萄糖2重量份；可溶性淀粉0.05重量份；氯化钠0.5重量份；l-半胱氨酸盐0.05重量份；西红柿汁20重量份；吐温-800.01重量份；水解乳蛋白0.5重量份；琼脂粉2重量份。本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：(1)本发明所述的粪链球菌，从人体粪便中分离大量的粪链球菌，根据抑制病源菌能力、产酸能力、消化能力等试验，筛选出能够较好地消化蛋白、肉渣、玉米、淀粉、树叶、草的粪链球菌，得到本发明所述的粪链球菌，将其用于人体，因为同源菌种好定殖，粪链球菌会抑制有害菌，进而维护肠道菌群生态平衡，形成生物屏障，抑制有害菌对肠道的入侵。另外，所述粪链球菌还可以通过产生大量的短链脂肪酸促进肠道蠕动及菌体大量生长改变渗透压而防止便秘。此外，菌体崩解产物和代谢物中含有多种酶、小肽、短链脂肪酸等成分，补充营养成分等优势。由于人和动物为了维持生命必须摄入食物，当食物进入消化道后，除了机体本身分泌的唾液、胃液、胆汁、胰液等的消化作用外还需要有大量的肠道菌群去分解和消化食物。如果大量的服用抗生素会破坏菌群的微生态平衡，食物得不到充分消化。我们通过对草、叶、纸、淀粉、玉米、肉渣、蛋白进行消化试验，筛选出的所述粪链球菌不但抑制病原菌能力强，而且在消化蛋白、肉渣、玉米、淀粉、草、树叶等方面具有较强的功能。(2)本发明所述的粪链球菌，在人的胃肠道疾病中，特别是腹泻发挥了很好的预防和治疗作用，并且通过多种途径弥补了抗生素和疫苗的不足，为人类的健康和获得安全的食品开辟了新的途径。(3)本发明所述的粪链球菌，能够产生细菌素，其对大肠杆菌、沙门氏菌的抑菌直径较大，具有较强的抑制病原菌能力。(4)本发明所述的粪链球菌，耐酸耐胆盐性良好，且经过冻干粉等工艺操作后菌株活性仍然较为理想、种子的保存期长。且通过本发明所述的粪链球菌冻干粉的制备方法制备，制备过程中，采用特定的保护剂，使制为冻干粉后粪链球菌的保持较高的存活率。附图说明图1是本发明所述的粪链球菌的菌液镜检结果图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本实施例的粪链球菌，于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)予以保藏，保藏编号为cgmccno.16128。实施例1粪链球菌的分离筛选本发明的保藏编号为cgmccno.16128的所述粪链球菌从人体的粪便中分离，并通过如下方法分离得到：将人体肠道粪便1克，装入放由30个玻璃球的灭菌瓶内加生理盐水作100倍稀释充分打均后，再作10-3、10-4、依次到10-8稀释度，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8五个稀释度的菌液分别接种于lyt通用琼脂平板、伊红、美兰琼脂、bb(bs)双歧杆菌选择性培养基、lbs(lc)乳酸杆菌选择性培养基、ec肠球菌择基和sb酵母菌择基。每种培养基接6个平板，接种后立即上下翻转培养皿使接种液在平皿表面均匀扩散。其中3个作需氧培养，24小时后即观察。另3个作培养48小时。经过肉眼观察和解剖显微镜45℃角折射光观察。将每种菌落再移植到lyt琼脂一个菌落及液体培养基一个菌落，分别做厌氧和需氧，同时涂片作革兰氏染色镜检，分离出138个菌株，进行鉴定结果属于8个科，11个属的36种菌，其中所分离筛选出的菌种每月继代一次，5代前冻干保存。按照如下标准进行种子菌株的筛选：⑴.无内外毒素、无毒、无害、安全、无副作用；⑵.有利于促进体内菌群平衡或预防生态失调；⑶.高产抗菌活性物质、产酸能力强；⑷.来源于自身肠道的益生菌才具有较好的粘附性能。得到具有抑制病原菌、调节肠道微生态平衡、提高机体免疫力的粪链球菌。所述粪链球菌的分离及选育具体方法如下：取粪便1g，置于装有10ml缓冲蛋白胨水的三角瓶中，振荡均匀。按10倍梯度稀释，选3个适宜稀释度各0.1ml涂布kf琼脂平板，37℃培养48h。挑选白色、表面光滑凸起、边缘整齐，直径约1.0～1.5mm的特征菌落。传于ptyg斜面培养后进行革兰氏染色，挑选镜检为革兰氏阳性，圆形成卵圆形，单个、成对或短链状排列的菌株纯化培养。将纯化后的菌株进行生长特性试验，接种6.5％氯化钠肉汤培养基和七叶苷斜面，37℃培养48h后，选择七叶苷水解阳性、6.5％氯化钠肉汤培养基上生长的菌株作为待筛菌株。将待测菌株接种ptyg液体培养基，37℃培养48h，转接平板，挑取单菌落，分别接种于ptyg基础半固体培养基和ptyg固体斜面上，38℃培养48h，并通过筛选得到耐酸和耐胆盐性能优良，且生长良好的、符合安全性试验的菌株。其中，所述粪链球菌的分离培养基为缓冲蛋白胨水溶液，具体包括如下成分：蛋白胨10g，na2hpo42g，葡萄糖5g，k2hpo42g，kcl5g，蒸馏水1000ml。制备方法如下：取10ml缓冲蛋白胨水置于50ml三角瓶，加入少量玻璃珠，121℃灭菌15min后备用。由于粪链球菌对叠氮钠有耐受性，同时具有能耐受45℃高温的特性，所述粪链球菌选择性培养基选择市售的kf培养基，结合高温培养条件，进行肠球菌的分离。经过验证，该方法能有效地分离出粪链球菌。得到的所述粪链球菌为革兰氏阳性杆菌，其特性如下：粪链球菌为革兰氏阳性球菌，直径0.5-1.0μm，菌体单个或成对存在，也常形成不规则的团堆，如图1所示。所述粪链球菌中等偏大菌落，呈灰白色，光滑，边缘整齐。其检验标准为：应无杂菌，转种时od600值为1.9-2.4。粪链球菌的形态学鉴定如下：将斜面或半固体深层保存菌种划线接种ptyg平板，37℃需氧培养24h。具体实验方法如下：将所述粪链球菌n9024株的基础种子分别接种ptyg液体培养基，粪链球菌37℃静置培养18h制备生产种子。将生产种子在ptyg液体培养基中连传13代(培养方法同上)，观察和测定不同代次菌种的形态、培养特性、和活菌数，以确定生产菌种的代次。其测试结果如下：表1不同传代次数的粪链球菌的od值及活菌数上述结果显示生产种子传至13代时，所述粪链球菌不低于1.0×109cfu/ml，其能够保证生物制品生产的正常进行，表明保藏编号为cgmccno.16128的所述粪链球菌的生产种子在1-13代活力稳定。所述粪链球菌的第1代、第10代、第13代生产种子的菌液均为组成均一的菌株，其形态特征与原始种子一致，其菌液镜检结果如图1所示，表明四种菌的生产种子在1-13代内其形态特征稳定。所述的粪链球菌，其16srdna序列具有如seqidno.1所示的序列结构。所述seqidno.1的序列结构具体如下：gaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtagaacgctgaagagaggagcttgctcttcttggatgagttgcgaacgggtgagtaacgcgtaggtaacctgccttgtagcgggggataactattggaaacgatagctaataccgcataacaatggatgacacatgtcatttatttgaaaggggcaattgctccactacaagatggacctgcgttgtattagctagtaggtgaggtaatggctcacctaggcgacgatacatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatgggggcaaccctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgtaagtcaagaacgggtgtgagagtggaaagttcacactgtgacggtagcttaccagaaagggacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtcccgagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggtttgataagtctgaagttaaaggctgtggctcaaccatagttcgctttggaaactgtcaaacttgagtgcagaaggggagagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaggaacaccggtggcgaaagcggctctctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaggtgttggatcctttccgggattcagtgccgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcccgatgctatttctagagatagaaagttacttcggtacatcggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctattgttagttgccatcattcagttgggcactctagcgagactgccggtaataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggttggtacaacgagttgcgagtcggtgacggcgagctaatctcttaaagccaatctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagt。实施例2粪链球菌冻干粉的制备本实施例的粪链球菌为保藏编号为cgmccno.16128的菌株，其通过如下方法制备为粪链球菌冻干粉：(1)取所述的粪链球菌，按照1％的接种量接种至一级发酵培养基中培养，在温度为37±3℃、转速为100-180rpm的条件下，发酵12-14h，得到一级发酵液；然后，取所述一级发酵液，按照5-10％的接种量接种至二级发酵培养基中，在温度为37±3℃、转速为100-180rpm的条件下，培养4-6h，得到二级发酵液；再取所述二级发酵液，按照5-12％的接种量接种至三级发酵培养基中，在温度为37±3℃、转速为150-250rpm的条件下，培养14-16h，得到三级发酵液；其中，所述一级发酵培养基、所述二级发酵培养基、所述三级发酵培养基为同一培养基，其ph值均为7.0-7.4，并均包括如下组分：蛋白胨1.5重量份；酵母浸出粉0.6重量份；葡萄糖2重量份；可溶性淀粉0.05重量份；氯化钠0.5重量份；l-半胱氨酸盐0.05重量份；西红柿汁20重量份；吐温-800.01重量份；水解乳蛋白0.5重量份；琼脂粉2重量份。(2)取步骤(1)中发酵得到的所述发酵液，将其置于离心机中，转速为8000r/min，离心30min，收集菌泥；(3)向步骤(2)中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂为蔗糖、脱脂奶粉和明胶按照5:3:1的重量比混合而成。将所述蔗糖、所述脱脂奶粉、所述明胶混合均匀，经115℃灭菌30min，待冷却至室温后，在无菌条件下与所述菌泥按照3:1的重量比混匀，制成菌悬液，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5％，即得粪链球菌冻干粉。实施例3粪链球菌冻干粉的制备本实施例的粪链球菌为保藏编号为cgmccno.16128的菌株，其通过如下方法制备为粪链球菌冻干粉：(1)取所述粪链球菌，在温度为37℃下，初始ph值为7.5的凝固牛乳中培养36～48小时，作为本实施例的优选实现方式，所述粪链球菌按3％的接种量接种至作为培养基的凝固牛乳上，并采用摇瓶培养的方式培养；(2)取步骤(1)中发酵得到的所述发酵液，将其置于离心机中，转速为8000r/min，离心30min，收集菌泥；(3)向步骤(2)中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂为蔗糖、脱脂奶粉和明胶按照5:3:1的重量比混合而成。将所述蔗糖、所述脱脂奶粉、所述明胶混合均匀，经115℃灭菌30min，待冷却至室温后，在无菌条件下与所述菌泥按照3:1的重量比混匀，制成菌悬液，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5％，即得粪链球菌冻干粉。实施例4粪链球菌冻干粉的制备本实施例的粪链球菌为保藏编号为cgmccno.16128的菌株，其通过如下方法制备为粪链球菌冻干粉：向所述的粪链球菌中加入保护剂，混合均匀，将其置于-30℃的温度下预冻1h，然后置于-20℃的温度下升华10h，再置于-10℃的温度下升华20h，再在30℃的温度下二次升华5h，在真空下放置1h后，即得粪链球菌冻干粉。本实施例中，所述保护剂为脱脂奶粉，作为本实施例可替换的实现方式，所述保护剂还可替换为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸钠、l-半胱氨酸、明胶中的一种或多种。效果试验例为验证本发明的技术效果，进行以下实验：实验一、保藏编号为cgmccno.16128的粪链球菌种子的制备保存期试验取保藏编号为cgmccno.16128的所述粪链球菌，将基础种子冻干粉于-80℃条件下保存，保存期为2年，每两年检测一次。其中，活菌计数的方法具体如下：无菌称取3g所述粪链球菌制剂，加入27ml液体培养基或生理盐水，充分摇匀(用数个玻璃球摇打)后作10倍系列稀释，选择适宜稀释度进行接种。采用lbs选择性培养基，细菌的每个稀释度按0.2ml接种3个平板，并迅速转动平板，使菌液在培养基表面流匀。培养48小时后，观察每个平板上的细菌生长情况，并计数。当每个平皿上的菌落数小于10或大于300时，应重新调整最后稀释度，重新测定。根据3个平皿菌落总数按下列公式计算活菌数：检测结果如下：表2菌株在-80℃保存不同时间的活菌数表3菌株在4℃保存不同时间的活菌数表4菌株在25℃保存不同时间的活菌数本发明所述的粪链球菌及其发酵液在冰箱的冷藏室内放置一年，拿出后做抑制病原菌试验，抑制病原菌能力仍然很强。实验二、菌株的耐酸耐胆盐特性实验为了模拟动物体内的胃肠道环境，配制人工胃液和人工肠液，进行体外的耐酸耐胆性能的研究。此外作用时间也是进行此类试验时应考虑的重要问题之一。由于胆盐的存在改变了菌体外膜的通透性，所以对益生菌产生抑制、杀灭作用，进而影响益生菌的存活。耐胃酸试验：取保藏编号为cgmccno.16128的所述粪链球菌，置于人工胃液中，37℃静置培养0h、1h、2h、4h，取样测定活菌数，并计算存活率。其实验结果如下：耐胆酸盐试验：取保藏编号为cgmccno.16128的所述粪链球菌，以人工肠液为基础，向其中加入0.3％的胆盐，然后所述粪链球菌置于其中，在37℃静置培养0h、1h、2h、4h，取样测定活菌数，并计算存活率。其实验结果如下：本实验中还采用上述方法对市售的三种粪链球菌进行实验，市售的三种粪链球菌在模拟胃酸、胆酸盐的环境中培养4h后，活菌率均低于43％。由此可见，本发明的保藏编号为cgmccno.16128的所述粪链球菌的耐酸和耐胆盐性能优良。实验三、抑制病原菌能力实验取本发明的保藏编号为cgmccno.16128的所述粪链球菌、市售的粪链球菌，再取由中国药品监察所提供致病菌：致病性强毒大肠杆菌44365、致病性强毒沙门氏菌c-79-14、致病性强毒沙门氏菌c-79-20。分别检测各菌株对各致病菌的抑菌半径，并记录。其检测结果如下：实验四、保护剂对冻干粉工艺的影响实验本实验以存活率为指标，考察对保护剂的冻干保护作用。按照实施例2中的方式制备粪链球菌冻干粉，区别仅在于：将保护剂分别替换为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠、l-半胱氨酸、明胶、甘露醇，制备得到粪链球菌，分别测试得到的粪链球菌冻干粉在常温下保存30天后的存活率。由此可见，单一的成分作为保护剂的效果并不理想，且保护剂对所述粪链球菌的保护效果差异较大。为了验证该工艺的稳定性，对实施例2中的方案进行三次实验验证，活菌率结果分别为93.6、92.5、95.9，误差率＜4％，证实结果稳定可靠。按照实施例2中的方式制备粪链球菌冻干粉，区别仅在于：将保护剂分别替换为将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照1:1:1的重量比混合，并将其记为第一组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照1:3:2的重量比混合，并将其记为第二组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照1:5:3的重量比混合，并将其记为第三组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照2:1:2的重量比混合，并将其记为第四组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照2:3:3的重量比混合，并将其记为第五组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照2:5:1的重量比混合，并将其记为第六组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照3:1:3的重量比混合，并将其记为第七组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照3:3:2的重量比混合，并将其记为第八组；将实施例2制备得到的粪链球菌冻干粉，记为第九组。分别测试上述各组得到的粪链球菌冻干粉在常温下保存30天后的存活率。其检测结果如下：实验五、所述粪链球菌对小白鼠安全性试验取20-22g的小白鼠，清洁级试验用小白鼠40只，分4组，每组10只，其中1-3组均给于本发明所述的粪链球菌的活菌制剂，其中，所述粪链球菌不低于1.0×107cfu，给药周期为3天，给药结束后，观察所有小白鼠的临床症状，对试验结果进行评价。观察喂药后小白鼠的精神、采食、饮水、生长、增重等临床情况，以及观察试验期间动物是否有与药物相关的不良反应，如呼吸、行为异常、精神抑制及排粪异常等变化情况。并于给药前当天(第1天)以及实验结束的第13天记录每组小白鼠的重量，计算小白鼠的日均增重。其实验结果如下：各组在试验期间小白鼠全部健活，精神良好，食欲旺盛，皮毛肤色正常，排便排尿色泽形态正常，无其他异常临床症状、无生病及死亡显现。分别于给药前当天(第1天)、实验结束后第13天对每组小白鼠进行称重，并计算各组平均日增重。结果见下表：从表中发现3个实验组的小白鼠日均增重明显高于空白对照的第4组，表明本发明所述的粪链球菌对小白鼠有增重作用，且给药安全性检验合格。实验六、所述粪链球菌对犬肠道菌群失调腹泻模型的改善效果实验本试验采用头孢氨苄作为诱导药物，通过持续给药导致比格犬肠道菌群紊乱，构建试验犬抗生素相关性腹泻，具体包括如下步骤：取3.5～4月龄，体重5.0～6.5kg的普通级试验用比格犬25只，其中5只，作为对照组，另外20只以梯度增加诱导药物剂量的方式，连续给予抗生素诱导，构建试验犬肠道菌群失调腹泻模型，抗生素诱导15～20天，构模成功。将经抗生素诱导的20只比格犬分为高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组，对高剂量组、中剂量组、低剂量组分别给予高、中、低剂量的本发明所述的粪链球菌的活菌制剂，模型组不给药，给药周期为6～8天，给药结束后，观察所有犬只的临床症状。其实验结果如下：比格犬体重是一个直观、易考察的指标，且与多种因素密切相关。对治疗前后比格犬的体重进行分析。造模后对不同组的比格犬体重进行两两比较，组间试验犬的平均体重p＞0.05，说明使用抗生素造模对比格犬体重变化影响不大。连续给予所述粪链球菌剂制剂7天后，将模型组、低、中、高剂量组两两比较p＞0.05，说明不同剂量粪链球菌对试验犬的体重影响不显著。由于本试验中试验犬为幼犬，其体重尚处于增长状态中，且受多方面因素的影响，故该指标无法反应真实的体重恢复程度，仅可作为间接指标。粪链球菌制剂对菌群紊乱比格犬体重的影响结果如下：造模后平均体重治疗后平均体重对照组7.45±0.2728.33±0.272模型组8.13±0.2728.90±0.567粪链球菌低剂量组7.72±0.6357.98±0.862粪链球菌中剂量组7.44±0.5338.56±1.057粪链球菌高剂量组8.03±0.4298.93±0.821其中，单位：kg，n＝2或5。造模前，各组比格犬活泼好动，被毛平整光滑、粪便干燥成形，较为正常。造模结束时，对照组比格犬饮食正常，行动活跃，排便次数规律，粪便干燥成形。经抗生素诱导的试验犬逐步出现大便稀湿、机敏性降低、偶有厌食或乏力、呕吐等症状，属于抗生素过量致肠道菌群失调所导致的典型症状。粪链球菌制剂对试验犬粪便状态的影响检测结果如下表：其中，粪便状态：--成形便；+成形但水分稍多；++粘稠的溏稀便；+++水样便。所述粪链球菌制剂对稀便犬只治疗效果统计结果，如下表所示：由于粪便中的微生物占肠道微生物总量中的大部分，其构成反映了整个消化系统的菌群状态，又因为粪便采集容易、称量方便，所以我们通过分析粪便来研究肠道菌群。采用传统微生物学技术(稀释平板菌落计数法)，对犬粪便中可培养微生物进行了分析。经所述粪链球菌连续给药6～7天后，对照组取2份样品，模型组与粪链球菌给药组20只犬分别取样，共22份样品，进行常规的平板活菌计数。粪链球菌对比格犬粪便微生物数量的影响其检测结果如下：其中，logcfu/g，n＝2或5；表中，*p<0.05，**p<0.01。连续给粪链球菌活菌制剂7天后，通过犬只临床症状、粪便情况及菌群检测结果，统计不同剂量组对幼犬肠道菌群失调症的疗效。其检测结果如下：粪链球菌活菌制剂以2.0g/只/次，每天2次，连续喂服10天，可以缓解幼犬因肠道菌群失调症所致腹泻症状，促进犬只恢复菌群平衡。由此可见，本发明所述的粪链球菌具有调理胃肠道健康，提高免疫力的功能。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。sequencelisting<110>谭瑛<120>一种粪链球菌及其应用<130>2018<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1412<212>dna<213>粪链球菌<400>1gaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtagaacgctgaagagaggagcttgctctt60cttggatgagttgcgaacgggtgagtaacgcgtaggtaacctgccttgtagcgggggata120actattggaaacgatagctaataccgcataacaatggatgacacatgtcatttatttgaa180aggggcaattgctccactacaagatggacctgcgttgtattagctagtaggtgaggtaat240ggctcacctaggcgacgatacatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactg300agacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatgggggcaac360cctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgtaa420gtcaagaacgggtgtgagagtggaaagttcacactgtgacggtagcttaccagaaaggga480cggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtcccgagcgttgtccggattta540ttgggcgtaaagcgagcgcaggcggtttgataagtctgaagttaaaggctgtggctcaac600catagttcgctttggaaactgtcaaacttgagtgcagaaggggagagtggaattccatgt660gtagcggtgaaatgcgtagatatatggaggaacaccggtggcgaaagcggctctctggtc720tgtaactgacgctgaggctcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagt780ccacgccgtaaacgatgagtgctaggtgttggatcctttccgggattcagtgccgcagct840aacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattga900cgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaacctta960ccaggtcttgacatcccgatgctatttctagagatagaaagttacttcggtacatcggtg1020acaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaac1080gagcgcaacccctattgttagttgccatcattcagttgggcactctagcgagactgccgg1140taataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggct1200acacacgtgctacaatggttggtacaacgagttgcgagtcggtgacggcgagctaatctc1260ttaaagccaatctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgc1320tagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgccc1380gtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagt1412当前第1页12