一种从肝素副产物中分离提纯舒洛地特原料药的方法与流程

本发明涉及医药技术领域，具体为一种从肝素副产物中分离提纯舒洛地特原料药的方法。

背景技术：

舒洛地特，商品名为“伟素”，是一种低分子肝素类药物，与肝素同属糖胺聚糖类药物，舒洛地特含有硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素两个主要成分，由于作用原理不同而协同增效，舒洛地特可以口服、皮下或静脉用药，最后经过肾脏代谢，其生物利用度高，与内皮细胞有较高的亲和力，在吸收的药物中，至少有90％存在于血管内皮，对血管内皮有很好的保护作用，舒洛地特作为一种新型天然糖胺聚糖，具有抗凝、溶栓、抗心血管疾病、降血脂等作用，在治疗周围动脉疾病、心血管疾病、静脉炎后综合征、糖尿病并发症等方面也可发挥重要作用。

舒洛地特中硫酸乙酰肝素的含量为：≥70.00％，硫酸皮肤素的含量为：≤20.00％，国内一般生产舒洛地特是将硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素按照一定比例混合或者使用超滤离心等方式，生产出来的产品往往纯度不够，内部结构破坏较大，结构确认难、合格率低，将硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素简单的混合，工艺很难控制，使得最终的产品难以达到较高的要求，制成注射剂药物在使用过程中存在一定的缺陷，使用超滤离心又会造成生产成本高昂和工业化生产困难。

从猪小肠粘膜到肝素生产过程会产生大量副产物，其中含有硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸乙酰肝素等，但是由于其中有效物质分离困难，故生产肝素后一般将这些副产物丢弃，本发明能有效的进行分离提纯，使其成为制备舒洛地特原料的良好材料。

公开号为cn106883321a的中国专利公开了一种从肝素钠副产物中提取舒洛地特原料药的方法，该方法也以肝素副产物为原料，溶解后沉淀，收集沉淀物后经氧化、沉淀、干燥制得，该方法虽然工艺简单，但去除色素蛋白质等杂质的能力欠缺，且得到的产物中硫酸乙酰肝素组分与硫酸皮肤素组分比例不可控，产品外观不好。

技术实现要素：

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种从肝素副产物中分离提纯舒洛地特原料药的方法，解决了现有生产出来的产品往往纯度不够，内部结构破坏较大，结构确认难、合格率低，生产成本高昂和工业化生产困难，去除色素蛋白质等杂质的能力欠缺，且得到的产物中硫酸乙酰肝素组分与硫酸皮肤素组分比例不可控，产品外观不好的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种从肝素副产物中分离提纯舒洛地特原料药的方法，具体包括以下步骤：

s1、肝素副产物预处理：将肝素副产物溶解为质量分数5％-15％的溶液，升温至35-40℃，加料液体积2％的氯化钠溶解，然后加入95％的乙醇至乙醇浓度为30％-35％，保温4-5小时，倒出上层清液，去除下层沉淀；

s2、肝素的分离：向s1中得到上层清液中继续加95％的乙醇至乙醇浓度为46％-50％，保温4-5小时，沉淀脱水干燥烘干，即可得到去除肝素后的粗品；

s3、肝素粗品的预处理：将步骤s1中的粗品加水溶解为质量分数5％-15％的溶液，升温到25-30℃，加料液体积2％氯化钠溶解，然后用氢氧化钠溶液调ph至10-11，之后再加入2％无水碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，再加2％双氧水，然后通入臭氧曝气4-5小时；

s4、硫酸皮肤素的分离：将s3中氧化完成后的混合液用盐酸调ph为6.0，升温至35-40℃，然后加入95％的乙醇至乙醇浓度为40％-45％，保温4-5小时，沉淀脱水干燥，即可完成硫酸皮肤素的分离；

s5、烘干处理：将步骤s4中得到的沉淀以50-60℃烘干，即可获得舒洛地特药物。

优选的，所述步骤s3中加入氢氧化钠的浓度为6mol/l。

优选的，所述步骤s3中双氧水的浓度为30％。

优选的，所述步骤s4中加入盐酸的浓度为6mol/l。

本发明要解决的问题是从肝素副产物中分离提纯舒洛地特原料药，为了得到最优的工艺，我们进行了下面几组工艺数据筛选。

研究实例一

肝素的分离：将肝素副产物肝素5％、硫酸乙酰肝素45％和硫酸皮肤素47％效价29uspu/mg溶解为质量分数10％的溶液，加料液体积2％氯化钠溶解，然后加95％的乙醇至乙醇浓度为35％，常温沉淀4小时，溶液浑浊无法分层。

结论：乙醇浓度低，溶液不分层，肝素无法去除。

研究实例二

肝素的分离：将肝素副产物肝素5％、硫酸乙酰肝素45％和硫酸皮肤素47％效价29uspu/mg溶解为质量分数10％的溶液，加料液体积2％氯化钠溶解，然后加95％的乙醇至乙醇浓度为48％，常温沉淀4小时.倒出上层清液，去除下层沉淀，上层清液中继续加95％的乙醇至乙醇浓度为50％，保温4小时,沉淀脱水干燥烘干。

结论：常温条件下高乙醇浓度，溶液可以分层，但是从检测结果分析肝素无法去除。

研究实例三

肝素的分离：将肝素副产物肝素5％、硫酸乙酰肝素45％和硫酸皮肤素47％效价29uspu/mg溶解为质量分数10％的溶液，升温到35℃，加料液体积2％氯化钠溶解，然后加95％的乙醇沉淀至溶液刚好分层，此时乙醇浓度为30％，保温沉淀4小时.倒出上层清液，去除下层沉淀，上层清液中继续加95％的乙醇至乙醇浓度为50％，保温4小时,沉淀脱水干燥烘干。

结论：温度在35℃下，乙醇浓度30％是最优条件，此时可以去除肝素。

研究实例四

肝素的分离：将肝素副产物溶解为质量分数10％的溶液，升温到35℃，加料液体积2％氯化钠溶解，然后加95％的乙醇至乙醇浓度为30％，保温4小时，倒出上层清液，去除下层沉淀，上层清液中继续加95％的乙醇至乙醇浓度为50％，保温4小时,沉淀脱水干燥烘干，得到去除肝素后的粗品；

将步骤s1中的粗品分为四个样品分别进行试验

a粗品加水溶解为质量分数10％的溶液，升温到30℃，加料液体积2％氯化钠溶解，用6mol/l氢氧化钠溶液调ph至10-11，再加2％双氧水(30％浓度)，氧化4h完成后用6mol/l盐酸调ph为6.0，升温至35℃，加95％的乙醇至乙醇浓度为45％，保温4小时，沉淀脱水干燥。

b粗品加水溶解为质量分数10％的溶液，升温到30℃，加料液体积2％氯化钠溶解，用6mol/l氢氧化钠溶液调ph至10-11，加2％无水碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，再加2％双氧水(30％浓度)，氧化4h完成后用6mol/l盐酸调ph为6.0，升温至35℃，加95％的乙醇至乙醇浓度为45％，保温4小时，沉淀脱水干燥。

c粗品加水溶解为质量分数5％-15％的溶液，升温到30℃，加料液体积2％氯化钠溶解，用6mol/l氢氧化钠溶液调ph至10-11，加2％无水碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，再加2％双氧水(30％浓度)，氧化12h完成后用6mol/l盐酸调ph为6.0，升温至35℃，加95％的乙醇至乙醇浓度为45％，保温4小时，沉淀脱水干燥。

d粗品加水溶解为质量分数10％的溶液，升温到30℃，加料液体积2％氯化钠溶解，用6mol/l氢氧化钠溶液调ph至10-11，加2％无水碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，再加2％双氧水(30％浓度)，然后通入臭氧曝气4小时，氧化完成后用6mol/l盐酸调ph为6.0，升温至35℃，加95％的乙醇至乙醇浓度为45％，保温4小时，沉淀脱水干燥。

结论：氧化过程中加入臭氧或无水碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液体系，氧化效果要比单独过氧化氢氧化效果好太多，而且氧化时间也算短了66％，大大的提高了生产效率。

通过对沉淀乙醇浓度和氧化条件的研究，确定了最终的工艺参数，具体发明如下：

将肝素副产物溶解为质量分数5％—15％的溶液，升温到35-40℃，加料液体积2％氯化钠溶解，然后加95％的乙醇至乙醇浓度为30％-35％，保温4小时，倒出上层清液，去除下层沉淀，上层清液中继续加95％的乙醇至乙醇浓度为46％-50％，保温4小时,沉淀脱水干燥烘干，得到去除肝素后的粗品，然后将粗品加水溶解为质量分数5％-15％的溶液，升温到25-30℃，加料液体积2％氯化钠溶解，用6mol/l氢氧化钠溶液调ph至10-11，加2％无水碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，再加2％双氧水(30％浓度)，然后通入臭氧曝气4小时，氧化完成后用6mol/l盐酸调ph为6.0，升温至35-40℃，加95％的乙醇至乙醇浓度为40％-45％，保温4小时，沉淀脱水干燥，最后将得到的沉淀以50-60℃烘干，即为舒洛地特原料药。

(三)有益效果

本发明提供了一种从肝素副产物中分离提纯舒洛地特原料药的方法。与现有技术相比具备以下有益效果：该从肝素副产物中分离提纯舒洛地特原料药的方法，具体包括以下步骤：s1、肝素副产物预处理：将肝素副产物溶解为质量分数5％-15％的溶液，升温至35-40℃，加料液体积2％的氯化钠溶解，然后加入95％的乙醇至乙醇浓度为30％-35％，保温4-5小时，倒出上层清液，去除下层沉淀，s2、肝素的分离：向s1中得到上层清液中继续加95％的乙醇至乙醇浓度为46％-50％，保温4-5小时，沉淀脱水干燥烘干，即可得到去除肝素后的粗品，s3、肝素粗品的预处理：将步骤s1中的粗品加水溶解为质量分数5％-15％的溶液，升温到25-30℃，加料液体积2％氯化钠溶解，然后用氢氧化钠溶液调ph至10-11，之后再加入2％无水碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，再加2％双氧水，然后通入臭氧曝气4-5小时，s4、硫酸皮肤素的分离：将s3中氧化完成后的混合液用盐酸调ph为6.0，升温至35-40℃，然后加入95％的乙醇至乙醇浓度为40％-45％，保温4-5小时，沉淀脱水干燥，即可完成硫酸皮肤素的分离，s5、烘干处理：将步骤s4中得到的沉淀以50-60℃烘干，即可获得舒洛地特药物，可实现氧化时采用过氧化氢－臭氧体系，可以提高氧化效果有效去除色素蛋白及杂质，沉淀时采用高温沉淀法比传统低温沉淀法效价回收率提高了10％，还减少了离心机和离子交换树脂的使用，采用了双氧水-臭氧高效氧化体系对色素杂质进行脱色以及去除残留蛋白，比单纯的过氧化氢氧化处理节约了60％时间，极大的提高了产品质量和生产效率，与现有技术相比，本发明适用于大规模工业化生产、周期短、成本低、充分有效利用肝素副产物且产品纯度较高、稳定性较强。

附图说明

图1为本发明研究实施例二的实验结果表图；

图2为本发明研究实施例三的实验结果表图；

图3为本发明研究实施例四的实验结果表图；

图4为本发明产品检测结果表图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-4，本发明实施例提供三种技术方案：一种从肝素副产物中分离提纯舒洛地特原料药的方法，具体包括以下实施例：

实施例1

s1、肝素副产物预处理：将肝素副产物肝素5％、硫酸乙酰肝素45％和硫酸皮肤素47％效价29uspu/mg溶解为质量分数5％的溶液，升温至35℃，加料液体积2％的氯化钠溶解，然后加入95％的乙醇至乙醇浓度为30％，保温4小时，倒出上层清液，去除下层沉淀；

s2、肝素的分离：向s1中得到上层清液中继续加95％的乙醇至乙醇浓度为50％，保温4小时，沉淀脱水干燥烘干，即可得到去除肝素后的粗品；

s3、肝素粗品的预处理：将步骤s1中的粗品加水溶解为质量分数10％的溶液，升温到25℃，加料液体积2％氯化钠溶解，然后用氢氧化钠溶液调ph至11，之后再加入2％无水碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，再加2％双氧水，然后通入臭氧曝气4小时；

s4、硫酸皮肤素的分离：将s3中氧化完成后的混合液用盐酸调ph为6.0，升温至35℃，然后加入95％的乙醇至乙醇浓度为40％，保温4小时，沉淀脱水干燥，即可完成硫酸皮肤素的分离；

s5、烘干处理：将步骤s4中得到的沉淀以50℃烘干12小时，即可获得舒洛地特药物。

实施例2

s1、肝素副产物预处理：将肝素副产物肝素5％、硫酸乙酰肝素45％和硫酸皮肤素47％效价29uspu/mg溶解为质量分数10％的溶液，升温至38℃，加料液体积2％的氯化钠溶解，然后加入95％的乙醇至乙醇浓度为35％，保温4小时，倒出上层清液，去除下层沉淀；

s2、肝素的分离：向s1中得到上层清液中继续加95％的乙醇至乙醇浓度为50％，保温4小时，沉淀脱水干燥烘干，即可得到去除肝素后的粗品；

s3、肝素粗品的预处理：将步骤s1中的粗品加水溶解为质量分数10％的溶液，升温到27℃，加料液体积2％氯化钠溶解，然后用氢氧化钠溶液调ph至11，之后再加入2％无水碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，再加2％双氧水，然后通入臭氧曝气4小时；

s4、硫酸皮肤素的分离：将s3中氧化完成后的混合液用盐酸调ph为6.0，升温至38℃，然后加入95％的乙醇至乙醇浓度为45％，保温4小时，沉淀脱水干燥，即可完成硫酸皮肤素的分离；

s5、烘干处理：将步骤s4中得到的沉淀以55℃烘干12小时，即可获得舒洛地特药物。

实施例3

s1、肝素副产物预处理：将肝素副产物肝素5％、硫酸乙酰肝素45％和硫酸皮肤素47％效价29uspu/mg溶解为质量分数15％的溶液，升温至40℃，加料液体积2％的氯化钠溶解，然后加入95％的乙醇至乙醇浓度为30％，保温4小时，倒出上层清液，去除下层沉淀；

s2、肝素的分离：向s1中得到上层清液中继续加95％的乙醇至乙醇浓度为46％，保温4小时，沉淀脱水干燥烘干，即可得到去除肝素后的粗品；

s3、肝素粗品的预处理：将步骤s1中的粗品加水溶解为质量分数12％的溶液，升温到30℃，加料液体积2％氯化钠溶解，然后用氢氧化钠溶液调ph至11，之后再加入2％无水碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液，再加2％双氧水，然后通入臭氧曝气4小时；

s4、硫酸皮肤素的分离：将s3中氧化完成后的混合液用盐酸调ph为6.0，升温至40℃，然后加入95％的乙醇至乙醇浓度为40％，保温4小时，沉淀脱水干燥，即可完成硫酸皮肤素的分离；

s5、烘干处理：将步骤s4中得到的沉淀以60℃烘干，即可获得舒洛地特药物。

对比例：此为专利cn106883321a所述方法。

1)将肝素副产物(肝素5％、硫酸乙酰肝素45％、硫酸皮肤素47％)效价29uspu/mg，溶解为质量分数20％的溶液，加料液体积1％(m/v)乙酸钠溶解，用醋酸溶液调节ph为5.0；

2)向1)中溶液加入0.3倍量的95％乙醇，搅拌10分钟后在2℃下静止沉淀，12小时后分层收集上清液；

3)向2)中溶液补加入0.2倍量的95％乙醇，搅拌10分钟后在2℃下静止沉淀，12小时后分层收集沉淀物；

4)将3)中所得沉淀物加水配置成10％质量分数的溶液，然后用氢氧化钠溶液调节ph为11，升温至25℃，加1％过氧化氢(30％浓度)搅拌反应6小时；

5)用盐酸溶液调节ph为6.0，然后用0.22um微孔滤膜过滤，再加95％乙醇9l搅拌静置8小时，所得沉淀以60℃烘干。

本发明建立了一种新的分离纯化工艺，从肝素副产物中直接分离出舒洛地特原料药，本方法35-40℃条件下利用肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素在乙醇中溶解度差异进行分离制取舒洛地特原料，氧化过程中采用过氧化氢－臭氧体系可以让氧化效果更佳产品外观合格且能够大幅度降低舒洛地特的吸光度，专利cn106883321a所述方法是采用低温方式沉淀分离，导致硫酸皮肤素分离效果不好，造成舒洛地特抗ⅱa、xa效价偏低，同时硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素的有关组分不合格。

产品检测

取上述实施例1、实施例2、实施例3、对比例，制得的舒洛地特原料药样品进行理化性质检测和hplc分析，如图4所示，结果表明三个样品都符合企业内控质量标准，对比例质量不合格。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。