一种猪流行性腹泻病毒感染猪小肠黏膜上皮细胞系的方法与流程

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒感染猪小肠黏膜上皮细胞系的方法。

背景技术：

猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)系冠状病毒科冠状病毒属成员，可引起以呕吐、腹泻和脱水为特征的猪肠道传染性疾病。各种年龄的猪均易感，但哺乳仔猪受害最严重，死亡率可高达100％，给我国乃至全世界的养猪业造成了严重的经济损失。pedv较难在体外培养的细胞系中进行增殖，使得pedv感染猪小肠黏膜上皮细胞系较为困难。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种体外培养猪流行性腹泻病毒的方法，能够实现猪流行性病毒感染猪小肠黏膜上皮细胞系。

本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒感染猪小肠黏膜上皮细胞系的方法，包括：

将猪小肠黏膜上皮细胞系与猪流行性腹泻病毒液混合后进行吸附，去掉液体后，再与液体培养基混合后进行培养，实现猪流行性腹泻病毒感染猪小肠黏膜上皮细胞系。

优选的，所述猪小肠黏膜上皮细胞系中细胞的数量与病毒液的体积比为(0.5～1.5×10⁸):(0.5～1.5)ml。

优选的，所述猪流行性腹泻病毒液中猪流行性腹泻病毒的数量为(0.5～1.5×10⁸)/ml。

优选的，所述猪流行性腹泻病毒液中还含有胰蛋白酶，所述胰蛋白酶的浓度为5～15μg/ml。

优选的，所述吸附的时间为80～90min。

优选的，所述吸附的温度为35～42℃，所述吸附在5％co2环境下进行。

优选的，所述液体培养基包括dmem液体培养基。

优选的，所述液体培养基中还含有胰蛋白酶，所述胰蛋白酶的的浓度为5μg/ml。

优选的，所述培养的时间为30～40h。

优选的，所述培养的温度为37℃。

本发明将猪小肠黏膜上皮细胞系与猪流行性腹泻病毒液混合后进行吸附，去掉液体后，再与液体培养基混合后进行培养，实现猪流行性腹泻病毒感染猪小肠黏膜上皮细胞系。

本发明实施例的结果显示：采用本发明提供的方法，能够实现猪流行性腹泻病毒感染猪小肠黏膜上皮细胞系，并且使用猪流行性腹泻病毒来感染该病毒的靶细胞，为后续研究猪流行性腹泻病毒的致病机理等提供了合适的研究材料。

附图说明

图1为本发明细胞培养物1％凝胶电泳图，其中m:dna分子标准量；+:阳性对照；-：阴性对照；1-6依次为：第5、10、15、20、25和30代细胞培养物；

图2为本发明细胞病变观察结果，其中图2-1:病毒液培养物；图2-2:dmem培养物；

图3为本发明细胞间接免疫荧光，其中图3-1:病毒液细胞培养物，图3-2:阴性对照组；

图4为对比例1中的吸附时间结果，其中，1、2、3和4分别为病毒孵育30min、60min、90min和120min；

图5为对比例2中猪流行性腹泻病毒液中胰蛋白酶含量结果，其中，1、2、3和4分别为猪流行性腹泻病毒液中胰酶含量为0μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml；

图6为对比例3中dmem液体培养基中胰蛋白酶含量结果，其中，1、2、3和4分别为dmem液体培养基中胰酶含量为0μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml；

图7为实施例1电镜观察病毒结果；

图8为qpcr检测原病毒液病毒的拷贝数结果；

图9为qpcr检测第50代病毒液病毒的拷贝数结果。

具体实施方式

本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒感染猪小肠黏膜上皮细胞系的方法，包括：将猪小肠黏膜上皮细胞系与猪流行性腹泻病毒液混合后进行吸附，去掉液体后，再与液体培养基混合后进行培养，实现猪流行性腹泻病毒感染猪小肠黏膜上皮细胞系。

本发明对所述猪小肠黏膜上皮细胞系的来源没有特殊限定，采用常规即可。

本发明对培养猪小肠黏膜上皮细胞系的方法没有特殊限定，采用常规培养方法即可，在本发明实施例中具体优选包括：使用细胞瓶培养，所述细胞瓶的底面积优选为25cm²，待细胞长满单层后，弃去培养基，得到猪小肠黏膜细胞系。本发明对所述培养基没有特殊限定，采用常规培养猪小肠黏膜上皮细胞系的培养基即可，在本发明实施例中具体为dmem液体培养基与fbs的混合物，所述dmem液体培养基与fbs的体积比优选为45:5。

本发明优选将得到的猪小肠黏膜上皮细胞系使用ph值为7.2的pbs缓冲液洗涤两次后再与猪流行性腹泻病毒混合。

本发明对所述猪流行性病毒的来源没有特殊限定，采用常规即可。本发明对所述猪流行性腹泻病毒液的制备方法没有特殊限定，采用常规制备猪流行性腹泻病毒液的制备方法即可。在本发明中，所述猪流行性腹泻病毒液中猪流行性腹泻病毒的数量优选为(0.5～1.5×10⁸)/ml，更优选为(0.8～1.2×10⁸)/ml，最优选为1×10⁸/ml。

在本发明中，所述猪流行性腹泻病毒液中还优选含有胰蛋白酶，所述胰蛋白酶的浓度优选为5～15μg/ml，更优选为8～12μg/ml，最优选为10μg/ml。

在本发明中，所述猪小肠黏膜上皮细胞系的数量与病毒液的体积比优选为(0.5～1.5×10⁸):(0.5～1.5)ml，更优选为(0.8～1.2×10⁸):(0.8～1.2)ml，最优选为1×10⁸:1ml。

在本发明中，所述吸附优选在5％co2环境下进行，所述吸附的时间优选为80～90min，更优选为82～88min；所述吸附的温度优选为35～42℃，更优选为37℃。

本发明对所述液体培养基的种类没有特殊限定，采用常规培养猪小肠黏膜上皮细胞系的培养基即可，在本发明实施例中具体为dmem液体培养基。

在本发明中，所述液体培养基中优选还含有胰蛋白酶，所述胰蛋白酶的的浓度为5μg/ml。

在本发明中，所述培养的时间优选为30～40h，更优选为36h；所述培养的温度优选为37℃。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种猪流行性腹泻病毒感染猪小肠黏膜上皮细胞系的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1、猪流行性腹泻病毒感染猪小肠黏膜上皮细胞系的方法

1.1使用底面积25cm²的细胞瓶培养iec细胞系，培养液在培养中的体积为5ml，待细胞长满单层，弃去培养液，培养液为45mldmem液体培养基和5mlfbs的混合物，使用ph为7.2的pbs清洗两次。每瓶加入含有胰蛋白酶10μg/ml的猪流行性腹泻病毒液1ml，置于37℃5％co2的培养箱中吸附90min。吸附完成后，弃掉液体，加入含有5μg/ml胰蛋白酶的dmem液体培养基，进行培养和观察。36h出现细胞病变。可见细胞脱落变圆，细胞间隙变大，实现猪流行性腹泻病毒的体外培养。收集细胞培养物在-80℃冰箱反复冻融三次，准备下一次接种使用。

1.2rt-pcr方法鉴定细胞培养物

将上述收获的细胞培养物取200μl，使用天隆生物科技有限公司的核酸提取试剂盒提取rna。提取后的rna进行反转录如下：

①分别向pcr扩增管中加入5μlrna模板，2μlddh2o，1μlolige(dt)。

②将pcr扩增管放置于65℃水浴锅中孵育5min，然后迅速放入到装有冰水混合物的泡沫箱中冰浴2min。

③向冰浴的pcr扩增管反应体系中加入10μl2×mix，1μlrt，1μlgdna。

④混合均匀后将pcr扩增管放入到提前预热的42℃水浴锅水浴30min，迅速放入85℃水浴锅中5s，获得cdna。产物保存在-20℃备用。

反转录后的cdna进行pcr反应，扩增s基因，

(seqidno.1)上游引物f:5’ccaagggtttgaacactgtg3’，

(seqidno.2)下游引物r：5’cttcgagacatctttgacaactg3’。反应体系如下：cdna2μl，2×taqmix12.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，补加去离子水至25μl，混合均匀。引物的浓度为10μm。

pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性1s，56℃退火1s，72℃延伸2min，反应40个循环；72℃延伸10min。

按照比例配制1％琼脂糖凝胶，将上述pcr产物取出恢复至室温，每孔加入5μl样品，20-25min后用凝胶成像系统仪查看结果。

1.3细胞病变的观察

使用导致显微镜对细胞培养物进行观察，并拍照保存。

1.4间接免疫荧光鉴定细胞培养物

于6孔板培养iec细胞，长至单层后接种病毒培养物，同时设立不接毒的iec细胞作阴性对照，分别在感染24至36小时内，每两小时在显微镜下观察细胞病变情况，轻轻吸弃培养液，pbst洗涤细胞3次。每孔加入500μl4℃预冷的4％多聚甲醛固定液，将培养板置4℃冰箱固定30min。pbst洗涤3次，每次5min。每孔加入500μl5％bsa(牛血清白蛋白)37℃封闭30min。用pbst轻轻洗涤3次，每次5min。向孔内滴加适当稀释后的一抗(兔抗pedv)各200μl，于4℃作用过夜。pbst洗涤5次，每次5min；滴加af488(alexafluor488)标记的山羊抗兔igg(1:1000)，室温避光作用60min，pbst洗涤5次，每次5min。于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.5电镜观察病毒

将病毒感染iec细胞单层，分别于30、36小时使用胰蛋白酶消化细胞，1000r/min离心2min后，收集细胞并用2.5％戊二醛电镜固定液固定，制作超薄切片并染色，透射电子显微镜观察病毒形态。电镜结果见图7。

2、结果：

rt-pcr检测检测结果见图1，从图1中可以得出，rt-pcr凝胶电泳图片中条带与阳性对照条带一致，证明pedv感染细胞成功。

细胞病变观察结果见图2，与图2-2相比，可见图2-1中细胞发生融合现象，并且有细胞脱落现象。

间接免疫荧光鉴定结果见图3，与图3-2相比，3-1中有绿色荧光信号，证明pedv成功感染了iec。

实施例2

实时荧光定量检测实施例1原病毒液病毒拷贝数和第50代病毒液拷贝数，采用常规提取病毒rna的提取方法提取rna。

rna反转录后的cdna进行pcr反应，扩增s基因，(seqidno.3)上游引物f:gcagatttagagcagcgttca，(seqidno.4)下游引物r:taatcaaccaaacccaccac。

扩增体系如下：cdna2μl，sybrgreenmix10μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，补加去离子水至20μl，混合均匀。引物的浓度为10μm。

pcr扩增程序如下：95℃预变性15min；95℃变性10s，61.3℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。

通过实验室建立的荧光定量pcr检测方法，标准曲线为y＝-3.295x+40.605，以拷贝数的对数为横坐标，ct值为纵坐标。计算病毒拷贝数，结果见图8和图9。

经计算可知，原病毒液病毒拷贝数为10^6.26copies/μl，第50代病毒液病毒拷贝数为10^7.51copies/μl。

对比例1

1、猪流行性腹泻病毒感染猪小肠黏膜上皮细胞系的方法

1.1使用底面积25cm²的细胞瓶培养iec细胞系，培养液在培养中的体积为5ml，待细胞长满单层，弃去培养液，培养液为45mldmem液体培养基和5mlfbs的混合物，使用ph为7.2的pbs清洗两次。每瓶加入含有胰蛋白酶10μg/ml的猪流行性腹泻病毒液1ml，置于37℃5％co2的培养箱中分别吸附30min、60min、90min和120min。吸附完成后，弃掉液体，加入含有5μg/ml胰蛋白酶的dmem液体培养基，进行培养和观察。36h出现细胞病变。可见细胞脱落变圆，细胞间隙变大，实现猪流行性腹泻病毒的体外培养。收集细胞培养物在-80℃冰箱反复冻融三次，准备下一次接种使用。

1.2rt-pcr方法鉴定细胞培养物

将上述收获的细胞培养物取200μl，使用天隆生物科技有限公司的核酸提取试剂盒提取rna。提取后的rna进行反转录如下：

①分别向pcr扩增管中加入5μlrna模板，2μlddh2o，1μlolige(dt)。

②将pcr扩增管放置于65℃水浴锅中孵育5min，然后迅速放入到装有冰水混合物的泡沫箱中冰浴2min。

③向冰浴的pcr扩增管反应体系中加入10μl2×mix，1μlrt，1μlgdna。

④混合均匀后将pcr扩增管放入到提前预热的42℃水浴锅水浴30min，迅速放入85℃水浴锅中5s，获得cdna。产物保存在-20℃备用。

反转录后的cdna进行pcr反应，扩增s基因，

(seqidno.1)上游引物f:5’ccaagggtttgaacactgtg3’，

(seqidno.2)下游引物r：5’cttcgagacatctttgacaactg3’。反应体系如下：cdna2μl，2×taqmix12.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，补加去离子水至25μl，混合均匀。引物的浓度为10μm。

pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性1s，56℃退火1s，72℃延伸2min，反应40个循环；72℃延伸10min。

按照比例配制1％琼脂糖凝胶，将上述pcr产物取出恢复至室温，每孔加入5μl样品，20-25min后用凝胶成像系统仪查看结果。

1.3细胞病变的观察

使用导致显微镜对细胞培养物进行观察，并拍照保存。

1.4间接免疫荧光鉴定细胞培养物

于6孔板培养iec细胞，长至单层后接种病毒培养物，同时设立不接毒的iec细胞作阴性对照，分别在感染24至36小时内，每两小时在显微镜下观察细胞病变情况，轻轻吸弃培养液，pbst洗涤细胞3次。每孔加入500μl4℃预冷的4％多聚甲醛固定液，将培养板置4℃冰箱固定30min。pbst洗涤3次，每次5min。每孔加入500μl5％bsa(牛血清白蛋白)37℃封闭30min。用pbst轻轻洗涤3次，每次5min。向孔内滴加适当稀释后的一抗(兔抗pedv)各200μl，于4℃作用过夜。pbst洗涤5次，每次5min；滴加af488(alexafluor488)标记的山羊抗兔igg(1:1000)，室温避光作用60min，pbst洗涤5次，每次5min。于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.5电镜观察病毒

将病毒感染iec细胞单层，分别于30、36小时使用胰蛋白酶消化细胞，1000r/min离心2min后，收集细胞并用2.5％戊二醛电镜固定液固定，制作超薄切片并染色，透射电子显微镜观察病毒形态。

2、结果：

rt-pcr检测检测结果见图4，从图4中可以得出，在吸附90min时，rt-pcr凝胶电泳图片中条带与阳性对照条带一致，证明pedv感染细胞成功，而其它时间则不出现亮带或者很弱，表明感染不成功。

对比例2

1、猪流行性腹泻病毒感染猪小肠黏膜上皮细胞系的方法

1.1使用底面积25cm²的细胞瓶培养iec细胞系，培养液在培养中的体积为5ml，待细胞长满单层，弃去培养液，培养液为45mldmem液体培养基和5mlfbs的混合物，使用ph为7.2的pbs清洗两次。每瓶分别加入含有胰蛋白酶2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml的猪流行性腹泻病毒液1ml，置于37℃5％co2的培养箱中吸附90min。吸附完成后，弃掉液体，加入含有5μg/ml胰蛋白酶的dmem液体培养基，进行培养和观察。36h出现细胞病变。可见细胞脱落变圆，细胞间隙变大，实现猪流行性腹泻病毒的体外培养。收集细胞培养物在-80℃冰箱反复冻融三次，准备下一次接种使用。

1.2rt-pcr方法鉴定细胞培养物

将上述收获的细胞培养物取200μl，使用天隆生物科技有限公司的核酸提取试剂盒提取rna。提取后的rna进行反转录如下：

①分别向pcr扩增管中加入5μlrna模板，2μlddh2o，1μlolige(dt)。

②将pcr扩增管放置于65℃水浴锅中孵育5min，然后迅速放入到装有冰水混合物的泡沫箱中冰浴2min。

③向冰浴的pcr扩增管反应体系中加入10μl2×mix，1μlrt，1μlgdna。

④混合均匀后将pcr扩增管放入到提前预热的42℃水浴锅水浴30min，迅速放入85℃水浴锅中5s，获得cdna。产物保存在-20℃备用。

反转录后的cdna进行pcr反应，扩增s基因，

(seqidno.1)上游引物f:5’ccaagggtttgaacactgtg3’，(seqidno.2)下游引物r：5’cttcgagacatctttgacaactg3’。反应体系如下：cdna2μl，2×taqmix12.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，补加去离子水至25μl，混合均匀。引物的浓度为10μm。

pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性1s，56℃退火1s，72℃延伸2min，反应40个循环；72℃延伸10min。

按照比例配制1％琼脂糖凝胶，将上述pcr产物取出恢复至室温，每孔加入5μl样品，20-25min后用凝胶成像系统仪查看结果。

1.3细胞病变的观察

使用导致显微镜对细胞培养物进行观察，并拍照保存。

1.4间接免疫荧光鉴定细胞培养物

于6孔板培养iec细胞，长至单层后接种病毒培养物，同时设立不接毒的iec细胞作阴性对照，分别在感染24至36小时内，每两小时在显微镜下观察细胞病变情况，轻轻吸弃培养液，pbst洗涤细胞3次。每孔加入500μl4℃预冷的4％多聚甲醛固定液，将培养板置4℃冰箱固定30min。pbst洗涤3次，每次5min。每孔加入500μl5％bsa(牛血清白蛋白)37℃封闭30min。用pbst轻轻洗涤3次，每次5min。向孔内滴加适当稀释后的一抗(兔抗pedv)各200μl，于4℃作用过夜。pbst洗涤5次，每次5min；滴加af488(alexafluor488)标记的山羊抗兔igg(1:1000)，室温避光作用60min，pbst洗涤5次，每次5min。于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.5电镜观察病毒

将病毒感染iec细胞单层，分别于30、36小时使用胰蛋白酶消化细胞，1000r/min离心2min后，收集细胞并用2.5％戊二醛电镜固定液固定，制作超薄切片并染色，透射电子显微镜观察病毒形态。

2、结果：

rt-pcr检测检测结果见图5，从图5中可以得出，胰酶浓度为10μg/ml时，rt-pcr凝胶电泳图片中条带与阳性对照条带一致，证明pedv感染细胞成功，而其它浓度则不出现亮带或者很弱，表明感染不成功。

对比例3

1、体外培养猪流行性腹泻病毒的方法

1.1使用底面积25cm²的细胞瓶培养iec细胞系，培养液在培养中的体积为5ml，待细胞长满单层，弃去培养液，培养液为45mldmem液体培养基和5mlfbs的混合物，使用ph为7.2的pbs清洗两次。每瓶分别加入含有胰蛋白酶10μg/ml的猪流行性腹泻病毒液1ml，置于37℃5％co2的培养箱中吸附90min。吸附完成后，弃掉液体，分别加入含有0μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml胰蛋白酶的dmem液体培养基，进行培养和观察。36h出现细胞病变。可见细胞脱落变圆，细胞间隙变大，实现猪流行性腹泻病毒的体外培养。收集细胞培养物在-80℃冰箱反复冻融三次，准备下一次接种使用。

1.2rt-pcr方法鉴定细胞培养物

将上述收获的细胞培养物取200μl，使用天隆生物科技有限公司的核酸提取试剂盒提取rna。提取后的rna进行反转录如下：

①分别向pcr扩增管中加入5μlrna模板，2μlddh2o，1μlolige(dt)。

②将pcr扩增管放置于65℃水浴锅中孵育5min，然后迅速放入到装有冰水混合物的泡沫箱中冰浴2min。

③向冰浴的pcr扩增管反应体系中加入10μl2×mix，1μlrt，1μlgdna。

④混合均匀后将pcr扩增管放入到提前预热的42℃水浴锅水浴30min，迅速放入85℃水浴锅中5s，获得cdna。产物保存在-20℃备用。

反转录后的cdna进行pcr反应，扩增s基因，

(seqidno.1)上游引物f:5’ccaagggtttgaacactgtg3’，(seqidno.2)下游引物r：5’cttcgagacatctttgacaactg3’。反应体系如下：cdna2μl，2×taqmix12.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，补加去离子水至25μl，混合均匀。引物的浓度为10μm。

pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性1s，56℃退火1s，72℃延伸2min，反应40个循环；72℃延伸10min。

按照比例配制1％琼脂糖凝胶，将上述pcr产物取出恢复至室温，每孔加入5μl样品，20-25min后用凝胶成像系统仪查看结果。

1.3细胞病变的观察

使用导致显微镜对细胞培养物进行观察，并拍照保存。

1.4间接免疫荧光鉴定细胞培养物

于6孔板培养iec细胞，长至单层后接种病毒培养物，同时设立不接毒的iec细胞作阴性对照，分别在感染24至36小时内，每两小时在显微镜下观察细胞病变情况，轻轻吸弃培养液，pbst洗涤细胞3次。每孔加入500μl4℃预冷的4％多聚甲醛固定液，将培养板置4℃冰箱固定30min。pbst洗涤3次，每次5min。每孔加入500μl5％bsa(牛血清白蛋白)37℃封闭30min。用pbst轻轻洗涤3次，每次5min。向孔内滴加适当稀释后的一抗(兔抗pedv)各200μl，于4℃作用过夜。pbst洗涤5次，每次5min；滴加af488(alexafluor488)标记的山羊抗兔igg(1:1000)，室温避光作用60min，pbst洗涤5次，每次5min。于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.5电镜观察病毒

将病毒感染iec细胞单层，分别于30、36小时使用胰蛋白酶消化细胞，1000r/min离心2min后，收集细胞并用2.5％戊二醛电镜固定液固定，制作超薄切片并染色，透射电子显微镜观察病毒形态。

2、结果：

rt-pcr检测检测结果见图6，从图6中可以得出，胰酶浓度为5μg/ml时，rt-pcr凝胶电泳图片中条带与阳性对照条带一致，证明pedv感染细胞成功，而其它浓度则不出现亮带或者很弱，表明感染不成功。

由以上实施例可以得出，采用本发明提供的方法，能够实现猪流行性腹泻病毒感染猪小肠黏膜上皮细胞系，并且使用此方法可以提高pedv的拷贝数。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>安徽农业大学

<120>一种猪流行性腹泻病毒感染猪小肠黏膜上皮细胞系的方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccaagggtttgaacactgtg20

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cttcgagacatctttgacaactg23

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gcagatttagagcagcgttca21

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

taatcaaccaaacccaccac20