一种提高茶园土壤有效氮的微生物固定化剂及其制备方法与流程

本发明属于农业集约化生产技术领域，具体涉及可一种提高茶园土壤有效氮的微生物固定化剂及其制备方法。

背景技术：

茶树是我国主要的叶用经济作物之一，每年的叶片采制会带走大量的含氮营养物质。由于有机肥养分含量低，短期内有效养分少，难以满足当季作物生长的需求。因此，为了保持产量，茶农只能每年向茶园中施入大量的化学氮肥。然而，茶园长期施用化学肥料，易造成土壤板结，土传病害增多，茶叶品质下降和农业面源污染加剧等诸多问题。因而提高土壤和有机肥中氮素的转化效率是减少茶园化肥施用量的根本途径之一。

氮素转化菌，可通过蛋白酶水解和固氮作用，将植物不可利用的氮素转化为植物可利用的小分子有机氮和氨、硝态氮，这类微生物在一定数量下可显著提高土壤中有效氮的含量。但是，在实际应用中，由于茶园土壤环境富含较高的活性铝，对大多数氮素转化菌都会造成生长胁迫，同时施用的微生物也易流失或被其他的微生物吞噬，这些都严重的限制了氮素转化菌的实际应用效果。因此此类微生物在茶园中的利用需要一个承载的载体来帮助微生物抵御不良环境，使其在土壤中可以均匀施用并继续快速繁殖，从而提高土壤甚至空气中氮素的转化效率，最终达到减少茶园化肥施用量和保证茶叶品质的目的。

技术实现要素：

本发明的其中一个目的是克服上述现有技术的不足，提供一种提高茶园土壤有效氮的微生物固定化剂，其可有效的将土壤甚至空气中的氮转化为茶树可吸收的有效氮，从而可有效减少茶园化肥施用量，确保茶叶品质。本发明的另一个目的是提供一种基于上述微生物固定化剂的制备方法，以便捷化和高效率的实现上述微生物固定化剂的精确制备。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种提高茶园土壤有效氮的微生物固定化剂，包括氮素转化菌、吸附材料和包埋剂，三者依序按质量比重为8：1：400，所述的微生物固定化剂含活菌数1.0×10⁷-1.0×10⁸cfu/g。

优选的，所述的吸附材料为活性炭，所述的包埋剂包括海藻酸钠、琼脂和甘油。

一种应用所述的提高茶园土壤有效氮的微生物固定化剂的制备方法，包括以下步骤：

1)、氮素转化菌的获取：取10g土样放入锥形瓶，向锥形瓶加入90ml的含100毫mol浓度铝离子的无菌水稀释，震荡过夜得到土壤悬浮液，用1ml无菌移液管吸取所述土壤悬浮液到9ml无菌水试管中稀释，依此方法稀释分别获得10²、10³和10⁴倍的稀释液，分别取所述10²、10³和10⁴倍的稀释液100μl涂布于酪素固体培养基处，且28℃培养3-4天，之后分离出其中生长较好的菌株进行纯化后转接于阿须毕无氮培养基中，再28℃培养3-4天后，选取其中生长较好的菌株即为氮素转化菌；

2)、氮转化菌的培养：将步骤1)所得的氮素转化菌接种于液体培养基中，于28-30℃培养2-3天，此时菌落形成单位≥1×10⁹个/ml；

3)、包埋剂的制备：取质量比为0.5-1:2的海藻酸钠和琼脂，煮沸溶解后获得混合液，再将该混合液与30％的甘油按照体积比100:1混合，搅拌均匀后形成包埋剂；

4)、微生物固定化剂的制备：将吸附材料添加到步骤2)所得的氮转化菌的菌液中进行12小时吸附，获得吸附菌悬液；然后加入到冷却至40℃的步骤3)中所得的包埋剂中；吸附菌悬液与包埋剂的体积比为1：25-50，搅拌均匀；之后，取4％的cacl2溶液，与饱和硼酸溶液混合后形成组成溶液，将搅拌均匀的吸附菌悬液与包埋剂的混合溶液再和所述组成溶液进行交联，交联时间为24-36h，将所得的产物按质量比1：2放于液体培养基中，于28-30℃培养2天，即得到微生物固定化剂。

优选的，将酪蛋白、牛肉浸粉、氯化钠、磷酸氢二钾、溴百里香酚兰、琼脂和蒸馏水，依次按照质量比为10：3：5：2：0.05：15：1000的配比混合后，经121℃高温灭菌20min，即可获得步骤1)中所述的酪素固体培养基。

优选的，将甘露醇、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、氯化钠、二水合硫酸钙、碳酸钙、琼脂和蒸馏水，依次按照质量比为10：0.2：0.2：0.2：0.2：2：15：1000的配比混合后，经121℃高温灭菌20min，即可获得步骤1)中所述阿须毕无氮培养基。

优选的，将葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、七水合硫酸镁和蒸馏水，依次按照质量比为10：5：0.5：0.2：1000的配比混合后，即可获得步骤2)和4)中所述的液体培养基。

本发明的有益效果在于：

1)、本发明立足于从茶园土壤中直接提取氮素转化菌，从而在利用了氮素转化菌具有水解大分子有机氮和固定空气氮的功能的同时，又使其同步具有了极强的耐铝毒能力。即使茶园土壤环境富含较高的活性铝，以本发明所述方法获得的氮素转化菌也能得以有效生存，并最终实现对土壤中植物难以利用的有机氮和固定空气中氮素的有效提取目的。此外的，产品中的活性炭、海藻酸钠和琼脂的吸附加包埋作用，避免了氮素转化菌在自然环境中的流失，增加了功能菌株的生物密度，同时甘油的添加也可以提高菌株对环境胁迫的抗逆性，成效显著。由于本发明是生物制剂，同时采用的包埋剂和吸附材料也都是环境友好型材料，不仅没有化学肥料的使用所带来的的一系列问题，而且还能加速土壤氮素的转化，农民可以在确保土壤及茶叶品质的同时，又可随之减少化学肥料的使用量，从而达到减少开支和增加收入的目的。

通过上述方法，本发明从改善茶园土壤氮素转化效率和提高生物有效氮含量这一关键问题入手，从而提出了上述可提高茶园土壤有效氮的微生物固定化剂，实践证明，本发明能在短期内提高茶园土壤碱解氮含量20％以上，也可以加速商品有机肥在茶园中施用后的氮素的转化效率10％以上，成效极其显著。

附图说明

图1为未放入液体培养基培养之前的微生物固定化剂的状态图；

图2为放入液体培养基培养之后的微生物固定化剂的状态图；

图3为实施例1的两组实验结果的对照图；

图4为实施例2的两组实验结果的对照图。

具体实施方式

为便于理解，此处结合图1-4，以两组具体实施例对本发明的具体工作流程作以下进一步描述：

实施例1

实施例1所用微生物固定化剂的制备步骤如下：

1)、氮素转化菌的获取：取10g土样放入锥形瓶，向锥形瓶加入90ml无菌水稀释，该无菌水中含100mma^l3+，震荡过夜得到土壤悬浮液。用1ml无菌移液管吸取上述土壤悬浮液到9ml无菌水试管中稀释，依此方法稀释分别获得10²、10³和10⁴倍稀释液。分别取100μl的上述10²、10³和10⁴倍稀释液涂布于酪素固体培养基，28℃培养3天，分离生长较好的菌株进行纯化后转接于阿须毕无氮培养基中，再28℃培养3天，选取生长较好的菌株即为氮素转化菌。

2)、氮转化菌的培养：将步骤1)所得的氮素转化菌接种于液体培养基中，于28℃培养2天，直至菌落形成单位≥1×10⁹个/ml。

3)、包埋剂的制备：分别称取一定质量的海藻酸钠、琼脂煮沸溶解加入30％的甘油搅拌均匀，其中海藻酸钠、琼脂的质量比为0.5:2，配制成溶液后和30％的甘油按体积比100:1进行混合。

4)、微生物固定化剂的制备：将吸附材料也即活性炭添加到步骤2)所得的菌液中进行12小时吸附，然后加入到冷却至40℃的步骤3)所得的包埋剂中，吸附菌悬液与包埋剂的体积比为1：25。搅拌均匀后，经注射装置挤压到4％的cacl2和饱和硼酸组成溶液中进行交联，交联时间为24h，即可形成图1中产物。之后将图1中的产物按质量比1：2放于液体培养基中，于28℃培养2天，即得到图2所示的本发明所述的微生物固定化剂。

上述步骤中，将酪蛋白、牛肉浸粉、氯化钠、磷酸氢二钾、溴百里香酚兰、琼脂和蒸馏水，依次按照质量比为10：3：5：2：0.05：15：1000的配比混合后，经121℃高温灭菌20min，即可获得步骤1)中所述的酪素固体培养基。

上述步骤中，将甘露醇、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、氯化钠、二水合硫酸钙、碳酸钙、琼脂和蒸馏水，依次按照质量比为10：0.2：0.2：0.2：0.2：2：15：1000的配比混合后，经121℃高温灭菌20min，即可获得步骤1)中所述阿须毕无氮培养基。

上述步骤中，将葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、七水合硫酸镁和蒸馏水，依次按照质量比为10：5：0.5：0.2：1000的配比混合后，即可获得步骤2)和4)中所述的液体培养基。

将微生物固定化剂制成后，将其直接沟施于茶行间，每亩用量20公斤。

具体实验结论如下：

ck：对照组，茶园未施肥茶行；

t：处理组，在茶园未施肥茶行中开沟10cm，以每亩20公斤的施用量施入微生物固定化剂。

分别于实验当天、第15天、第30天和第45天采集上述两组中的土壤样品，测定土壤碱解氮含量。

实验结果：如图3所示，0-30天内微生物固定化剂对土壤有效氮含量的提升作用明显。其中，第15天和30时，处理组由于施用本发明所述的微生物固定化剂，其土壤碱解氮的含量分别是对照组的1.39倍和1.27倍，30天后有效氮转化能力减弱，到45天时土壤碱解氮水平趋回与对照组同水平。

实施例2：

实施例2所用微生物固定化剂的制备步骤如下：

1)、氮素转化菌的获取：取10g土样放入锥形瓶，向锥形瓶加入90ml无菌水稀释，该无菌水中含100mma^l3+，震荡过夜得到土壤悬浮液。用1ml无菌移液管吸取上述土壤悬浮液到9ml无菌水试管中稀释，依此方法稀释分别获得10²、10³和10⁴倍稀释液。分别取100μl的上述10²、10³和10⁴倍稀释液涂布于酪素固体培养基，28℃培养4天，分离生长较好的菌株进行纯化后转接于阿须毕无氮培养基中，再28℃培养4天，选取生长较好的菌株即为氮素转化菌。

2)、氮转化菌的培养：将步骤1)所得的氮素转化菌接种于液体培养基中，30℃培养3天，直至菌落形成单位≥1×10⁹个/ml。

3)、包埋剂的制备：分别称取一定质量的海藻酸钠、琼脂煮沸溶解加入30％的甘油搅拌均匀，其中海藻酸钠、琼脂的质量比为1:2，配制成溶液后和30％的甘油按体积比100:1进行混合。

4)、微生物固定化剂的制备：将吸附材料也即活性炭添加到步骤2)所得的菌液中进行12小时吸附，然后加入到冷却至40℃的步骤3)所得的包埋剂中，吸附菌悬液与包埋剂的体积比为1：50。搅拌均匀后，经注射装置挤压到4％的cacl2和饱和硼酸组成溶液中进行交联，交联时间为36h，即可形成图1中产物。之后将图1中的产物按质量比1：2放于液体培养基中，于28℃培养2天，即得到图2所示的本发明所述的微生物固定化剂。

上述步骤中，将酪蛋白、牛肉浸粉、氯化钠、磷酸氢二钾、溴百里香酚兰、琼脂和蒸馏水，依次按照质量比为10：3：5：2：0.05：15：1000的配比混合后，经121℃高温灭菌20min，即可获得步骤1)中所述的酪素固体培养基。

上述步骤中，将甘露醇、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、氯化钠、二水合硫酸钙、碳酸钙、琼脂和蒸馏水，依次按照质量比为10：0.2：0.2：0.2：0.2：2：15：1000的配比混合后，经121℃高温灭菌20min，即可获得步骤1)中所述阿须毕无氮培养基。

上述步骤中，将葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、七水合硫酸镁和蒸馏水，依次按照质量比为10：5：0.5：0.2：1000的配比混合后，即可获得步骤2)和4)中所述的液体培养基。

将微生物固定化剂制成后，将其直接沟施于茶行间，每亩用量25公斤。

具体实验结论如下：

ck：对照组，茶园施商品有机肥200公斤/亩；

t：处理组，茶园施商品有机肥150公斤/亩后，再施加微生物固定化剂25公斤/亩；开沟深15-20cm。

分别于实验当天、第15天、第30天和第45天采集上述两组中的土壤样品，测定土壤碱解氮含量。

实验结果：由图4可明显看出，微生物固定化剂与有机肥混施后，对土壤有效氮含量的提升作用明显。其中，第15-30天的处理组的碱解氮含量的增加率比对照组增加12.61％，第30-45天处理组碱解氮含量的增加率比对照组增加10.59％。

综上可看出，本发明从改善茶园土壤氮素转化效率和提高生物有效氮含量这一关键问题入手，从而提出了上述可提高茶园土壤有效氮的微生物固定化剂，其能在短期内提高茶园土壤碱解氮含量20％以上，也可以加速商品有机肥在茶园中施用后的氮素的转化效率10％以上。本发明的作用机制在于从茶园土壤中直接提取氮素转化菌，从而在利用了氮素转化菌具有水解大分子有机氮和固定空气氮的功能的同时，又使其具有了极强的耐铝毒能力，即使茶园土壤环境富含较高的活性铝，以本发明所述方法获得的氮素转化菌也能得以有效生存，并最终实现对土壤中植物难以利用的有机氮和固定空气中氮素的有效提取目的。此外的，产品中的活性炭、海藻酸钠和琼脂的吸附加包埋作用，避免了氮素转化菌在自然环境中的流失，增加了功能菌株的生物密度，同时甘油的添加可以提高菌株对环境胁迫的抗逆性。由于本发明是生物制剂，同时采用的包埋剂和吸附材料也都是环境友好型材料，不仅没有化学肥料的使用所带来的的一系列问题，而且还能加速土壤氮素的转化，农民可以在确保土壤及茶叶品质的同时，又可随之减少化学肥料的使用量，从而达到减少开支和增加收入的目的。