一种改造BZLF1和改造LMP1的融合基因及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，具体说是一种改造bzlf1和改造lmp1的融合基因及其应用。

背景技术：

研究表明，eb病毒(epstein-barrvirus，ebv)的感染与鼻咽癌、胃癌的发生关系密切，即刻早期基因(bzlf1)的表达可诱导病毒从潜伏期进入裂解期，所编码的蛋白是一种转录激活因子，eb病毒感染宿主细胞包括潜伏期和裂解期，在eb病毒阳性肿瘤细胞中，病毒一般处于潜伏期，其潜伏存在及其dna与宿主细胞整合是导致肿瘤细胞发生的重要原因，人工诱导病毒由潜伏期进入裂解期，导致肿瘤细胞裂解死亡，有望成为治疗eb病毒相关肿瘤的新手段和新方法。将bzlf1重组后，感染ebv阳性肿瘤细胞，可以诱导肿瘤细胞中处于潜伏期的eb病毒进入裂解期，并开启病毒复制基质，导致eb病毒阳性肿瘤细胞裂解死亡，达到特异性杀伤肿瘤细胞的作用，但是现有的即刻早期基因(bzlf1)转录频率低，庸余序列多，影响了bzlf1的表达。

潜伏膜蛋白1(latentmembraneproteinl，lmp1)是eb病毒编码的一种癌蛋白，能够组成激活各种信号通路，从而导致细胞生长不受控制，向癌细胞转化和对肿瘤的微环境造成影响，而羧基端功能区是lmp1癌基因的功能区，删除这个区域，lmp1将失去对b细胞转化的能力，对lmp1基因进行改造，去除其在致癌过程中起决定作用的c末端部分氨基酸，使其不再具有致癌性，但是仍然具有良好的免疫原性。

卡介苗(bcg)是由减毒牛型结核杆菌悬浮液制成的活菌苗，具有增强巨噬细胞活性，加强巨噬细胞杀灭肿瘤细胞的能力，活化t淋巴细胞，增强机体细胞免疫的功能，但是目前还未有研究将预防其他癌症的基因与其融合的报道，使卡介苗的功能单一。

如何将去除致癌部分基因、加入增强子的lmp1与去除庸余序列、加入增强子的bzlf1基因融合，并且增强机体的细胞免疫反应，同时发挥lmp1与bzlf1基因诱导潜伏期ebv进入裂解期复制的作用，从而协同杀伤ebv阳性肿瘤细胞是目前亟待解决的问题；此外，将该基因序列在现有疫苗中复制并表达，制备既能够预防、治疗鼻咽癌又具有较高安全性的转化bcg疫苗，达到一次接种预防两种疾病的目的也是我们亟待解决的问题。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种改造bzlf1和改造lmp1的融合基因及其应用。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

一种改造bzlf1和改造lmp1的融合基因，是将去除致癌基因、加入增强子的lmp1与去除庸余序列、加入增强子的bzlf1基因进行融合得到；

改造bzlf1和改造lmp1的融合基因的基因序列为：

atgatggacccaaactcgacttctgaagatgtaaaatttacacctgacccataccaggtgccttttgtacaagcttttgaccaagctaccagagtctatcaggacctgggagggccatcgcaagctcctttgccttgtgtgctgtggccggtgctgccagagcctctgccacaaggccagctaactgcctatcatgtttcaaccgctccgactgggtcgtggttttctgcccctcagcctgctcctgagaatgcttatcaagcttatgcagcacctcagctgttcccagtctccgacataacccagaatcaacagactaaccaagccgggggagaagcacctcaacctggagacaattctactgttcaaacagcagcagcagtggtgtttgcttgccccggggctaaccaaggacaacagctagcagacattggtgttccacagcctgcaccagtggctgccccggcacgacgcacacggaaaccacaacagccagaatcgctggaggaatgcgattctgaactagaaataaagcgatacaagaatcgggtggcttccagaaaatgccgggccaagtttaagcaactgctgcagcactaccgtgaggtggctgctgccaaatcatctgaaaatgacaggctgcgcctcctgttgaagcagatgtgcccaagcctggatgttgactccattatccgccggacaccagatgttttacacgaggatctcttaaatttctaaatggaacacgacctt

本发明还包括一种改造bzlf1和改造lmp1的融合基因的构建方法：包括以下步骤：

①将去除庸余序列、加入增强子的bzlf1基因以上游引物p1和下游引物p2进行扩增，电泳纯化，得到bzlf1*dna片段；

去除庸余序列、加入增强子的bzlf1基因序列为：

atgatggacccaaactcgacttctgaagatgtaaaatttacacctgacccataccaggtgccttttgtacaagcttttgaccaagctaccagagtctatcaggacctgggagggccatcgcaagctcctttgccttgtgtgctgtggccggtgctgccagagcctctgccacaaggccagctaactgcctatcatgtttcaaccgctccgactgggtcgtggttttctgcccctcagcctgctcctgagaatgcttatcaagcttatgcagcacctcagctgttcccagtctccgacataacccagaatcaacagactaaccaagccgggggagaagcacctcaacctggagacaattctactgttcaaacagcagcagcagtggtgtttgcttgccccggggctaaccaaggacaacagctagcagacattggtgttccacagcctgcaccagtggctgccccggcacgacgcacacggaaaccacaacagccagaatcgctggaggaatgcgattctgaactagaaataaagcgatacaagaatcgggtggcttccagaaaatgccgggccaagtttaagcaactgctgcagcactaccgtgaggtggctgctgccaaatcatctgaaaatgacaggctgcgcctcctgttgaagcagatgtgcccaagcctggatgttgactccattatccgccggacaccagatgttttacacgaggatctcttaaatttctaa；

上游引物p1：5′-ggaattcatgatctaatggactgacc-3′；其中gaattc为ecori酶切位点

下游引物p2：5′-gctgccgccaccgccgcttccgccaccgccgcttccaccgccaccgaaatttaagagatcctc-3′；

②将去除致癌基因、加入增强子的lmp1基因以上游引物p3和下游引物p4进行扩增，电泳纯化，得到lmp1*dna片段；

去除致癌基因、加入增强子的lmp1基因序列为：

上游引物p3：5′-ggtggcggtggaagcggcggtggcggaagcggcggtggcggcagcatggaacacgaccttgagagg-3′；

下游引物p4：5′-cgcgtcgacttagtcatagtagcttagctg-3′；其中gtcgac为sal1酶切位点；

③以步骤①所得bzlf1*dna片段和步骤②所得lmp1*dna片段为模板，以上游引物p1和下游引物p4进行重叠延伸pcr，得到融合基因片段；

反应条件：95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min共30个循环，最后72℃延伸8min；

④将步骤③所得融合基因片段冷却至20～30℃，加入taq酶、datp，放入pcr仪中在72℃下延伸45分钟，将其顺利与pmvs穿梭质粒连接，产物进行电泳检测后，进行纯化，得到改造bzlf1和改造lmp1的融合基因。

本发明还包括一种改造bzlf1和改造lmp1的融合基因的bcg疫苗，其特征在于：是由改造bzlf1和改造lmp1的融合基因序列引入pmvs穿梭质粒上，然后与bcg感受态细胞电转复苏后获得。

优选的，包含改造bzlf1和改造lmp1的融合基因的bcg疫苗，其特征在于：将包含改造bzlf1和改造lmp1的融合基因的bcg疫苗通过卡那霉素抗性筛选，得到稳定的无卡那霉素抗性的bcg疫苗。

本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明将去除致癌基因、加入增强子的lmp1与去除庸余序列、加入增强子的bzlf1基因进行融合，构建的融合基因能够同时发挥lmp1和bzlf1基因诱导潜伏期ebv进入裂解期复制的作用，从而协同杀伤ebv阳性肿瘤细胞；另一方面，本发明将融合基因连接在pmvs穿梭质粒上，并在bcg及其子代中复制和表达，得到了既能预防鼻咽癌发生又具有较高安全性的转化bcg疫苗；该转化bcg疫苗能够分泌eb病毒lmp1(去除致癌部分)与bzlf1的融合蛋白，有效的激活机体免疫系统，产生特异性抗体和有效的细胞免疫应答，在预防结核病的同时，具有杀伤鼻咽癌细胞，很好的预防治疗肿瘤的作用。

本发明优选的转化bcg疫苗无抗生素抗性，在制备过程中为了能够筛选出成功导入穿梭质粒pmvs卡介苗菌体，而人为的在pmvs质粒载体中加入了卡那霉素抗性，但是疫苗在用于临床治疗和预防鼻咽癌的过程中，人为引进的卡那霉素抗性可能会使疫苗使用者产生卡那霉素耐药性，使用quikchange(agilent,beijing,china)定点突变试剂盒，将卡那霉素抗性位点突变，并通过将结核分枝杆菌菌体在无抗性的米氏培养基中传3代，选择在能在无抗性的米氏培养基上生长，而在卡那霉素抗性培养基上不生长的菌株，得到稳定的无卡那霉素抗性的bcg疫苗，从而避免了患者在治疗过程中出现卡那霉素耐药性。

附图说明

图1为对eb病毒阳性肿瘤的预防作用实验中各组的肿瘤生长趋势示意图；

图2为对eb病毒阳性肿瘤的预防作用实验中各组的肿瘤重量示意图；

图3为对eb病毒阳性肿瘤的预防作用实验中各组的肿瘤大小示意图；

图4为对eb病毒阳性肿瘤的治疗作用实验中各组的肿瘤体积示意图；

图5为对eb病毒阳性肿瘤的治疗作用实验中各组的肿瘤重量示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。

实施例

一、一种改造bzlf1和改造lmp1的融合基因，是将去除致癌基因、加入增强子的lmp1与去除庸余序列、加入增强子的bzlf1基因进行融合得到；

改造bzlf1和改造lmp1的融合基因的基因序列为：

atgatggacccaaactcgacttctgaagatgtaaaatttacacctgacccataccaggtgccttttgtacaagcttttgaccaagctaccagagtctatcaggacctgggagggccatcgcaagctcctttgccttgtgtgctgtggccggtgctgccagagcctctgccacaaggccagctaactgcctatcatgtttcaaccgctccgactgggtcgtggttttctgcccctcagcctgctcctgagaatgcttatcaagcttatgcagcacctcagctgttcccagtctccgacataacccagaatcaacagactaaccaagccgggggagaagcacctcaacctggagacaattctactgttcaaacagcagcagcagtggtgtttgcttgccccggggctaaccaaggacaacagctagcagacattggtgttccacagcctgcaccagtggctgccccggcacgacgcacacggaaaccacaacagccagaatcgctggaggaatgcgattctgaactagaaataaagcgatacaagaatcgggtggcttccagaaaatgccgggccaagtttaagcaactgctgcagcactaccgtgaggtggctgctgccaaatcatctgaaaatgacaggctgcgcctcctgttgaagcagatgtgcccaagcctggatgttgactccattatccgccggacaccagatgttttacacgaggatctcttaaatttctaaatggaacacgacctt

二、一种改造bzlf1和改造lmp1的融合基因的构建方法，包括以下步骤：

①将去除庸余序列、加入增强子的bzlf1基因以上游引物p1和下游引物p2进行扩增，电泳纯化，得到bzlf1*dna片段；电泳采用1％琼脂糖凝胶；

去除庸余序列、加入增强子的bzlf1基因序列为：

atgatggacccaaactcgacttctgaagatgtaaaatttacacctgacccataccaggtgccttttgtacaagcttttgaccaagctaccagagtctatcaggacctgggagggccatcgcaagctcctttgccttgtgtgctgtggccggtgctgccagagcctctgccacaaggccagctaactgcctatcatgtttcaaccgctccgactgggtcgtggttttctgcccctcagcctgctcctgagaatgcttatcaagcttatgcagcacctcagctgttcccagtctccgacataacccagaatcaacagactaaccaagccgggggagaagcacctcaacctggagacaattctactgttcaaacagcagcagcagtggtgtttgcttgccccggggctaaccaaggacaacagctagcagacattggtgttccacagcctgcaccagtggctgccccggcacgacgcacacggaaaccacaacagccagaatcgctggaggaatgcgattctgaactagaaataaagcgatacaagaatcgggtggcttccagaaaatgccgggccaagtttaagcaactgctgcagcactaccgtgaggtggctgctgccaaatcatctgaaaatgacaggctgcgcctcctgttgaagcagatgtgcccaagcctggatgttgactccattatccgccggacaccagatgttttacacgaggatctcttaaatttctaa；

上游引物p1：5′-ggaattcatgatctaatggactgacc-3′；其中gaattc为ecori酶切位点；

下游引物p2：5′-gctgccgccaccgccgcttccgccaccgccgcttccaccgccaccgaaatttaagagatcctc-3′；

②将去除致癌基因、加入增强子的lmp1基因以上游引物p3和下游引物p4进行扩增，电泳纯化，得到lmp1*dna片段；电泳采用1％琼脂糖凝胶；

去除致癌基因、加入增强子的lmp1基因序列为：

上游引物p3：5′-ggtggcggtggaagcggcggtggcggaagcggcggtggcggcagcatggaacacgaccttgagagg-3′；

下游引物p4：5′-cgcgtcgacttagtcatagtagcttagctg-3′；其中gtcgac为sal1酶切位点；

③以步骤①所得bzlf1*dna片段和步骤②所得lmp1*dna片段为模板，以上游引物p1和下游引物p4进行重叠延伸pcr，得到融合基因片段；

反应条件：95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min共30个循环，最后72℃延伸8min；

④将步骤③所得融合基因片段冷却至20～30℃，加入taq酶0.4μl、datp(50mol/l)2μl，放入pcr仪中在72℃下延伸45分钟，将其顺利与pmvs穿梭质粒连接，(pmvs穿梭质粒相当于载体)，产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测后，进行纯化，纯化采用u-niq-5pcr产物纯化试剂盒(上海生工产品)进行，得到改造bzlf1和改造lmp1的融合基因zlp1。

三、一种包含上述改造bzlf1和改造lmp1的融合基因的bcg疫苗，是由改造bzlf1和改造lmp1的融合基因序列引入pmvs穿梭质粒上，然后与bcg感受态细胞电转复苏后获得，具体步骤包括：

感受态bcg的制备：bcg在middlebrook7h9培养基35℃摇床培养(转速为200rpm)，待培养液od600为0.6时将bcg菌液加入离心管中，冰浴2hr，将bcg菌液加入离心管中，在冰盒中预冷2hr，4℃离心，10000rpm×2min，丢弃上清液；用原始体积的0.1，预冷的浓度为10％甘油重悬菌体，重复上述操作6次，弃上清，加入原始体积的0.02的10％甘油重悬菌体，即得到bcg感受态细菌；

取5×10⁶个bcg感受态细菌，然后将纯化的pmvs-zlp1质粒用电穿孔法转化bcg，电穿参数为：0.4cm的电穿孔杯，电压2.5kv电容25μf，电阻1000ω，作用时间11.6毫秒，37℃下培养10小时后取100μl涂布在含50ug/ml卡那霉素的middlebrook7h10固体培养基的离心试管内斜面上，37℃继续培养直至发现克隆；3～4周后挑选阳性克隆，先进行抗酸染色初步鉴定，然后在含60mlmiddlebrook7h9培养基的离心试管里摇床生长。

pmvs-zlp1质粒的构建步骤：

首先，质粒pmv261购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心(北京)，将合成后的bcg-ag85b信号肽基因克隆到pmv261载体并测序鉴定，信号肽基因及质粒pmv261分别用bamh和ecori双酶切，pmv261载体酶切后加入小牛肠碱性磷酸酶1u，于37℃去磷酸化处理1h，经酚：氯仿(1：1)抽提、无水乙醇沉淀、70％乙醇洗涤，溶于te中。然后加入5μl(等量)的ligationsolutionι,t4dna连接酶1μl,纯水补足至总体积10μl，于16℃进行连接反应30min(或4℃过夜反应),构建重组质粒pmvs；将质粒pmvs用ecori和sali进行双酶切，再将eb病毒融合基因序列zlp1插入至pmvs中，得到重组质粒：pmvs-zlp1；

四、无卡那霉素抗性、包含改造bzlf1和改造lmp1的融合基因的bcg疫苗的制备

将包含改造bzlf1和改造lmp1的融合基因的bcg疫苗通过卡那霉素抗性筛选，得到稳定的无卡那霉素抗性的包含融合基因的bcg疫苗，具体的筛选步骤为：

人为引进的卡那霉素抗性可能会使疫苗使用者产生卡那霉素耐药性，使用quikchange(agilent,beijing,china)定点突变试剂盒，将卡那霉素抗性位点突变，并通过将结核分枝杆菌菌体在无抗性的米氏培养基中传3代，选择在能在无抗性的米氏培养基上生长，而在卡那霉素抗性培养基上不生长的菌株，得到稳定的无卡那霉素抗性的bcg疫苗，从而避免了患者在治疗过程中出现卡那霉素耐药性。

五、包含改造bzlf1和改造lmp1的融合基因的bcg疫苗(以下简称rbcg)对eb病毒阳性肿瘤的预防作用

对实验小鼠c57bl/6(鼠源性瘤)在进行肿瘤接种前30d，连续3次进行疫苗接种，中间间隔10d，免疫时采用右肋腹侧皮下注射的方式进行，设pbs组、bcg组、含空载体pmvs的bcg组、pmvs-zlp1质粒组、含目的基因的rbcg组，每组5只。在最后一次免疫后10天接种肿瘤细胞。在接种肿瘤细胞后40天断颈处死小鼠，手术剥离肿瘤并测定各种数据。肿瘤细胞接种后，观察其生长情况，当可触及时，记成瘤时间，如表1所示；每间隔1天测量其垂直长径及短径，计算其体积，记录其生长趋势，得到图1，肿瘤体积公式为：垂直长径x(垂直短径)²x0.5，第30天(按接种肿瘤起)处死小鼠，称取瘤重，得到图2，各组的肿瘤大小示意图如图3所示。

表1各组免疫小鼠皮下接种肿瘤细胞的成瘤时间

注：*表示与对照组相比，差异显著(p≤0.05)

由图1可以看出，在接种12天时各组的肿瘤细胞开始生长，其中接种14天时肿瘤体积开始不同，在22天时pbs组肿瘤体积最大，依次为pmvs-zlp1质粒组、bcg组、含空载体pmvs的bcg组，肿瘤最小的为rbcg组，并且rbcg组的肿瘤在14天至22天增加的体积不大，可见，本发明的包含改造bzlf1和改造lmp1的融合基因的bcg疫苗对肿瘤细胞具有很好的预防作用。

由图2和图3可以看出，接种包含改造bzlf1和改造lmp1的融合基因的bcg疫苗后，eb病毒阳性肿瘤重量和体积均增加较小，可以看出本发明的包含改造bzlf1和改造lmp1的融合基因的bcg疫苗对肿瘤细胞具有很好的预防作用。

六、包含改造bzlf1和改造lmp1的融合基因的bcg疫苗(以下简称rbcg)对小鼠肿瘤的治疗作用

5组小鼠接种eb病毒阳性肿瘤细胞，分别于接种gt39肿瘤细胞后第9d和15d进行免疫。bcg组、pmvs-zlp1质粒组、含空载体pmvs的bcg组和含目的基因的rbcg组各组在接种后13d，平均肿瘤体积分别为0.38±0.16(cm³)、0.72±0.14(cm³)、0.42±0.11(cm³)和0.21±0.18(cm³)，均小于pbs对照组平均瘤体积0.8±0.25(cm³)(p<0.05)，如图4所示，在肿瘤细胞接种28天后处死小鼠剥离肿瘤，称量肿瘤的重量，如图5所示，经计算得出rbcg组肿瘤体积和瘤重与pbs对照组相比显著减小(p<0.05)，上述研究表明rbcg对eb病毒阳性肿瘤细胞治疗作用显著，bcg组、转空载体bcg组(pmv261+bcg)对肿瘤细胞早期有治疗作用，晚期不明显。

序列表

<110>济宁医学院

<120>一种改造bzlf1和改造lmp1的融合基因及其应用

<130>20190123a-1

<141>2019-01-23

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1899

<212>dna

<213>人类疱疹病毒4型(humanherpesvirus6)

<400>1

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<213>人类疱疹病毒4型(humanherpesvirus6)

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