一株高效解磷真菌小孢根霉及其筛选方法与应用与流程

本发明属于微生物学领域，具体涉及一株高效解磷真菌小孢根霉及其筛选方法与应用。
背景技术：
：磷是植物生长发育所必需的三大营养元素之一，是植物细胞中遗传物质和能量物质等有机化合物的基本构成元素，植物的光合作用和体内的生化代谢过程都必须有磷参加，磷在植物的整个生命过程中起着不可替代的作用。据报道，我国74％的耕地土壤中缺乏磷，土壤中约95％的磷以无效磷的形式存在，不能被植物吸收利用。因此，磷成为限制作物生长和产量的主要元素之一。为了减缓磷匮乏对植物生长的影响，农业生产上主要依靠施用磷肥来增加磷素供应。然而，施入土壤中的磷肥大部分会与土壤中的金属离子如al3+、fe3+、ca3+等结合形成难溶性磷酸盐，导致当年磷的利用率仅为10-25％。为满足农作物对磷的需求，农业生产中往往会大量施加磷肥，而磷肥的过量施用不仅会造成严重的经济损失，使土壤中微生物多样性下降，还会造成土壤板结、地力衰退、环境污染、生态恶化和农产品品质下降等环境问题，因此，如何有效利用土壤中的无效态磷，提高磷肥的利用率，对减少农业生产中化肥的使用和资源消耗，以及保护生态环境具有十分重要的意义。解磷微生物能够溶解土壤中的不溶性磷，将无效磷转变成植物能吸收的有效磷，并能通过产胞外酶和有机酸来刺激植物的生长。解磷微生物可以分为解磷细菌、放线菌和真菌，其中解磷细菌研究的比较多，包括肠细菌属(enterbacter)、土壤杆菌属(agrobacterium)、欧文氏菌属(erwinia)、假单胞菌属(pseudomonas)、沙雷氏菌属(serratia)、黄杆菌属(flavobacterium)、芽孢杆菌属(bacillus)、微球菌属(micrococcus)、固氮菌属(azotobacter)、色杆菌属(chromabacterium)、沙门氏菌属(salmonella)、产碱菌属(alcaligenes)、节细菌属(arthrobacter)、硫杆菌属(thiobacillus)、埃希氏菌属(escherichia)；解磷放线菌主要侧重于链霉菌属(streptomyces)；解磷真菌方面的相关研究报道不多，大多为曲霉属(aspergillus)、根霉属(rhizopus)、镰刀菌属(fusarium)、青霉属(penicillium)、小菌核菌属(sclerotium)、am菌根菌(arbuscularmycorrhiza)等。很多解磷细菌和放线菌在传代培养后会丧失其最初的解磷能力，且这种丧失是不能再恢复的。技术实现要素：针对如何降解土壤中无机磷、促进作物生长的问题，本发明提供了一株高效解磷真菌小孢根霉(rhizopusmicrosporus)neau-8，其保藏编号为：cgmccno.14635。本发明还提供了上述小孢根霉的筛选方法，方法如下：1)取小麦根际土壤，加入0.85％的生理盐水富集培养后，静置15-30min；所述土壤与生理盐水的比例为1:9(g/ml)；2)然后取1ml上清液进行梯度稀释，取每一个稀释度的稀释液，分别涂布在无机磷固体培养基上进行培养；3)将每个培养基上出现有透明圈的微生物挑取出，接种到新的无机磷固体培养基上培养；4)然后，分别将培养的菌体制成孢子悬液，接种到无机磷液体培养基中培养，通过测定菌液中可溶性磷的含量，筛选获得高效解磷的真菌小孢根霉。进一步地限定，步骤1)所述富集培养是指28℃摇床中150r/min振荡培养90-120min。进一步地限定，步骤2)所述梯度稀释是指将上清液分别稀释到原体积的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。进一步地限定，步骤2)所述无机磷固体培养基配方为：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，mgso4.7h2o0.3g，feso4.7h2o0.03g，mnso4.4h2o0.03g，磷酸钙10g，琼脂18g，去离子水1000ml，ph调至7.0。进一步地限定，步骤4)所述接种是指将孢子悬液按照1％(体积分数)接种到无机磷液体培养基中；所述培养，条件为28℃、150r/min摇床培养7d。本发明还提供了上述小孢根霉在抑制病原真菌产生中的应用。进一步地限定，所述病源真菌为黄瓜枯萎致病菌(fusariumoxysporum)、玉米大斑致病菌(exserohilumturcicum)、黄瓜褐斑致病菌(corynesporacassiicola)、黄瓜炭疽致病菌(colletotrichumorbiculare)、玉米小斑致病菌(helminthosporiummaydis)、水稻纹枯致病菌(rhizoctoniasolani)、玉米弯孢致病菌(curvularialunata)、大豆根腐致病菌(rhizoctoniasolanikuhn)或大豆菌核致病菌(sclerotiniasclerotiorum)。本发明还提供了上述小孢根霉在促进作物生长中的应用。进一步地限定，将小孢根霉拌土后，用于栽培玉米或小麦种子，所述小孢根霉在土壤中的孢子浓度为1.0×103cfu/g～1.0×105cfu/g，最佳孢子浓度为1.0×104cfu/g。有益效果本发明从小麦根际土壤中分离得到的小孢根霉neau-8对磷酸钙、磷酸锌具有较强的解磷能力，其对应的解磷能力分别为403mg/l、507mg/l。盆栽试验表明，该菌的孢子液可以明显的促进小麦和玉米的生长。本发明提供的菌株小孢根霉neau-8及其菌剂在使用过程中无污染，无公害，可减少化学肥料的用量，此外，解磷真菌的遗传性状稳定，传代培养一般不易丧失解磷能力，为开发微生物菌肥提供优良的菌株资源，并具有良好的应用开发前景。本发明所提供的菌株小孢根霉(rhizopusmicrosporus)neau-8，是从河北省廊坊市小麦根际土壤中分离获得的，已于2017年11月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称cgmcc)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.14635。附图说明图1为菌株neau-8在pda培养基上的菌落特征。图2为菌株neau-8菌株在摇瓶中培养时分解磷酸钙效果图。图3为磷标准曲线。图4为菌株neau-8对病原真菌的拮抗作用，在每张图片左侧平皿中为病菌对照，每张图片右侧上部接种菌株neau-8，下部接种病原真菌。病原真菌：a黄瓜褐斑致病菌(corynesporacassiicola)，b黄瓜炭疽致病菌(colletotrichumorbiculare)，c大豆菌核致病菌(sclerotiniasclerotiorum)，d黄瓜枯萎致病菌(fusariumoxysporum)，e玉米大斑病菌(exserohilumturcicum)，f大豆根腐致病菌(rhizoctoniasolanikuhn)，g玉米弯孢病菌(curvularialunata)，h水稻纹枯致病菌(rhizoctoniasolani)，i玉米小斑病菌(helminthosporiummaydis)图5为菌株neau-8对盆栽玉米的促生效果图。图6为菌株neau-8对盆栽小麦生长的影响的结果图。具体实施方式以下通过具体实施例对本发明做进一步的说明，但不用以限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。本发明所述的小孢根霉(rhizopusmicrosporus)neau-8，在下述实施例或附图中简称为菌株neau-8、小孢根霉neau-8。所述平板即指代固体培养基，为本领域的惯用术语。pda培养基、pdb培养基以及其他的化学试剂或仪器设备，如无特殊说明书，均为常规试剂或仪器设备，均可通过商业化途径购买获得。实施例1.小孢根霉(rhizopusmicrosporus)neau-8的分离鉴定。1.菌株的分离和培养小孢根霉neau-8是从河北省廊坊市的小麦根际土壤中筛选获得。解磷菌筛选采用无机磷固体培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，mgso4.7h2o0.3g，feso4.7h2o0.03g，mnso4.4h2o0.03g，磷酸钙10g，琼脂18g，去离子水定容至1000ml，ph调至7.0。1)取小麦根际土壤，加入体积分数为0.85％的生理盐水富集培养后，静置15-30min；所述土壤与生理盐水的比例为1:9(g/ml)。具体如下：将适量小麦根际土壤过20目筛，然后加入研钵中充分研磨，称取10g研磨后的小麦根际土壤倒入250ml锥形瓶中，同时加入体积分数为0.85％的生理盐水90ml，于28℃摇床中150r/min振荡培养90-120min，以120min为佳，然后取出于室温中静置30min。2)然后取1ml上清液进行梯度稀释，取每一个稀释度的稀释液，分别涂布在无机磷固体培养基上进行培养；具体如下：取1ml上清液，按照稀释涂布平板法，分别将上清液稀释到原体积的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，(可用无菌水进行稀释)取每一个稀释度的稀释液200μl，均匀地涂布在无机磷固体培养基上，每个稀释度下重复2个平板。将所有平板标记用保鲜膜封口，并倒置于28℃恒温箱中培养。3)培养过程中，将每个平板上出现有透明圈的微生物挑取出，培养于新的无机磷固体培养基中，并做好菌种标记，4℃保藏。将初筛得到的具有较好解磷能力的菌株进行活化，28℃恒温培养箱中倒置培养5天。4)然后，分别将培养的菌体制成孢子悬液，接种到无机磷液体培养基中培养，通过测定菌液中可溶性磷的含量，筛选获得高效解磷的真菌小孢根霉。具体如下：再将活化好的菌株转接到pda大试管斜面上于28℃恒温培养箱中培养，7d后无菌水冲洗制成孢子悬液，并用血球计数板统计孢子浓度。再按照1％(v/v)的接种量将孢子悬液接入无机磷液体培养基中(配方为：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，mgso4.7h2o0.3g，feso4.7h2o0.03g，mnso4.4h2o0.03g，磷酸钙10g，去离子水1000ml，ph调至7.0)，对照组接种等体积的无菌蒸馏水，28℃、150r/min摇床培养7d，每隔1d取一次样离心，用钼锑抗比色法测定上清液中可溶性磷的含量，连续测定，确定试验菌株对难溶无机磷的分解情况，超出对照组中可溶性磷含量越高，说明菌株对无机磷的分解效果越好，从而获得解磷效果较好的菌株。将纯化的菌株命名为neau-8，用20％甘油保存于-80℃超低温冰箱中。2.菌株的鉴定。(1)形态特征：如图1所示，小孢根霉neau-8在pda培养基上28℃培养5天，菌落已经快速蔓延铺满整个平板，菌丝呈现灰白色，棉絮状，菌落质地疏松，四周有呈放射状排列的绒毛状白色菌丝，培养基背面不变色(无色素产生)。生长温度范围：15-48℃；生长ph范围：3-8；生长nacl范围：3-10％。(2)itsrdna序列测序：将小孢根霉neau-8接种到pda平板上在28℃生化培养箱内培养5-7d后，待菌丝量足够多，刮取菌丝于灭菌研钵内，加入液氮研磨至粉末状，采用ctab(cetyltriethylamoiumbromide)法提取真菌dna。通用引物its1/its4扩增供试真菌5.8srdna-its区的序列。其序列如下：its1引物序列为：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’its4引物序列为：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’选用50μl反应体系，各组分的成分如表1：表1pcr扩增体系反应所用程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共28个循环，最后72℃延伸5min。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，1×tae电泳缓冲液，上样量5μl。通过凝胶成像系统观察。扩增产物利用凝胶回收试剂盒进行回收纯化。具体操作按照试剂盒说明进行。所得胶回收产物由dna测序公司测序(吉林省库美生物科技公司)。将获得的itsrdna序列，输入genbank获得登录号。用blast软件进行比较分析。itsrdna序列如seqidno:1所示，该序列已登录ncbi，登录号为mf945552。通过blast程序进行序列比对分析，结果表明该菌株的itsrdna序列与rhizopusmicrosporuscbs130158似性达100％。综合菌体形态特征和itsrdna(如seqidno:3所示)序列测序，将分离的菌株鉴定为rhizopusmicrosporusneau-8。该菌株于2017年11月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称cgmcc)，保藏编号为cgmccno.14635。实施例2.小孢根霉rhizopusmicrosporusneau-8解磷能力的测定。用无机磷液体培养基测定解磷真菌小孢根霉rhizopusmicrosporusneau-8的解磷能力，先将斜面上培养的小孢根霉neau-8接种到pdb液体培养基(不加琼脂的土豆培养基)中作为种子液，于28℃、200r/min恒温摇床中振荡培养12h，随后按1％的接种量(v/v)将培养好的菌液接种到无机磷液体培养基三角瓶中，对照组按1％的接种量(v/v)接种未接菌的pdb液体培养基于无机磷液体培养基中，于28℃、200r/min恒温摇床中振荡培养7d。解磷效果见图2，由图可见接种小孢根霉neau-8的液体培养基澄清透明，沉淀完全消失，而对照组中液体培养基浑浊，且未见沉淀溶解，说明本发明筛选获得的小孢根霉neau-8具有很强的解磷效果。钼锑抗比色法测上清中的有效磷含量。在容量瓶中分别加入相应体积的100mg/l的标准磷溶液，加2滴2,6-二硝基苯酚作指示剂，用稀硫酸和10％naoh(g/v)溶液调节ph值，加钼锑抗显色剂5ml，定容至刻度,使标准磷浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mg/l，摇匀，在室温下(25℃左右)反应30min后用uv-1601pc紫外-可见分光光度计在720nm处比色，根据结果绘制标准曲线，根据标准曲线计算出对应的有效磷含量。将发酵液8000r/min离心10min，取上清2.5～5.0ml至50ml容量瓶中，按上述方法进行比色。磷标准曲线见图3，我们可得磷标准曲线方程为：y＝0.4405x+0.0484，其相关系数可达0.9993。其中y为od720，x为标准磷溶液浓度(mg/l)，根据该标准曲线方程，可计算出解磷菌的解磷能力。空白对照溶液中的有效磷浓度为87.4mg/l，ph为5.82，小孢根霉的溶液中有效磷含量为403.2mg/l，ph为2.08，该试验表明小孢根霉是一株高效解磷真菌。实施例3.小孢根霉(rhizopusmicrospores)neau-8在抑制病原真菌产生中的应用。以含有pda固体培养基的培养皿中心为原点，把培养好的待测菌菌饼倒置在培养皿内距离原点1/2半径处，同时将真菌的菌饼倒置在原点另一侧对称的位置，以未接种待测菌的培养皿为对照，每一组合重复三次，于28℃培养箱中培养，间隔一定时间观察病原真菌和待测真菌菌落大小、两菌落之间距离变化情况、抑菌带的有无及其大小，并用记号笔在平板上标记，观察变化情况。测定抑菌带宽度及两菌饼之间的距离，计算抑菌率。在对峙培养中，小孢根霉neau-8对实验室多种病原真菌产生抑制作用，均表现良好的抑菌活性，可见其抑菌谱的广谱性。其中，对黄瓜枯萎致病菌抑制率最大，可达100％，对9种病原真菌的抑菌率顺序为黄瓜枯萎致病菌>玉米大斑致病菌>黄瓜褐斑致病菌>黄瓜炭疽致病菌>玉米小斑致病菌>水稻纹枯致病菌>玉米弯孢致病菌>大豆根腐致病菌>大豆菌核致病菌(表2)。小孢根霉neau-8通过大量产生孢子进行扩展，通过基质竞争来抑制供试病原真菌生长(图4)。小孢根霉neau-8在平板拮抗实验上表现出对多种病害真菌的拮抗性，鉴于此，可以应用于土壤，对土壤中某些病害真菌起到抑制作用，在作物生长期间为作物提供生防保护。表2病原真菌抑制率％实施例4.小孢根霉(rhizopusmicrosporus)neau-8在促进作物生长中的应用。一、小孢根霉(rhizopusmicrosporus)neau-8对玉米的促生作用。小孢根霉neau-8在pda培养基上活化两次后接种于pda大试管斜面上28℃培养，7d后无菌水收集菌丝及孢子菌丝体，用磁力搅拌器打碎后，用无菌水稀释到1.0×104cfu/ml备用。处理组每克土加入1ml孢子悬浮液混合均匀，最终孢子浓度为1.0×104cfu/g，以无菌水作为对照。挑选完好饱满玉米种子用湿毛巾包好，28℃温度保湿催芽，至80％种子露白时播种。挑选长势一致的露白的玉米种子用镊子轻轻夹出摆放在盛有1kg土壤的盆中，每盆放置3粒种子，每个处理设置4次重复。30天后，分别测量玉米的株高，根长，苗和根的鲜重及干重。结果见图5及表3。表3菌株neau-8孢子液对盆栽玉米生长的影响可见，与对照相比，真菌小孢根霉neau-8孢子浓度为1.0×104cfu/g时，对玉米具有显著的促生效果，株高增加24.1％，根长增加34.8％，苗鲜重增加67.1％，苗干重增加38.4％，根鲜重增加69.0％，根干重增加71.1％。二、小孢根霉(rhizopusmicrosporus)neau-8对小麦的促生作用。小孢根霉neau-8在pda培养基上活化两次后接种于pda大试管斜面上28℃培养7d后，无菌水稀释到1.0×104cfu/ml备用。处理组每克土加入1ml孢子悬浮液混合均匀，最终孢子浓度为1.0×104cfu/g，以无菌水作为对照。挑选完好饱满小麦种子用湿毛巾包好，28℃温度保湿催芽，至80％种子露白时播种。挑选长势一致的露白的小麦种子用镊子轻轻夹出摆放在盛有1kg土壤的盆中，每盆放置10粒种子，每个处理设置4次重复。30天后，分别测量小麦的株高，根长，苗和根的鲜重及干重。结果见图6及表4。表4菌株neau-8孢子液对盆栽小麦生长的影响株高(cm)根长(cm)苗鲜重(g)苗干重(g)根鲜重(g)根干重(g)ck46.03±2.8618.53±1.951.662±0.2030.149±0.0140.695±0.0220.053±0.012菌株neau-857.45±2.8324.51±2.462.366±0.3110.197±0.0230.996±0.0360.095±0.021可见，与对照相比，菌株的浓度为1.0×104cfu/g时，对小麦具有显著的促生效果，株高增加24.8％，根长增加32.3％，苗鲜重增加42.4％，苗干重增加32.2％，根鲜重增加43.3％，根干重增加79.2％。核苷酸序列表<110>东北农业大学<120>一株高效解磷真菌小孢根霉及其筛选方法与应用<130><160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>its1引物<400>1tccgtaggtgaacctgcgg19<210>2<211>20<212>dna<213>its4引物<400>2tcctccgcttattgatatgc20<210>3<211>647<212>dna<213>itsrdna<400>3gttggcactttactgggatttacttctcagtattgtttgcttctatactgtgaacctctg60gcgatgaaggtcgtaactgaccttcgggagagactcaggacatataggctataatgggta120ggcctgttctggggtttgatcgatgccaatcaggattacctttcttcctttgggaaggaa180ggtgcctggtaccctttaccatataccatgaattcagaattgaaagtataatataataac240aacttttaacaatggatctcttggttctcgcatcgatgaagaacgtagcaaagtgcgata300actagtgtgaattgcatattcgtgaatcatcgagtctttgaacgcagcttgcactctatg360gatcttctatagagtacgcttgcttcagtatcataaccaacccacacataaaatttattt420tatgtggtgatggacaagctcggttaaatttaattattataccgattgtctaaaatacag480cctctttgtaattttcattaaattacgaactacctagccatcgtgcttttttggtccaac540caaaaaacatataatctaggggttctgctagccagcagatattttaatgatctttaacta600tgatctgaagtcaagtgggactacccgctgaacttaagcatatcaaa647当前第1页12