一种基于RPA的HPV16或HPV18病毒的E6或E7核酸的检测方法与流程

本发明属于体外诊断技术领域，尤其涉及一种基于rpa的hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的检测方法。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：

hpv病毒是人类乳头瘤病毒的缩写，是一种乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒a属，是球形dna病毒感染引起的一种性传播疾病。主要类型为hpv1、2、6、11、16、18、31、33及35型等，hpv16和18型长期感染可能与女性宫颈癌有关。

hpv病毒侵入子宫颈基底膜，被感染的细胞一部分横向扩散，另一部分迁移到鳞状上皮细胞，病毒整合到鳞状上皮细胞中，然后大量繁殖，受感染的鳞状上皮细胞逐步演变成cin1、cinii、ciniii，直至宫颈癌，但是并非所有被感染的细胞都会转换成癌细胞。

目前，宫颈癌的诊断及检测方法主要有组织病理学检测法、tct(液基薄层细胞学技术)检测法、hpv核酸扩增检测法。组织病理检测法有时很难将cin与非瘤病变、不同级别的cin准确鉴别开来，而不同级别的cin治疗是不同的，且有一定的创伤。tct的重复性不好，会受环境及医师经验等因素的影响，与活检的一致性不高，敏感性40％-60％。hpv核酸扩增检测法是一种基于pcr的检测方法，需要复杂的温度控制设备，而且无法直接检测hpv的mrna，约95％的高危hpv-dna感染者并不会发展成宫颈癌，无法确定病毒感染的真实致癌性。临床急需一种检测速度快且灵敏度高的检测技术，更有利于患者的及时诊治。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有技术中组织病理检测法有时很难将cin与非瘤病变、不同级别的cin准确鉴别开来，而不同级别的cin治疗是不同的，另外，组织病理学检测需要进行活体穿刺，穿刺过程中穿刺针可能造成子宫损失或出血等，对身体有一定的创伤。

(2)现有技术中tct的重复性不好，会受环境及医师经验等因素的影响，与活检的一致性不高，另外提取细胞样品的过程简易和范围有限容易造成假阴性，因此检测的敏感性仅为40％～60％，一些阳性患者会出现漏诊。

(3)现有技术中hpv核酸扩增检测法是一种基于pcr的检测方法，但是需要复杂的温度控制设备，而且无法直接检测hpv的mrna，约95％的高危hpv-dna感染者并不会发展成宫颈癌，无法确定病毒感染的真实致癌性。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于rpa的hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的检测方法，该检测不需要进行活体穿刺，具有很高的灵敏度和特异性，而且不仅可以检测dna，也可以检测mrna。

本发明是这样实现的，一种基于rpa的hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的检测方法，具体包括以下步骤：

步骤一：设计并筛选出高效并特异性扩增hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的引物；

步骤二：通过rpa反应扩增hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸。

进一步，步骤一中，rpa引物具有以下特点：

(1)5’端3到5个核苷酸避免聚鸟嘌呤，最好是胞嘧啶，能促进重组；

(2)3’端3个核苷酸是g或c有助于聚合酶的稳定性；

(3)不要出现聚嘌呤和嘧啶；

(4)gc含量在30-70％之间，避免形成二级结构，发卡结构等；

(5)扩增区域避开重复元件。

进一步，步骤一中，根据不同的靶基因(包括hpv16的e6或e7，以及hpv18的e6或e7等)，引物序列不同，但大小都在20-40个核苷酸之间。

进一步，步骤一中，引物序列优选为30-35个核苷酸。

进一步，步骤一中，引物与靶基因的序列互补匹配，同时也包括进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或替换后得到的与原引物具有相同扩增性能的单链dna分子。

进一步，步骤一中，优选为与靶基因序列完全互补匹配。

进一步，步骤一中，扩增序列都在靶基因的范围内，大小约但不限于80-250个核苷酸。

进一步，步骤一中，扩增序列优选为100-200个核苷酸。

进一步，步骤二中，rpa反应扩增hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸具体步骤为：

(1)以待测样品作为模板，将筛选出的不同的rpa引物加入至rpa反应体系中，进行rpa扩增反应；

(2)通过琼脂糖凝胶电泳观察，根据是否含有大小对应的核酸片段，判断待测样品是否包含hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸成分。

进一步，步骤二中，rpa反应体系包括2.4μl前引物10μm，2.4μl后引物10μm，29.5μlrpa缓冲液，2μl检测样品，11.2μl双蒸水，2.5μl醋酸镁280mm；醋酸镁一旦加入，反应即开始计时。

进一步，步骤二中，rpa反应可在36-42摄氏度进行，反应时间为15-40分钟。

进一步，步骤二中，rpa反应优选为37摄氏度，反应30分钟。

进一步，步骤二中，通过琼脂糖凝胶电泳观察，最终结果判断标准为，rpa反应产物含有大小对应的核酸片段，则判断待测样品包含hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸成分；rpa反应产物不含有大小对应的核酸片段，则判断待测样品不包含或候补不包含hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸成分。

进一步，该方法既可以检测靶基因的dna，也可以通过加入逆转录试剂检测靶基因的mrna；优选为dna检测。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述基于rpa的hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的检测方法的检测的靶基因dna。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述基于rpa的hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的检测方法的检测的靶基因的mrna。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

1、利用本发明公开的rpa检测方法进行检测，以筛选的引物和对应的含有hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的质粒dna为模板时，可以得到明显的电泳条带，然而当引物与序列不对应时以及人类基因组作为阴性对照模板时，没有得到电泳条带，证明了检测方法的高度特异性，特异性达100％。

2、利用本发明公开的rpa检测方法进行检测，以筛选的引物和对应的含有hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的质粒dna为模板时，将模板用双蒸水进行稀释后，可以检测到10个拷贝的靶基因，证明了该方法的高度灵敏性。

3、利用本发明公开的rpa检测方法进行检测，检测条件温和，检测时间短，使用更加便捷。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于rpa的hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的检测方法流程图。

图2是本发明实施例提供的筛选出的针对hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的rpa引物的rpa反应扩增效果示意图。

图3是本发明实施例提供的筛选出的针对hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的rpa引物的特异性验证示意图。

图4是本发明实施例提供的筛选出的针对hpv16的e6核酸的rpa引物的灵敏度验证示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了解决现有的技术问题，本发明提供一种基于rpa的hpv16或hpv18病毒的e6hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸hpv16和hpv18病毒e6和e7核酸的序列，设计rpa引物，通过rpa反应可有效地扩增靶基因(包括dna或mrna)，特异性达100％，灵敏度为10copies/反应；且本发明中的rpa等温扩增体系，反应迅速，不需要复杂的控温体系，在37-42摄氏度条件下均可实现靶基因的有效扩增，适用于hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的现场快速检测。

下面结合附图本发明的应用原理作详细描述；

如图1所示，本发明实施例提供的基于rpa的hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的检测方法，具体包括以下步骤：

s101：设计并筛选出高效并特异性扩增hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的引物；

s102：通过rpa反应扩增hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸。

步骤s101中，本发明实施例提供的rpa引物具有以下特点：

(1)5’端3到5个核苷酸避免聚鸟嘌呤，最好是胞嘧啶，能促进重组；

(2)3’端3个核苷酸是g或c有助于聚合酶的稳定性；

(3)不要出现聚嘌呤和嘧啶；

(4)gc含量在30-70％之间，避免形成二级结构，发卡结构等；

(5)扩增区域避开重复元件。

步骤s101中，本发明实施例提供的根据不同的靶基因(包括hpv16的e6或e7，以及hpv18的e6或e7等)，引物序列不同，但大小都在20-40个核苷酸之间。

步骤s101中，本发明实施例提供的引物序列优选为30-35个核苷酸。

步骤s101中，本发明实施例提供的引物与靶基因的序列互补匹配，同时也包括进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或替换后得到的与原引物具有相同扩增性能的单链dna分子。

步骤s101中，本发明实施例提供的优选为与靶基因序列完全互补匹配。

步骤s101中，本发明实施例提供的扩增序列都在靶基因的范围内，大小约但不限于80-250个核苷酸。

步骤s101中，本发明实施例提供的扩增序列优选为100-200个核苷酸。

步骤s102中，本发明实施例提供的rpa反应扩增hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸具体步骤为：

(1)以待测样品作为模板，将筛选出的不同的rpa引物加入至rpa反应体系中，进行rpa扩增反应；

(2)通过琼脂糖凝胶电泳观察，根据是否含有大小对应的核酸片段，判断待测样品是否包含hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸成分。

步骤s102中，本发明实施例提供的rpa反应体系包括2.4μl前引物10μm，2.4μl后引物10μm，29.5μlrpa缓冲液，2μl检测样品，11.2μl双蒸水，2.5μl醋酸镁280mm；醋酸镁一旦加入，反应即开始计时。

步骤s102中，本发明实施例提供的rpa反应可在36-42摄氏度进行，反应时间为15-40分钟。

步骤s102中，本发明实施例提供的rpa反应优选为37摄氏度，反应30分钟。

步骤s103中，本发明实施例提供的通过琼脂糖凝胶电泳观察，最终结果判断标准为，rpa反应产物含有大小对应的核酸片段，则判断待测样品包含hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸成分；rpa反应产物不含有大小对应的核酸片段，则判断待测样品不包含或候补不包含hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸成分。

本发明实施例提供的该方法既可以检测靶基因的dna，也可以通过加入逆转录试剂检测靶基因的mrna；优选为dna检测。

本发明实施例提供的根据hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的序列，设计大量的rpa引物，引物中个别碱基的增减都会对特异性扩增的效果有所影响，从中筛选出一套可快速有效地检测出hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的rpa引物。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理进行进一步说明；

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例用于验证筛选出来的针对hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的rpa引物的rpa反应扩增效果。

本实施例选择了含有针对hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的质粒dna作为模板进行了检测。具体序列如下：

hpv16的e6：

hpv16的e7：

hpv18的e6：

hpv18的e7：

其中带有横线的序列为筛选出来的针对hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的rpa引物。

根据不同的靶基因选择对应的引物配置rpa反应体系。rpa反应体系包括2.4μl前引物(10μm)，2.4μl后引物(10μm)，29.5μlrpa缓冲液(来自twistdx公司)，2μl检测样品(含有10ng质粒dna)，11.2μl双蒸水，2.5μl醋酸镁(280mm)；醋酸镁一旦加入，反应即开始计时。

rpa反应在37摄氏度进行，反应30分钟。反应结束后通过琼脂糖凝胶电泳观察。如图2所示，筛选出来的引物可以快速准确地扩增出各自的目的基因片段。

如图2所示，本发明实施例提供的筛选出的针对hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的rpa引物的rpa反应扩增效果。

图中：1：dl2000marker；

2：hpv16的e6扩增；

3：hpv16的e7扩增；

4：hpv18的e6扩增；

5：hpv18的e7扩增。

实施例2

本实施例用于筛选出的针对hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的rpa引物的特异性验证。

根据不同的靶基因选择非对应的引物配置rpa反应体系。rpa反应体系包括2.4μl前引物(10μm)，2.4μl后引物(10μm)，29.5μlrpa缓冲液(来自twistdx公司)，2μl检测样品(含有10ng质粒dna或1000ng人类基因组dna)，11.2μl双蒸水，2.5μl醋酸镁(280mm)；醋酸镁一旦加入，反应即开始计时。

rpa反应在37摄氏度进行，反应30分钟。反应结束后通过琼脂糖凝胶电泳观察。如图3所示，筛选出来的引物不能扩增出非对应的hpv核酸成分和人类基因组，证明了该方法的特异性。

如图3所示，本发明实施例提供的筛选出的针对hpv16或hpv18病毒的e6或e7核酸的rpa引物的特异性验证。

图中：1：dl2000marker；

2-5：hpv16的e6引物用于hpv16的e7、hpv18的e6、hpv18的e7以及人类基因组dna扩增；

6-9：hpv16的e7引物用于hpv16的e6、hpv18的e6、hpv18的e7以及人类基因组dna扩增；

10-13：hpv18的e6引物用于hpv16的e6、hpv16的e7、hpv18的e7以及人类基因组dna扩增；

14-17：hpv18的e7引物用于hpv16的e6、hpv16的e7、hpv18的e6以及人类基因组dna扩增。

实施例3

本实施例用于筛选出的针对hpv16的e6核酸的rpa引物的灵敏度验证。

rpa反应体系包括2.4μl前引物(10μm)，2.4μl后引物(10μm)，29.5μlrpa缓冲液(来自twistdx公司)，2μl检测样品(含有不同拷贝数的质粒dna)，11.2μl双蒸水，2.5μl醋酸镁(280mm)；醋酸镁一旦加入，反应即开始计时。引物和模板都是针对hpv16的e6核酸。

rpa反应在37摄氏度进行，反应30分钟。反应结束后通过琼脂糖凝胶电泳观察。如图4所示，该方法可以扩增出含有10个拷贝目的核酸的质粒dna，证明了该方法的高度灵敏性。

如图4所示，本发明实施例提供的筛选出的针对hpv16的e6核酸的rpa引物的灵敏度验证示意图。

图中：1：dl2000marker；

2：10拷贝；

3：20拷贝；

4：50拷贝；

5：100拷贝；

6：500拷贝；

7：1000拷贝。

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的方法方案，与上述实施例的实质相同。

重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)，被称为是可以替代pcr的核酸检测技术。rpa技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。

rpa技术原理如下：重组酶与引物结合形成的蛋白-dna复合物，能在双链dna中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动dna合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的dna链与ssb结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。