抗人PCSK9单克隆抗体及其用途的制作方法

本发明涉及基因工程抗体技术，特别涉及一种针对pcsk9的全人源单克隆抗体和全长抗体的制备方法及其抗肿瘤应用。

背景技术：

pcsk9原名神经凋亡调控转化酶1(neuralapoptosis-regulatedconvertase1，narc-1)，是前蛋白转化酶枯草溶菌素家族的第9个成员，由加拿大生化学家nabilseidah及其团队发现并首次报道。pcsk9主要的生理作用是介导肝细胞低密度脂蛋白受体(lowdensitylipoproteinreceptor，ldlr)的降解，减少ldlr对血浆低密度脂蛋白胆固醇(ldl-cholesterol，ldl-c)的摄取，导致ldl-c水平升高。靶向抑制pcsk9，有助于降低ldl-c水平。因此，pcsk9成为炙手可热的降脂新靶点，pcsk9抑制剂应运而生。目前大约有10家制药公司在生产研发pcsk9抑制剂，包括赛诺菲、安进、诺华、辉瑞以及施贵宝等。其中，大约半数的pcsk9抑制剂属于单克隆抗体，并处于药物临床研究的领先阶段。目前的pcsk9抑制剂多数用于治疗血脂异常、代谢疾病、高胆固醇症、炎性疾病等，其抑制肿瘤的作用却鲜少有人研究或报道。

肿瘤一直是威胁人类健康的罪魁祸首之一，人类也一直致力于肿瘤的研究，希望能够找出更有效的治疗肿瘤的方法。但是仍然存在对更有效且毒性更小的疗法的未满足的医疗需要。攻克肿瘤一直是学者们迫切希望解决的问题，通过对肿瘤发生原因、发病机理等方面的深入研究，目前已拥有一系列治疗肿瘤的技术，如外科手术切除、放化疗等，但这些方法存在治愈率低、药物副作用大等不足，肿瘤治疗仍然是困扰医学界的一大难题。单克隆抗体对相应的抗原具有高度特异性，可以针对他定的分子靶点制备与之特异性结合的单克隆抗体。单克隆抗体药物是生物医药领域的研发热点，具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，代表了药品治疗领域的最新发展方向。

结肠癌，常称为结直肠癌或肠癌，是来自结肠或直肠或阑尾中不受控的细胞生长的癌症，它是美国第二常见诊断的恶性和第二大常见的癌症死亡起因。目前，结直肠癌领域常用的靶向药物包括：以表皮生长因子受体(egfr)为靶点(见图)和以血管内皮生长因子(vegf)为靶点的两类药物，具体包括贝伐珠单抗、西妥昔单抗和帕尼单抗。

目前制备抗体的技术一般包括杂交瘤技术以及噬菌体筛选技术。杂交瘤技术筛选抗体的缺点包括时间长、产量低、抗体纯度低以及该技术产出的抗体为鼠源性抗体。关于抗pcsk9单克隆抗体的制备方法目前专利大多是前期通过噬菌体筛选的方法筛出pcsk9抗体或者通过基因工程的方法制备出新型的pcsk9抗体，至于后期将构建的质粒转染到悬浮细胞并通过细胞上清培养制备抗体这类的方法也鲜少有涉及。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术存在的技术问题，本发明提供了一种抗人pcsk9单克隆抗体，并提供了所述抗人pcsk9单克隆抗体的制备方法以及制药应用。

技术方案：本申请所述的一种抗人pcsk9单克隆抗体，其vhcdr1、cdr2和cdr3分别具有seqidno:1-3所示的氨基酸序列，且其vlcdr1、cdr2和cdr3分别具有seqidno:4-6所示的氨基酸序列。

进一步的，所述抗人pcsk9单克隆抗体vh具有seqidno:7所示的氨基酸序列，且其vl具有seqidno:8所示的氨基酸序列。

上述抗人pcsk9单克隆抗体是全人源抗体。

本发明还公开了所述抗人pcsk9单克隆抗体在制备治疗由人pcsk9介导的疾病药物中的用途。

进一步的，本发明还公开了所述抗人pcsk9单克隆抗体在制备治疗癌症，特别是结直肠癌的药物中的用途。

本发明利用已经构建保存的人源单克隆抗体噬菌体展示文库(根据hans].w.dehaard等人的报道(antibodyphagedisplay，2002，p87-100)构建的天然人源的fab噬菌体展示文库)，该库的库容超过1.0x10^10，宿主为大肠杆菌tg1。该库的库容超过1.0x10^10，宿主为大肠杆菌tg1)筛选到针对人pcsk9的fab抗体，并利用基因工程的方法得到完整全长抗体；并进一步通过实验发现该抗体可以有效抑制小鼠模型中结直肠癌的生长，在实验中发现相对于对照组其治疗组的肿瘤的生长明显受到了抑制。

所述抗人pcsk9单克隆抗体制备方法如下：

步骤一、噬菌体文库筛选目的抗体

将免疫管中加入一定浓度的pcsk9抗原并包被过夜，第二天清洗封闭并将封闭过的噬菌体加入到免疫管中，使抗原抗体结合。反复翻转以及静置之后用tween20清洗，洗脱。洗脱的噬菌体用1mtris-hcl进行中和并感染tg1，测定滴度并进行扩增浓缩，用于下一轮筛选，等4轮筛选过后，将洗脱的噬菌体感染大肠杆菌tg1并涂板挑单克隆，进一步进行elisa检测，筛出阳性克隆。将筛选出的抗体(命名为pa6)进行dna测序，得到pa6重链可变区和轻链可变区序列。

步骤二、阳性单克隆pa6抗体fab片段的表达及纯化

挑选其中一个单克隆抗体进行tg1感染，并提取质粒，酶切去除geneiii后将质粒进行转化并扩大培养，收集菌落进行纯化。

步骤三、全长抗体igg1形式的阳性克隆的表达及纯化

1、重链表达质粒的构建：通过pcr，对pa6抗体的fab片段中ch1-vh部分进行扩增，将ch1-vh部分与fc片段连接。然后将kozak序列、信号肽和限制性内切酶位点添加到重链可变区vh的n端。使用限制性内切酶ngomiv和nhei消化扩增后的重链片段和表达载体，酶切结束后，将片段与载体相连接。

2、轻链表达质粒的构建：通过pcr，对pa6抗体的fab片段中完整的轻链部分进行扩增。将kozak序列、信号肤和限制性内切酶位点添加到轻链可变区vl的n端。使用限制性内切酶ngomiv和nhei消化扩增后的轻链片段和表达载体，酶切结束后，将片段与载体相连接。

3、诱导表达：将构建好的质粒，使用转染试剂进行转染cho-s细胞，转染后待细胞活率恢复至90％左右，用嘌呤霉素对细胞进行筛选，同时在细胞中加入mtx进行加压，加压浓度从50nm、慢慢增加至500nm，直到细胞处于比较稳定的状态。取细胞上清跑胶鉴定pa6抗体表达量(图3)，确认抗体确实表达，将细胞铺到96孔板中进行阳性克隆筛选并采用elisa检测。筛选出的阳性克隆扩大培养至250ml摇瓶中继续培养并定期添加补料。后收集细胞上期纯化出相应抗体并测量浓度(图4)。

步骤四、细胞上清纯化：取上述-80℃上清放置4℃自然解冻，使用15ml50kd(截留分子量)的超滤管对所有上清约150ml体积超滤浓缩至总体积约10ml，并用结合缓冲液稀释2倍，最后再使用0.45μm滤膜过滤。将rproteingbeads装入1ml层析柱，层析用5倍柱体积的结合液进行平衡，然后将样品加到平衡好的rproteingbeads中，接着用10倍柱体积的洗杂液进行清洗，最后使用5倍柱体积的洗脱液洗脱结合的抗体，将收集的洗脱液使用15ml50kd(截留分子量)的超滤管脱盐浓缩，期间使用pbs清洗两遍，最后收集浓缩液约1ml，4℃暂保存。使用伯乐蛋白浓度bradford法检测试剂盒检测纯化抗体浓度，最终测得其浓度为2.775mg/ml。使用sds-page检测流出组分、洗杂组分和洗脱组分以观察纯化效果，最终标明纯度在95％以上。

有益效果：本发明一方面利用噬菌体展示技术筛选出一种全新的pcsk9抗体，然后通过基因工程技术获取全长基因序列，并应用于抗体制备，制备的抗体产量高、周期短、并且是人源化抗体；另一方面创新性地发现了抗pcsk9抗体的抗肿瘤作用(以结直肠癌为例)，为以后研究肿瘤发生发展机制拓宽了思路，同时为后期将抗pcsk9抗体研制成单克隆抗体药物用于肿瘤治疗奠定了基础。

附图说明

图1为细胞上清sds-page鉴定结果；

图2为pcsk9纯化的抗体进行sds-page检测结果；

图3为抗体对裸鼠肿瘤抑制曲线；

图4是抗体对裸鼠肿瘤大小抑制展示。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。

实施例1筛选fab噬菌体文库得到抗人pcsk9的阳性单克隆

1、将pcsk9蛋白(金斯瑞生物科技有限公司)稀释至浓度为100ug/ml，取1.5ml加入到免疫管中，于4度包被过夜。于次日将免疫管中包被液弃去，并用pbs洗3遍。配制2％脱脂奶粉封闭免疫管3～4个小时，与此同时将我们根据hans].w.dehaard等人的报道(antibodyphagedisplay，2002，p87-100)构建的天然人源的fab噬菌体展示文库，也封闭1h，后将噬菌体加入到免疫管中，反复翻转2h，用0.1％吐温20洗脱与免疫管结合的噬菌体，并中和一下。将中和后的噬菌体感染tg1，准备下一轮筛选。

2、3～5轮筛选过后，将洗脱下来的噬菌体感染大肠杆菌tg1(碧云天，d0389)并涂平板，随机挑取100个克隆，用于噬菌体elisa鉴定。

3、将克隆接种于96孔平板，37℃培养至od600达到o.5左右；加入vscm13辅助噬菌体，过夜培养；扩增后的噬茵体用2％脱脂奶粉阻断，分别加入到包被1μg/mlpcsk9抗原和bsa的elisa板中(bsa为阴性对照)，室温孵育1h，用pbst洗板5次，加入兔抗m13噬茵体hrp偶联物，室温孵育1h，用pbst洗板5次，加入tmb过氧底物，于450nm波长处读数。最终筛选出亲和力较高的6号单克隆抗体，为pa6。

4、将pa6进行dna测序，得到pa6重链可变区和轻链可变区序列，其中完整重链和轻链可变区序列如seqidno:7和seqidno:8所示，其中，vhcdr1、cdr2和cdr3分别具有seqidno:1-3所示的氨基酸序列，vlcdr1、cdr2和cdr3分别具有seqidno:4-6所示的氨基酸序列。

重链可变区seqidno:7

evqleesgpelvkpsfvvkisckasgysftgyvlnwvrqshkvlwighinvcresfynqkfkdkasltsrtahvyikmltsedsavyycvrggmvcesdywgqgtsvtvss

其中，cdr1seqidno:1gyvln

cdr2seqidno:2hinvcresfynqkfkd

cdr3seqidno:3ggmvcesdy

轻链可变区seqidno:8

dilmtqtpltyslgdsiscsgfqnivghlklewflqkpqfgvklliykvgylvfsgvpdrfsgsggthlikisrveaedlgvyycfqgfsvtytfgggtkleik

其中，cdr1seqidno:4sgfqnivghlkle

cdr2seqidno:5kvgylvfs

cdr3seqidno:6fqgfsvtyt

实施例2阳性单克隆pa6抗体fab片段的表达及纯化

1、将筛选出的具有高亲和力的pa6抗体感染tg1并进行扩增，之后收集菌液，采用质粒提取试剂盒(omega，d6950-01)提取质粒，切除质粒的geneiii。

2、将获得的geneiii切除的质粒转化大肠杆菌tgl，2yta培养基中，37℃培养至对数期，加入1mmiptg，37℃过夜诱导表达。

3、离心收集上清，使用proteina(康为世纪，cw0894s)纯化，得到pa6fab蛋白。

实施例3全长抗体igg1形式的阳性克隆的表达及纯化

1、重链表达质粒的构建：通过pcr，对pa6抗体的fab片段中ch1-vh部分进行扩增将ch1-vh部分与实验室保存的fc片段(详见针对pcsk9的全人源单克隆抗体的可变区基因及其应用，专利号cn104861071a)使用t4连接酶连接。然后将kozak序列(aagcttgccacc)、信号肤和限制性内切酶位点添加到重链可变区vh的n端。使用限制性内切酶ngomiv和nhei消化扩增后的重链片段和表达载体ucoe-mu-p，酶切结束后，将片段与载体相连接。

2、轻链表达质粒的构建：通过pcr，对pa6抗体的fab片段中完整的轻链部分进行扩增。将kozak序列(aagcttgccacc)、信号肤和限制性内切酶位点添加到轻链可变区vl的n端。使用限制性内切酶ngomiv和nhei消化扩增后的轻链片段和表达载体ucoe-mu-p，酶切结束后，将片段与载体相连接。

3、诱导表达：将表达pcsk9抗体的重轻链质粒利用转染试剂共转染至cho-s细胞(北纳生物，bncc338010)中，待细胞活率稳定后，加入mtx(50nm、100nm、200nm、500nm)以及嘌呤霉素(索莱宝，p8230)进行加压筛选，直至细胞状态稳定，取细胞上清跑胶看其目的抗体是否表达。确认其表达后，将细胞铺至96孔板中，平均每个孔2个细胞，待其长至单克隆状态，取上清进行elisa检测，经过2～3轮亚克隆筛选，将细胞扩大培养至250ml摇瓶。并定期添加补料以提高抗体的产量，每次添加补料时摇瓶中细胞进行取样计数并分析。具体如表1-3所示，稳定表达抗pcsk9单克隆抗体的细胞株扩大培养并通过摇瓶培养的方式制备抗体，分别进行三次独立实验，将细胞扩大上摇瓶，每隔2～3天取样计数的具体结果以及对细胞进行的处理。

表1

表2

表3

待摇瓶中细胞活率达到70％及以下的时候，收集细胞上清，取样进行sds-page鉴定，结果如图1所示，由此可见上清中确实有目的条带抗pcsk9抗体表达，后期将上清进行纯化。

实施例4纯化pcsk9单克隆抗体

1、缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前用0.45μm滤膜过滤。

结合/洗杂缓冲液:0.15mnacl,20mmna2hpo4,ph7.0。

洗脱缓冲液:0.1m甘氨酸,ph3.0。

中和液：1mtris-hcl,ph8.5。

2、样品准备

取上述-80℃上清放置4℃自然解冻，使用15ml50kd(截留分子量)的超滤管(thermo)对所有上清约150ml体积超滤浓缩至总体积约10ml，并用结合缓冲液稀释2倍，最后再使用0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

3、样品纯化

1)将rproteingbeads装入1ml层析柱，层析用5倍柱体积的结合液进行平衡，使填料处于与目的抗体相同的缓冲体系下，起到保护抗体的作用。

2)将样品加到平衡好的rproteingbeads中，保证目的抗体与rproteingbeads充分接触，提高目的抗体的回收率，收集流出液。

3)用10倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4)使用5倍柱体积的洗脱液洗脱结合的抗体，收集洗脱液于预先加入了中和缓冲液的离心管中(5ml洗脱液中加入0.5ml中和缓冲液)，即目的抗体组分。

5)将收集的洗脱液使用15ml50kd(截留分子量)的超滤管脱盐浓缩，期间使用pbs清洗两遍，最后收集浓缩液约1ml，4℃暂保存，待检测浓度和纯度。

4、纯化抗体浓度与纯度检测

使用伯乐蛋白浓度bradford法检测试剂盒检测纯化抗体浓度，最终测得其浓度为2.775mg/ml。使用sds-page检测流出组分、洗杂组分和洗脱组分以观察纯化效果，如图2所示，如图箭头所示，样品还原后出现了明显的重、轻链条带，最终标明纯度在95％以上。

实施例5上述得到的抗pcsk9抗体的治疗肿瘤应用

抗体纯化后，标记好浓度，分装保存于-80℃，选取结肠癌细胞(北纳生物，bncc100275)接种小鼠，并用pcsk9抗体治疗小鼠，观察肿瘤大小，具体操作步骤如下：

1、购买10只裸鼠，雌，6周，将sw480细胞扩大，大概12盘10cm的大皿，保证每只小鼠的细胞接种量为5x10^6个细胞。

2、胰酶消化细胞，收集细胞，保证每只小鼠的细胞接种量为5x10^6个细胞。将10只裸鼠分为对照组和抗体组，皮下注射细胞，观察小鼠直至肿瘤长到一定大小(体积大概200mm3)。

3、将pcsk9抗体准备好，抗体组按照每只裸鼠按照体重注射10mg/g的剂量，尾静脉注射；对照组注射相同体积的生理盐水，每只裸鼠每隔一个星期测量裸鼠肿瘤大小并继续注射抗体治疗。并测量肿瘤大小，每星期重复该实验操作，连续进行一个月。

4、最后将裸鼠的瘤子摘取出来，比较实验组和对照组肿瘤大小并进行分析，结果如图3和图4所示，如图3，将裸鼠肿瘤大小进行数据分析后，可以发现相对于对照组其治疗组的肿瘤生长明显受到抑制；如图4，将小鼠肿瘤取出，上排为对照组，下排为治疗组。结果显示看到，抗体组的肿瘤生长相对于对照组肿瘤明显受到抑制。

序列表

<110>浙江蓝盾药业有限公司

<120>抗人pcsk9单克隆抗体及其用途

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>5

<212>prt

<213>智人(homosapiens)

<400>1

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15

<210>2

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<213>智人(homosapiens)

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