SlGLR3基因在提高植物灰霉病抗性中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及slglr3基因在提高植物灰霉病抗性中的应用。

背景技术：

随着我国现代化农业的进步，最近几十年来蔬菜产业蓬勃发展，但由于真菌性等病害高发，极大地影响了园艺作物的生长发育、产量和品质。番茄(solanumlycopersicuml.)，是世界性经济作物，我国的番茄种植面积和产量都位居世界前列。另外，番茄也极易受到病原菌侵染，造成了极大的经济损失。

番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌botrytiscinerea引起的死体营养型真菌病害。灰霉病发病严重时可导致作物减产甚至绝收，是我国乃至全世界威胁作物安全生产的重要因素。目前生产上对番茄灰霉病的防治主要依赖于农药的使用，给生态环境和食品安全带来了严重威胁。所以，从番茄中筛选具有提高灰霉病抗性的基因，对于创新番茄灰霉病抗性调控策略具有重要意义。

哺乳动物神经细胞中存在着两类谷氨酸受体：离子型谷氨酸受体(ionotropicglutamatereceptor，iglur)和代谢型谷氨酸受体(metabotropicglutamatereceptor，mglu)(kew,jamesn.c.,andj.a.kemp."ionotropicandmetabotropicglutamatereceptorstructureandpharmacology."psychopharmacology179.1(2005):4-29.)；其中，iglur与人类的抑郁、精神分裂、疼痛等神经疾病有关(traynelis,s.f.,etal."glutamatereceptorionchannels:structure,regulation,andfunction."pharmacologicalreviews62.3(2010):405-496.)。哺乳动物中，谷氨酸(glu)从神经突触小泡释放到神经突触中，与突触后神经元上的iglur结合，打开离子通道引发钙离子和其他阳离子的流入，从而诱导膜电位的变化。有大量研究表明，离子型谷氨酸受体iglur在哺乳动物神经系统中是诱导长距离信号传递的关键元件。

近年来的研究表明植物在感知局部信号后，也会将信号传递到整个植物体内，以快速激活未损坏部分的防御反应。植物谷氨酸类受体(glrs)是哺乳动物中枢神经系统的神经元iglur的同源基因，家族中的很多成员可以被胞外的谷氨酸激活。

植物glr已经被发现在植物的生长发育，机械损伤信号传递过程中起到重要作用。例如，苔藓glr调控其趋化性和生殖行为(ortiz-ramírez,carlos,etal."glutamatereceptor-likechannelsareessentialforchemotaxisandreproductioninmosses."nature(2017).)；拟南芥glr参与调控花粉管的发育(michard,erwan,etal."glutamatereceptor-likegenesformca²⁺channelsinpollentubesandareregulatedbypistild-serine."science332.6028(2011):434-7.)。

番茄glr3位于glr家族的iii类亚族，拟南芥glr3已经被报道在抗虫领域起到了重要的作用(mousavi,seyeda.r.,etal."glutamatereceptor-likegenesmediateleaf-to-leafwoundsignalling."nature500.7463(2013):422-426.)。然而，在植物真菌类病害的抗性领域，glr3基因却未见报道。因此，研究番茄slglr3基因对于植物灰霉病抗性的调控作用，有着重要的理论和实际应用意义。

技术实现要素：

本发明提供了slglr3基因在提高植物灰霉病抗性中的新用途，为选育具有灰霉病抗性的植物品种提供了理论依据。

具体技术方案如下：

本发明提供了slglr3基因在提高植物灰霉病抗性中的应用，其中，所述slglr3基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seqidno.1所示。

进一步地，所述植物为番茄。

本发明对番茄slglr3基因(solyc04g082610)的dna全长进行序列分析(https://solgenomics.net/)，设计特定的引导rna(singleguiderna,sgrna)。构建含有sgrna和cas9蛋白的载体；将所述含sgrna和cas9蛋白的载体利用农杆菌侵染法转化到番茄外植体中，制备得到定点编辑slglr3基因的一种番茄glr3缺失突变体植株；然后，将所述glr3缺失突变体植株进行灰霉病的病原菌接种处理，统计植株接种后灰霉病的发病情况；研究发现，番茄slglr3基因突变后，灰霉病的病斑面积显著变大；因此，番茄slglr3基因有利于提高番茄对灰霉病的抗性，可用于抗灰霉病番茄的选育。

进一步地，本发明通过实时荧光定量pcr试验，发现：所述slglr3基因通过促进茉莉酸合成相关基因的表达，提高茉莉酸的表达量，进而提高番茄对灰霉病的抗性。

具体地，所述茉莉酸合成相关基因为loxd(lipoxygenased,solyc03g122340)，其蛋白编码区的核苷酸序列如seqidno.2所示；该基因编码的脂氧合酶为茉莉酸合成的关键酶。

进一步地，本发明通过植物叶片膜电位测量试验，发现：所述slglr3基因可产生电信号，并通过信号转导反应提高细胞中抗性激素合成基因的表达水平，进而提高番茄对灰霉病的抗性。

该抗性激素为茉莉酸。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用crispr/cas9基因编辑技术获得番茄glr3缺失突变体植株，证明了slglr3基因在提高植物灰霉病抗性中的应用，可用于抗灰霉病番茄的选育。

附图说明

图1为番茄glr3缺失突变体植株t2代(纯合、不含外源cas9片段)的基因型与普通番茄的基因型的比较；

其中，与普通番茄比较，可知番茄glr3是一个突变型，在sgrna的位置发生了4个碱基的缺失突变；wt代表普通番茄，glr3代表缺失突变体植株，“------------”示为缺失序列。

图2为glr3缺失突变体叶片进行番茄灰霉病病原菌处理后的表型；

其中，a为灰霉病病斑的面积大小统计；b为根据a图病斑面积选取的普通番茄和glr3缺失突变体植株具有代表性的灰霉病点斑后发病的叶片照片；wt代表普通番茄，glr3代表缺失突变体植株。

图3为glr3缺失突变体植株进行番茄灰霉病病原菌处理后的表型以及茉莉酸合成基因表达水平；

其中，a为灰霉生长量的统计，b为茉莉酸合成相关基因loxd的表达量，c为灰霉病级指数的统计；wt代表普通番茄，glr3代表缺失突变体植株。

图4为glr3缺失突变体植株叶片受到谷氨酸刺激后的电信号表型；

其中，a为叶片膜电位振幅的大小统计；b为电位波动的图形；wt代表普通番茄，glr3代表缺失突变体植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

若未特别指明，下述实施例中所用实验方法均为常规方法，所用实验材料、试剂等，均可从商业途径得到。下述实施例中采用的番茄品种为番茄常规品种ailsa。

实施例1番茄glr3缺失突变体植株的制备与鉴定

1.1含特异sgrna的crispr/cas9载体的构建

在sgn网站https://solgenomics.net/上找到glr3的dna全长序列如seqidno.3所示，将其序列输入http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/crispr2/crispr网站，查找pam序列，即5‘-ngg-3’的序列(n代表a、t、c、g任一种核苷酸)，将ngg之前20bp的序列定义为sgrna，寻找特异性靶向基因蛋白编码区的sgrna。该特异性靶向glr3基因的蛋白编码区的sgrna的dna序列如seqidno.4所示。

设计crispr引物，如下所示：

crispr前引物(seqidno.5):ctggagctactgtgacgcga；

crispr后引物(seqidno.6):tcgcgtcacagtagctccag；

中间载体pmd18-t经bbsi单酶切，利用普通dna纯化试剂盒纯化。各取5μlcrispr前引物和后引物，混匀，用pcr仪退火成双链。将双链与酶切后的中间载体用t4连接酶连接，16℃连接过夜。42℃热击转化涂板，抗性为氨苄青霉素。

挑单克隆菌落，利用crispr前引物(seqidno.5)：ctggagctactgtgacgcga和载体后引物(seqidno.7)：ctacttatcgtcatcgtctttg，进行pcr验证。将条带大小正确的菌液送至测序公司测序，测序结果表明载体包含sgrna序列，提质粒。

质粒经hindiii(thermoscientific公司)与kpni(thermoscientific公司)酶切后，连至终载体pcambia1301上。pcambia1301载体抗性为卡那霉素。将测序正确的质粒电击进gv3101农杆菌感受态里，获得含特异sgrna的crispr/cas9载体的农杆菌菌株。

1.2glr3缺失突变体植株材料制备与鉴定

利用农杆菌侵染法将实施例1.1制得的载体转化到普通番茄ailsa的子叶中，利用植物细胞全能性，获得t0代基因编辑番茄植株。

对t0代植株进行检测筛选，利用pcr扩增slglr3基因的特异片段，片段大小为484bp，验证前引物：gatcccacactctcctctc(seqidno.8)；验证后引物：ctggagtgtgttgtcgcaag(seqidno.9)，然后对pcr产物进行测序，将测序结果与普通番茄slglr3基因进行序列比对，检测在sgrna的位置是否有碱基突变，如果有碱基突变，表明slglr3编辑成功。

通过该筛选方法，获得了1株slglr3基因发生了改变的t0代基因编辑植株，命名为glr3。将t0代种植于生长室，自交得到t1种子，并检测基因编辑情况，方法同上。为了在t1代中获得不含外源cas9片段的个体，采用如下方法：通过pcr方法扩增t1代植株中的crispr/cas9载体序列。

cas9载体前引物：agcttcattcggagtttttg(seqidno.10)；

cas9载体后引物：ctacttatcgtcatcgtctttg(seqidno.11)。

扩增后电泳检测，未观察到cas9条带扩增。从而获得了不含外源cas9片段的缺失了4个碱基的t1代植株，序列比较如图1所示。

将该不含外源cas9片段t1代植株进行连续自交，获得不含外源cas9片段，sgrna发生变异且可稳定遗传的t2代，下述实施例2与3接种病原菌实验均采用t2代材料。

实施例2番茄slglr3基因抗病表型的离体鉴定

对番茄glr3缺失突变体叶片进行灰霉病病原菌接种处理，具体如下：

灰霉病病原菌培养采用v8固体培养基(36％v8果汁，0.2％caco3，2％琼脂粉)，在22℃避光条件下培养15天左右，待培养皿内长满孢子后，4℃避光保存，一周内可以使用。

使用时，将菌丝块放入接种培养基(1％蛋白胨，4％一水合麦芽糖)中，组培刀片将菌丝刮下，剧烈涡旋震荡释放孢子，用纱布过滤，血球计数板在显微镜下调整孢子浓度至10⁶spores/ml，即为接种液。

离体叶片点斑试验：取2.5μl已调好浓度的接种液，放于普通番茄wt、glr3缺失突变体植株的叶片上，每个叶片上左右各点2个斑，后用保鲜膜覆盖，保持湿度高于80％。每个处理约8-10片叶子的重复。待48小时出现病斑后，量取灰霉病病斑直径，计算出面积，并拍照。

如图2所示，番茄slglr3基因可提高番茄对灰霉病的抗性。相比平均病斑面积为0.48cm²(图2a)的普通番茄wt，glr3缺失突变体植株发病严重，平均病斑面积约达0.85cm²(图2a)，且病斑大(图2b)。

实施例3番茄slglr3基因抗病性功能鉴定及其对抗性激素的影响

对番茄glr3缺失突变体植株进行灰霉病病原菌接种处理，具体如下：

灰霉病病原菌培养用v8固体培养基(36％v8果汁，0.2％caco3，2％琼脂粉)，在22℃避光条件下培养15天左右，待培养皿内长满孢子后，4℃避光保存，一周内可以使用。

使用时，将菌丝块放入接种培养基(1％蛋白胨，4％一水合麦芽糖)中，组培刀片将菌丝刮下，剧烈涡旋震荡释放孢子，用纱布过滤，血球计数板在显微镜下调整孢子浓度至10⁶spores/ml，即为接种液。

整株接种试验：将调好浓度的接种液倒入100ml的喷壶，旋紧后上下轻轻摇晃混匀，均匀地喷在番茄的每个叶片上，使得整个叶片都得到接种液的喷雾，而并不会有过多的接种液汇聚在叶尖而滴落。将植株放置在透明的塑料箱里，箱子顶部用保鲜膜密封，从而保证湿度高于80％。每个处理至少5个重复。

接种24小时后，取叶片样品0.2g；接种48小时后，统计发病率。

用总rna提取试剂盒(tiangen，dp419)按照trizol裂解法提取rna，在使用反转录试剂盒(toyobo，fsq-301)反转录成cdna，进行qrt-pcr实验，实时荧光定量pcr(qrt-pcr)采用480iireal-timepcrdetectionsystem(roche，swiss)，并使用sybrgreenpcrmastermix(takara，rr420a)。pcr反应条件为：95℃3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，40个循环。在每个循环的延伸末期采集荧光数据。

通过qrt-pcr技术测定灰霉生长量。根据灰霉的cdna的序列设计基因特异性引物，将其命名为b.cinereaactin，序列如下：

b.cinereaactin前引物：ggtaacattgttatgtctgg(seqidno.12)；

b.cinereaactin后引物：cttgaccttcatcgacg(seqidno.13)；

根据番茄的loxd基因序列设计特异性引物；

loxd基因前引物：cattgccattgaacttag(seqidno.14)；

loxd基因后引物：gaactccagcatcattag(seqidno.15)；

接种24小时后，glr3缺失突变体的灰霉生长量是普通番茄wt的6倍左右(图3a)，茉莉酸合成相关基因相比普通番茄下调了50％左右。(图3b)

接种48小时后，glr3缺失突变体的灰霉病级指数为普通番茄wt的2倍左右(图3c)。

实施例4番茄slglr3基因介导电信号的研究

对番茄glr3缺失突变体植株进行电信号的测量，具体如下：使用电极制作仪(narishige公司，型号pc-10)将单孔玻璃毛细管(sutter公司，型号bf150-86-7.5，外径1.5mm，内径0.86mm)由加工成微电极，电极成细针状。拉制采用两步法，第一步拉制强度为67.4，第二步拉制强度为47.3。使用针头(直径约0.5mm)，灌入0.1moll^-1kcl即可使用，在显微镜下轻轻抖动以去除小气泡，并观察毛细管尖端是否破损，每次测量前必须保证其完好无损。

测定样品时，选择健康四叶左右的水培番茄苗，从上往下数第二个叶片为待测叶片，将待测叶片固定在透明玻璃槽内，在显微镜下借助微操纵仪轻轻将电极靠近叶片，小心将微电极垂直插入叶片细胞内(插入时应避免插入细胞间隙)，当膜电位将由0变化到－60mv左右，说明电极处于细胞中了。当叶片在缓冲液(basicsolution组成成份为mes5mm，caso40.5mm，kcl0.05mm，ph为6.0)，中的膜电位平稳以后将水培营养液用输液管分别替换为不同浓度的glr刺激剂(谷氨酸)+水培营养液(成分浓度不变)记录膜电位的变化，统计其波动的振幅。每个品种每个处理浓度分别用不同的番茄苗重复12次以上。仪器和待测样品都必须放置在金属铜丝屏蔽罩内，从而实现隔绝静电。

如图4所示，番茄slglr3基因可以介导电信号。glr3缺失突变体的电信号相对于普通番茄wt振幅下降了95％(图4a)，波形图明显平缓(图4b)。

序列表

<110>浙江大学

<120>slglr3基因在提高植物灰霉病抗性中的应用

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2787

<212>dna

<213>番茄(solanumlycopersicuml.)

<400>1

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