一种黑果枸杞花色苷单体PRG的制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种黑果枸杞花色苷单体prg的制备方法及其在应用。

背景技术：

高脂血症是指血液内tc或tg及其相关脂蛋白水平过高，或血清高密度脂蛋白胆固醇过低。高脂血症与高血压、冠心病、脑卒中、糖尿病等多种疾病相关。由于高脂血症是引起的动脉粥样硬化是造成冠心病、心肌梗塞、脑出血、脑梗塞等心脑血管疾病的主要原因，且目前市面上的降血脂药物主要有他汀类、贝特类、烟酸类等。他汀类药物是典型的轻甲基戊二酞辅酶还原酶抑制剂，其疗效显著，但价格昂贵，且具有肝毒性、肌毒性等潜在的毒副作用。因此，研制天然的、无毒的治疗高血脂的药物将具有重要的现实意义及开发潜力。

花色苷单体（矮牵牛素-3-o-芸香糖苷（反式-香豆酸）-5-o-葡萄糖苷，prg）是花青素在自然状态下与各种单糖结合而成的糖苷化合物，广泛存在于植物的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中，使其呈现由红、紫红到蓝等不同颜色。现已知的花青素有20多种，主要存在于植物中的有6种：矢车菊色素、飞燕草色素、牵牛花色素、天竺葵色素、芍药色素、和锦葵色素。在自然条件下，游离状态的花青素极少见，主要以糖苷形式存在。黑果枸杞成熟过程中，会积累大量花色苷，从而使其果实呈现出紫黑色。目前世界上有多家实验室在从事花色苷化合物的提取分离、结构鉴定以及对其生物活性的测定研究工作。研究表明，花色苷类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗癌、抗炎、降血脂、抗动脉粥样硬化、预防糖尿病、减肥、保护视力等功效，同时花色苷类作为一种天然色素，其安全、无毒、药食兼用的特性，目前在食品工业中蕴藏着巨大潜力。

花色苷单体prg大量存在于黑果枸杞中，属于花色苷类化合物。目前花色苷单体prg的提取工艺参数复杂，且操作步骤繁多，采用现代分离纯化方法富集制备prg天然产物标准品，用于预防和治疗高血脂药物中的用途，迄今尚未见有公开报道。

技术实现要素：

基于上述问题，本发明的目的在于提供一种工艺简单、易于操作的黑果枸杞中花色苷单体prg的制备方法。本发明所要解决的另一个目的是提供一种黑果枸杞花色苷单体prg在降血脂药物中的应用。

一种黑果枸杞花色苷单体prg的制备方法，包括如下步骤：

（1）样品处理：黑果枸杞干果粉碎后，首先经含有0.1%盐酸的质量浓度为80～95%的乙醇冷浸提取，然后用含有0.1%盐酸的去离子水冷浸提取，合并提取液，减压浓缩并冷冻干燥得到黑果枸杞提取物；

（2）大孔树脂除糖：将步骤（1）所制得的黑果枸杞提取物用质量体积比为1：5～7的去离子水溶解后，上ab-8大孔树脂柱，首先用去离子水洗脱除去多糖和蛋白，然后用含有0.1%盐酸的质量浓度为80～95%的乙醇洗脱，减压浓缩并冷冻干燥得到花色苷提取物；

（3）spe柱富集：将步骤（2）所制得的花色苷提取物用质量体积比为1：3～5的去离子水溶解后，用含有0.1%盐酸的质量浓度为20～40%的甲醇洗脱5个柱体积后，经含有0.1%盐酸的质量浓度为60～80%甲醇洗脱，减压浓缩并冷冻干燥得到主要含prg单体的花色苷富集物；

（4）反相制备柱纯化：将步骤（3）所制得的主要含prg单体的花色苷富集物用质量体积比为1：3～5的去离子水溶解后，上c18柱分离柱，用10倍柱床体积，含有0.1%盐酸的质量浓度为20～45%的乙腈酸水溶液洗脱，得到含有prg单体的洗脱液，经减压浓缩得到黑果枸杞花色苷单体prg的天然产物标准品。

进一步的，所述的步骤（1）冷浸提取的条件是指料液比为1：5（w/v）、提取次数为3次，每次24h。

进一步的，所述的步骤（3）中spe柱富集的条件是指spe-x1固相萃取柱，孔径为10μm，尺寸为30×100mm。

进一步的，所述的步骤（4）中反相制备纯化的条件是指mergres-c18反相制备柱，孔径为10μm，尺寸为30×250mm；柱温为25℃；流速为10~20ml/min。

进一步的，所述黑果枸杞花色苷单体prg在降血脂药物中的应用。

进一步的，所述的黑果枸杞花色苷单体prg可作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成降血脂药用制剂。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

（1）本发明仅涉及prg的提取浓缩、大孔树脂除糖、微孔树脂富集和反相mergres柱纯化四个步骤，分离过程简单、易于操作；

（2）本发明采用固相萃取spe-x1柱和mergres-c18反相制备柱结合，能将prg进行高效富集，富集后纯度达到80%以上，很大程度上降低了后续制备纯化难度；采用本发明方法，1kg黑果枸杞中能得到约4.3gprg，纯度大于等于92.0%；

（3）本发明方法所制得的prg为花色苷类化合物，其结构式（详见附图1），prg,esi-msm/z:933.2658[m]+;1hnmr(meod+tfa,600mhz)δ=8.88(s,1h,h-4),7.86(s,1h,h-2’),7.69(s,1h,h-6’),7.53(d,1h,j=15.3hz,h-8’’),7.38(d,1h,j=8.2hz,h-2’’,h-6’’),6.98(s,1h,h-8),6.96(s,1h,h-6),6.79(d,1h,j=8.3hz,h-3’’,h-5’’),6.19(d,1h,j=15.2hz,h-7’’),5.53(d,1h,j=7.8hz,gluh-1),5.22(d,1h,j=7.8hz,gluh-1’),4.92(t,1h,j=9.7hz,gluh-4’’),4.72(t,1h,j=7.8hz,gluh-1’’),4.10-3.54(m,15h),3.33(s,3h,ome),1.01(d,3h,me)；以上波谱数据与文献报道基本一致，确认其结构为矮牵牛素-3-o-芸香糖苷(反式-香豆酸)-5-o-葡萄糖苷。

附图说明

图1本发明方法所制得的prg为花色苷类化合物结构式；

图2本发明果枸杞花色苷单体prg氢谱；

图3本发明果枸杞花色苷单体prg高分辨质谱；

图4本发明果枸杞花色苷单体prg固相萃取spe柱富集谱图；

图5本发明果枸杞花色苷单体prg斑马鱼体内降血脂效果图；

图6本发明果枸杞花色苷单体prg降低小鼠体内tc效果图；

图7本发明果枸杞花色苷单体prg降低小鼠体内tg效果图；

图8本发明果枸杞花色苷单体prg升高小鼠体内hdl效果图；

图9本发明果枸杞花色苷单体prg降低小鼠体内ldl效果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

实施例1

一种黑果枸杞花色苷单体prg的制备方法。包括如下步骤：

（1）样品处理：黑果枸杞干果粉碎后，按照料液比为1：5（w/v），首先经含有0.1%盐酸的质量浓度为80%的乙醇冷浸提取，提取次数为3次，每次24h；然后用含有0.1%盐酸的去离子水冷浸提取，合并提取液，减压浓缩并冷冻干燥得到黑果枸杞提取物；

（2）大孔树脂除糖：将步骤（1）所制得的黑果枸杞提取物用质量体积比为1：5的去离子水溶解后，上ab-8大孔树脂柱，首先用去离子水洗脱除去多糖和蛋白，然后用含有0.1%盐酸的质量浓度为80%的乙醇洗脱，减压浓缩并冷冻干燥得到花色苷提取物；

（3）spe柱富集：该步骤采用spe-x1固相萃取柱，孔径为10μm，尺寸为30×100mm；首先将步骤（2）所制得的花色苷提取物用质量体积比为1：3的去离子水溶解后，用含有0.1%盐酸的质量浓度为20%的甲醇洗脱5个柱体积后，经含有0.1%盐酸的质量浓度为60%甲醇洗脱，减压浓缩并冷冻干燥得到主要含prg单体的花色苷富集物；

（4）反相制备柱纯化：采用mergres-c18反相制备柱，孔径为10μm，尺寸为30×250mm；柱温为25℃；流速为10~20ml/min；首先将步骤（3）所制得的主要含prg单体的花色苷富集物用质量体积比为1：3的去离子水溶解后，上c18柱分离柱，用10倍柱床体积，含有0.1%盐酸的质量浓度为20%的乙腈酸水溶液洗脱，得到含有prg单体的洗脱液，经减压浓缩得到黑果枸杞花色苷单体prg的天然产物标准品，纯度为92.0%，附图2和3为制得的果枸杞花色苷单体prg的氢谱图和高分辨质谱图。

上述黑果枸杞花色苷单体prg在降血脂药物中的应用。其中，黑果枸杞花色苷单体prg作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成降血脂药用制剂。

实施例2

一种黑果枸杞花色苷单体prg的制备方法。包括如下步骤：

（1）样品处理：黑果枸杞干果粉碎后，按照料液比为1：5（w/v），首先经含有0.1%盐酸的质量浓度为95%的乙醇冷浸提取，提取次数为3次，每次24h；然后用含有0.1%盐酸的去离子水冷浸提取，合并提取液，减压浓缩并冷冻干燥得到黑果枸杞提取物；

（2）大孔树脂除糖：将步骤（1）所制得的黑果枸杞提取物用质量体积比为1：7的去离子水溶解后，上ab-8大孔树脂柱，首先用去离子水洗脱除去多糖和蛋白，然后用含有0.1%盐酸的质量浓度为95%的乙醇洗脱，减压浓缩并冷冻干燥得到花色苷提取物；

（3）spe柱富集：该步骤采用spe-x1固相萃取柱，孔径为10μm，尺寸为30×100mm；首先将步骤（2）所制得的花色苷提取物用质量体积比为1：5的去离子水溶解后，用含有0.1%盐酸的质量浓度为40%的甲醇洗脱5个柱体积后，经含有0.1%盐酸的质量浓度为80%甲醇洗脱，减压浓缩并冷冻干燥得到主要含prg单体的花色苷富集物；

（4）反相制备柱纯化：采用mergres-c18反相制备柱，孔径为10μm，尺寸为30×250mm；柱温为25℃；流速为10~20ml/min；首先将步骤（3）所制得的主要含prg单体的花色苷富集物用质量体积比为1：5的去离子水溶解后，上c18柱分离柱，用10倍柱床体积，含有0.1%盐酸的质量浓度为45%的乙腈酸水溶液洗脱，得到含有prg单体的洗脱液，经减压浓缩得到黑果枸杞花色苷单体prg的天然产物标准品，纯度为95.0%，附图2和3为制得的果枸杞花色苷单体prg的氢谱图和高分辨质谱图。

上述黑果枸杞花色苷单体prg在降血脂药物中的应用。其中，黑果枸杞花色苷单体prg作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成降血脂药用制剂。

实施例3

一种黑果枸杞花色苷单体prg的制备方法。包括如下步骤：

（1）样品处理：黑果枸杞干果粉碎后，按照料液比为1：5（w/v），首先经含有0.1%盐酸的质量浓度为90%的乙醇冷浸提取，提取次数为3次，每次24h；然后用含有0.1%盐酸的去离子水冷浸提取，合并提取液，减压浓缩并冷冻干燥得到黑果枸杞提取物；

（2）大孔树脂除糖：将步骤（1）所制得的黑果枸杞提取物用质量体积比为1：6的去离子水溶解后，上ab-8大孔树脂柱，首先用去离子水洗脱除去多糖和蛋白，然后用含有0.1%盐酸的质量浓度为90%的乙醇洗脱，减压浓缩并冷冻干燥得到花色苷提取物；

（3）spe柱富集：该步骤采用spe-x1固相萃取柱，孔径为10μm，尺寸为30×100mm；首先将步骤（2）所制得的花色苷提取物用质量体积比为1：4的去离子水溶解后，用含有0.1%盐酸的质量浓度为30%的甲醇洗脱5个柱体积后，经含有0.1%盐酸的质量浓度为70%甲醇洗脱，减压浓缩并冷冻干燥得到主要含prg单体的花色苷富集物；

（4）反相制备柱纯化：采用mergres-c18反相制备柱，孔径为10μm，尺寸为30×250mm；柱温为25℃；流速为10~20ml/min；首先将步骤（3）所制得的主要含prg单体的花色苷富集物用质量体积比为1：4的去离子水溶解后，上c18柱分离柱，用10倍柱床体积，含有0.1%盐酸的质量浓度为30%的乙腈酸水溶液洗脱，得到含有prg单体的洗脱液，经减压浓缩得到黑果枸杞花色苷单体prg的天然产物标准品，纯度为94.0%，附图2和3为制得的果枸杞花色苷单体prg的氢谱图和高分辨质谱图。

上述黑果枸杞花色苷单体prg在降血脂药物中的应用。其中，黑果枸杞花色苷单体prg作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成降血脂药用制剂。

实施例4

本发明方法所制得的黑果枸杞花色苷单体prg降血脂活性实验

（1）实验材料

受试药物：本发明制得的黑果枸杞花色苷单体prg。

动物：斑马鱼；km小鼠

试剂：甲基纤维素（sigma，china）；异丙醇（上海沪试，中国上海，批号为80109218）；二甲基亚砜/dmso（sigma-aldrich，中国上海，批号为bcbt0803），tg、tc、ldl、hdl试剂盒（中国南京建成生物工程研究所）。

（2）实验仪器

台式恒温振荡器（中国上海精宏实验设备有限公司thz-312），酶标仪（美国mdspectramaxm3）；高速冷冻离心机（德国sigma3-18k型），解剖显微镜（szx7，olympus，japan）；与显微镜相连的相机（verta1）；电动聚焦连续变倍荧光显微镜（az100，nikon公司）；心跳血流分析系统（zebralab3.3(pb2084c)）；精密电子天平（cp214，ohaus，america）；六孔板（fisherscientific，china）；

（3）黑果枸杞花色苷单体prg斑马鱼降血脂活性研究

随机选取受精后5天黑色素等位基因突变型半透明albino品系斑马鱼于烧杯中，用蛋黄粉喂饲斑马鱼建立高血脂模型，模型建立后，随机选取90尾模型斑马鱼于六孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。水溶给予黑果枸杞花色苷单体prg，其浓度为1000µm，阳性对照药洛伐他汀0.2μm浓度，同时设置模型对照组，每孔（实验组）容量为3ml。供试品处理48h后，用油红o进行染色，染色后每个实验（浓度）组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照并采集数据，分析统计斑马鱼尾部血管血脂光密度总和，根据光密度总和的统计学分析结果评价黑果枸杞花色苷单体prg降血脂作用。结果显示：黑果枸杞花色苷单体prg在1000μm浓度条件下对蛋黄粉诱发的斑马鱼高血脂具有降血脂作用（详见附图5）。

实验结论：斑马鱼活性研究发现黑果枸杞花色苷单体prg具有降血脂作用。

（4）黑果枸杞花色苷单体prg小鼠体内降血脂活性研究

小鼠高血脂模型制备：高脂饲料researchdiets(d12079b)喂食造模。

实验用km小鼠48只，随机6组，每组10只，饲喂不同饮食，分别为正常对照组：普通饲料；高脂组：高脂饲料；阳性对照药组：高脂饲料加灌胃阿托伐他汀钙片（0.125mg／kg）；高剂量：高脂饲料加灌胃花色苷单体（90mg/kg）；中剂量：高脂饲料加灌胃花色苷单体（60mg/kg）；低剂量：高脂饲料加灌胃花色苷单体（30mg/kg）；小鼠自由摄食、饮水，记录各组小鼠每天的摄食量，食物利用率（%）=（体重增加量/总摄食量）×100，连续喂养7周。每天光照时间12h，温度控制在20±2℃，湿度50±5%。小鼠喂养7周后，禁食12h，进行称重，摘眼球取血，处死打开小鼠腹腔和胸腔，立即分离肝脏、心脏、脾、肾、腹部脂肪和肾周脂肪，进行称重。将血液静止一段是时间离心得到血清，用tg、tc、ldl、hdl试剂盒测定血脂水平。

实验结果表明（详见附图6-9），结果显示，黑果枸杞花色苷prg单体能够显著降低高脂小鼠tc，tg，ldl水平，升高hdl水平。因此，黑果枸杞花色苷prg可用于制备降血脂药物。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的原理之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。