一种从微生物发酵液中精制氨基葡萄糖盐酸盐的方法及应用与流程

本发明涉及微生物发酵产物的分离提取技术领域，尤其涉及一种从微生物发酵液中精制氨基葡萄糖盐酸盐的方法及应用。

背景技术：

氨基葡萄糖盐酸盐，又称d-氨基葡萄糖盐酸盐，是一种天然的粘多糖，为一种无气味但稍有苦涩的白色结晶性粉末，易溶于水，不溶于乙醇。氨基葡萄糖盐酸盐在化工、医药、食品和保健等领域均具有广泛应用。氨糖能够特异性地作用于关节软骨，恢复软骨细胞正常的代谢功能，能刺激软骨细胞产生具有正常多聚体结构的蛋白多糖，抑制损伤软骨的酶，延缓骨性关节炎的病理过程和疾病的进展，改善关节活动，缓解疼痛，因此在临床上被大量用于骨关节炎的治疗。此外，氨糖在体内也具有重要的生理作用，如具有肝肾解毒，发挥抗炎、护肝的作用；以及作为抗菌消炎药物，治疗胃溃疡等。

氨基葡萄糖盐酸盐的生产方法可分为酸水解法、酶解法和微生物发酵法，前两种方法以虾蟹壳中提取的甲壳素和壳聚糖为原料，经酸解或酶解获得氨基葡萄糖盐酸盐产品。酸解法由于大量浓酸的使用，带来严重的环境污染问题，酶解法由于降解酶的专属性和降解效率的限制，存在生产周期长和效率低的特点，生产成本较高。微生物发酵法生产氨基葡萄糖盐酸盐产品，不受资源限制，对环境污染小，产品无鱼腥味，不存在过敏效应，是近年来国内外学者研究和关注的热点。

但是，微生物发酵法制备氨基葡萄糖产品的生产工艺中，除了发酵菌株的活力和发酵工艺条件的控制外，如何从发酵液中提取分离获得高纯度的氨基葡萄糖产品也是发酵生产中的一个难题。在现有实际发酵生产中，以大肠杆菌基因工程菌作为发酵株发酵生产的发酵液中，含有n-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖两种氨糖的产品形式，分离纯化困难。此外，氨糖与发酵液中大量杂质混合在一起，如发酵未消耗完的原料，生产过程中的副产物等，都限制了目标产物的提取，这也成为了限制微生物发酵生产氨糖工艺的技术难题。

现有的分离技术以强酸性阳离子交换树脂为主，其分离纯化工艺存在纯化周期长，且发酵液中氨基葡萄糖盐酸盐的回收率不足70％，造成了氨糖产品的极大浪费。

因此，如何从发酵液中高效提取氨基葡萄糖也成为氨糖发酵工艺中亟待解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种工艺合理、回收率和产品纯度高的氨基葡萄糖盐酸盐分离纯化工艺，解决了现有技术中发酵液中氨基葡萄糖提取率较低和周期长的问题；并且提供了精制的氨基葡萄糖盐酸盐在体内抗胰腺癌的新用途。

具体技术方案如下：

一种从微生物发酵液中精制氨基葡萄糖盐酸盐的方法，包括：

(1)取含有氨基葡萄糖的微生物发酵液，去除菌体后，收集上清液，得到溶液i；

(2)向溶液i中加入稀盐酸，在沸水浴中进行酸解，得到溶液ii；

所述稀盐酸的浓度为0.1～0.4mol/l，酸解时间为1～6h；

(3)向溶液ii中加入活性炭进行吸附，吸附完成后，过滤，得到溶液iii；

以溶液ii的质量计，活性炭的添加量为2～5％，所述吸附的温度为40～50℃，时间为1～2h；

(4)向溶液iii中加入碱，调节ph值至中性，采用聚丙烯滤膜进行超滤处理，得到溶液iv；

所述聚丙烯滤膜的分子量为1000～6000d，所述超滤的压力为0.4～0.8mpa；

(5)先对溶液iv进行真空浓缩，得到浓缩液，再向浓缩液中加入乙醇，持续低温搅拌进行结晶处理，结晶结束后离心，得到氨基葡萄糖盐酸盐结晶；然后，氨基葡萄糖盐酸盐结晶经洗涤和真空干燥处理，得到精制的氨基酸盐酸盐。

进一步地，步骤(1)中，所述微生物发酵液为通过基因工程菌发酵获得的含n-乙酰d-氨基葡萄糖和d-氨基葡萄糖的发酵液；所述基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌。

本发明的创新点在于：采用“酸解+活性炭吸附+超滤+浓缩结晶”的精制工艺，对特定的含有n-乙酰d-氨基葡萄糖和d-氨基葡萄糖的微生物发酵液进行分离纯化，获得回收率和产品纯度高的氨基葡萄糖盐酸盐，解决了现有技术中微生物发酵液中氨基葡萄糖提取率较低和周期长的问题。尤其是，超滤膜处理步骤能够与酸解和活性炭吸附处理进行配合，将微生物发酵液中难以去除的大分子杂质过滤去除，显著提高了氨基葡萄糖盐酸盐的回收率。

作为优选，步骤(1)中，所述离心的转速为10000～12000rpm，时间为8～12min。

进一步优选，步骤(2)中，所述稀盐酸的浓度为0.2mol/l，酸解时间为4h。

进一步优选，步骤(3)中，以溶液ii的质量计，活性炭的添加量为4％，所述吸附的温度为40℃，时间为1h。

进一步优选，步骤(4)中，所述碱为naoh，浓度为0.3～0.8mol/l；所述聚丙烯滤膜的分子量为3000d，超滤的压力为0.5mpa。

作为优选，步骤(5)中，所述真空浓缩的温度为50～70℃，浓缩倍数为20～30倍；

所述结晶的温度为3-8℃，时间为4～8h，浓缩液与乙醇的体积比为1:2～6，搅拌的速率为100-180rpm/min；

所述离心的速度为5000-8000rpm/min；

洗涤时，采用质量分数为93％～97％的乙醇水溶液进行洗涤，洗涤次数为1～2次；

所述真空干燥的温度为50～80℃，时间为4～10h。

本发明还提供了所述的精制方法获得的氨基葡萄糖盐酸盐。

并且进一步现，氨基葡萄糖盐酸盐在抗胰腺癌活性中的新用途。

本发明通过测定荷瘤小鼠的瘤块质量和胸腺指数，发现从微生物发酵液中分离纯化的氨基葡萄糖盐酸盐能够通过提高胸腺指数，提高荷瘤小鼠的免疫能力，并通过降低瘤块质量，来抑制胰腺癌细胞的生长。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明采用“酸解+活性炭吸附+超滤+浓缩+结晶+洗涤+干燥”的精制工艺，对特定的含有n-乙酰d-氨基葡萄糖和d-氨基葡萄糖的微生物发酵液进行分离纯化，获得了回收率和产品纯度高的氨基葡萄糖盐酸盐；解决了现有技术中微生物发酵液中氨基葡萄糖提取率较低和周期长的问题。

(2)本发明利用稀盐酸处理发酵液将发酵液中n-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖均转化为氨基葡萄糖盐酸盐，便于后续的高效分离纯化；利用活性炭的物理吸附原理，去除发酵液中的色素杂质；利用膜过滤技术去除发酵液中残留的蛋白质、核酸、胶体颗粒和大分子杂质；通过添加一定比例的无水乙醇和低温层析，提高了氨基葡萄糖盐酸盐的结晶效率。本发明提供的方法减少了分离纯化步骤，显著提高了发酵液中氨基葡萄糖盐酸盐产品的回收效率，且具有工艺流程简单、成本低的特点，可获得高纯度的氨基葡萄糖盐酸盐产品。

(3)本发明提供的精制方法可显著提高微生物发酵液中氨基葡萄糖盐酸盐的回收率，在活性炭吸附洗脱和膜过滤工艺中氨基葡萄糖盐酸盐的回收率为95.8％，真空浓缩和结晶纯化工艺中氨基葡萄糖盐酸盐的回收率为97.3％，发酵液中氨基葡萄糖盐酸盐总回收率93.2％，且氨基葡萄糖盐酸盐样品的纯度为94.6％。

附图说明

图1为实施例1中微生物发酵液(即溶液i)经不同浓度的稀盐酸处理不同时间后，发酵液中n-乙酰氨基葡萄糖的含量变化情况。

图2为实施例1中发酵纯化液(即溶液iv)中加入不同比例的乙醇后对氨基葡萄糖盐酸盐结晶析出量的比较变化情况。

图3为实施例1中制得的氨基葡萄糖盐酸盐样品的hplc纯度检测分析。

图4为实施例2不同给药量的氨基葡萄糖盐酸盐样品体内对胰腺癌细胞pan02生长的影响。

图5为实施例2不同给药量的氨基葡萄糖盐酸盐样品对荷瘤小鼠的胸腺指数的变化情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

1、氨基葡萄糖微生物发酵液的获取

本实施例采用的氨基葡萄糖发酵液通过现有技术方法发酵获得，即：将大肠杆菌的基因工程菌株bl21(de3)-pet28a-es-glms-gan1bl21接种至发酵培养基中进行发酵，获得的含有氨基葡萄糖和n-乙酰氨基葡萄糖的发酵液。

具体内容见公布号为cn108588049a、名为“一种氨基葡萄糖合成酶、工程菌及其应用”的专利申请文本；其中，工程菌制备过程参见实施例1和2，发酵制备氨基葡萄糖的过程参见实施例5。

2、氨基葡萄糖盐酸盐的精制

(1)取氨基葡萄糖微生物发酵液，12000rpm离心10min后，去除菌体，收集上清液，获得溶液i；

(2)酸解：向溶液i中加入0.2mol/l的盐酸，在100℃沸水浴中酸解处理4h，得到溶液ii；

为了使发酵液中n-乙酰氨基葡萄糖脱去乙酰基，在溶液i中加入不同浓度的稀盐酸进行100℃沸水浴处理，并设置不同处理时间，检测发酵液中n-乙酰氨基葡萄糖的变化情况，结果图1所示。

实验结果表明，不同浓度的稀盐酸均可降低发酵液中n-乙酰氨基葡萄糖的含量，且随着时间的延长，其转化的量逐渐提升。在0.1mol/l的盐酸处理1h后，发酵液中44.2％的乙酰氨基葡萄糖可被转化为氨基葡萄糖，当处理2h后，转化率可达56.7％。当盐酸的浓度增加为0.2mol/l时，处理1h和2h时n-乙酰氨基葡萄糖的转化率分别为58.2％和72.8％。

综合考虑时间成本、转化效率和盐酸浓度，最终确定的条件为0.2mol/l的盐酸沸水浴中处理4h，在此条件下，发酵液中n-乙酰氨基葡萄糖的转化率可达98.6％。

其中，n-乙酰氨基葡萄糖的检测采用hplc法进行检测，其具体的操作步骤如下：取适量酸解后的发酵液，经12000rom离心10min后，取适量的上清液用超纯水稀释后，将样品稀释液用0.22μm滤膜过滤。高效液相色谱法检测n-乙酰氨基葡萄糖含量采用氨基柱检测，流动相采用乙腈-磷酸盐缓冲液(65:35，ph7.5)，流速为1.0ml/min，检测波长为195nm，进样体积为10μl。

(3)活性炭吸附：40℃下，向溶液ii中加入活性炭(以溶液ii的质量计，活性炭的添加量为4％)，吸附1h(每间隔10min震荡处理一次)，吸附完成后，趁热过滤，得到过滤液，再在过滤后的活性炭滤渣中加入酸解液0.6倍体积的超纯水洗脱一次，过滤获得洗脱液，将过滤液和洗脱液合并，得到溶液iii；

酸解工艺处理完成后，发酵液中残留的色素会影响后续的分离纯化，且影响最终产品的质量。为降低氨基葡萄糖中的色素含量，采用活性炭对处理后的发酵液进行吸附处理。

在40℃水域中，加入不同浓度的活性炭吸附1h(质量分数为2％、3％、4％和5％)，期间10min震荡处理一次，使活性炭与发酵液充分接触；处理完后，趁热过滤，在过滤后的活性炭滤渣中加入酸解液0.6倍体积的超纯水洗脱一次，过滤获得洗脱液，将过滤液和洗脱液合并。

通过观察溶液iii的颜色，最终确定选择加入的活性炭量为4％(质量比)，此浓度下经过吸附后，溶液iii相对澄清，显著降低了发酵液中的色素含量。

(4)膜过滤：向溶液iii中加入0.5mol/l的naoh，调节溶液iii的ph值至中性，采用截留分子量为3000d的聚丙烯滤膜进行压力为0.5mpa的超滤处理，得到溶液iv；

利用0.5mol/l的naoh调节活性炭吸附后的溶液iii的ph值至中性，再采用截留分子量为3000d的聚丙烯滤过，对经过酸解和活性炭吸附的发酵液进行超滤处理，去除发酵液中残留的蛋白质、核酸、胶体颗粒和大分子杂质和色素、多肽等小分子杂质。

经计算，吸附和超滤之前的酸解液中氨基葡萄萄糖盐酸盐的含量为24.6g/l，将1l酸解液经活性炭脱色吸附、洗脱和超滤膜过滤后，共获得过滤液1.42l，经检测氨基葡萄糖盐酸盐含量为16.6g/l，氨基葡萄糖盐酸盐的回收率为95.8％。

(5)浓缩与结晶纯化：先利用旋转蒸发仪对溶液iv浓缩，浓缩的温度为60℃，将溶液iv浓缩25倍，得到浓缩液(保证浓缩液中氨基葡萄糖盐酸盐的浓度为30～50％)；再将浓缩液降至室温，取100ml浓缩液加入5倍体积的乙醇，在低温层析柜中按照150rpm/min速度搅拌处理过夜后，8000rpm离心10min后，将获得的氨基葡萄糖盐酸盐结晶利用95％的乙醇溶液洗涤二次后，真空干燥6h，得到精制的氨基酸盐酸盐。

将经过超滤膜处理后的溶液iv利用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩的温度为60℃，将过滤液浓缩25倍，经检测浓缩后溶液中的氨基葡萄糖浓度为33.5％(335g/l)。

将浓缩液降至室温后，取100ml浓缩液加入不同体积的乙醇溶液，在低温层析柜(温度设定为4℃)中按照150rpm/min速度搅拌处理过夜后，8000rpm离心10min后，将获得的氨基葡萄糖盐酸盐结晶利用95％的乙醇溶液洗涤二次后，真空干燥6h，称重，hplc检测获得的样品纯度。

结果如图2所示，不同的乙醇浓度处理后对氨基葡萄糖的结晶解析有显著的影响。低浓度的乙醇不利于氨基葡萄糖盐酸盐的结晶析出，1倍体积的乙醇加入后，获得的氨基葡萄糖盐酸盐的量仅为10.6g，随着乙醇浓度的提高其结晶析出的量逐步提高，当加入4倍体积的乙醇后，其析出的氨基葡萄糖盐酸盐量达到28.5g，当乙醇的加入量为母液体积的5倍是，析出的氨基葡萄糖盐酸盐量达到32.6g，后期随着乙醇浓度的提升，对结晶物的产量没有显著的提高作用。经计算，当加入5倍体积的乙醇，低温层析结晶过夜后，可获得32.6g的氨基葡萄糖盐酸盐结晶，其结晶的回收率达到97.3％。hplc检测氨基葡萄糖盐酸盐样品的纯度为94.6％。

对比例1

本对比例除步骤(4)采用离子交换树脂进行吸附外，其余步骤与实施例1相同。

离子交换树脂吸附的具体步骤如下：

(1)选择阳离子交换树脂001×8为吸附树脂，用去离子水浸泡12h后，反复洗树脂，利用两倍树脂体积的4％的盐酸溶液浸泡树脂6h，去离子水洗至中性后，用约两倍树脂体积的4％左右的氢氧化钠溶液浸泡树脂6h，去离子水洗至中性，再用约两倍树脂体积的4％的盐酸溶液浸泡树脂4h，用去离子水洗至出水呈中性后备用。

(2)将经过步骤(3)活性炭吸附洗脱后的发酵液加入离子交换柱中进行吸附，采用1mol/l的硫酸铵溶液洗脱作为洗脱液进行洗脱，获得氨基葡萄糖盐酸盐洗脱液。经计算，离子交换树脂对发酵液中氨基葡萄糖盐酸盐的吸附率为84.2％，硫酸铵溶液对氨基葡萄糖盐酸盐的洗脱率81.5％。

将经过阳离子交换树脂纯化后的氨基葡萄糖盐酸盐溶液，利用旋转蒸发仪进行浓缩25倍后，经计算氨基葡萄糖盐酸盐中的溶液为37.6％(376g/l)，将浓缩后的氨基葡萄糖盐酸盐溶液降至室温后，取100ml浓缩液加入5倍体积的乙醇溶液，在低温层析柜中(温度设定为4℃)按照120rpm/min速度搅拌处理过夜后，8000rpm离心10min后，将获得的氨基葡萄糖盐酸盐结晶利用95％的乙醇溶液洗涤一次后，真空干燥4h，称重，hplc检测获得的样品纯度。

经计算，100ml的氨基葡萄糖盐酸盐溶液中，共获得氨基葡萄糖盐酸盐样品35.6g，结晶纯化的回收率为94.68％，hplc检测氨基葡萄糖盐酸盐样品的纯度为98.3％。综合计算，离子交换树脂分离纯化方法对发酵液中氨基葡萄糖盐酸盐的综合回收率为64.9％。

实施例2氨基葡萄糖盐酸盐的体内抗胰腺癌活性研究

以实施例1制备的氨基葡萄糖盐酸盐为原料药，体内系统评价其对胰腺癌的效果。

以鼠源的pan02胰腺癌细胞在c57bl/6小黑鼠中建立胰腺癌的皮下移植瘤模型，pan02细胞用含10％胎牛血清的rpmi1640培养液重悬，于37℃、5％的co2的细胞培养箱中培养，待细胞贴壁生长近80％后，弃培养瓶中的培养液，用pbs清洗后加入适量的胰酶消化，待贴壁细胞变圆，即加培养液中止并800r/min离心5min，取适量比例的单颗细胞传代培养。扩增pan02细胞，当每个培养瓶的细胞融合度达到90％后，对细胞进行消化，800r/min离线5min，pbs洗两遍，用不含血清的rpmi1640培养基重悬细胞，使细胞数达到10⁷/ml，混合均匀。将细胞悬液注射进c57bl/6小黑鼠(上海西普尔－必凯实验动物有限公司)的两侧腹股沟的皮下，每侧100μl。

肿瘤移植7天后，全部建模成功，腹股沟有长径大约为5-8mm的瘤块，将小黑鼠随机分为3组，分别为空白对照组、低剂量氨基葡萄糖盐酸盐组和高剂量氨基葡萄糖盐酸盐组，其中空白对照组每天灌胃给予生理盐水，低剂量氨基葡萄糖盐酸盐组每天灌胃给予低浓度的氨基葡萄糖盐酸盐样品，给药剂量为100mg/kg，高剂量氨基葡萄糖盐酸盐组每天灌胃给予高浓度的氨基葡萄糖盐酸盐样品，给药剂量为300mg/kg，连续给药21天后，对小黑鼠进行断颈处死，完整剥取瘤块并称重，计算各组裸鼠的抑瘤率，同时剥离小黑鼠胸腺组织，称重计算各组中胸腺指数的变化情况。其中胸腺指数为解剖剥离胸腺后，去除筋膜和脂肪组织，用电子分析天平称重，按照如下公式计算获得：胸腺指数(mg/g)＝胸腺湿重(mg)/小鼠体重(g)。

体内利用实施例1制备的氨基葡萄糖盐酸盐对胰腺癌的生长有一定抑制作用，且呈现浓度依赖性。100mg/kg的氨基葡萄糖盐酸盐对胰腺癌pan02细胞的生长抑制率为18.2％，当氨基葡萄糖盐酸盐的给药剂量提高为300mg/kg时，其对细胞的生长抑制率为32.6％，较低剂量的给药量提高了79.1％，与空白对照组相比，低剂量氨基葡萄糖盐酸盐和高剂量氨基葡萄糖盐酸盐组均具有显著性差异(p<0.05)。

与此同时，高剂量的氨基葡萄糖盐酸盐可以显著提高了荷瘤小鼠的胸腺指数，空白对照组荷瘤小鼠的胸腺指数仅为1.82，低剂量氨基葡萄糖盐酸盐给药组和高剂量氨基葡萄糖盐酸盐给药组中荷瘤小鼠的胸腺指数为1.96和2.14，分别较空白对照组荷瘤小鼠提高了7.69％和17.58％，且与空白对照组相比具有显著性差异(p<0.05)。

该结果表明实施例1制备获得的氨基葡萄糖盐酸盐可通过提高荷瘤小鼠的免疫能力而发挥体内抗胰腺癌作用。