一种根肿菌漂浮式菌液接种方法与流程

本发明属于根肿菌室内接种技术领域，尤其涉及一种根肿菌漂浮式菌液接种方法。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：建立一套稳定的人工病害接种方法是筛选抗根肿病十字花科材料的基础。现有的根肿菌室内接种方法主要有根际土壤注菌法、拌土法、灌根法、蘸根法等。灌根接种法是待幼苗长至两叶一心时，在寄主根系周围灌入根肿菌休眠孢子悬浮液，但缺点是使用的肿根量较大，浪费接种源、操作浪费人力；蘸根接种法是在两叶一心期，将根系拔出用清水洗净后，蘸菌悬液接种，虽然可以节省菌源，但操作较复杂；根际土壤注菌法的特点是在播种后在育苗穴内逐个进行单独注射接种，工作量繁琐，费时费力；拌土法是将制备好的根肿菌休眠孢子悬浮液，拌入无菌育苗基质中，容易造成基质中接种菌液浓度不均匀，影响统计结果。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)灌根接种法是待幼苗长至两叶一心时，在寄主根系周围灌入根肿菌休眠孢子悬浮液，但缺点是使用的肿根量较大，浪费接种源、操作浪费人力。

(2)蘸根接种法是在两叶一心期，将根系拔出用清水洗净后，蘸菌悬液接种，虽然可以节省菌源，但操作较复杂。

(3)根际土壤注菌法的特点是在播种后在育苗穴内逐个进行单独注射接种，工作量繁琐，费时费力。

(4)拌土法是将制备好的根肿菌休眠孢子悬浮液，拌入无菌育苗基质中，容易造成基质中接种菌液浓度不均匀，影响统计结果。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种根肿菌漂浮式菌液接种方法。

本发明是这样实现的，一种根肿菌漂浮式菌液接种方法，所述根肿菌漂浮式菌液接种方法包括：

第一步，将十字花科根肿病发病田块采集的发病植株肿根作为供试病原菌、低温保存备用；再将灭菌蛭石、灭菌草炭、无菌土壤混合，作为供试基质、装于消毒漂浮式育苗盘备用；

第二步，将冷冻保存的甘蓝肿根取出，室温解冻，剪成小块后称重，加无菌水，用组织捣碎匀浆机搅成匀浆后，6层纱布过滤，调ph＝5～6，使孢子裂解充分、过滤杂质，利用血球计数板计测匀浆中休眠孢子浓度；

第三步，将第一步消毒后的种子，播在装有灭菌基质的漂浮式育苗盘中，将接种液加入漂浮盘中；使混匀后的基质中休眠孢子浓度达10⁸个/g基质，保湿，进行正常管理；

第四步，抗性鉴定时间为感病品种严重感病时期，在播种6周后，根据的发病情况调查进行病情指数分级调查。

进一步，所述第一步中按照质量比为蛭石：草炭：灭菌土＝1：1：2，ph＝5～6。

进一步，所述第二步中加5倍重量的无菌水。

进一步，所述第三步中在25℃黑暗条件下保湿48h，进行正常管理。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：根肿菌漂浮式菌液接种法克服了其他技术中接种菌源量消耗大、接种菌液浓度不均匀、操作复杂等的问题，减少了因接种不均匀而需要反复接种的次数；另外该接种方法较其他方法能够更短时间内发生症状，接种后发病快，品种长势均一，发病均匀，病情判别灵敏度高，并能正确划分出品种真实抗病性；既适用于小样本材料的病原菌小种鉴定，也适用于大批量材料的品种抗病性鉴定，操作简单快捷，接种效率高，成本低，对环境友好，生产应用上操作性强，轻简化程度高，该技术适合室内抗性鉴定及药剂活性筛选研究工作，更适用大田育种材料的规模化接种筛选和评价。

本发明的根肿菌漂浮式菌液接种法针对快捷、均一的接种方式设计，以接种后发病快，品种长势均一，发病均匀，病情判别灵敏度高，并能正确划分出品种真实抗病性及操作简单方便为宗旨；根肿菌漂浮式菌液接种法是一种适合十字花科大批量的品种抗病性鉴定的最佳接种方法，为抗病新品种选育和抗病品种合理布局服务。

附图说明

图1是本发明实施例提供的根肿菌漂浮式菌液接种方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术使用的肿根量较大，操作浪费人力；工作量繁琐，费时费力；接种菌液浓度不均匀，影响统计结果的问题。本发明的根肿菌漂浮式菌液接种法针对快捷、均一的接种方式设计，以接种后发病快，品种长势均一，发病均匀，病情判别灵敏度高。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的根肿菌漂浮式菌液接种方法包括以下步骤：

s101：供试材料的选取：将十字花科根肿病发病田块采集的发病植株肿根作为供试病原菌、低温保存备用；再将灭菌蛭石、灭菌草炭、无菌土壤按照配比混合(质量比为蛭石：草炭：灭菌土＝1：1：2，ph＝5～6)，作为供试基质、装于消毒漂浮式育苗盘备用；最后选取至少一种种质资源进行后续鉴定试验；

s102：制备接种液：将冷冻保存的甘蓝肿根取出，室温解冻，剪成小块后称重，加5倍重量的无菌水，用组织捣碎匀浆机搅成匀浆后，6层纱布过滤，调ph＝5～6，使孢子裂解充分、过滤杂质，利用血球计数板计测匀浆中休眠孢子浓度；

s103：接种：将第一步消毒后的种子，播在装有灭菌基质的漂浮式育苗盘中，将接种液加入漂浮盘中；使混匀后的基质中休眠孢子浓度达10⁸个/g基质，达到室内鉴定发病标准，在25℃黑暗条件下保湿48h，进行正常管理；

s104：抗性鉴定时间为感病品种严重感病时期，通常在播种6周后，根据发病情况调查进行病情指数分级调查。

下面结合实验对本发明的应用效果作详细的描述。

1材料和方法

菌种：在甘蓝根肿病发病田块采集发病植株肿根,-20℃冷冻保存。

供试甘蓝材料：高度感病品种：秋实4号；抗病品种：百慕田尚品。

2方法

2.1接种液的制备

取出部分冷冻保存的甘蓝肿根，室温解冻，剪成小块后称重，加等量无菌水，用组织捣碎匀浆机搅成匀浆后4层纱布过滤，4000r/min离心15min，弃上清液；用无菌水悬浮沉淀3500r/min离心10min，弃上清液重复此步3次，最后弃上清液重新用无菌水悬浮沉淀，制成根肿菌休眠孢子悬浮液，利用血球计数板计测休眠孢子悬浮液浓度，并调至3.8×10⁸个/ml。4℃保存备用。

2.2接种方法

根际土壤注菌法：将消毒后的种子，播在装有灭菌基质(质量比为蛭石:草炭:灭菌土＝1：1：2，ph＝5～6)的营养钵中,用移液枪吸取2ml配制好的3.8×10⁸个/ml休眠孢子悬浮液注射于根际基质正常管理。对供试甘蓝材料进行接种，每份材料50株，设置对照，3次重复培养，6周后调查发病情况。

漂浮式菌液接种法：将冷冻保存的甘蓝肿根取出，室温解冻，剪成小块后称重，加5倍重量的无菌水，用组织捣碎匀浆机搅成匀浆后，6层纱布过滤，调ph＝5～6，利用血球计数板计测匀浆中休眠孢子浓度。将消毒后的种子，播在装有一定灭菌基质(质量比为蛭石:草炭:灭菌土＝1：1：2，ph＝5～6)的漂浮式育苗盘中,将接种液加入漂浮盘中，最终使混匀后的基质中休眠孢子浓度达10⁸个/g基质，在25℃黑暗条件下保湿48h，此后进行正常管理。为了保持育苗盘漂浮，应适当加水。抗性鉴定时间为感病品种严重感病时期，通常在播种6周后。

3数据统计和分析

3.1甘蓝根肿病室内人工接种病情分级标准如下：

表1室内甘蓝根肿病分级标准及症状

3.2病情指数

病情指数(di)＝∑(发病级代表值×各级病株数×100)/(调查总株数×最高级发病代表值)

甘蓝根肿病群体抗性分级标准如下：

免疫(i)：di＝0；高抗hr:0<di≤5；抗病r:5<di≤15；中抗mr:15<di≤30；感病s:30<di≤50；高感hs:di>50。

4结果

接种六周后，对发病情况进行调查，按照甘蓝根肿病室内人工接种病情分级标准对接种植株进行分级，计算发病率和病情指数。从表2、表3中可以看出2种接种方法均可使植株发病，其中漂浮式菌液接种法接种效果较好，秋实4号的平均发病率为97.95％，平均病情指数为95.50；对于高抗品种百慕田尚品，其平均发病率为7.14％，平均病情指数为3.06。根际土壤注菌法效果较之稍差，秋实4号的平均发病率为89.58％，平均病情指数为84.22；对于高抗品种百慕田尚品，其平均发病率为5.95％，平均病情指数为3.06。因此2种接种方法中以漂浮式菌液接种法的接种效果更佳。

表2不同方法下“秋实4号”发病情况

同列数据后相同*表示差异显著(p＝0.05)，**表示差异极显著(p＝0.01)。

表3不同方法下“百慕田尚品”发病情况

同列数据后相同*表示差异显著(p＝0.05)，**表示差异极显著(p＝0.01)。

本发明针对快捷接种方式设计试验，结果表明，所采用的2种接种方法，根际土壤注菌法和漂浮式菌液接种法中，以漂浮式菌液接种法接种效果为最佳，其在抗病育种中，可以简单而有效的有在通常条件下发病稳定且一致,并能同时准确地鉴定大量植株的抗病性。2种接种方法的接种物都为病原菌休眠孢子，区别在于漂浮式菌液接种法是灭菌基质主动吸收休眠孢子悬浮液进行接种，不用逐个进行单独注射接种；而根际土壤注菌法特点是将逐个进行单独注射接种，工作量繁琐，费时费力。根据接种效果的优劣，可以通过灭菌基质主动吸收接种液的接种效果更好，使基质吸收接种液的过程更加促进休眠孢子萌发，利于其侵染。本发明试验过程中，根瘤中的休眠孢子萌发出游动孢子，可随水流游动，由于育苗盘基部的水未流出，所以大部分游动孢子都保留在育苗盘中，相比其他接种方法，浪费菌量较少，且发病均匀。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。