本发明涉及一种从溶血血清中分离白蛋白的工艺。
背景技术：
血清蛋白又称白蛋白。一类分子量较小，呈球状，能溶于水的蛋白质。主要存在于哺乳动物、细菌、霉菌和植物中。卵白蛋白、乳白蛋白、豆白蛋白和血清白蛋白等都属此类。卵白蛋白是蛋清中的一种重要蛋白质，约占蛋清总蛋白的70％。血清白蛋白是血清中含量最丰富的蛋白质，占血清总蛋白量的50％以上，不含糖。血清白蛋白在血液中有重要生理功能，和维持血液正常渗透压有关，是血液总渗透压的主要调节物质，缺少该白蛋白可能导致机体浮肿。血清白蛋白的另一作用是作为脂肪酸的载体参与运送脂肪酸。血清蛋白用作血溶扩充剂，代替输血，可提高血浆胶体渗透压，增加血容量，主要用于预防和抢救失血性休克、创伤性休克、严重烧伤烫伤等；可补充机体白蛋白，提高血浆白蛋白的浓度，用于治疗低蛋白症、肝硬化、肾病疾患所致的腹水和水肿，以及脑水肿或大脑损伤所引起的脑压升高等。
白蛋白的制备方法较多，目前常用的方法有：盐析法和有机溶剂沉淀法。盐析法主要工艺流程是：将新鲜血液离心→纯水稀释→加40～50％的硫酸铵、离心弃沉淀，取上清→透析脱盐→聚乙二醇浓缩→冻干为成品。盐析法具有以下缺点：硫酸铵用量大，需要20-40倍体积的纯水透析脱盐；费时，透析需要48h，浓缩需要24h，整个工艺流程需要5天；收率低，一般为0.8～1％；废水处理量大，透析脱盐产生大量废水，含有较高的硫酸铵，处理成本高。有机溶剂沉淀法以e.j.cohn氏法最常用，但该方法需0～5℃低温进行，费时费力，整个工艺流程需7天，收率不高，1％左右，环保处理难度大，要建有机溶剂回收工艺，成本高。并且，目前的白蛋白提取方法对血清要求较高，要求血清不能溶血，这对白蛋白的制备带来极大的限制。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从溶血血清中分离白蛋白的工艺。
本发明所采取的技术方案是：
一种从溶血血清中分离白蛋白的工艺，其特征在于：包括以下步骤：
1)在溶血血清中加入活性炭，冷冻，后于常温静置，直至血清完全冻融分层，抽取上层溶液，过滤收集滤液a，优选的，冷冻温度为-20℃；
2)将滤液a凝胶层析，收集洗脱液得溶液b；
3)在溶液b中加入羧基化四氧化三铁纳米磁珠，室温孵育后，过滤分离得到溶液c；
4)将溶液c超滤除杂，浓缩，得蛋白浓缩液d；
5)将蛋白浓缩液d进行病毒灭活后干燥得白蛋白粉末。
进一步地，活性炭与溶血血清的质量体积比(g/l)为(30～50)：1。
进一步地，步骤1)中过滤使用的滤纸孔径为0.4～0.5μm。
进一步地，凝胶层析时使用醋酸钠溶液进行洗脱，醋酸钠溶液的ph值为7.5～8.5，洗脱流速为45～55cm/h。
进一步地，羧基化四氧化三铁纳米磁珠以1～3％的质量分数加入溶液b。
进一步地，使用孔径为0.4～0.5μm超滤膜超滤。
进一步地，超滤之后还需要使用截留分子量为10kda的板式超滤膜超滤除盐，得到蛋白浓缩液d。
进一步地，使用巴氏消毒法病毒灭活，在蛋白浓缩液d中加入稳定剂，调节其ph至6.4～7.4，加热至60℃保温10小时；优选的，稳定剂与蛋白浓缩液d的质量体积比(g/l)为0.5～1％，稳定剂选自甘氨酸、蔗糖中的任意一种。
进一步地，病毒灭活后的蛋白浓缩液d中加入保护剂，然后进行喷雾干燥；优选的，保护剂为海藻糖；进一步地，海藻糖与蛋白浓缩液d的质量体积比(g/l)为5～10％。
进一步地，喷雾干燥为离心喷雾干燥法或压力喷雾干燥法，离心喷雾干燥法的转速控制在5000～20000r/min，压力喷雾干燥法的压力控制在150～250kg/cm2，进风温度控制在100～180℃，出风温度控制在60～80℃。
本发明的有益效果是：
1.原料成本低。本工艺所需原料为犬溶血血清，对血清的质量要求低，可以直接从屠宰场获得。常规的白蛋白制备要求血清不能溶血。犬生性凶猛，常规的静脉采血难度大，风险高。
2.不需要有机溶剂，最大程度保留白蛋白的活力。常规的白蛋白分离要使用乙醇等有机溶剂。
3.采用喷雾干燥工艺，成本低，生产效率高。常规的白蛋白生产采用冻干工艺，冻干时间长，成本高。
4.采用羧基化四氧化三铁纳米磁珠分离去除血清中的抗体，磁珠可反复使用，成本低，
操作方便。常规采用proteina/g磁珠进行去除抗体，成本高，操作繁琐。
5.产品质量符合行业质量标准。白蛋白纯度高，纯度≥99.0％；1％白蛋白溶液403nm吸光度值≤0.1％；内毒素含量≤10eu/ml；无抗体；6、收率高，收率为>2.0％。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
实施例1
一种从溶血血清中分离白蛋白的工艺：
1)用量筒准确量取1l犬溶血血清；
2)用电子天平准确称取30g活性炭，加入到血清中放置在-20℃过夜冷冻。
3)将冷冻血清取出，放置在常温下，静置，直至血清完全冻融分层，此时，上层为以白蛋白为主的灰白色溶液，下层为以血红素、纤维连接蛋白和脂肪酸为主的暗红色溶液，抽取上层溶液，转移到新的容器中。下层溶液中，加入2倍体积的纯水，重复两次加活性炭冷冻后取上层溶液的操作，将两次获得的上层溶液合并。然后，用0.4μm的滤纸进行抽滤，收集滤液，得溶液1。
4)将溶液1用focudex75pg凝胶层析介质进行层析，柱高15cm，用ph7.5的醋酸钠洗脱，流速为55cm/h，收集蛋白得溶液2。
5)加入1％(m/m)的羧基化四氧化三铁纳米磁珠到溶液2，室温孵育2h，转速200rpm。
用磁力架进行过滤分离得到白蛋白溶液3。纳米磁珠可重新回收再用。
6)用0.4μm的超滤膜包进行过滤，得澄清滤液4。
7)用分子量为10kda的板式超滤膜进行超滤，除盐，浓缩成10％的白蛋白溶液5。添加0.5％(m/v)的甘氨酸作为保护剂，60℃，10h灭活病毒，得溶液6。
8)用5％(m/v)的海藻糖为热保护剂，加入到溶液6中，进行喷雾干燥，得白蛋白粉末20g，4℃保存，其中喷雾干燥为压力喷雾干燥法，压力喷雾干燥法的压力控制在150kg/cm2，进风温度控制在100℃，出风温度控制在60℃。
经检测制备的犬血清白蛋白的性能参数如下：
(1)纯度(白蛋白浓度/总蛋白浓度×100％)：99.2％；
(2)溶液澄清度(1％白蛋白溶液403nm吸光度值)：0.1％；
(3)内毒素含量(鲎试剂法)：5eu/ml；
(4)外观：白色粉末状；溶解后，为淡黄色液体，无浑浊；
(5)sds-page凝胶电泳鉴定：白蛋白在68kda位置。
实施例2
1)用量筒准确量取1l犬溶血血清；
2)用电子天平准确称取50g活性炭，加入到血清中放置在-20℃过夜冷冻。
3)将冷冻血清取出，放置在常温下，静置，直至血清完全冻融分层，此时，上层为以白蛋白为主的灰白色溶液，下层为以血红素、纤维连接蛋白和脂肪酸为主的暗红色溶液，抽取上层溶液，转移到新的容器中。下层溶液中，加入2倍体积的纯水，重复两次加活性炭冷冻后取上层溶液的操作，将两次获得的上层溶液合并。然后，用0.45μm的滤纸进行抽滤，收集滤液，得溶液1。
4)将溶液1用focudex75pg凝胶层析介质进行层析，柱高15cm，用ph8.5的醋酸钠洗脱，流速为45cm/h，收集蛋白得溶液2。
5)加入2％(m/m)的羧基化四氧化三铁纳米磁珠到溶液2。室温孵育2h，转速200rpm。
用磁力架进行过滤分离得到白蛋白溶液3。纳米磁珠可重新回收再用。
6)用0.45μm的超滤膜包进行过滤，得澄清滤液4。
7)用分子量为10kda的板式超滤膜进行超滤，除盐，浓缩成10％的白蛋白溶液5。添加1％(m/v)的甘氨酸作为保护剂，60℃，10h灭活病毒，得溶液6。
8)用10％(m/v)的海藻糖为热保护剂，加入到溶液6中，进行喷雾干燥，得白蛋白粉末22g，4℃保存，其中，喷雾干燥为压力喷雾干燥法，压力喷雾干燥法的压力控制在250kg/cm2，进风温度控制在180℃，出风温度控制在70℃。
经检测制备的犬血清白蛋白的性能参数如下：
(1)纯度(白蛋白浓度/总蛋白浓度×100％)：99.5％；
(2)溶液澄清度(1％白蛋白溶液403nm吸光度值)：0.08％；
(3)内毒素含量(鲎试剂法)：4eu/ml；
(4)外观：白色粉末状；溶解后，为淡黄色液体，无浑浊；
(5)sds-page凝胶电泳鉴定：白蛋白在68kda位置。
实施例3
1)用量筒准确量取1l犬溶血血清；
2)用电子天平准确称取40g活性炭，加入到血清中放置在-20℃过夜冷冻。
3)将冷冻血清取出，放置在常温下，静置，直至血清完全冻融分层，此时，上层为以白蛋白为主的灰白色溶液，下层为以血红素、纤维连接蛋白和脂肪酸为主的暗红色溶液，抽取上层溶液，转移到新的容器中。下层溶液中，加入2倍体积的纯水，重复两次加活性炭冷冻后取上层溶液的操作，将两次获得的上层溶液合并。然后，用0.5μm的滤纸进行抽滤，收集滤液，得溶液1。
4)将溶液1用focudex75pg凝胶层析介质进行层析，柱高15cm，用ph8的醋酸钠洗脱，流速为50cm/h，收集蛋白得溶液2。
5)加入3％(m/m)的羧基化四氧化三铁纳米磁珠到溶液2。室温孵育2h，转速200rpm。
用磁力架进行过滤分离得到白蛋白溶液3。纳米磁珠可重新回收再用。
6)用0.45μm的超滤膜包进行过滤，得澄清滤液4。
7)用分子量为10kda的板式超滤膜进行超滤，除盐，浓缩成10％的白蛋白溶液5。添加0.5％(m/v)的甘氨酸作为保护剂，60℃，10h灭活病毒，得溶液6。
8)用8％(m/v)的海藻糖为热保护剂，加入到溶液6中，进行喷雾干燥，得白蛋白粉末21g，4℃保存，其中，喷雾干燥为压力喷雾干燥法，压力喷雾干燥法的压力控制在200kg/cm2，进风温度控制在150℃，出风温度控制在80℃。
经检测制备的犬血清白蛋白的性能参数如下：
(1)纯度(白蛋白浓度/总蛋白浓度×100％)：99.6％；
(2)溶液澄清度(1％白蛋白溶液403nm吸光度值)：0.09％；
(3)内毒素含量(鲎试剂法)：2eu/ml；
(4)外观：白色粉末状；溶解后，为淡黄色液体，无浑浊；
(5)sds-page凝胶电泳鉴定：白蛋白在68kda位置。