飞蝗FK506结合蛋白46及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及飞蝗fk506结合蛋白46(fkbp46)及其编码基因与应用。

背景技术：

飞蝗是农牧业重大害虫，以胚胎滞育越冬，属兼性滞育昆虫，滞育诱导外界条件有温度、光周期等。目前已经报道的滞育调控机制有分子调控、激素调控，生物钟调控，以及能量调控，比较公认的是激素调控方式。

亲免素是可与免疫抑制剂环孢霉素a、他克莫司(fk506)及雷帕霉素结合的一类细胞受体蛋白，广泛地存在于生物体内。根据结合的免疫抑制剂不同，亲免素家族分为亲环素和fkbp两类。fkbp(fk506结合蛋白)是一种在生物体中广泛存在、进化上高度保守的组成型蛋白质，作为分子伴侣与一些蛋白相互作用从而调控不同的生化过程。在免疫细胞中，亲免素-免疫抑制剂复合物可与钙磷酸酶相互作用，从而阻遏免疫相关基因表达过程中的磷酸化信号途径，产生免疫抑制作用。植物fkbp在信号转导、胁迫响应、光合作用以及基因转录等方面都具有重要作用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是如何防治害虫。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种fk506结合蛋白。

本发明提供的kf506结合蛋白来源于飞蝗(locustamigratoria)，其名称为lmfkbp46，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

上述c)中的蛋白质lmfkbp46，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质lmfkbp46可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质lmfkbp46的编码基因可通过将序列1第75-1274位所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了与lmfkbp46蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的与lmfkbp46蛋白质相关的生物材料为下述a1)至a8)中的任一种：

a1)编码lmfkbp46蛋白质的核酸分子；

a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；

a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体；

a4)含有a2)所述表达盒的重组载体；

a5)含有a1)所述核酸分子的重组微生物；

a6)含有a2)所述表达盒的重组微生物；

a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物；

a8)含有a4)所述重组载体的重组微生物。

上述生物材料中，a1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1第75-1274位所示的cdna分子或基因组dna分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码lmfkbp46蛋白质的cdna分子或基因组dna分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码lmfkbp46蛋白质的cdna分子或基因组dna分子。

其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码lmfkbp46蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的lmfkbp46的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码lmfkbp46且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了lmfkbp46蛋白质或上述生物材料的新用途。

本发明提供了lmfkbp46蛋白质或上述生物材料在如下a1)-a6)中任一种中的应用：

a1)调控昆虫滞育；

a2)制备调控昆虫滞育的产品；

a3)防治害虫；

a4)制备防治害虫的产品；

a5)降低昆虫滞育率；

a6)制备降低昆虫滞育率的产品。

上述应用中，所述调控为降低；所述昆虫或害虫为飞蝗；所述降低昆虫滞育率为降低子代蝗卵滞育率。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种降低飞蝗滞育率的方法。

本发明提供的降低飞蝗滞育率的方法包括降低昆虫中fk506结合蛋白的表达量和/或活性的步骤，从而实现降低昆虫滞育率。

进一步的，所述降低昆虫中fk506结合蛋白的表达量和/或活性的方法是将抑制昆虫中fk506结合蛋白的编码基因表达的物质导入昆虫；

所述抑制昆虫中fk506结合蛋白的编码基因表达的物质为抑制昆虫中fk506结合蛋白的编码基因表达的dsrna。

更进一步的，所述fk506结合蛋白为上述lmfkbp46蛋白质；抑制昆虫中所述lmfkbp46蛋白质的编码基因表达的dsrna为由序列表中序列3所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链rna。

上述方法中，所述导入的方式为注射。

上述方法中，所述昆虫为飞蝗；所述降低昆虫滞育率为降低子代蝗卵滞育率。

上述方法在防治害虫中的应用也属于本发明的保护范围。

为了解决上述问题，本发明最后还提供了抑制lmfkbp46蛋白质的编码基因表达的物质。

本发明提供的抑制lmfkbp46蛋白质的编码基因表达的物质为由序列表中序列3所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链rna。

上述抑制lmfkbp46蛋白质的编码基因表达的物质在防治害虫和/或降低昆虫滞育率中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述昆虫或害虫为飞蝗。

本发明通过基因克隆技术从飞蝗中克隆了飞蝗lmfkbp46基因，并合成了用于干扰飞蝗lmfkbp46基因的dsrna，且运用注射法将dsrna导入飞蝗对飞蝗lmfkbp46基因进行rnai，结果发现该基因能够调控飞蝗卵滞育，本发明为更深入理解飞蝗滞育机制、提供新的生物农药靶标位点提供理论基础。

附图说明

图1为长日照条件下飞蝗lmfkbp46基因干扰效率。

图2为短光照条件下飞蝗lmfkbp46基因干扰效率。

图3为长光照和短光照条件下飞蝗lmfkbp46基因rnai后蝗卵滞育率。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的供试虫源：飞蝗卵采集于天津黄骅，在实验室连续饲养多代。飞蝗卵在智能人工气候箱中孵化，温度30℃，相对湿度60％。饲养条件：滞育诱导条件，光周期l：d＝10h：14h，温度28℃；非滞育条件，光周期l：d＝16h：8h，28℃。喂食小麦幼苗。

下述实施例中的主要试剂：rna分离试剂(invitrogen原装)，rnaspincolumn(全式金)，胶回收试剂盒(axygen)，extaqdna聚合酶(takara)，t4dna连接酶(takara)，pgem-teasyvectorsystems(promega)，无水乙醇、异丙醇、丙三醇等试剂均为国产分析醇。

下述实施例中的主要仪器：超净工作台(上海博讯实业有限公司)、东胜龙etc-811pcr仪(北京东胜创新生物科技有限公司)、德国sigma3k15冷冻离心机(德国希格玛离心机有限公司)、nanophotometer微量分光光度计(德国implen公司)、hpx-9052mbe数显电热培养箱(上海博讯实业有限公司)、thz-d台式恒温振荡器(华美生化仪器厂)、漩涡振荡器ql-901(海门市其林贝尔仪器制造)、高压灭菌锅yxq-ls-50sii(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。

实施例1、飞蝗fk506结合蛋白46及其编码基因lmfkbp46的获得

1、飞蝗总rna的提取

用rna分离试剂提取飞蝗组织样品的rna。具体步骤如下：

1)2ml匀浆器放于烘箱中，160℃，3个小时，冷却至室温备用。

2)将匀浆器置于冰上，加入1mlrna分离试剂和100-200mg飞蝗组织，研磨。

3)将匀浆液转移至1.5ml离心管中，室温静置5min。4℃，13000r离心5min。

4)将上清转移至干净的1.5ml离心管中，加入200μl氯仿，漩涡震荡15s。室温放置5min。4℃，13000r离心10min。

5)吸取400μl上清转移至新的1.5ml离心管中，加入200μl氯仿，漩涡震荡30s。室温放置5min。4℃，13000r离心10min。

6)吸取300μl上清，加入300μl异丙醇，漩涡震荡30s，转移至rnaspincolumn中，冰上静置10min。

7)4℃，13000r离心2min，弃滤液。

8)加入600μlrnawashsolution，吸打使沉降物洗涤，4℃，13000r离心2min，弃滤液。再次加入600μlrnawashsolution，吸打使沉降物洗涤，4℃，13000r离心2min，弃滤液。4℃，13000r空离3min，除去多余乙醇，空气吹干3min。

9)更换一个新的收集管，向rnaspincolumn中加入50μl65℃预热的rnase-free-water，余热下热置5min，4℃，13000r离心3min。

10)收集滤出液，用nanophotometer微量分光光度计检测rna浓度和od260/280值，确认rna质量。同时，取2μl提取的rna，琼脂糖凝胶电泳检测，剩余rna储存于-20℃备用。

2、反转录

用primescript^tm1ststrandcdnasynthesiskit反转录试剂盒反转录获得cdna。

具体步骤如下：

1)配置10μl体系：oligodtprimer(50μm)1μl、dntpmixture(10mmeach)1μl、totalrna<5μl、rnasefreedh2o补足体系至10μl。

2)65℃保温5min后，冰上迅速冷却。

3)配置20μl反应液：5×primescriptbuffer4μl、rnaseinhibitor(400u/μl)0.5μl(20units)、primescriptrtase(200u/μl)1μl(200units)、rnasefreedh2o补足体系至20μl。

4)缓慢混匀。

5)42℃保温30-60min。

6)95℃保温5min，使酶失活，冰上放置，-20℃保存cdna。

3、飞蝗fk506结合蛋白46及其编码基因lmfkbp46的获得

1)引物设计

根据前期测得的飞蝗转录组得到fkbp46基因序列，利用dnaman8设计fkbp46基因片段引物。设计的引物如下：

fkbp46-1f：gctgttgcgttggttacatc；

fkbp46-1r：ccagaactctcattcagtcaca。

2)pcr反应

以飞蝗cdna为模板，以引物fkbp46-1f/fkbp46-1r进行pcr扩增，得到pcr产物。

pcr反应体系如下(总体积50μl)：cdna模板1μl、dntp4μl、10×buffer5μl、前引物2μl、后引物2μl、taq酶0.25μl、ddh2o35.75μl。

pcr反应条件如下：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min；4℃保存。

3)pcr产物回收、克隆、测序

3-1)将pcr产物在tae配制的1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，当目标带分离较好时，用刀片切下目标带所在的胶块放入无菌的离心管中。再用胶回收试剂盒(axygen)回收纯化目标带，回收纯化过程参照试剂盒说明书进行。

3-2)pcr产物回收后连接pmd19-t载体，得到重组载体。连接体系如下：pmd19-tvector1μl、solution6μl、pcr回收产物3μl。连接条件：室温下连接6个小时。

3-3)感受态细胞的制备与转化

在1.5ml离心管中，加入33.3μltrans1-t1感受态细胞，冰上放置15min，42℃水浴90s，冰上放置10min。在每个1.5ml离心管中加入500μl的液体lb培养液，37℃，200rpm摇菌2h。摇菌后，吸取100μl菌液至1‰amplb固体培养基中，37℃培养过夜。挑选单菌落于2ml的离心管中，管中有1ml的1‰amplb液体培养基。37℃，200rpm摇菌3-6h，观察生长情况。

3-4)菌液pcr

对3-3)中的菌液进行pcr验证，菌液pcr反应体系(总体积49.25μl)如下：菌液1μl、dntp4μl、10×buffer5μl、前引物2μl、后引物2μl、taq酶0.25μl、ddh2o35μl。

反应条件如下：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min；4℃保存。

将阳性克隆菌株送到上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定并对测序结果进行分析。

测序结果表明：pcr扩增得到大小为1500bp的dna片段，其核苷酸序列如序列1所示，将序列1第75-1274位所示的基因命名为lmfkbp46，其编码的完整开放阅读框氨基酸序列如序列2所示，将序列2所示的飞蝗fk506结合蛋白46命名为lmfkbp46。

实施例2、lmfkbp46基因的dsrna及其在防治飞蝗中的应用

一、dsrna的合成

采用t7ribomax^tmexpressrnaisystem试剂盒合成dsrna。具体步骤如下：

1、dsrna引物的合成

根据已克隆出的基因片段设计引物，扩增目的片段为595bp，在引物的5'端引入t7启动子。引物序列如下：

fkbp46-2f：taatacgactcactataggtagacgacgacgatgttga；

fkbp46-2r：taatacgactcactataggtggagtattggcacctttgt。

2、dna模板的制备

用试剂盒提取菌液质粒，以含基因片段的质粒(实施例1中的重组载体)为模板，采用fkbp46-2f和fkbp46-2r进行pcr扩增，得到含有t7启动子序列的目的片段。

pcr反应体系如下(总体积49.25μl)：质粒1μl、dntp4μl、10×buffer5μl、前引物2μl、后引物2μl、taq酶0.25μl、ddh2o35μl。

pcr反应条件如下：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。

回收pcr产物，并用nanophotometer微量分光光度计检测目标dna浓度，回收浓度需大于150ng/μl。

3、dsrna的合成

采用t7ribomax^tmexpressrnaisystem试剂盒将回收的dna体外转录合成lmfkbp46基因的dsrna，并用nanophotometer微量分光光度计检测dsrna浓度，将dsrna浓度调整为1000ng/μl，得到dsrna溶液(溶剂为nucleausefreewater)。

本发明获得的lmfkbp46基因的dsrna为双链rna，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列3，其反义链的核苷酸序列为序列3的反向互补序列。上述lmfkbp46基因的dsrna也可通过人工合成的方法获得。将lmfkbp46基因的dsrna命名为dsfkbp46。

4、对照gfp的dsrna

按照上述方法合成对照gfp的dsrna，将对照gfp的dsrna命名为dsgfp，得到浓度为1000ng/μl的dsgfp溶液。对照gfp的dsrna为双链rna，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序列4，其反义链的核苷酸序列为序列4的反向互补序列。合成gfpdsrna的引物如下：gfp-1f：5’-taatacgactcactataggtacgactcactataggagtaaagg-3’；gfp-1r：5’-taatacgactcactataggtaggtttgtatagttcatccatacc-3’。

二、dsrna在防治飞蝗中的应用

1、实验方法

将dsrna导入蝗虫体内。具体步骤如下：分别在长光照(非滞育条件，光周期l：d＝16h：8h)和短光照(滞育条件，光周期l：d＝10h：14h)条件(温度28℃)下饲养飞蝗，用10μl的微量注射器吸取10μl浓度为1000ng/μl的dsfkbp46溶液(实验组)和dsgfp溶液(对照组)，在飞蝗雌成虫羽化第一天分别注射进入飞蝗雌成虫腹部的第三和第四腹节之间的节间膜内，注射器的针头和腹部平行，避免损伤蝗虫的内部器官组织。长日照和短日照条件下，实验组和对照组分别注射25头雌成虫。注射36h后，每个处理组随机取5头雌成虫，获得脂肪体、后足。

2、实时荧光定量pcr

提取飞蝗脂肪体、后足的总rna，takara反转录试剂盒合成cdna，检测飞蝗lmfkbp46基因的相对表达水平。以actin基因作为内参基因。引物序列如下：

fkbp46-3f：gacagtgatgaggaaatggaag；

fkbp46-3r：gtgggagtgtttggagttgc；

actin-f：gttacaaactgggacgacat；

actin-r：agaaagcacagcctgaatag。

结果如图1和图2所示。从图中可看出：在长光照和短光照条件下，rnai飞蝗lmfkbp46基因后，飞蝗脂肪体和后足中lmfkbp46基因的相对表达量与对照组相比有显著性差异(p＜0.05)，且低于对照组。说明dsfkbp46成功干扰了飞蝗脂肪体和后足中lmfkbp46基因的表达。

3、飞蝗滞育率统计

分别取在长光照和短光照条件下注射dsfkbp46和dsgfp的飞蝗产的卵(蝗卵)并置于28℃、相对湿度60％的条件下孵化，统计孵化幼虫数d1和未孵化蝗卵数d2，则：蝗卵滞育率(％)＝d2/(d1+d2)×100。

结果如图3所示。从图中可看出：干扰飞蝗雌成虫lmfkbp46基因后，长光照条件下蝗卵均孵化，滞育率为0；短光照条件下，飞蝗子代蝗卵滞育率与对照组相比下降，且有显著差异(p＜0.05)。表明长光照条件(非滞育条件)下，lmfkbp46基因转录水平改变不影响非滞育蝗卵的孵化率；而短光照条件(滞育条件)下，lmfkbp46基因参与调控飞蝗滞育，且lmfkbp46基因转录水平下降时，飞蝗卵滞育率降低。上述结果证明lmfkbp46基因可诱导飞蝗胚胎滞育，具有调控昆虫滞育的功能。

序列表

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>飞蝗他克莫司结合蛋白46及其编码基因与应用

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1500

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gctgttgcgttggttacatcaagtggttaatcaattactatttagagtttgcgtgaatat60

tatccttcggaagaatgttttgggcacttgttttggagccaggaaagaaatatgcacaaa120

ccgtgtcaaaaccattccacatatcaatggcttctcttgatgtagtgcattctgaaaatg180

aattggtgacagtgaatgttaacttccagaatgctgagtttattctgtgtaatctacaga240

aaaataaaattcttcagacgtctctagatctaaactttgaggcaggagacaggattgcat300

tctatacctcgggaaagggtcgtgtacatttaacaggttatctaatagacgacgacgatg360

ttgacgacgatttggatatcgacgcggaagcggaagaatcggaagaagacgtaacccctc420

agaaaaatgctattaaagccaataaacaagaaaagcggaagagtgtgggacagactccgg480

gaaaaccagtattgaaaaagagtaaaatggacagtgaagacgaagacggagatgacgacg540

gtgatgattttgatgacgacggtgacagtgatctcgaaagcctaggagacagtgatgagg600

aaatggaagtagaaagtgaagaagatgatggggaagaggatgaggactctgaacttgaag660

aaacaccaccacagaaacatcaacaaggaaagaaaaaagagaaacagagtgcacaaaaac720

agctacaggataaacaaacaaatactccaaatgaaatgaaaaagaagaagaacaaggggc780

atgacgctgcaactccaaacactcccactgttcaggcaaatggaactccagaaacacaat840

caggaaagaaaaataagaagaaaggtggtgaaacgcctggggacaaaggtgccaatactc900

caaaaccacctcaggctgggtcacctcagacaccgcagaagaagctcctggagggcggag960

tggctgtggaagatactgtcgtcggctccggtccggtggcaaagcctggcagattcgtaa1020

ctgtgtactacacaggccgtttgaagcagaataacaagaagtttgatgaaactgtgcaag1080

ggcctggcttcaaatttagactggggaaaggtgaggtaataaaaggatgggacattggag1140

ttacaggaatgaaagttggaggaaagaggaaacttattattccacctcacatggcgtacg1200

gagccaaaggttcgccaccagttattccacccaacagtgcgttagtatttgaagtggaac1260

taaagaatgtaaactaataatgctgtggtgattaatgccacacagtcactgaaaaagact1320

tctttgtggattttaaagtaatcgtactgggttttaattctcgttgagtgcttcattatt1380

aagtgaaacattgaattaacgttctgctactgggaaagctttctgtcaatacattgttgt1440

atatgatatttgtttgaatgcattccagtagtactaagtgtgactgaatgagagttctgg1500

<210>2

<211>400

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metphetrpalaleuvalleugluproglylyslystyralaglnthr

151015

valserlysprophehisilesermetalaserleuaspvalvalhis

202530

sergluasngluleuvalthrvalasnvalasnpheglnasnalaglu

354045

pheileleucysasnleuglnlysasnlysileleuglnthrserleu

505560

aspleuasnpheglualaglyaspargilealaphetyrthrsergly

65707580

lysglyargvalhisleuthrglytyrleuileaspaspaspaspval

859095

aspaspaspleuaspileaspalaglualaglugluserglugluasp

100105110

valthrproglnlysasnalailelysalaasnlysglnglulysarg

115120125

lysservalglyglnthrproglylysprovalleulyslysserlys

130135140

metaspsergluaspgluaspglyaspaspaspglyaspasppheasp

145150155160

aspaspglyaspseraspleugluserleuglyaspseraspgluglu

165170175

metgluvalgluserglugluaspaspglyglugluaspgluaspser

180185190

gluleuglugluthrproproglnlyshisglnglnglylyslyslys

195200205

glulysglnseralaglnlysglnleuglnasplysglnthrasnthr

210215220

proasnglumetlyslyslyslysasnlysglyhisaspalaalathr

225230235240

proasnthrprothrvalglnalaasnglythrprogluthrglnser

245250255

glylyslysasnlyslyslysglyglygluthrproglyasplysgly

260265270

alaasnthrprolysproproglnalaglyserproglnthrprogln

275280285

lyslysleuleugluglyglyvalalavalgluaspthrvalvalgly

290295300

serglyprovalalalysproglyargphevalthrvaltyrtyrthr

305310315320

glyargleulysglnasnasnlyslyspheaspgluthrvalglngly

325330335

proglyphelyspheargleuglylysglygluvalilelysglytrp

340345350

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355360365

ileproprohismetalatyrglyalalysglyserproprovalile

370375380

proproasnseralaleuvalphegluvalgluleulysasnvalasn

385390395400

<210>3

<211>595

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

uaauacgacucacuauagguagacgacgacgauguugacgacgauuuggauaucgacgcg60

gaagcggaagaaucggaagaagacguaaccccucagaaaaaugcuauuaaagccaauaaa120

caagaaaagcggaagagugugggacagacuccgggaaaaccaguauugaaaaagaguaaa180

auggacagugaagacgaagacggagaugacgacggugaugauuuugaugacgacggugac240

agugaucucgaaagccuaggagacagugaugaggaaauggaaguagaaagugaagaagau300

gauggggaagaggaugaggacucugaacuugaagaaacaccaccacagaaacaucaacaa360

ggaaagaaaaaagagaaacagagugcacaaaaacagcuacaggauaaacaaacaaauacu420

ccaaaugaaaugaaaaagaagaagaacaaggggcaugacgcugcaacuccaaacacuccc480

acuguucaggcaaauggaacuccagaaacacaaucaggaaagaaaaauaagaagaaaggu540

ggugaaacgccuggggacaaaggugccaauacuccaccuauagugagucguauua595

<210>4

<211>769

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

uaauacgacucacuauagguacgacucacuauaggaguaaaggagaagaacuuuucacug60

gaguugugacaauucuuguugaauuagauggugauguuaauggucacaaauuuucuguua120

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