一种来源于苦参的蛋白质及其编码基因与应用的制作方法

本发明实施例涉及生物基因技术领域，具体涉及一种来源于苦参的蛋白质及其编码基因与应用。

背景技术：

豆科苦参属(sophora)有大约50个种，其中有报道可以结瘤是20个种。目前文献关于苦参属植物与根瘤菌共生的详细研究很少。之前有报道苦豆子(sophoraalopecuroides)可以与来自6个属11个种的根瘤菌共生。2015年，新西兰的学者从本地的苦参属植物分离到48个菌株都属于中慢生根瘤菌,同时拥有独特的结瘤基因nodc发育地位。这些都表明苦参属植物是共生混杂性宿主。

豆科植物与根瘤菌共生固氮是重要的氮循环的途径。根瘤菌可以通过侵染豆科植物形成根瘤，固定空气中的氮气变成植物可以吸收的氨。随着人们对苦参需求量的增加，采挖野生的苦参不能满足需求量增长的需求,因此，苦参的人工栽培片区逐渐成立，主要分布在山西、甘肃、宁夏、内蒙等地。苦参是能与根瘤菌共生固氮的一种豆科植物，能够通过结瘤因子受体蛋白nfp去识别根瘤菌，从而根瘤菌侵染植物根部进去形成根瘤，让根瘤菌在根瘤里面共生固氮。

苦参(sophoraflavescens)是分布在亚洲东北部的药用多年生豆科植物。历史上苦参的根部被当做传统中药来治疗疾病。目前苦参的豆科植物特点可以被开发根瘤菌剂来发展可持续农业。尽管人们很早就认识苦参这种植物,但是却对于苦参的结瘤因子受体蛋白nfp信息毫无所知，这个蛋白对于识别苦参根瘤菌至关重要。这个蛋白突变了之后，不能与根瘤菌共生固氮，从而不能发挥共生固氮的能力。

在感知nf的过程中，lysm家族的两个成员被认为发挥重要作用：一是位于lysmi分支中包括百脉根的nfr1和苜蓿的lyk3；二是lysmii分支包括百脉根的nfr5和苜蓿的nfp。蛋白模型已经预测了受体蛋白与nf的结合位点，同时两个受体以纳摩尔水平浓度去结合nf。这个亲和力与激活共生信号尤其是钙离子振荡所需的nf的浓度一致。实验证明nfr1和nfr5对于根瘤菌的侵入同等重要，并且一起结合互作。但nfr5的胞内激酶似乎是无功能的，并且突变分析后也表明这个结构域对于侵染不需要。相反，nfr1有一个对共生信号至关重要的激酶结构域，并且有自我磷酸化能力。表明结瘤受体蛋白的激酶区是以多聚物形式发挥功能的，这种磷酸化转移的功能对于下游信号的激活至关重要。

综上所述，目前苦参中结瘤因子受体蛋白nfp的信息并未研究，从苦参中挖掘出结瘤因子受体蛋白nfp及其编码的基因序列，并将该蛋白质应用到其他豆科植物中，提高豆科植物的共生固氮率，减少化肥的使用，培育豆科植物新品种，具有重要的生物学意义及经济价值。

技术实现要素：

为此，本发明实施例提供一种来源于苦参的蛋白质及其编码基因与应用。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质选自如下(a1)或(a2)：

(a1)：氨基酸序列如seqidno.1所述的蛋白质；

(a2)：将seqidno.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且为结瘤因子受体由(a1)衍生的蛋白质。

本发明实施例提供的所述的蛋白质的编码基因。

所述编码基因选自如下(b1)或(b2):

(b1)核苷酸序列如seqidno.2所示的编码基因；

(b2)具有在严格条件下可与seqidno.2所示dna序列杂交的核苷酸序列的编码基因。

本发明实施例提供的蛋白质在制备提高豆科类植物固氮能力中的应用。

本发明实施例提供的应用，包括将编码所述蛋白质的基因导入到受体植物中，获得固氮能力比受体植物高的植物的步骤。

所述受体植物为双子叶植物或者单子叶植物。

编码所述蛋白质的基因是通过含有编码所述蛋白质的核酸分子的表达盒以及含有编码所述蛋白质的核酸分子的载体导入所述受体植物中。

本发明实施例中，nfp：结瘤因子受体基因。

本发明实施例中，mtnfp：蒺藜苜蓿结瘤因子受体基因。

本发明实施例中，sfnfp：苦参结瘤因子受体基因。

本发明实施例中，nfp：结瘤因子受体蛋白。

本发明实施例中，pnfp:mt-nfp：蒺藜苜蓿结瘤因子受体回补nfp突变体的质粒。

本发明实施例中，pnfp:sf-nfp：苦参结瘤因子受体回补nfp突变体的质粒。

本发明实施例具有如下优点：

实验说明，本发明实施例的通过苦参根部转录组中获得的苦参nfp基因，将该基因通过连接到载体，并且可以回补苜蓿nfp突变体，使得回补的nfp苜蓿突变体具备结瘤能力，苦参nfp蛋白可作为结瘤因子受体，应用到受体植物中，以提高受体植物的固氮能力。苦参nfp基因在提高豆科植物共生固氮效率，减少化肥的使用方面具有较好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例提供的ml系统发育树构建的苦参蛋白nfp及其他相关豆科植物同源蛋白系统发育树，其中，五角星表示两个不同的系统发育分支；标尺，10％氨基酸差异性；

图2为本发明实施例提供的三个lysm结构域保守性比较的weblogo图；

图3为本发明实施例提供的苦参nfp基因成功回补苜蓿nfp突变体电镜图，其中，s.meliloti2011-gfp是接种菌株；从左到右回补质粒分别是emptyvector(a,d,g)、苜蓿nfp回补苜蓿突变体mtnfp(b,e,h)、苦参nfp回补的苦参突变体sfnfp(c,f,i)；启动子序列是m.truncatula的nfp原有的启动子；d,e,f显示利用rfp荧光筛选转基因根；g,h,i显示s.meliloti2011-gfp侵染结瘤后发出的gfp荧光；标尺，1mm；

图4为本发明实施例提供的光学显微镜观察sfnfp和mtnfp回补苜蓿nfp后形成的根瘤的切片图，其中，a,c指mtnfp回补nfp后形成的根瘤切片；b,d指sfnfp回补nfp后形成的根瘤切片；红色箭头标识出侵染线。标尺:a,b25um；c,d7.5um。

图5为本发明实施例提供的不同载体回补苜蓿nfp后与s.meliloti2011互作结瘤情况比较柱状图，其中，emptyvector指空质粒回补苜蓿突变体nfp的阴性对照；pnfp指苜蓿nfp的启动子；pnfp:mt-nfp是苜蓿nfp基因回补苜蓿突变体nfp的阳性对照；pnfp:sf-nfp指用苦参nfp回补苜蓿突变体nfp。实验植株统计数目标注在柱状图上面,数据收集自三次生物学重复试验。mtnfp和sfnfp回补实验的结瘤数目差异不显著(p>0.05,t检验)。

图6为本发明实施例的p1载体的图谱。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1苦参nfp基因的调取

1、培养基及试剂准备：

ty培养基(1l)：胰蛋白胨5g，酵母粉3g，cacl20.6g，固体培养基加琼脂粉15g。低氮营养液(1l)：柠檬酸铁0.075g，ca(no3)2,0.03g，kcl0.075g，mgso4·7h2o0.06g，k2hpo40.136g,caso40.46g，微量元素1ml。微量元素(1l)：h3bo32.86g，mnso41.81g，cuso4·5h200.8g，znso40.22g，h2moo40.02g。根瘤固定液(2.5％戊二醛)(vandeveldeetal.2006)。

0.05mcacodylatebuffer(ph7.2)的配制：solutiona(1l):sodiumcacodylatetrihydrate42.8g。solutionb:0.2mhcl,36-38％的浓盐酸10ml加入603ml水中。加4.2mlsolutionb到50mlsolutiona中，加水补齐至200ml。

根瘤固定液的配制：将25％的戊二醛溶液(sigma)与配好的0.05mcacodylatebuffer按1:9混合，即为根瘤固定液。

甲苯胺蓝染液(100ml)：将1gtoluidinebuleo溶于100mlddh2o中，使用0.22μm细菌滤器过滤后分装使用。

类菌体提取缓冲液：0.33gpvp的提取缓冲液(含10mmdtt,300mmsucrose,10mmphosphatebufferph7.0，2mmmgcl2)总rna提取试剂盒rnaisoplus购自takara公司；高盐沉淀溶液购自北京六合通公司；depc购自北京拜尔迪生物公司；定量pcr试剂starscriptⅱfirst-strandcdnasynthesismix，反转录试盒starscriptⅱfirst-strandcdnasynthesismix购自genstar；pcr引物合成及测序，高通量测序工作都由北京华大基因公司完成。

2、苦参根部转录组样品测序质量评估

采用2株不同的菌株分别为：r.yanglingenseccbau01603和s.frediiccbau45436来接种苦参根部,并在15天左右收取苦参根部相应的部位。取材时间的选择是根据苦参结瘤过程观察后发现,相比较其他豆科植物,苦参是子叶留土型的,结瘤时间较晚。分别取6个苦参根部，对其进行转录组样品测序，6个苦参根部转录组样品测序质量评估结果见表1。

表1

通过本地blast，发现数据库中c51657_g1基因序列号与苜蓿和百脉根nfp同源基因相似性高。从转录组数据中获取苦参nfp基因，其基因序列如seqidno.2所示。

3、苦参系统发育树构建以及蛋白质序列比较

如图1所示，ml系统发育树构建的苦参蛋白nfp及其他相关豆科植物同源蛋白系统发育树，五角星表示两个不同的系统发育分支；标尺，10％氨基酸差异性。通过系统发育树构建和蛋白序列比较表明这个潜在基因与已知的其他豆科结瘤因子受体相似性高。苦参nfp蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

如图2所示，苦参nfp蛋白通过weblogo，网站http://weblogo.threeplusone.com/在线计算得到的蛋白质的三个lysm结构域保守性比较图，其中，不同的氨基酸大小排列代表保守性差异，如不同字母代表不同氨基酸，图中每一个位置上不同字母的大小，代表该氨基酸的保守性，字母越大，保守性越强。

实施2苦参nfp基因的克隆

1、苦参植物组织rna的提取

(1)准备液氮，用液氮预冷1.5ml离心管，在预冷的管中加入1mlrnaisoplus提取液；

(2)研钵提前加入无水乙醇烧一下，去rna酶，然后加入液氮预冷研钵(至液氮稳定)；

(3)使用液氮，在n2冷却的研钵中研磨约0.1g的根瘤或纯体的根瘤菌，彻底研磨至粉末状；

(4)将约0.1g组织加入装有1ml的rnaisoplus的离心管中，用振荡器震荡均匀；

(5)室温静置5～10min；

(6)12000rmp，4℃离心15min裂解液，以除去杂物，将上清转移到一个新的1.5ml离心管中，加入2ml氯仿；

(7)剧烈振荡，倒转试管几次进行充分混匀；

(8)室温下孵育5～10min；

(9)12000rmp，4℃离心20min，然后将水相(约400μl)转移至新的1.5ml管中，切勿吸出白色中间层；

(10)对应吸出的水相加入1倍体积的异丙醇和1倍体积的高盐沉淀溶液；

(11)轻轻颠倒混匀，室温下孵育10分钟，然后在-20℃孵育过夜；

(12)12000rmp，4℃离心10min，除去上清液，切勿触及沉淀，残留少量异丙醇没关系；

(13)加入1ml70％的乙醇，12000rmp，4℃离心10min，除去上清液，获得苦参植物组织rna；

(14)将苦参植物组织rna添加1ml无水乙醇至每个管中用于保藏和运输。

2、苦参nfp基因的克隆

根据苦参nfp基因的核苷酸序列如seqidno.2所示，设计特异性引物对，正向引物为(seqidno.3)：

ggggacagctttcttgtacaaagtggaaatgtctgccttctttcttcct；

反向引物为(seqidno.4)：

ggggacaactttgtataataaagttgcttaacgagctattacagaagt。

将实施例1提取的苦参植物组织rna，反转录为cdna；以cdna为模板，以上述引物对进行pcr扩增，回收pcr扩增产物。pcr反应体系及扩增程序如表2所示：

表2

3、pcr扩增产物的检测

使用0.5×tbe电泳缓冲液配制1％琼脂糖凝胶，微波炉高火至完全溶解，冷却至不烫手，加入溴化乙锭(终浓度0.5μg·ml^-1)，摇晃至溴化乙锭与琼脂糖溶液完全混合均匀，倒入制胶槽，插入制胶梳，琼脂糖完全溶解后，拔出制胶梳，将制好的胶放入电泳槽，倒入0.5×tbe电泳缓冲液至刚好没过胶板，每个样品点样6μl，100v电压电泳30分钟。取出胶板，使用扫胶仪uv扫描显影，取明亮单一条带的样品进行酶切。样品储存于-20℃。

将上述获得的pcr产物插入gateway系统的载体pdonr201载体，然后进行bp反应和lr反应。获得的重组载体的marker基因是红色荧光蛋白rfp。此载体命名为p，在已有的启动子载体基础上，结合p1载体，p1载体的图谱如图6所示，构建苜蓿nfp启动子驱动的苦参nfp表达的p2载体。

实施例2苦参nfp基因回补突变体实验

1、p2载体转染苜蓿突变体根毛：

将萌发好的蒺藜苜蓿种子，根系生长约1cm，在距离根尖大约3-4mm处用解剖刀切断，然后将上半部分幼苗粘上已准备好的农杆菌并置于fm无氮培养基上，用封口膜封闭置于22℃光照培养箱中共培养。7天后将幼苗新生的根系全部切除，并转移至含有适合抗生素的hre(hairyrootemergence)培养基上培养10天，待转基因根系生长出来后，通过rfp荧光筛选。

2、利用含有苜蓿nfp基因的载体转染苦参突变体根毛：

同样基于上述苜蓿根毛转染的方法，获得回补的苜蓿突变体植株，转基因的根系通过rfp荧光筛选。

3、空白对照组利用空质粒载体转染苜蓿突变体根毛。

本发明实施例中，转染过程中用到的载体及引物序列如表3所示。

表3苦参nfp受体回补实验

转基因受体部分的工作所用到的主要背景载体(携带rfp的空质粒)来自是荷兰兰瓦赫宁根大学ton实验室已经构建好的通用质粒。载体详细信息可参阅文献(xiaoetal.,2014)。xiao,t.t.,schilderink,s.,moling,s.,deinum,e.e.,kondorosi,e.,franssen,h.,kulikova,o.,niebel,a.,andbisseling,t.(2014).fatemapofmedicagotruncatularootnodules.development.141,3517-3528。

本实施例2可获得，含有苦参nfp基因回补的苜蓿突变体、苜蓿nfp基因回补的苜蓿突变体以及空质粒回补的苜蓿突变体。

实施例3苦参nfp基因回补的苜蓿突变体、苜蓿nfp基因回补的苜蓿突变体结瘤能力评估

筛选出的代表菌株s.meliloti2011需要回接回补的苦参nfp基因回补的苜蓿突变体、苜蓿nfp基因回补的苜蓿突变体，空白质粒回补的苜蓿突变体，并检测其结瘤能力。

1、菌株培养：所有代表菌株s.meliloti2011从-80℃活化至yma平板，28℃倒置培养2-5d，挑取单菌落接种至ty液体培养基，180rpm，28℃培养2-3d至对数期；

2、双层钵的制备：将去离子水加到500ml容量的罐头瓶中，每瓶约250ml,使用封口膜封住瓶口，121℃灭菌30min。使用1×低氮营养液将蛭石拌至手握成团不滴水，使用黑色塑料袋(两层)将拌匀的蛭石装好，121℃灭菌90min。将350ml的一次性塑料杯底部打孔并穿一根纱布，黑色塑料袋装起来，121℃灭菌30min。在超净工作台中，将无菌的蛭石分装至350ml无菌塑料杯中，将无菌塑料杯放入无菌罐头瓶中，保证纱布能够从罐头瓶中吸水，供给蛭石中的植物生长所需。

3、萌发种子：分别将回补的苦参nfp基因回补的苜蓿突变体、苜蓿nfp基因回补的苜蓿突变体以及空质粒回补的苜蓿突变体的种子以浓硫酸破壳处理5min，将浓硫酸倒掉，水洗至不掉颜色。接下来转到超净工作台中进行操作，将破壳处理后的种子放入无菌小烧杯中，加入95％的乙醇，静置30s，倒掉乙醇，并用无菌枪头吸干净残留的乙醇，加入次氯酸钠消毒液处理5min，1min摇晃一次，倒掉次氯酸钠消毒液，枪头洗净残留的消毒液，再用无菌水洗7次。将消过毒的种子均匀摆在0.5％的水琼脂平板上，28℃避光发芽。

4、种苗：此过程在超净工作台中操作，将芽长1-2cm的种子种到双层钵中的蛭石中，接种1ml菌液到种子根部，封口膜封口。在16h光照，8h黑暗的光照温室中培养35d，收获统计结瘤情况。

实验结果，如图3所示，在苜蓿nfp(mtnfp)的启动子驱动下，与对照组相比，含有mtnf载体通过根毛转染可以回补苜蓿nfp突变体表型，能够被s.meliloti2011-gfp侵染结瘤。同样，苦参nfp(sfnfp)的p2载体在苜蓿nfp启动子启动后，成功的回补了苜蓿nfp突变体表型。本发明实施例的sfnfp基因有类似于其他豆科植物nfp同源基因识别根瘤菌的功能，苦参却可以与s.meliloti2011-gfp共生结瘤(jiaoetal.,2015)。

本发明实施例将把回补后结的根瘤做切片并甲苯胺蓝染色后观察，如图4所示，sfnfp回补后形成的根瘤内部,s.meliloti2011的侵染线延伸正常,同时放大后可以观察到类菌体的排列和在根瘤内部的发育状态也与mtnfp回补的根瘤内类菌体类似(xiaoetal.,2014)。本发明实施例的sfnfp可以完全恢复苜蓿nfp的表型到野生型水平。但是，在氨基酸序列比对显示,对mtnfp蛋白的功能至关重要的氨基酸l与sfnfp蛋白并不一致，sfnfp与mtnfp在识别s.meliloti2011时可能采取不同的蛋白空间结构。

如图5所示，不同载体回补nfp后与s.meliloti2011互作结瘤情况比较，本发明实施例统计了不同处理红色荧光转基因根上根瘤数目，与mtnfp回补苜蓿突变体结瘤情况类似，sfnfp在回补苜蓿nfp后与s.meliloti2011结瘤情况很好，结瘤数量为平均3个，无显著差异。这说明sfnfp与mtnfp在识别s.meliloti2011结瘤因子效率上没有明显差异。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>焦银山陈文峰

<120>一种来源于苦参的蛋白质及其编码基因与应用

<130>gg19443618a

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>595

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metalavalphepheleuproserargservalserleuleuileala

151015

phemetleupheserthrasnilealaalaglnalaglnhisthrasn

202530

glythraspphesercysprovalaspserproprosercysgluthr

354045

tyrvalthrtyrilealaglnserproasnphevalserleupheasn

505560

ileserasnleupheaspthrserproleuserilealaseralaser

65707580

asnleulysalagluaspasnlysleuvalproglyglnvalleuleu

859095

ileprovalthrcysglycysileglyasnargserphealaasnmet

100105110

sertyrgluilelyslysglyaspthrtyraspphevalalathrthr

115120125

sertyrgluasnleuthriletrpglnvalvalvalasppheasnpro

130135140

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145150155160

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165170175

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195200205

tyrglylysasnphethralaalathrtyrleuprovalleuilepro

210215220

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225230235240

glyargargserserserhisleumetvalileileglythrthrleu

245250255

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260265270

tyrtyrleulyslyslysileleulysargasnalaserservalglu

275280285

thralaasplysleuleuserglyvalserglytyrvalserlyspro

290295300

thrmettyrgluileaspalailemetglualathrmetasnleugly

305310315320

gluglncyslysileglygluservaltyrlysalalysmetglugly

325330335

argvalleualavallysargilelysgluaspvalserglugluleu

340345350

lysileleuglnlysvalasnhisglyasnleuvallysleuilegly

355360365

valserseraspasnaspglyasnphepheleuvaltyrglutyrala

370375380

gluasnglyserleuaspasptrpmetpheserlysserthrserasn

385390395400

sermetvalserleuthrtrpserglnargleuserilealavalasp

405410415

valalametglyleuglntyrmethisgluhisthrhisproargile

420425430

valhisargaspilethrthrserasnileleuleuaspserasnphe

435440445

lysalalysilealaasnphesermetalaargthrserthrasnpro

450455460

metmetprolysileaspvalphealapheglyvalvalleuileglu

465470475480

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485490495

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500505510

argglugluserleuglnargtrpmetaspprolysleugluasnphe

515520525

tyrprovalasptyralaleuserleualaserleualavalasncys

530535540

thralaasplysproleuserargprothrmetalagluilevalleu

545550555560

cysleuserleuleualaglnproserproproileleugluargser

565570575

leuthrserglyleuaspvalgluvalthrglnthrmetalaproile

580585590

alaalaarg

595

<210>2

<211>1788

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atggctgtcttcttcctcccctcacgttctgtgagtcttcttattgcattcatgttgttt60

tctactaacatagcagctcaagcacaacacaccaatggaacagacttttcatgccctgtg120

gattcacctccttcctgtgaaacttatgtgacatacattgcacagtctccaaattttgtg180

agcctgttcaacatatctaatttatttgatacaagtcctttatccattgcaagtgccagt240

aacttaaaggccgaggacaacaagctggttccaggccaagtcctactgatacctgtaact300

tgtggttgcattggaaatcgctcttttgccaatatgtcctatgagatcaagaaaggtgat360

acctacgactttgttgctacaacttcatacgagaatctcacaatctggcaggtagtggta420

gatttcaaccctggtctaactccagcggtgttgccagtgcgcgtcaaagttgtattccct480

ttattctgcaggtgcccttcaaagaaccagttgaacaaagggataaagcatctgattact540

tatgtgtggcagcctaatgacactgtttccattgtaggtgccaagtttggtgcatcccca600

gtggacttattgactgaaaacaactatggtaaaaacttcactgctgcaacctacctgcca660

gtgttgatcccagtgagacagttgccaactcttaatcaaagtcaacctaatccttcaaat720

ggaagaaggagcagcagtcatctcatggttataatcggcactaccctgggatgcacattt780

ctagttgcagttttagcggtattactggtgtatgtttattatctgaaaaagaagatattg840

aaaaggaatgcttcttctgttgagactgcagataagctactttctggcgtttcaggctat900

gtaagtaagccaacaatgtatgaaattgatgcaattatggaagctaccatgaacctcggt960

gaacagtgcaagattggggaatcagtatacaaggccaaaatggaaggtcgagttttagca1020

gttaaaagaatcaaggaagatgtctcggaggagcttaaaattctacagaaggtgaaccat1080

ggaaatctggtaaaattaattggcgtctcttcagacaatgacgggaattttttcctggtt1140

tatgaatatgctgaaaacgggtctcttgatgactggatgttctccaagtccacctcaaac1200

tcaatggtctcactcacatggagtcagaggttaagcatagcagtggatgttgccatgggt1260

ctgcaatacatgcatgaacatactcatccaagaatagtccacagggacatcacaacaagt1320

aatatccttcttgactcaaactttaaggccaagatagcaaatttctccatggccagaact1380

tctaccaaccctatgatgccaaaaatagatgtctttgcttttggggtggttctgatagag1440

ttgcttactggcaggaaagccataacaaccaaagcaaatggtgaggtggttatgctgtgg1500

aaggatgttaggaagatctttgatctagaagagaatagagaggagagtctccaaagatgg1560

atggatcctaagctagagaacttttatcctgtagattatgctctcagcttggcctcctta1620

gcagtgaattgcactgcagataagcctttatccagaccaaccatggcagaaattgttctt1680

tgcctctcccttctagctcagccatctcccccaatattagagagatccttgacttctggg1740

ctagatgtggaagttactcaaacaatggctcccatagcagctcgttga1788

<210>3

<211>49

<212>dna

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