一种具有ACE抑制活性和DPP-IV抑制活性的三肽的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有ace抑制活性和dpp-iv抑制活性的三肽。

背景技术：

目前，很多高血压病人特别是肥胖型常伴有糖尿病，而糖尿病也较多的伴有高血压，糖尿病病人血管对具有升压作用的血管紧张素敏感；糖尿病易引起肾脏损害，肾脏受损害后可使血压升高，因此将两者称之同源性疾病。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(raas)通过控制小动脉血管收缩和血管内液体体积在调节血压中起重要作用。raas主要受血管紧张素转换酶(ace)的调节。因此，ace是治疗高血压的关键靶点，ace抑制肽可在口服后可实现降低高血压作用。目前，临床上已经使用依那普利，卡托普利和赖诺普利等合成类的ace抑制剂来治疗高血压。2型糖尿病是由几种基本缺陷引起的慢性高血糖状态，二肽基肽酶(dpp-iv)抑制剂的使用增加了肠降血糖素和胰岛素分泌的作用持续时间，降低血糖的同时又避免了低血糖的风险。因此，它可以有效地用于治疗2型糖尿病。但合成类的抑制剂存在潜在的健康危害。因此，食源性ace抑制肽和dpp-iv抑制肽受到越来越多的关注。

ace抑制活性和dpp-iv抑制活性肽都是重要的功能活性肽，是生物活性肽研究领域的重点之一，可分别抑制体内ace和dpp-iv活性，从而分别起到降血压和降血糖的作用。此外，ace和dpp-iv也是重要的膜肽酶，兼具ace抑制活性和dpp-iv抑制活性的活性肽更具有体内的稳定性。因此，从食源性蛋白质中水解分离出兼具ace抑制活性和dpp-iv抑制活性的活性肽成为预防和治疗高血压和高血糖的研究热点。

本发明旨在发现一种兼具ace抑制活性和dpp-iv抑制活性的三肽，并提供一种开发兼具ace抑制活性和dpp-iv抑制活性的活性肽的原料。

技术实现要素：

本发明公开了一种具有ace抑制活性和dpp-iv抑制活性的三肽，并且可以将该ace抑制活性和dpp-iv抑制活性肽应用于食品、保健品以及生物制药领域。

本发明的具有ace抑制活性和dpp-iv抑制活性的三肽，其氨基酸序列为phe-gly-arg(fgr)。

本发明的三肽抑制ace和dpp-iv活性的半抑制浓度(ic50)分别为66.982μm和46.22mm。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

(1)活性肽的筛选

本发明借助expasypeptidecutter(http：//web.expasy.org/peptide_cutter/)这一在线酶切工具对鸡蛋蛋白序列进行虚拟酶切，将酶切后产生的肽序列与biopep(http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep)数据库中已报道的ace抑制和dpp-iv抑制肽进行比较，筛选获得到未经报道的三肽fgr、gcr、cdr、fk、ntf、naf、fyq、qgf、qgl、adf。通过peptidepropertycalculator、peptideranker和discoverystudio2017软件的admet模块对三肽fgr、gcr、cdr、fk、ntf、naf、fyq、qgf、qgl、adf进行水溶性、生物活性和admet(吸收、分布、代谢、排泄、毒性)性质的预测。筛选得到溶解性好、活性评分高于0.5、无毒的肽fgr、cdr、fk、adf。从pdb数据库(http：//www.rcsb.org/)中获得ace的晶体结构(1o86)和dpp-iv的晶体结构(5j3j)，并将其作为蛋白靶标，通过ds中的cdocker程序进行分子对接来筛选能与ace和dpp-iv紧密结合的三肽，并明确活性位点。以结合‘cdocker-interaction-energy’得分、形成氢键的数目及作用的关键氨基酸为指标，筛选得到具有潜在ace抑制活性和dpp-iv抑制活性的三肽fgr。

(2)体外ace抑制活性和dpp-iv抑制活性测定

通过高效液相色谱法对三肽fgr的ace抑制活性进行测定，取30μl马尿酰-组胺酰-亮氨酸(hhl)底物溶液，加入10μl抑制剂混合均匀，在37℃恒温水浴锅中预热3～5min，然后加入20μlace液充分混合，37℃保温30min后，得到反应液。该反应液用hplc进行分析。

色谱条件：柱温25℃，流速0.5ml/min，进样量10μl，流动相乙腈：水为25∶75等度洗脱，检测波长228nm。

利用下列公式计算不同浓度三肽的抑制率：

ace抑制活性(％)＝(a-b)/a×100％

其中a是反应空白的峰面积，反应空白混合物含有相同体积的缓冲溶液而不是样品；b是ace和酶促肽样品存在下反应的峰面积，ic50值定义为在测定条件下抑制50％ace活性的抑制剂浓度。

ace活性的定义：ace活性的一个单位(u)定义为在37℃下每分钟从催化hhl形成1mol的ha所需的酶量。

通过荧光分光光度法对三肽fgr的dpp-iv抑制活性进行测定，取25μl抑制剂溶液，加入50μl酶缓冲液充分混合在37℃避光保温10min，然后加入25μl底物缓冲液。同时用dpp-iv缓冲液替代抑制剂溶液作为酶对照组。该反应液用荧光分光光度计进行分析。

计算公式：

dpp-iv抑制活性(％)＝(slopeec-slopesm)/slopeec×100％

其中slopesm是样品抑制剂的斜率，slopeec是酶对照的斜率，ic50值定义为在测定条件下抑制50％dpp-iv活性的抑制剂浓度。

dpp-iv活性的定义：dpp-iv活性的一个单位(u)定义为在37℃下每分钟通过切割底物以产生与存在的酶活性成比例的荧光产物所需的酶量。

荧光分光光度检测参数：

时间扫描：20min；

激发波长：360nm，发射波长460nm。

活性肽fgr的获得可利用胃蛋白酶和胰蛋白酶对鸡蛋溶菌酶进行酶解并通过多维色谱纯化(凝胶过滤色谱、亲和色谱和半制备液相色谱)实现；也可通过固相化学合成方法实现。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果为：

本发明从鸡蛋蛋白中筛选得到了能够有效抑制ace活性和dpp-iv活性的三肽fgr，并明确活性肽fgr与ace和dpp-iv的作用位点；fgr既具有抑制高血压和高血糖的靶点的作用，而且能够克服膜肽酶消化等优点，因此可作为功能成分用于食品、保健品以及降压药品中，具有良好的潜力和应用前景。

附图说明

本发明附图2幅，其中：

图1fgr与ace的对接结果3d图；

图2fgr与dpp-iv的对接结果3d图；

具体实施方式

下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的阐述。

实施例1.具有ace抑制活性与dpp-iv抑制活性的三肽的筛选

本发明借助expasypeptidecutter(http：//web.expasy.org/peptide_cutter/)的胃蛋白酶和胰蛋白酶对鸡蛋蛋白进行虚拟酶切，将酶切后产生的肽序列与biopep(http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep)数据库中已知的ace抑制和dpp-iv抑制肽进行比较，筛选获得到未经报道的肽fgr、gcr、cdr、fk、ntf、naf、fyq、qgf、qgl、adf。通过在线工具peptidepropertycalculator、peptideranker和discoverystudio(ds)2017中的admet程序对fgr进行水溶性、生物活性和admet(吸收、分布、代谢、排泄、毒性)性质的预测。筛选得到溶解性好、活性评分高于0.5、无毒的肽fgr、cdr、fk、adf。从pdb数据库(http：//www.rcsb.org/)中获得与利那普利复合的人ace的晶体结构(1086)和与西他列汀复合的人dpp-iv的晶体结构(5j3j)，并将其作为蛋白靶标，通过ds中的cdocker程序进行分子对接来筛选能与ace和dpp-iv紧密结合的肽。结合‘cdocker-interaction-energy’得分、形成氢键的数目及作用的关键氨基酸，筛选得到一种理论上具有潜在ace抑制活性和dpp-iv抑制活性的三肽fgr。结果表明fgr可以与ace的主要残基即his353、glu384、ala354、his513、tyr523、和lys511结合(图1)；fgr可以与dpp-iv的主要残基即his740、glu205、arg358、tyr666、phe357和glu206结合(图2)。

实施例2.fgr体外ace抑制活性和dpp-iv抑制活性鉴定

通过高效液相色谱法对得到三肽的ace抑制活性进行测定，取马尿酰-组胺酰-亮氨酸(hhl)底物溶液，加入抑制剂混合均匀，在37℃恒温水浴锅中预热3～5min，然后加入ace溶液充分混合，37℃保温30min后，得到反应液。同时用硼酸缓冲液替代抑制剂溶液作为空白对照组，用高效液相色谱进行分析。

色谱条件：柱温25℃，流速0.5ml/min，进样量10μl，流动相乙腈：水为25∶75等度洗脱，检测波长228nm。

利用下列公式计算不同浓度三肽的抑制率：

ace抑制活性(％)＝(a-b)/a×100％

其中a是反应空白的峰面积，反应空白混合物含有相同体积的缓冲溶液而不是样品；b是ace和酶促肽样品存在下反应的峰面积，ic50值定义为在测定条件下抑制50％ace活性的抑制剂浓度。

ace活性的定义：ace活性的一个单位(u)定义为在37℃下每分钟从催化hhl形成1mol的ha所需的酶量。

结果表明fgr可有效抑制ace的活性，其ic50值为66.982μm。

通过荧光分光光度法对三肽fgr的dpp-iv抑制活性进行测定，取25μl抑制剂溶液，加入50μl酶缓冲液充分混合在37℃避光保温10min，然后加入25μl底物缓冲液。同时用dpp-iv缓冲液替代抑制剂溶液作为酶对照组。该反应液用荧光分光光度计进行分析。

计算公式：

dpp-iv抑制活性(％)＝(slopeec-slopesm)/slopeec×100％

其中slopesm是样品抑制剂的斜率，slopeec是酶对照的斜率，ic50值定义为在测定条件下抑制50％dpp-iv活性的抑制剂浓度。

dpp-iv活性的定义：dpp-iv活性的一个单位(u)定义为在37℃下每分钟通过切割底物以产生与存在的酶活性成比例的荧光产物所需的酶量。

结果表明fgr可有效抑制dpp-iv的活性，其ic50值为46.22mm。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，还可以做出各种变化和变型，这些变化和变型也应视为本发明的保护范围。