D-34蛋白的应用和含有D-34蛋白的热保护剂的制作方法

本发明属于蛋白稳定剂技术领域，具体涉及一种d-34蛋白的应用和含有d-34蛋白的热保护剂。

背景技术：

在现代生物医药生产、食品生产及加工、微生物和细胞的生产及发酵过程中，很多工艺均要使用蛋白(酶)进行催化反应。一般来说，提高温度会加速蛋白(酶)的酶促反应，增加产量，并缩短反应或生产周期；同时，提高反应的温度，也势必导致反应及发酵过程中的蛋白质(酶)结构改变，其活性下降，甚至完全失活。此外，在蛋白质及其产品(制剂)的运输及保存过程中，也需要低温环境或冷链技术，来稳定蛋白质产品的活性，阻止或防止蛋白质的聚集。可见，保持蛋白质活性，阻止蛋白质活性降低，是蛋白质及抗体工程、细胞工程及发酵工程中面临的、亟待解决的问题。

在生产实践中，蛋白(酶)制品可采用冻干技术，制备的蛋白冻干粉方便运输，能较好的保持稳定状态。但是蛋白质样品在冻干过程中也易变性，冻干工艺、冷链技术也将大幅度增加蛋白制剂的生产成本。在上述情况下，人们也想到寻找蛋白稳定剂。目前使用的蛋白质稳定剂主要是：小分子化合物，如二甲基亚砜(dmso)，海藻糖、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖和山梨醇等；另一种为大分子物质，如蛋白质(热激蛋白，小牛血清白蛋白-bsa)。但是这些蛋白稳定剂有的蛋白有一定的毒性，有的在高温时对蛋白(酶)制品保护作用有限。如蔗糖和葡聚糖在低温下可以保护蛋白(酶)的活性，但在高温下起不到保护蛋白(酶)的作用，甚至会降低蛋白(酶)的活性。葡聚糖虽然在高温下对蛋白(酶)具有保护作用，但葡聚糖是大分子物质，很难进入蛋白(酶)的空隙中，所以保护效果有限。bsa蛋白在低温时对蛋白保护作用较好，但在高温时bsa易变性。因此，寻找新型、有效的具有热保护作用的蛋白稳定剂十分重要，在生物制药领域、在食品加工领域中也将有着广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种d-34蛋白的应用和蛋白热保护剂，以解决现有蛋白稳定剂在高温时对蛋白、酶、抗体制品及细胞保护作用有限的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明一方面提供一种d-34蛋白的应用。具体的是所述d-34蛋白作为蛋白、抗体、酶和细胞中至少一种的热稳定剂的应用。

本发明另一方面提供一种热保护剂，所述热保护剂用于蛋白、酶和细胞至少一种的热热保护，所述热保护剂含有d-34蛋白。

与现有技术相比，所述d-34蛋白作为蛋白、酶和细胞的热稳定剂时，其能够有效保护目标蛋白、抗体或/和酶的热稳定性，因此，也能提高细胞耐热性，从而有效保证了目标蛋白、抗体或/和酶的生物活性和避免其变性聚集，实现对蛋白、抗体、酶和细胞的热保护的作用。

所述热保护剂由于含有d-34蛋白，因此，所述热保护剂能够有效保护目标蛋白、抗体或/和酶的热稳定性，从而有效保证了目标蛋白、抗体或/和酶的生物活性和避免其聚集，而且具有广谱蛋白、抗体或/和酶保护的作用。同时，所述热保护剂也能提高细胞耐热性，保证细胞在相对高温环境中的活性。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明实施例d-34蛋白电泳图；

图2为bsa、海藻糖和本发明实施例d-34蛋白对cs热聚集影响的柱状图；

图3为bsa、海藻糖和本发明实施例d-34蛋白对adh酶活热保护的柱状图；

图4为bsa、海藻糖和本发明实施例d-34蛋白对酵母可溶性总蛋白的热保护的柱状图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

胚胎发育晚期富集蛋白(lateembryogenesisabundant，lea)是在植物种子胚胎发育晚期大量积累的一个无序蛋白家族，lea蛋白不仅在植物种子成熟过程中大量表达，也可受干旱、温度胁迫(低温和高盐)等胁迫的诱导而在植物营养组织中表达，提高植物对非生物胁迫的耐受性。发明人通过大量的实验发现，lea蛋白中的一种d-34蛋白具有对蛋白的热保护作用。基于该研究发现，提出了所述d-34蛋白作为一种新型的蛋白热保护剂及其应用。

一方面，本发明实施例提供了所述d-34蛋白一种应用方法。具体的是所述d-34蛋白作为蛋白、酶和细胞中至少一种的热稳定剂的应用。经发明人构建的相关实验得知，所述d-34蛋白作为有效成分，其与目标蛋白或酶混合后，能够有效提高目标蛋白、抗体或/和酶的热稳定性，从而保证目标蛋白、抗体或/和酶的生物活性和避免目标蛋白、抗体或/和酶由温度引起的变性聚集，而且所述d-34蛋白具有广谱蛋白、抗体或/和酶保护的作用。其中，所述目标蛋白或/和酶是指希望能够保证生物活性、空间结构稳定(避免发生聚集现象)的蛋白或/和酶。其中，所述蛋白、抗体或/和酶特别是指对热敏感的蛋白、抗体或/和酶。基于所述d-34蛋白能够有效提高目标蛋白或/和酶的热稳定性特性，基于细胞的构成，因此，所述d-34蛋白同时也能够作为细胞的热稳定剂的应用，以提高细胞的耐热性，保证细胞在相对高温环境中的活性。

进一步研究发现，d-34蛋白具有保护多种蛋白和酶的作用，如在一实施例中，所述d-34蛋白可以有效保护如包括柠檬酸合成酶、乙醇脱氢酶、酵母可溶性总蛋白、β-甘露聚糖酶和抗体等对热敏感的蛋白或酶的热稳定性。

另一方面，基于上文所述d-34蛋白的应用，本发明实施例还提供了一种热保护剂。所述热保护剂含有d-34蛋白。这样，将所述d-34蛋白作为所述热保护剂的有效成分，赋予所述热保护剂具有用于蛋白、酶和细胞至少一种的热保护的作用和用途，具体的是使得所述热保护剂具有广谱蛋白或/和酶热保护的作用，有效保护目标蛋白或/和酶的热稳定性，从而有效保证了目标蛋白或/和酶的生物活性和避免其变性聚集，提高目标蛋白或/和酶的热稳定性和生物活性。其中，所述目标蛋白、抗体或/和酶是指对热敏感的蛋白、抗体或/和酶。那么，所述热保护剂也能够有效起到对细胞的热保护作用，以提高细胞的耐热性，保证细胞在相对高温环境中的活性。

其中，所述d-34蛋白在所述热保护剂中的含量应该是能够保护目标蛋白、抗体、酶或细胞热稳定的有效含量或者浓度，本领域技术人员将会理解，该含量或浓度可以根据不同目标蛋白、抗体、酶或细胞的不同而不同。如在一实施例中，所述d-34蛋白在所述热保护剂中的可以0.08mg/ml、或者0.08mg/ml以上的任何浓度，当然也可以是目标蛋白、抗体、酶或细胞浓度的0.1倍浓度，以及目标蛋白、酶或细胞浓度0.1倍以上的任何浓度。

在进一步实施例中，所述热保护剂还可以包含能够有利于提高和/或协助d-34蛋白提高目标蛋白、抗体、酶或细胞热稳定性如包括生物活性和结构稳定性的其他有效成分，所述其他有效成分可以是辅助蛋白稳定剂。由于如上段所述的，d-34蛋白从低浓度到高浓度均表现出良好的热保护作用，因此，只要是所述热保护剂中所述d-34蛋白存在，那么d-34蛋白与所述其他有效成分如所述辅助蛋白稳定剂之间的质量浓度可以是任一的比例。如在一具体实施例中，所述海藻糖、葡聚糖、山梨醇中的至少一种与所述d-34蛋白的质量的浓度比可以但不仅仅为(50-300：1)。通过优化该些组分与所述d-34蛋白的含量比例，进一步提高他们之间的协同增效作用，从而提高目标蛋白或/和酶的热稳定性。在具体实施例中，所述辅助蛋白稳定剂可以是包括海藻糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、麦芽糖、葡聚糖、葡聚糖、山梨醇中的至少一种。该些组分的存在，能够与所述d-34蛋白起到对目标蛋白、抗体、酶或细胞的热稳定性起到协同增效作用，提高目标蛋白、抗体、酶或细胞的热稳定性，从而进一步保障目标蛋白、抗体、酶或细胞的生物活性，避免蛋白、抗体、酶发生变性聚集等不良现象发生，具体如附图2-4所示。

另外，所述热保护剂可以以粉剂(冻干粉)、水剂等形态呈现。其中，当为粉剂时，在使用时可以将其用溶剂复原成为水剂，然后与目标蛋白、抗体、酶或细胞进行混合，从而实现对目标蛋白、抗体、酶或细胞的热保护作用；当为水剂时，也即是所述d-34蛋白或进一步所含的所述其他有效成分是溶解分散在溶剂中，在使用时可以直接将目标蛋白、抗体、酶或细胞加入进行混合实现对目标蛋白、抗体、酶或细胞的热保护作用。其中，用于复原粉剂的溶剂或者水剂的溶剂包括tris-hcl缓冲液和磷酸缓冲液等。其中，所述目标蛋白、抗体、酶或细胞如上文所述的是指希望能够保证生物活性、空间结构稳定(是指避免蛋白、抗体、酶发生聚集现象)的蛋白、抗体、酶或细胞。

其次，上文中所述d-34蛋白可以按照如下方法进行制备：

s01：制备重组载体，所述重组载体含有能够表达d-34蛋白的基因序列；

s02：将所述重组载体转化感受态细胞，筛选阳性克隆，并提取重组表达质粒转化至大肠杆菌进行所述d-34蛋白的表达。

其中，步骤s01中的所述重组载体按照可以如下方法制备获得：

s011：根据d-34蛋白基因序列设计引物，并扩增d-34蛋白基因片段；

s012：将扩增的所述d-34蛋白基因片段与质粒pet28a分别进行双酶切处理后连接处理，得到所述重组载体。

所述s011中的d-34蛋白基因序列为seqidno:1所示。所述s011中的所述引物为seqidno:2和seqidno:3所示。所述s012中的双酶切处理可以是采用bamhi和hindiii双酶切。其中，seqidno:1的序列为：

atgagccaggaacagctcaagaaacctcaaggggagcaggaccccatcaaatacggcgacgttttcaaagtctccgacgaactcgctttcaaacccatcgcgccaagagacgcagctctcatgcaagccacggagaaccaagcattgggccaaactcaaaaaggaggtcccgcctcggtgatgcaatccgccgcaaccgaaaacctccgcgccggcgtcgtgggccgccaagacatctccgacgtggcgaggaacgaaggcgtgagcgtgaccgaaaccaaagtgggctgccaccgcgtcatcacggagttcgtgggaagacacgtggtggggcagttcgtggagcccgacgtccccatgaacaccccaggcaccgcgctggagcgtgacgccataaccatcggcgaggctctcgaggcatcggcgatagccggagcaagcgacaagccggtggatgaaagcgacgccgccgcgatacaagctgcggagatgagagcgacaggaaagaacgagacagagcctggcgggctgggcgccagggcccagtcagcagccacgcggaatactcgtactgtgtcccactctcacaagacaaccttgtctgatgtcttaacggatgcgaaggagaagctaccagcggataaggcggtgacgcgagaagatgcggagggagtgattggagctgagcttaggaacaaattggacatgagaaccacccctggtggggtcgctgcatccatggctgcagcagccacacttaatcaaaacagacaagtgactgatgcgtga。

d-34蛋白的氨基酸序列如下seqidno.4所示：

msqeqlkkpqgeqdpikygdvfkvsdelafkpiaprdaalmqatenqalgqtqkggpasvmqsaatenlragvvgrqdisdvarnegvsvtetkvgchrvitefvgrhvvgqfvepdvpmntpgtalerdaitigealeasaiagasdkpvdesdaaaiqaaemratgknetepgglgaraqsaatrntrtvshshkttlsdvltdakeklpadkavtredaegvigaelrnkldmrttpggvaasmaaaatlnqnrqvtda。其中，所述seqidno.4所示氨基酸序列中的每个大写字母表示一个氨基酸，且每个单字母所示氨基酸遵循氨基酸常规单字母符号，如m为赖氨酸(lysine，met)。

所述seqidno:2的序列为：

f:5'ggatccatgagccaggaacagctcaaga3'。

所述seqidno:3的序列为：

r:5'aagctttcacgcatcagtcacttgtc3'。

在具体实施例中，所述d-34蛋白可以按照下文实施例1中的制备方法进行获得。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1

d-34蛋白的构建与表达：

根据seqidno:1所示的d-34基因序列设计引物f:5'ggatccatgagccaggaacagctcaaga3'(seqidno:2)和r:5'aagctttcacgcatcagtcacttgtc3'(seqidno:3)。以大豆cdna为模板进行pcr扩增，将扩增的pcr片段进行bamhi和hindiii双酶切，并连接至经同样双酶切的pet28a载体，经连接转化top10，在含kana的lb平板上筛选阳性克隆，提质粒pcr鉴定，正确后测序。提取重组表达质粒转化至大肠杆菌bl21star中，进行蛋白表达，用亲和层析法对蛋白进行纯化。

所用层析柱参数如下：柱长：20cm；直径：16mm，填料：chelatingsepharosefastflow4btm，填料体积：10ml；厂家：amershambiosciences流速为3ml/min。纯化后，d-34蛋白的电泳图如图所示。

实施例2

d-34、d-34+海藻糖对cs热聚集的影响实验：

为检测d-34蛋白对cs(柠檬酸合成酶citroylsynthetase，sigma)热聚集的抑制作用，将cs(0.08mg/ml)按照图2中的比例与不同浓度的d-34蛋白、bsa(牛血清蛋白，生工)和海藻糖混合后，45℃恒温1h，在紫外分光光度计上测定a400。在蛋白质发生聚集是在400nm的光吸收值将会上升。以未加蛋白的cs处理后的聚集度为100％计，各组中的cs热聚集度如图2所示。由图2知，对照组蛋白bsa对cs热聚集没有明显的抑制作用；而d-34蛋白组对cs热聚集就有明显的抑制作用，且随浓度增加，其抑制效果越明显。在含有海藻糖组中，单独的海藻糖对cs热聚集具有一定的抑制作用；同时含有海藻糖和d-34蛋白组中，cs热聚集度显著的降低，由此说明d-34蛋白与海藻糖对cs热聚集的抑制有明显的协同作用。

实施例3

d-34、d-34+海藻糖对adh酶活热保护的实验：

为检测d-34蛋白对adh(乙醇脱氢酶，10mmtris-hciph＝7.5，sigma)酶活的保护作用，将adh(0.2mg/ml)按照图3中的比例与d-34蛋白、bsa(牛血清蛋白，生工)或海藻糖混合55℃处理1.5h，测定酶活性。取0.1ml的上述液体加入到1.4ml缓冲液(50mmtris-hciph＝8.8)、0.1ml无水乙醇和1.4ml0.025m的nad组成的体系中。在25℃恒温，连续测定a340，每10s测一次，共测2分钟，处理数据，计算各组中adh的残余酶活，结果如图3所示。由图3知，d-34蛋白组和对照蛋白bsa组对adh酶热失活都有明显的保护作用。当添加海藻糖后，也即是对含有海藻糖组的检查结果显示d-34蛋白与海藻糖对adh热失活的有明显的协同保护作用。

实施例4

d-34、d-34+海藻糖对酵母可溶性总蛋白热保护的实验：

为检测d-34蛋白对酵母可溶性总蛋白的热保护作用。测定了d-34蛋白对酵母可溶性蛋白热聚集的抑制作用。具体实验方法：用酵母蛋白提取试剂盒(生工)提取的酵母热敏突变株δtps2(实验室保存)的可溶性总蛋白(0.25mg/ml)按照图4中的比例与d-34蛋白、bsa(牛血清蛋白，生工)和海藻糖混合45℃处理1h，测定od400值的变化，测得的结果如图4所示。由图4知，对照蛋白bsa组对酵母蛋白(0.25mg/ml)热聚集没有明显的抑制作用；d-34蛋白组对酵母蛋白有明显的保护作用。而且有图4可知海藻糖对酵母蛋白有一定的保护作用，当将海藻糖与d-34蛋白混合后，对酵母蛋白的保护有一定的协同作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>深圳大学

<120>d-34蛋白的应用和含有d-34蛋白的热保护剂

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>789

<212>dna

<213>d-34蛋白基因序列

<400>1

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gctgcggagatgagagcgacaggaaagaacgagacagagcctggcgggctgggcgccagg540

gcccagtcagcagccacgcggaatactcgtactgtgtcccactctcacaagacaaccttg600

tctgatgtcttaacggatgcgaaggagaagctaccagcggataaggcggtgacgcgagaa660

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<210>2

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggatccatgagccaggaacagctcaaga

28

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<210>4

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<212>prt

<213>d-34蛋白的氨基酸序列

<400>4

metserglngluglnleulyslysproglnglygluglnaspproilelystyrglyasp

15101520

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2125303540

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261