一种多拉菌素杂质的制备方法与流程

本发明涉及一种质量控制标准品的制备方法，特别涉及一种多拉菌素杂质的制备方法。

背景技术：

多拉菌素(doramectin)是一种新型兽用大环内酯类抗生素，主要用于禽畜寄生虫防治。相比于传统兽用抗生素，多拉菌素具有抗虫谱广(目前已经证明对三纲12目73属的寄生虫都有效)、低耐受、低存留等特点。1993年，美国辉瑞医药公司率先利用突变基因由生物合成方式得到多拉菌素，因为其在动物消化道线虫、圆虫、虱等寄生虫病的预防和治疗效果，临床应用越来越广泛。

药品质量研究事关用药安全，近年来越来越受到重视。其中杂质研究又是质量研究的重中之重。受生物合成方式的自身特殊性限制，发酵产物中会有大量的干扰杂质出现，其中一部分在提取纯化后仍然难以除去。一般认为杂质含量1.5％的杂质需要对其结构进行确认。多拉菌素成品中的rrt＝1.5位置有一峰面积大于1.5％的杂质，内部命名为杂质5，结构确认为为有效进行杂质检测，需要采用化学合成方法制备该杂质作为对照品使用。

将多拉菌素的适当羟基氧化可以得到杂质5，然而由于多拉菌素的氧化反应位点众多，同时存在烯键，实际氧化反应得到的杂质5中，存在较大量的其他杂质，纯度不高，难以作为标准品使用。开发出一种高效、高纯度多拉菌素杂质5的制备工艺，具有非常实际的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可以制备得到高纯度多拉菌素杂质5的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种多拉菌素杂质的制备方法，该多拉菌素杂质的结构式为：包括如下步骤：

1)将多拉菌素溶解于非质子性有机溶剂中，得到多拉菌素溶液；

2)在多拉菌素溶液中加入氧化反应催化剂mno2，在含氧气的气氛中或向溶液中通入含氧气的气体，进行氧化反应；

3)将氧化产物纯化，得到多拉菌素杂质。

作为上述制备方法的进一步改进，非质子性有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、丙酮中的至少一种。

作为上述制备方法的进一步改进，mno2的用量为底物质量的至少2倍，优选2～5倍。

作为上述制备方法的进一步改进，氧化反应的温度为20～40℃。

作为上述制备方法的进一步改进，含氧气的气氛为空气氛；含氧气的气体为空气。

作为上述制备方法的进一步改进，使用制备液相法对氧化产物进行纯化。

作为上述制备方法的进一步改进，纯化的填料为5μm粒径c18制备柱或8μm粒径c18dac填充柱。

作为上述制备方法的进一步改进，制备液相法中使用的流动相为乙腈：水(v:v)体积比＝(80：20)～(70：30)的混合液。

作为上述制备方法的进一步改进，纯化时流动相的流速为4～20ml/min。

本发明的有益效果是：

本发明的方法，打破现有技术的局限，通过控制氧化反应的条件，成功将多拉菌素氧化制备得到多拉菌素杂质5，得到的产物纯度可达98％以上，同时收率可达75％以上。得到的产物可以满足杂质标准品的要求。

附图说明

图1是多拉菌素实施例1杂质5的制备液相图。

具体实施方式

一种多拉菌素杂质的制备方法，该多拉菌素杂质的结构式为：包括如下步骤：

1)将多拉菌素溶解于非质子性有机溶剂中，得到多拉菌素溶液；

2)在多拉菌素溶液中加入氧化反应催化剂，在含氧气的气氛中或向溶液中通入含氧气的气体，进行氧化反应；

3)将氧化产物纯化，得到多拉菌素杂质。

mno2可以出人意料地促进反应的进行。

含氧气的气氛或含氧气的气体中，氧气的含量没有特别的要求，氧气的体积占比可以在1％～100％之间。氧气的含量越高，其反应相对会快些，但是对反应本身没有显著影响。

考虑到反应条件控制的方便性和成本，作为上述制备方法的进一步改进，含氧气的气氛为空气氛；含氧气的气体为空气。

非质子性有机溶剂不会抑制氧化反应的进行。非质子性有机溶剂的种类不限，只要其对多拉菌素有较好的溶解度即可。作为上述制备方法的进一步改进，非质子性有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、丙酮中的至少一种；出于安全性考虑，进一步优选二氯甲烷、丙酮中的至少一种。

作为上述制备方法的进一步改进，mno2的用量为底物质量的至少2倍，优选2～5倍。用量在2倍以下，催化效果极不明显，反应速度过慢，甚至监测不到产物的生成；而用量过大，会导致产物的收率因为被mno2吸附过多而显著降低。mno2的用量为底物质量的2～5倍时，不仅具有良好的反应速率，同时可以出人意料地获得较高纯度的杂质5。

作为上述制备方法的进一步改进，氧化反应的温度为20～40℃，优选20～35℃。这种反应温度下，可以出人意料地得到纯度更高的杂质5。反应温度低于20℃，反应速率会显著下降；而反应温度高于40℃，反应会过于剧烈，产生大量的杂质。

作为上述制备方法的进一步改进，使用制备液相法对氧化产物进行纯化。进一步的，纯化填料为5μm粒径c18制备柱或8μm粒径c18dac填充柱。当然，本领域技术人员也可以根据实际情况使用其他纯化方法或者填料。

作为上述制备方法的进一步改进，制备液相法中使用的流动相为乙腈：水(v:v)体积比＝(80：20)～(70：30)的混合液。

作为上述制备方法的进一步改进，纯化时流动相的流速为4～20ml/min。

下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

1)将5g多拉菌素样品溶于50ml丙酮中；

2)空气气氛中，加入20g的mno2混匀，置于恒温恒速磁力搅拌器上，20℃下反应5个小时，在线监测产物含量大于80％时，以5倍量甲醇结束反应；

3)将所得反应液过滤后，取上清液浓缩干燥，得杂质5粗品，纯度为81％；

4)制备所得杂质5粗品用乙腈溶解至适当浓度，用制备液相分离制备，采用5μm粒径c18制备柱，以乙腈：水(v:v)体积比＝(80：20)作为流动相，流速10ml/min，收集纯度大于98％的流分，冻干，得到杂质5标准品。

综合收率为79％，纯度98.5％。将uv、ir、高分辨质谱和核磁数据与文献分析比对，确定分离所得杂质即为目标化合物。

图1是多拉菌素杂质5的制备液相图。图中30～35min之间为收集流分段。

实施例2

1)将2g多拉菌素样品溶于50ml二氯甲烷中；

2)空气气氛中，加入5g的mno2混匀，置于恒温恒速磁力搅拌器上，35℃下反应2个小时，在线监测产物含量大于80％时，以10倍量甲醇结束反应；

3)将所得反应液过滤后，取上清液浓缩干燥，得杂质5粗品；

4)制备所得杂质5粗品用乙腈溶解至适当浓度，用制备液相分离制备，采用100g粒径为8μm的ymc的c18填料，dac色谱柱，以乙腈：水(v:v)体积比＝(75：25)作为流动相，流速20ml/min。收集纯度大于98％的流分，冻干，得到杂质5标准品。

综合收率为88％，纯度98.6％。

实施例3

1)将5g多拉菌素样品溶于50ml氯仿中；

2)空气气氛中，加入10g的mno2混匀，置于恒温恒速磁力搅拌器上，25℃下反应3个小时，在线监测产物含量大于80％时，以10倍量甲醇结束反应；

3)将所得反应液过滤后，取上清液浓缩干燥，得杂质5粗品；

4)制备所得杂质5粗品用乙腈溶解至适当浓度，用制备液相分离制备，采用300g粒径为8μm的ge的c18填料，dac色谱柱，以乙腈：水(v:v)体积比＝(70：30)作为流动相，流速4ml/min。收集纯度大于98％的流分，冻干，得到杂质5标准品。

综合收率为90％，纯度98.8％。

实施例4：

同实施例1，不同之处在反应在密闭条件下，搅拌的过程中通入纯氧。

综合收率为83％，纯度98.7％。

实施例5：

同实施例1，不同之处在反应温度为40℃。

综合收率为81％，纯度95.4％。

不同反应溶剂对氧化反应的影响：

对比例1和对比例2

反应条件同实施例1，不同之处在于分别使用等体积的质子性溶剂甲醇和乙醇替换丙酮。在线监测显示对比例1和对比例2均未产生目标化合物杂质5。

实验结果表明，非质子性溶剂有利于反应的进行，而质子性溶剂无法得到目标化合物杂质5。可能的原因是质性有机溶剂具有氢键给体，不利于氧化反应的发生。

不同氧化剂对氧化反应的影响：

对比例3

同实施例4，不同之处在于使用10v/v％h2o2水溶液滴加代替通入氧气。

反应剧烈，但在线监测未产生目标化合物杂质5。

对比例4：

同实施例1，不同之处在于反应在氮气气氛下进行。在线监测未产生目标化合物杂质5。

实施例1、2的结果表明，在存在氧气的情况下，氧气的含量对反应结果没有显著影响。对比例3的结果表明，氧化活性强于氧气同样不利于得到杂质5；对比例4的结果表明，没有氧存在的情况下，不会发生氧化反应。

不同氧化催化剂对氧化反应的影响

对比例5

同实施例1，不同之处在于mno2使用等体积的高锰酸钾替换。在线监测未产生目标化合物杂质5。

对比例6

同实施例1，不同之处在于不使用mno2。在线监测未产生目标化合物杂质5。

对比例7

同实施例1，不同之处在于mno2的使用量为5g。在线监测反应产物最高纯度仅为50％。

对比例8

同实施例1，不同之处在于mno2的使用量为30g。产物由于mno2加入太多吸附溶液，实际过滤时间延长，且滤液明显减少。

实验结果表明mno2可以有效催化反应的进行，而其他常见的氧化反应催化剂并不能有效引发氧化反应的发生。mno2的用量过少，不利于得到高纯度的杂质5；而用量过多，又会导致收率下降，增加后处理的难度。

反应温度对氧化反应的影响

对比例9

同实施例2，不同之处在于反应温度为10℃。在线监测反应产物最高纯度仅为40％。

对比例10

同实施例1，不同之处在于反应温度为50℃。出现局部爆沸现象，停止实验。

可见，反应温度过低不利于反应的进行；而反应温度过高，存在较大的安全隐患，同样不利于反应的进行。