专利名称：净化阿维菌素类药物的方法及其免疫亲和色谱柱的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种净化阿维菌素类药物(Aermectins，AVMs)，包括阿维菌素(Aermectin，AVM)，多拉菌素(Doramectin，DOR)，埃比菌素(Eprinomectin，EP)和伊维菌素(Ivermectin，IVM)的方法及其专用免疫亲和色谱柱。
背景技术：
随着生命科学的发展，人们对生物体内的物质及其变化产生了越来越浓厚的兴趣，而生物样本的分析就成为探索和发现生命奥秘的必要手段。由于生物样本成分复杂，待测物浓度较低，而且大多数取样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提出了更高的要求。免疫亲和色谱(IAC，immunoaffinity chromatography)是一种将免疫反应与色谱分析方法相结合的分析方法。它的高度选择性和高亲和性无疑使分析过程简化。在兽药残留分析中，IAC最简单而且最有效的应用方式是作为理化测定技术(如HPLC，GC)的样品净化手段，这种联用方法可使免疫学技术和理化技术在选择性、分离能力、速度和灵敏度方面得到互补，并避免了免疫分析法(如ELISA，RIA)直接测定样品的诸多不足。目前，该方法在抗体、激素、多肽、酶、重组蛋白、受体病毒及小分子化合物的分析中被广泛应用。
AVMs包括阿维菌素(Avermectin，AVM)、伊维菌素(Ivermectin，IVM)、多拉菌素(Doramectin，DOR)、埃普里诺菌素(埃比菌素、依普菌素，Eprinomectin，EP)、莫西菌素(Moxidectin，MOX)和塞拉菌素(Selamectin，SEL)等药物，其中，AVMs的共有结构如图2所示。
阿维菌素(Avermectin，AVM)，多拉菌素，埃比菌素和伊维菌素属于大环内酯类广谱抗寄生虫抗生素类药，对本类药物的抗虫谱包括牛羊的多种线虫如哥伦比亚结节虫、辐射结节虫及其幼虫、毛圆线虫、血柔属线虫、牛副丝虫、马属动物各类圆虫、副蛔虫、蛲虫、血柔线虫、蟠尾丝蚴，猪的食道口线虫、肺丝虫、旋毛虫及其移行蚴、包囊蚴、肾虫、犬的蛔虫、蛲虫、心丝虫、钩虫及各种动物的体外寄生虫如螨虫、蜱、虱、蝇类及蝇类蚴、日痒恙虫等本类药物的抗虫谱包括牛羊的多种线虫如哥伦比亚结节虫、辐射结节虫及其幼虫、毛圆线虫、血柔属线虫、牛副丝虫、马属动物各类圆虫、副蛔虫、蛲虫、血柔线虫、蟠尾丝蚴，猪的食道口线虫、肺丝虫、旋毛虫及其移行蚴、包囊蚴、肾虫、犬的蛔虫、蛲虫、心丝虫、钩虫及各种动物的体外寄生虫如螨虫、蜱、虱、蝇类及蝇类蚴、日痒恙虫等。许多国家建立了阿维菌素类药物的残留检测方法并作出了残留限量的规定。AVMs作为脂溶性化合物，在动物体内残效时间较长，因而WHO将其列为高毒化合物，其动物源食品中的残留检测工作引起各国的极大关注，并制定最高残留限量。
目前检测阿维菌素，多拉菌素，埃比菌素和伊维菌素的方法主要有高效液相色谱法-荧光(HPLC-FLD)、液-质联机(LC-MS-MS)和酶联免疫法(ELISA)等。这些方法的前处理利用液-液分配，常规的SPE柱净化和分离，都在不同程度地存在着处理过程繁琐、净化效果差、有机溶剂浪费多、所需时间长等缺点。免疫亲和技术是90年代在分析领域得到应用的新技术，但用免疫亲和柱净化基质中的阿维菌素，多拉菌素，埃比菌素和伊维菌素未见报道，更无商品化的IAC柱出售。
发明内容
本发明的目的是提供一种净化阿维菌素和/或伊维菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素的方法及其专用免疫亲和色谱柱。
本发明所提供的净化阿维菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素和/或伊维菌素的免疫亲和吸附剂是由固相载体和与其偶联的阿维菌素多克隆抗体或单克隆抗体组成；所述阿维菌素多克隆抗体或阿维菌素单克隆抗体是以阿维菌素半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的；所述阿维菌素半抗原是在阿维菌素的C4″位置上连接琥珀酸酐得到的4″-羟-琥珀酸酐阿维菌素(4″-o-succinoyl AVM)即为阿维菌素半抗原。
阿维菌素是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。本发明将阿维菌素用琥珀酸酐酰化，再与载体蛋白偶联得到免疫原。半抗原与载体蛋白的结合比例过低或过高都对免疫不利，半抗原与卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)的结合摩尔比分别为31.6∶1和23∶1。
所述固相载体可为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶等，优选为Sepharose 4B。
所述阿维菌素多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，所述阿维菌素单克隆抗体优选为阿维菌素鼠单克隆抗体，所述阿维菌素多克隆抗体为优选阿维菌素兔多克隆抗体。
所述阿维菌素鼠单克隆抗体优选为对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCC No.1606。
所述对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCC No.1606已于2006年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
所述载体蛋白可为牛血清白蛋白或卵清蛋白等常用载体蛋白。
所述免疫亲和吸附剂可装载入柱中制成免疫亲和色谱柱，该免疫亲和色谱柱也属于本发明的保护范围。
含有上述免疫亲和吸附剂或免疫亲和色谱柱的试剂盒也属于本发明的保护范围。
所述试剂盒中还包括洗脱液，所述洗脱液可为甲醇。
所述试剂盒中还包括洗涤液I、洗涤液II、洗涤液III和保存液；所述保存液可为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液，所述0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液可为1L中含有0.2g KH2PO4，0.2g KCl，2.9g Na2HPO4.12H2O，8.8g NaCl，0.02gNaN3的溶液；所述洗涤液I可为1L中含有体积百分含量20％的甲醇，0.2gKH2PO4，0.2g KCl，2.9g Na2HPO4.12H2O，和29.3g NaCl，pH7.4的溶液；所述洗涤液II为体积百分含量为20％的甲醇溶液；所述洗涤液III可为体积百分含量为50％的甲醇溶液。
该免疫亲和吸附剂以及含有该免疫亲和吸附剂的色谱柱基于免疫反应和色谱反应，适合从生物样品(如肌肉、肝、肺、肾血浆)中净化阿维菌素，多拉菌素，埃比菌素和伊维菌素，便于残留分析。在该免疫亲和吸附剂中，阿维菌素鼠单克隆抗体和阿维菌素兔多克隆抗体与溴化氰活化的Sepharose 4B的偶联率分别是99.7％，98.1％，偶联有阿维菌素鼠单克隆抗体的免疫亲和色谱柱对阿维菌素，伊维菌素，埃比菌素和多拉菌素动态柱容量分别为3884ng/mL、3896ng/mL、3612ng/mL、3897ng/mL，绝对柱容量分别为545ng/mg IgG、549ng/mg IgG、506ng/mg IgG、542ng/mgIgG；使用了15次后动态柱容量为1300-1500ng/mL。
本发明所提供的提纯阿维菌素和/或伊维菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素的方法，包括以下步骤1)样品的前处理取动物组织匀浆物按5±0.01g的量加入15mL甲醇，充分混匀，然后在振荡器上中速振荡30min，3000rpm离心10分钟，得到上清液即为样品溶液；2)取3ml样品溶液与20mL的上述保存液混合，过上述免疫亲和色谱柱，然后先后用20mL洗涤液I、15mL洗涤液II和3mL洗涤液III洗涤，然后用4mL洗脱液洗脱，收集洗脱液，得到纯化的阿维菌素和/或伊维菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素溶液。
本发明的免疫亲和色谱柱具有高选择性，使样品前处理过程大大简化，尤其适用于肌肉、肝和血浆中微量阿维菌素类药物的前处理，分析质量得到改善。免疫亲和吸附剂的高选择性使得阿维菌素，伊维菌素，埃比菌素和多拉菌素分析方法的检测限将主要取决于取样量，这是单纯理化手段难以达到的；本发明的免疫亲和色谱柱对待测组分有很强的保留和浓缩能力，只要加样量不超过柱容量，在实测样品条件下免疫亲和吸附剂对组分的保留能力几乎不受样品体积或组分浓度的影响。本发明的方法对组分净化的同时还可提供定性信息。本发明的方法水相操作，操作简单，净化效果好，免疫亲和色谱柱能重复使用，能节省大量的有机溶剂，降低分析成本和环境污染。本发明的净化方法结合色谱法高效检测阿维菌素，伊维菌素，埃比菌素和多拉菌素的含量，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。
图1为AVMs的标准品、空白肌肉组织和添加样本的液相色谱2为AVMs的共有结构图具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、净化阿维菌素和/或伊维菌素和/或埃比菌素和/或多拉菌素的免疫色谱柱的制备1、阿维菌素兔多克隆抗血清的制备阿维菌素半抗原的合成分三步(1)5-o-t-BuMe2Si-AVM-4″-OH的合成将1.0g阿维菌素置于25mL三口鸡心瓶中，6mL N，N-二甲基酰胺(DMF)溶解，加0.47g咪唑，混合。机械搅拌下，将2mL DMF稀释的0.52g t-BuMe2SiCl(tert-butyldimethylchlorosilane)逐滴加入，30℃反应2h。向反应液中加入100mL乙酸乙酯(EtoAc)混合。混合液用50mL水洗涤3次。分离EtoAc层，MgSO4干燥，减压浓缩得到微黄色粘稠物。将该微黄色粘稠物用CH2Cl2溶解，硅胶柱层析分离产物，干燥后得到5-o-t-BuMe2Si-AVM-4″-OH。
(2)5-o-t-BuM2Si-AVM-4″-o-succinoyl的合成取0.50g 5-o-t-BuM2Si-R-4″-OH置于50mL三口鸡心瓶中，加12mLCH2Cl2使其溶解，依次加入0.28g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)、0.45g三乙胺和0.92g琥珀酸酐，水浴中回流2.5小时，溶液由无色变为棕色、黑色(与反应原料无关)。减压蒸干CH2Cl2后，加入100mL乙醚，过滤除去不溶物后转至250mL分液漏斗中，乙醚层用100mL 3.6％(质量百分含量)HCl洗涤2次，再用100mL水洗涤2次。MgSO4干燥，浓缩，得淡黄色粘稠物，用CH2Cl2溶解后，用薄层色谱(TLC)对产物进行分离(展开剂各成分体积比为CH2Cl2∶四氢呋喃(THF)∶CH3OH＝95∶5∶5)。TLC出现三条区带，将中间最大的区带刮下，用CH2Cl2和CH3OH(体积比为1∶1)淋洗，减压浓缩，真空干燥24h(避光)得到5-o-t-BuM2Si-AVM-4″-o-succinoyl。
(3)将步骤2)得到的产物脱去保护基5-o-t-BuM2Si-AVM，得到4″-o-succinoyl-AVM，该阿维菌素的琥珀酸衍生物即为阿维菌素半抗原。
免疫原的制备本试验采用N-羟基琥珀酰亚胺酯法(NHS)将阿维菌素半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶联，得到BSA-AVM偶联物或OVA-AVM偶联物即为免疫抗原。
免疫原合成的具体步骤如下1)取12mg阿维菌素半抗原置于5mL圆底烧瓶中，加0.4mL二甲基甲酰胺(DMF)使阿维菌素半抗原溶解，再加入2.7mg N-羟基琥珀酰亚胺酯和4.7mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)，混合后，室温(18-20℃)避光搅拌10小时。
2)搅拌下，在1h内将步骤1)得到的反应液逐滴加到6mL含30mg BSA或OVA和0.6ml DMF的硼酸盐缓冲液(0.2M，pH9.4)。溶液开始略显混浊，最后有少量沉淀出现，继续搅拌1小时，再转至4℃下搅拌10-12小时，立即进行下述透析纯化。
3)将步骤2)得到的反应液转入透析袋(截止分子量10,000Da)4℃搅拌下，透析2d，其间换PBS三次。将透析物1000rpm离心5min，除去沉淀，得到的上清液即为免疫原BSA-AVM偶联物或OVA-AVM偶联物。
动物免疫采用新西兰大白兔作为免疫动物，免疫剂量为1mg·ml-1BSA-AVM偶联物或1mg·ml-1OVA-AVM偶联物。将新西兰兔子饲养数周后接种免疫，首次免疫用1ml完全弗氏佐剂乳化，加强免疫用1ml不完全弗氏佐剂乳化。每次免疫间隔3-4周，一共免疫5次，最后一次不加佐剂直接肌肉注射，最后一次免疫7-10d后采血检测，测定血清效价和交叉反应后，颈动脉放血，收集血清。
2、阿维菌素鼠单克隆抗体的制备动物免疫采用BALA/C小鼠作为免疫动物、以上述阿维菌素半抗原与蛋白质载体的偶联物BSA-AVM偶联物或OVA-AVM偶联物为免疫原，免疫剂量为50μg/只(体积为0.1ml)加等体积的完全弗氏佐剂乳化，进行首次免疫。一个月后，取同样量免疫抗原加不完全弗氏佐剂，乳化，进行加强免疫，再过一个月后同法再次进行加强免疫，二免后10天采血，测定抗体效价和交叉反应后，取脾细胞。
细胞融合脾细胞按5∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。
杂交瘤细胞克隆化采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直到得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCC No.1606，该单克隆杂交瘤细胞株对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应。对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCCNo.1606已于2006年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
单克隆抗体大量生长及提纯采用体内诱生法，将BALB/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油，7-14天后腹腔注射对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCC No.16065×105-106个/只，7-10天后采集腹水。
单克隆抗体的保存在液氮-20℃下保存，使用时37℃水浴快速解冻。
3、IgG的纯化采用饱和硫酸胺盐法(SAS)和DEME纤维素离子交换层析法纯化抗血清或腹水，首先用饱和硫酸铵法将IgG进行粗提和浓缩，再用DEAE52纤维素阴离子交换法将IgG进一步纯化。其具体步骤如下粗提取3mL阿维菌素多克隆抗体血清或对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCC No.1606腹水与3mLPBS(0.01M，pH7.0)，混匀，吸取饱和硫酸铵溶液6mL，边缓慢滴加边搅拌加入血清或腹水溶液中，使硫酸铵溶液的饱和度达到50％。4℃放置60min后，3000g离心15min。将所得沉淀再溶于3mL PBS(0.01M，pH7.0)中，缓慢滴加饱和硫酸铵溶液1.6mL，使硫酸铵溶液饱和度达35％。4℃放置20min后，以3000g离心15min。沉淀再用上述方法在饱和度为35％的硫酸铵溶液中沉淀一次。
脱盐将沉淀溶于(0.0175M，pH6.7)PBS中，装入透析袋，并将透析袋置于1000mL的PBS(0.0175M，pH6.7)溶液中于4℃下搅拌透析24小时，在此过程中置换缓冲液3次，得到粗提的IgG溶液。
纯化称取2g DE-52(DEAE-52)纤维素粉末，置于盛有重蒸馏水的烧杯中，充分搅拌，静置后去掉多余溶液，然后加入0.5mol/L NaOH溶液，搅拌均匀，1h后布氏漏斗抽滤，接着用重蒸水充分洗涤至中性。再用0.5mol/L HCl溶液以同样的方法处理。最后换用0.5mol/LNaOH溶液处理一次，充分水洗至中性，然后将处理的DEAE-52装入层析柱中(2.0×20cm)，于0.0175M，pH6.7的PBS中平衡。将盐析所得粗提的IgG溶液滴入层析柱，待全部样本进入柱后，关闭柱下口，并在柱上覆盖3-5cm 0.0175M，pH6.7的PBS洗脱，连接洗脱瓶，控制流速为1.0mL/min，用紫外检测器收集蛋白组分。将含有抗体蛋白的洗脱液用50％的饱和硫酸铵进行沉淀，所得沉淀脱盐后，得到对伊维菌素、埃比菌素和多拉菌素都有交叉反应的阿维菌素兔多克隆抗体或对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的单克隆抗体，将抗体分装并于-20℃保存。
4、免疫色谱柱(IAC)的制备基质的准备取溴化氰活化的Sepharose 4B干冻粉，在盛有1.0mmol l-1HCl的G3漏斗中膨胀。
偶联反应将凝胶用0.1mol/L NaHCO3溶液平衡后，与20mg的上述纯化抗体(溶于5mL 0.1mol/L NaHCO3溶液)混合，在4℃搅拌20h。
反应液转入G3漏斗中，用100mL 0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)洗涤，收集洗涤液，紫外鉴定，计算偶联率。偶联率计算公式为 偶联率的检测结果表明，兔多克隆抗体和对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的单克隆抗体与溴化氰活化的Sepharose 4B的偶联率分别是99.7±1.5％、98.1±1.6％。
活化位点的封闭将上述偶联后的凝胶转入盛有0.1mol/L、pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，混合，4℃下缓慢搅拌2hr，以封闭未偶联的活化位点。
洗涤凝胶用5倍体积的0.1mol/L、pH4.0醋酸盐缓冲液和0.1mol/L、pH8.0Tris-HCl缓冲液交替冲洗3次。用0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)平衡后，抽干的凝胶转入0.01mol/L、pH7.4的含0.1％NaN3磷酸盐缓冲液(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g，NaN31g)中，4℃下存放备用。
装柱将偶联有阿维菌素兔多克隆抗体或对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的单克隆抗体的免疫吸附剂转入到含G3滤板的玻璃柱里，制成偶联有兔多克隆抗体或对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱(IAC柱)。
5、IAC柱容量的确定将步骤4制备的偶联有兔多克隆抗体或对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱，分别用保存液洗柱，平衡。轻轻上下晃动IAC柱，赶走柱里的气泡。将2mL含有2000ng·ml-1阿维菌素(AVM)、2000ng·ml-1伊维菌素(IVM)、2000ng·ml-1埃比菌素(EP)和2000ng·ml-1多拉菌素4种药物的混合标准品的保存液分别连续加到免疫亲和色谱柱上，自然重力下流出。当柱达到饱和后(流出液中样品浓度和加样液浓度相同)，先后用20mL洗涤液I(1L中含有体积百分含量20％的甲醇，0.2g KH2PO4，0.2g KCl，2.9g Na2HPO4.12H2O，和29.3g NaCl，pH7.4)，15mL洗涤液II(体积百分含量为20％的甲醇溶液)和3mL洗涤液III(体积百分含量为50％的甲醇溶液)洗涤免疫亲和色谱柱，除去干扰杂质。最后用4ml洗脱液(甲醇)将阿维菌素类药物洗脱，自然重力下流出，收集，吹干，进行HPLC测定。计算出动态柱容量和绝对柱容量。动态柱容量(dynamic column capacity)是指每毫升免疫吸附剂(或柱床体积)对待测物的最大吸收值。绝对柱容量(specificcolumn capacity)是指每毫克固定抗体对待测物的最大结合容量。结果表明偶联有对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱的动态柱容量和绝对柱容量分别为3884ng/mL，545ng/mg IgG(阿维菌素)；3896ng/mL，549ng/mg IgG(伊维菌素)；3612ng/mL，506ng/mg IgG(埃比菌素)；3897ng/mL，542ng/mgIgG(多拉菌素)。
实施例2、含有偶联有兔多克隆抗体或鼠单克隆抗体的免疫色谱柱的试剂盒的制备及其对阿维菌素类药物的提纯净化效果1、阿维菌素的试剂盒的制备该试剂盒主要由盒体，免疫色谱柱(IAC柱)，阿维菌素标准溶液，伊维菌素标准溶液，多拉菌素标准溶液，埃比菌素标准溶液，洗涤液I，洗涤液II，洗涤液III，洗脱液，保存液，海绵托架所组成，海绵托架上设有孔和凹槽。海绵托架的凹槽内有装有阿维菌素标准溶液，伊维菌素标准溶液，多拉菌素标准溶液，埃比菌素标准溶液，涤液I，洗涤液II，洗涤液III，洗脱液，保存液的试剂瓶，海绵托架的孔内装有IAC柱。其中免疫色谱柱为实施例1制备的偶联有兔多克隆抗体或对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCCNo.1606分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱。
洗脱液为甲醇。
保存液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液，即1L中含有0.2gKH2PO4，0.2g KCl，2.9gNa2HPO4.12H2O，8.8gNaCl，0.02g NaN3的溶液；洗涤液I为1L中含有体积百分含量20％的甲醇，0.2gKH2PO4，0.2gKCl，2.9gNa2HPO4.12H2O，和29.3gNaCl，pH7.4的溶液；洗涤液II为体积百分含量为20％的甲醇溶液；洗涤液III为体积百分含量为50％的甲醇溶液。
将含有偶联有兔多克隆抗体或对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的单克隆抗体的免疫色谱柱的试剂盒分别放在4℃。
2、阿维菌素类药物的提纯净化效果实验IAC提取原理是，将特异性抗体阿维菌素兔多克隆抗体或对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的单克隆抗体和惰性基质偶联，制备免疫吸附剂，装柱。当含阿维菌素和/或伊维菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素的混合物流过IAC柱时，固定抗体选择性地结合阿维菌素和/或伊维菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素，其它不被识别的样品杂质则不受阻碍地流出IAC柱，经洗涤后，将抗原-抗体复合物解离洗脱，阿维菌素和/或伊维菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素得到净化。IAC柱经再生处理后可重复使用。
检测样品的处理动物组织样品分别取猪肌肉，牛的肝、肺、肌肉、心、肾各组织样品匀浆物5.0±0.01g，于50ml塑料离心管中，每个样本按10ng/g浓度分别添加阿维菌素，伊维菌素，多拉菌素和埃比菌素标准品，静置15min后，加入甲醇15mL，充分混匀，在振荡器上振荡30min，3000rpm离心10min，取上清液3mL，与20mL的保存液混合，作为样品溶液。
分别将偶联有兔多克隆抗体IgG或对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的单克隆抗体的免疫亲和色谱柱平衡到室温，然后将上述的样品溶液过柱，自然重力下流出，先后用20mL洗涤液I，15mL洗涤液II和3mL洗涤液III洗涤免疫亲和色谱柱，最后用4mL洗脱液洗脱，收集洗脱液，氮气吹干。
加入100μL衍生化试剂A液(由体积比为3∶4的1-甲基咪唑和乙腈组成)，涡动0.5分钟，再加入100μL衍生化试剂B液(由体积比为2∶5的醋酸酐和乙腈组成)，涡动0.5min，密闭，于96℃衍生化反应100分钟，用乙腈定容至2.5mL，过0.45μm针筒滤膜，进HPLC分析(色谱条件C18反相色谱柱，Inertsil ODS-3(4.6mm×250mm，粒径5μm)；流动相为体积百分含量为97％的甲醇溶液；流速为1mL/min；进样量为20μL；激发波长为365nm，发射波长475nm)。IAC柱用20ml的保存液平衡保存在4℃冰箱里备用。结果表明，用IAC进行样品净化，不干扰药物色谱峰，能够完全分离，说明本发明制备的IAC非特异性吸附极小，其中猪肌肉中的阿维菌素，伊维菌素，多拉菌素和埃比菌素净化效果如图1所示，图1中，A为含有阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素各10ng/mL的标准品溶液；B为添加10ng/g阿维菌素、10ng/g伊维菌素、10ng/g多拉菌素和10ng/g埃比菌素标准品的猪肌肉样本浓度；C为未添加阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素的猪肌肉组织；图1中，1为埃比菌素B1a，2为阿维菌素B1a，3为多拉菌素，4为伊维菌素B1a。
权利要求
1.一种净化阿维菌素和/或伊维菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素的免疫亲和吸附剂，是由固相载体和与其偶联的阿维菌素多克隆抗体或单克隆抗体组成；所述阿维菌素多克隆抗体或阿维菌素单克隆抗体是以阿维菌素半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的；所述阿维菌素半抗原是在阿维菌素的C4″位置上连接琥珀酸酐制备得到的4″羟-琥珀酸酐阿维菌素即为阿维菌素半抗原。
2.根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于所述固相载体为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶，优选为Sepharose 4B；所述阿维菌素单克隆抗体为阿维菌素鼠单克隆抗体；所述阿维菌素多克隆抗体为多拉菌素兔多克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的吸附剂，其特征在于所述阿维菌素鼠单克隆抗体为对阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反应的单克隆杂交瘤细胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。
5.以权利要求1-4任一所述的免疫亲和吸附剂为填料的免疫亲和色谱柱。
6.含有权利要求1-4任一所述的免疫亲和吸附色谱柱的试剂盒或含有权利要求5所述的免疫亲和色谱吸附剂的试剂盒。
7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括洗脱液，所述洗脱液为甲醇。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括洗涤液I、洗涤液II、洗涤液III和保存液；所述保存液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液，所述0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液为1L中含有0.2g KH2PO4，0.2g KCl，2.9gNa2HP04.12H20，8.8gNaCl，0.02g NaN3的溶液；所述洗涤液I为1L中含有体积百分含量20％的甲醇，0.2gKH2P04，0.2gKCl，2.9gNa2HP04.12H20和29.3gNaCl，pH7.4的溶液；所述洗涤液II为体积百分含量为20％的甲醇溶液；所述洗涤液III为体积百分含量为50％的甲醇溶液。
9.一种净化阿维菌素和/或伊维菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素的方法，包括以下步骤1)样品的前处理取动物组织匀浆物按5±0.01g的量加入15mL甲醇，充分混匀，然后在振荡器上中速振荡30min，3000rpm离心10分钟，得到上清液即为样品溶液；2)取3ml样品溶液与20mL的权利要求8所述的保存液混合，过权利要求5所述的免疫亲和色谱柱，然后先后用20mL权利要求8所述的洗涤液I、15mL权利要求8所述的洗涤液II和3mL权利要求8所述的洗涤液III洗涤，然后用4mL权利要求7所述的洗脱液洗脱，收集洗脱液，得到纯化的阿维菌素和/或多拉菌素和/或伊维菌素和/或埃比菌素溶液。2)将步骤1)得到的样品溶液过权利要求5所述的免疫亲和色谱柱，然后用权利要求8所述的洗涤液洗涤，再用权利要求7所述的洗脱液洗脱，得到纯化的阿维菌素溶液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述动物组织样品包括肌肉、肝、肺、心、肾和血浆。
全文摘要
本发明公开了一种净化阿维菌素类药物的方法及其免疫亲和色谱柱。该净化阿维菌素的免疫亲和色谱柱装载有免疫亲和吸附剂，该吸附剂是由固相载体和与其偶联的阿维菌素多克隆抗体或单克隆抗体组成；所述阿维菌素多克隆抗体或阿维菌素单克隆抗体是以阿维菌素半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的；所述阿维菌素半抗原是将阿维菌素－4″－OH与琥珀酸酐酯化得到阿维菌素的琥珀酸衍生物即为阿维菌素半抗原。本发明的提纯方法结合色谱法高效检测阿维菌素的含量，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。
文档编号G01N30/00GK1830547SQ200610007260
公开日2006年9月13日 申请日期2006年2月16日 优先权日2006年2月16日
发明者沈建忠, 史为民, 何继红, 何方洋, 侯晓林, 吴聪明 申请人:中国农业大学